CN117795070A - 用于对elane基因进行等位基因特异性编辑的化合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于对ELANE基因进行等位基因特异性编辑的核酸分子、一种包含所述核酸分子的载体、一种包含所述核酸分子或载体的组合物、一种在包含编码所述ELENE基因的遗传物质的生物材料中等位基因特异性编辑ELENE基因的体外方法，以及一种预防和/或治疗和/或检查生物体内疾病的方法。

Description

用于对ELANE基因进行等位基因特异性编辑的化合物和方法
技术领域
本发明涉及分子医学领域，具体涉及基因工程应用领域，更具体涉及疾病相关基因的靶向敲除。
背景技术
遗传疾病是由基因组中的一个或多个异常引起的健康问题。它可以由单个基因(单基因)突变或多个基因(多基因)突变或染色体异常引起。
单个基因或单基因疾病是单个基因突变的结果。单基因疾病可以通过多种方式遗传给后代。然而，基因组印记和单亲二体可能会影响遗传模式。单基因疾病可分为隐性型和显性型，以及常染色体型(即与性染色体无关)和X关联型。但通常情况下，它只是指常染色体隐性或常染色体显性单基因疾病。
常染色体隐性疾病患者，基因的两个拷贝(即两个等位基因)必须发生突变。受影响的人通常有未受影响的父母，他们各自携带突变基因的一个拷贝，被称为基因携带者。常染色体显性疾病患者只需要一个基因突变拷贝(即一个等位基因)。每个受影响的人通常都有一个受影响的父母。在某些情况下，零星的基因突变会首次出现在父母均健康未受影响的孩子身上。有时，父母中有一方是显性突变的嵌合体，而孩子则是这种突变的杂合子。显性遗传病涉及一个或多个基因对一个或多个正常(功能性/健康)基因的显性作用。因此，在显性遗传病中，只需要异常基因的一个拷贝(即等位基因)就能引起或导致特定遗传病的症状。例如，这种突变包括功能增益突变，其中改变的基因产物具有新的分子功能或新的基因表达模式。
中性粒细胞减少症是一种以血液和骨髓中中性粒细胞浓度异常偏低为特征的疾病。中性粒细胞占循环白细胞的大多数，通过清除血液中的细菌、细菌碎片以及和免疫球蛋白结合的病毒，作为抵御感染的主要防御手段。中性粒细胞减少症患者更容易受到细菌感染，如果不及时就医，病情可能会危及生命(中性粒细胞败血症)。中性粒细胞减少症可以是急性的(暂时的)，也可以是慢性的(长期的)。该术语有时可与"白细胞减少症"("白细胞数量不足")互换使用。
中性粒细胞减少症可分为获得性和先天性两种。先天性中性粒细胞减少症的两种主要类型是重度先天性中性粒细胞减少症(CN或SCN)和周期性中性粒细胞减少症(CyN)。
周期性中性粒细胞减少症的特点是中性粒细胞计数从正常水平波动到零，而重度先天性中性粒细胞减少症的特点是出生时观察到的绝对中性粒细胞计数(ANC)非常低(500/ml)，骨髓中的骨髓细胞生成在早幼粒细胞/中幼粒细胞阶段成熟停滞，以及早期细菌感染。
重度先天性中性粒细胞减少症可通过测量血液中极低的ANC和检查骨髓抽吸物，以确定骨髓成熟停滞来确诊。其通常在出生后不久即可诊断出来，而CyN的诊断一般在不同年龄提出，主要临床表现为反复发作的急性口腔疾病。通常需要进行骨髓检查，以排除造血恶性变异、确定细胞性质、评估骨髓成熟度以及发现确切的病因迹象，当怀疑CN/SCN时，细胞遗传学骨髓研究现在至关重要。抗中性粒细胞抗体测定、免疫球蛋白检测(Ig GAM)、淋巴细胞免疫分型、胰腺标志物(血清胰蛋白酶原和粪便弹性蛋白酶)和脂溶性维生素水平(维生素A、E和D)也是判断CN/SCN和CyN的重要依据。
CN/SCN和CyN都是典型的常染色体显性遗传疾病，大多是由所谓的"中性粒细胞表达弹性蛋白酶的基因"(ELANE基因)的杂合突变引起的。不过，也有一些CN/SCN病例是常染色体隐性遗传，例如HAX1基因突变。ELANE基因编码中性粒细胞弹性蛋白酶，这是一种丝氨酸蛋白酶，参与中性粒细胞胞外诱捕网(NETs，结合病原体的纤维网络)的功能。一些研究表明，突变型ELANE的产物会抑制骨髓造血干细胞成熟为中性粒细胞，并导致中性粒细胞减少症。这些研究表明，中性粒细胞弹性蛋白酶的突变启动了未折叠蛋白反应(UPR)，导致骨髓中性粒细胞形成过程出现缺陷。除了CN/SCN和CyN之外，本领域已知的其他ELANE基因相关疾病还有肺气肿或肺气肿改变。
目前，中性粒细胞减少症采用造血生长因子粒细胞集落刺激因子(G-CSF)治疗。G-CSF刺激中性粒细胞的产生并延迟其凋亡。重组G-CSF因子制剂，如非格司亭(filgrastim)，可对不同形式的中性粒细胞减少症患者有效，包括重度先天性中性粒细胞减少症和周期性中性粒细胞减少症。诱导中性粒细胞生成的剂量根据个体的情况有很大的变化。重度先天性中性粒细胞减少症患者目前的总体存活率估计已超过80％，但仍有10％的CN/SCN患者死于严重细菌感染或败血症。虽然G-CSF疗法能成功预防败血症导致的死亡，但长期治疗被认为与CN/SCN患者罹患骨髓增生异常综合征(MDS)或白血病的风险增加有关。
造血干细胞移植(HSCT)对G-CSF治疗无效或患急性髓性白血病或MDS的患者是一种替代性治愈疗法。然而，接受造血干细胞移植的先天性中性粒细胞减少症患者发生例如真菌病和移植物抗宿主病等感染性并发症的风险增加。
WO2019/217294A1中公开了一种通过CRISPR/Cas9技术敲除突变ELANE基因表达的方法。然而，所公开的方法依赖于单核苷酸多态性(SNPs)的存在，而这些单核苷酸多态性在许多突变的ELANE基因中并不普遍，或者被证明不能用于靶向敲除。
发明内容
在此背景下，本发明的目的是提供一种新的方法或化合物，可对ELANE基因相关疾病进行有针对性的预防和/或治疗和/或检查。此外，还提供一种化合物，它可以以等位基因特异性的方式处理突变的ELANE基因。特别是要提供这样一种化合物，它能解决ELANE基因中经常流行的白血病相关突变或与对G-CSF无应答相关的突变，而不仅仅是罕见的多态性。
为实现这一目标，我们提供一种用于对ELANE基因进行等位基因特异性编辑的核酸分子，其包含选自SEQ ID NOS:1-5所组成的组的核苷酸序列。
发明人已经意识到，通过使用根据本发明的核酸分子，可以实现ELANE基因的等位基因特异性编辑。例如，包含或由核苷酸序列SEQ ID NO:1和/或4组成的核酸分子可分别特异性地靶向人ELANE基因外显子2的c.170C>T突变或相应基因产物的p.A57V突变。例如，包含或由核苷酸序列SEQ ID NO:2和/或5组成的核酸分子可分别特异性地靶向人ELANE基因外显子5上的c.641G>T突变或相应基因产物的p.G214V突变。根据发明人的研究结果，这两种突变在常染色体显性遗传的CN/SCN中经常出现。由于本发明核酸分子的特殊结构，未突变的ELANE基因不会成为靶标。因此，根据本发明的核酸分子的这种特殊结构可以对ELANE基因进行等位基因特异性编辑。
这种方法的优点是，在ELANE基因的突变的第一等位基因和未突变的第二等位基因存在的情况下，只有突变的第一等位基因会被靶向，例如被敲除，而未突变的第二等位基因仍能表达功能正常的ELANE基因产物。因此，具有异常功能的突变ELANE基因产物的表达将分别受到抑制或阻止。相反，只有功能性的ELANE基因产物才能表达。这样，即使不使用修复模板，也能对显性突变进行基因校正。
发明人能够在体外系统中使用根据本发明的核酸分子敲除ELANE基因，例如以单向导RNA(sgRNA)的形式，证明先天性中性粒细胞减少症患者的造血干细胞和祖细胞(HSPCs)的减弱的粒细胞分化可以成功恢复。与未被本发明的核酸分子编辑ELANE基因的HSPCs相比，恢复和分化的HSPCs显示出显著的ROS生成。
发明人的发现是令人惊讶的，也是意料之外的。
本文所说的"核酸分子"包括单链或双链的脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)分子，包括连接的天然核苷酸和/或化学修饰的核苷酸。
根据本发明，ELANE基因或"中性粒细胞表达弹性蛋白酶"基因(人类变体：GeneID:1991,Ensembl：ENSG00000197561,Uni-ProtKB/Swiss-Prot:P08246)编码一种丝氨酸蛋白酶，也称为中性粒细胞弹性蛋白酶。中性粒细胞弹性蛋白酶与糜蛋白酶同属一个家族，具有广泛的底物特异性。它在炎症期间由中性粒细胞和巨噬细胞分泌，破坏细菌和宿主组织。
根据本发明，"基因编辑"或基因组编辑是一种基因工程，在生物体的基因组中插入、删除、修饰或替换DNA。在本发明中，"基因编辑"指的是对ELANE基因的修改，例如在生物细胞中。因此，根据本发明，"基因编辑"包括对ELANE基因，最好是对突变的ELANE基因的敲除、敲低或校正。根据本发明，"等位基因特异性"是指基因编辑专门针对ELANE基因突变的等位基因，而非突变的等位基因不受影响。在本发明的一个实施方案中，基因编辑分别导致ELANE基因突变等位基因表达的定向敲除和特异性功能消除。因此，根据本发明的基因编辑包括在生物细胞中使ELANE基因的突变等位基因失活，该细胞是所述突变的杂合子，即所述细胞还包括至少一个ELANE基因的非突变等位基因。
本发明所要解决的问题在此得以完全实现。
在本发明的一个实施方案中，所述核酸分子被配置用于ELANE基因常染色体显性突变的等位基因特异性编辑。
这种方法的优点是可以特异性地解决相当大比例的ELANE基因相关疾病。例如，在CN/SCN患者中，ELANE基因突变通常以常染色体显性方式发生。尽管存在未突变的其他等位基因，但两个等位基因中的一个的突变就会导致疾病表型。本发明可有效弥补这种遗传构成。
在本发明的另一个实施方案中，核酸是"单向导RNA"(sgRNA)。
这一措施为通过CRISPR/Cas9方法使用根据本发明的核酸分子创造了先决条件，尤其是包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列(针对人ELANE基因外显子2的c.170C>T突变或相应基因产物的p.A57V突变)和/或SEQ ID NO:2(针对人ELANE基因外显子5的c.641G>T突变或相应基因产物的p.G214V突变)的核苷酸序列或由其组成的核苷酸序列。
根据本发明，"单向导RNA"(sgRNA)或向导RNA是CRISPR复合物的一个组成部分，其作用是引导CRISPR内切酶到达其靶标，例如ELENE基因。sgRNA是一种非编码的短核糖核酸(RNA)序列，可与互补的目标DNA序列结合。sgRNA首先与CRISPR内切酶结合，且该sgRNA序列通过配对引导复合物到达DNA上特定的ELANE基因位置，CRISPR内切酶在该位置介导双链断裂。
技术人员的可以理解是，相应DNA分子中所含的任何胸腺嘧啶(t)在RNA或sgRNA分子中都分别被尿嘧啶(u)所取代。当应用SEQ ID NOS:1和2的序列时，相应sgRNA分子的序列如下：5'UCAGGGUGACGCCGCAGAAG3'(SEQ ID NO:4)和5'GGACGAAGGAGGCAAUUACG3'(SEQ IDNO:5)。
在本发明的另一个实施方案中，所述核酸分子是修复模板。
这种措施的优点是，ELANE基因的突变等位基因不仅可以被敲除，例如，通过使用包含SEQ ID NOs:1和/或2和/或4和/或5，或由其组成的核苷酸序列的sgRNA，而且还可以被修复，例如，通过包含SEQ ID NO:3或由其组成的核苷酸序列的核酸分子或单链寡核苷酸DNA(ssODN)。SEQ ID NO:3的核苷酸序列来自人类ELANE基因的外显子5，没有发生任何突变。通过这种方法，可以建立一个功能性非突变ELANE基因或等位基因的额外拷贝，从而增加基因产物的表达量。
因此，包含选自SEQ ID NOS:1-5所组成的组的核苷酸序列的核酸分子是本发明的另一主题。
在另一个实施方案中，本发明的核酸分子被设计用于疾病的预防和/或治疗和/或检查，优选ELANE相关疾病，更优选先天性中性粒细胞减少症，更优选重度先天性中性粒细胞减少症(CN/SCN)和/或周期性中性粒细胞减少症(CyN)。
这种措施的优点是，本发明可用于以成因方式治疗ELANE相关疾病，特别是CN/SCN或CyN，也可以是肺气肿或肺气肿改变。
本发明的另一个主题涉及一种包含根据本发明的核酸分子的载体。
根据本发明，"载体"包括任何用作媒介的DNA分子，其以人工方式将核酸分子(如sgRNA)携带到另一个细胞中的，并在其中复制和/或表达。病毒载体尤其受到青睐，因为他们的特点是包含了病毒在感染的细胞内高效运输基因组的专门分子机制。在本发明的一个优选实施方案中，载体可以是也可以不是腺相关载体(AAV)。
根据本发明描述的核酸分子所描述的特征、特性、优点和实施例也适用于根据本发明的载体。
本发明的另一个主题涉及一种包含根据本发明的核酸分子和/或载体的组合物。
根据本发明描述的核酸分子和载体的特征、特性、优点和实施例也适用于根据本发明的组合物。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物进一步包含编码CRISPR相关蛋白9(Cas9)的载体，优选金黄色葡萄球菌Cas9(SaCas9)。
本措施确立了应用CRISPR/Cas9技术的要求。Cas9(CRISPR相关蛋白9，以前称为Cas5、Csn1或Csx12)是一种160千道尔顿的蛋白质，指的是一种能裂解多核苷酸链中磷酸二酯键的酶，是CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)复合物的一个组成部分。因此，Cas9能够特异性地与将内切酶导向靶核酸的sgRNA结合。金黄色葡萄球菌CRISPR Cas9(SaCas9)是一种小型Cas9同源物，可以包装在AAV中，克服了AAV的包装限制。SaCas9的有效基因靶向已在成年大鼠身上得到验证。最近还发现了其他更小的Cas9，例如来自耳葡萄球菌、空肠弯曲杆菌或脑膜炎奈瑟菌的Cas9，它们也同样适用。
在根据本发明的组合物的一个实施方案中，所述Cas9受CAG启动子控制。
CAG(CMV增强子/鸡β-肌动蛋白启动子)启动子驱动的长期表达优于其他启动子，特别是普通突触素启动子。这对于需要长期表达/监测的神经退行性疾病的治疗、预防或建模至关重要。在使用AAV.PHP.EB的最新研究中，CAG已成为首选启动子。
在本发明的另一个实施方案中，所述组合物是一种药物组合物，包括药学上可接受的载体。
"药物组合物"是一种适合在医疗环境中给动物和/或人用药的组合物。药用组合物最好是无菌的，并按照GMP指南生产。
"药学上可接受的载体"或药用辅料在本领域是公知的，例如包括纳米载体(nanocarriers)、纳米载体(nanovectors)、水溶液(如水或生理缓冲盐水)或其他溶剂或载体(如乙二醇、甘油、油类(如橄榄油)或可注射的有机酯)。在优选的实施方案中，当此类药物组合物用于人体给药，例如用于胃肠外给药时，水溶液为无热原或基本无热原。可以选择药用辅料来实现药剂的延迟释放或选择性地靶向一个或多个细胞、组织或器官。药物组合物可以是剂量单位形式，如注射剂、片剂、胶囊(包括分散型胶囊和明胶胶囊)、颗粒剂、粉剂、糖浆剂、栓剂等。组合物也可以以适合局部用药的溶液形式存在。另外，药物组合物还可以以可吸入的气雾剂形式存在。
短语"药学上可接受的"是指化合物、材料、组合物和/或剂型在合理的医学判断范围内，适合用于与人类和动物的组织接触而不会产生过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，且与合理的效益/风险比相称的。适用于药物制剂的药物载体或药用辅料以及药物必需品在该领域著名的参考文献Remington—The Science and Practice ofPharmacy，2020年第23版，以及USP/NF(《美国药典》和《国家处方集》)中均有描述。本领域的普通技术人员还可以利用其他资源。
本发明的药物组合物以及下文将解释的方法可用于治疗有需要的生物体。在某些实施方案中，生物体是哺乳动物，如人类或其他非人类哺乳动物。
在根据本发明的组合物的一个实施方案中，后者被配置用于预防和/或治疗和/或检查疾病，优选ELANE基因相关疾病，进一步优选先天性中性粒细胞减少症，进一步优选重度先天性中性粒细胞减少症(CN/SCN)和/或周期性中性粒细胞减少症(CyN)。
本发明的另一个主题涉及一种在体外对包括编码所述ELENE基因的遗传物质的生物材料中的ELENE基因进行等位基因特异性编辑的方法，包括将根据本发明的核酸分子和/或所述载体和/或所述组合物导入所述生物材料的步骤，优选地，所述编辑是通过CRISPR/Cas9技术进行的。
根据本发明，"包括编码所述ELANE基因的遗传物质的生物材料"包括生物细胞、组织和生物体的部分。
在本发明的一个实施方案中，所述生物材料包括造血干细胞和祖细胞(HSPCs)。
该措施的优点是，在突变表现为病理学突变的生物材料中编辑ELANE基因。例如，在CN/SCN患者中HSPCs表现出粒细胞分化减弱，而根据发明人的研究结果，其能够被根据本发明的核酸分子恢复。
本发明的另一主题涉及一种用于预防和/或治疗和/或检查生物体(例如动物或人)中的疾病的方法，该方法包括通过将根据本发明的核酸分子和/或所述载体和/或所述组合物引入所述生物体中，对所述生物体中的ELANE基因进行等位基因特异性编辑的步骤，优选地，所述基因编辑是通过CRISPR/Cas9技术进行的。
本发明提供了一种使细胞中的弹性蛋白酶、中性粒细胞表达基因(ELANE基因)突变等位基因失活的方法，优选具有与先天性中性粒细胞减少症、重度先天性中性粒细胞减少症(CN/SCN)或周期性中性粒细胞减少症(CyN)相关的突变，且所述细胞的ELANE基因在一个或多个选自以下的核苷酸位置发生突变：c.170C>T(外显子2)和c.641G>T(外显子5)，和/或所述细胞的ELANE基因产物在选自p.A57V和p.G214V的一个或多个氨基酸位置发生突变，该方法包括:
---向细胞导入一种组合物，该组合物包含：
---CRISPR核酸酶或编码CRISPR核酸酶的序列；以及包含SEQ ID NO:1或2或4或5的核苷酸序列的第一RNA分子，
其中所述CRISPR核酸酶和所述第一RNA分子的复合物影响ELANE基因突变等位基因的双链断裂。
在根据本发明的所述方法的一个实施方案中，将包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列的单链寡核苷酸DNA(ssODN)另外引入细胞中。
本发明提供了一种通过本发明上述方法获得的修饰的细胞。
本发明提供一种在体外或体内外制备包含修饰的细胞的组合物的方法，该方法包括：
a)从具有与CN/SCN或CyN有关的ELANE基因突变和/或患有CN/SCN或CyN的生物体(优选人类)的细胞中分离或提供HSPCs，所述细胞的ELANE基因在选自c.170C>T(外显子2)和c.641G>T(外显子5)的一个或多个核苷酸位置上发生突变；和/或所述生物体的ELANE基因产物在选自p.A57V和p.G214V的一个或多个氨基酸位置发生突变，
b)向步骤(a)的细胞中导入一种组合物，该组合物包含：
CRISPR核酸酶或编码CRISPR核酸酶的序列；以及包含SEQ ID NO:1或2或4或5的核苷酸序列的第一RNA分子，
其中，所述CRISPR核酸酶和所述第一RNA分子的复合物影响一个或多个细胞中ELANE基因突变等位基因的双链断裂，从而使一个或多个细胞中ELANE基因突变等位基因失去活性，从而获得修饰的细胞；可选地，
c)对步骤(b)中的修饰的细胞进行培养扩增，其中所述修饰的细胞能够接种并在接种后产生后代细胞。
在根据本发明所述的方法的一个实施方案中，将包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列的单链寡核苷酸DNA(ssODN)额外导入细胞中。
在根据本发明所述的方法的另一个实施方案中，后期包括以下附加步骤d)，其中步骤(b)或步骤(c)的细胞被施用到生物体中，以治疗受试者体内的CN/SCN或CyN。
因此，本发明还提供了一种治疗患有CN/SCN或CyN的生物体(优选人类)的方法，包括施用治疗有效量的所述修饰的细胞。
根据本发明描述的核酸分子、载体和组合物的特征、特性、优点和实施例也适用于根据本发明的前述方法。
应当理解的是，在不脱离本发明范围的情况下，上述特征和以下将要提及的特征不仅可用于相应情况下指示的组合，还可用于其他组合或以独立的方式使用。
现在，现在通过产生本发明的附加特征、特性和优点的实施例来进一步解释本发明。这些实施例纯粹是说明性的，并不限制本发明的范围。在具体实施例中提到的特征是本发明的一般特征，不仅适用于具体实施例，也可以独立的方式适用于本发明的任何实施例。
现参照以下非限制性实施例和图对本发明作进一步详细描述和说明。
附图说明
图1：等位基因特异性基因敲除可拯救p.A57V ELANE-CN患者的粒细胞生成。A：描述等位基因特异性基因敲除和等位基因特异性基因校正过程的实验方案。在体外扩增ELANE-CN HSPCs并加入等位基因特异性Hifi Cas9 RNP电穿孔。为了进行等位基因特异性基因校正，还额外添加了单链DNA修复模板(ssODN)。三天后，将细胞接种于液体培养基中，向中性粒细胞分化。第14天通过流式细胞术和形态学分析评估分化情况。B：在液体培养分化的第14天，分析ELANE-CN和健康对照中V57特异性RNP的基因修饰效率。C：通过流式细胞术检测表面标记物的表达，评估ELANE V57基因敲除CD34+细胞的粒细胞分化情况。D：分化14天后，Wright-Giemsa染色细胞的代表性细胞离心涂片(cytospin)图像。E：用非靶向RNP或突变特异性RNP核转染ELANE-CN HSPCs的集落形成单位检测。CFU培养14天后对菌落进行计数。F：从突变特异性KO细胞中挑取CFU-G克隆，并进行Sanger测序分析。G：经fMLP处理后，对液体培养分化的中性粒细胞产生ROS的功能进行研究。
图2：与未编辑的对照细胞相比，p.G214V ELANE-CN患者的等位基因特异性基因校正改善了粒细胞分化。A：对用非靶向RNP或V214特异性RNP和ssODN校正模板核转染的p.G214V ELANE-CN HSPCs进行了液体培养分化。14天后对表面标记物表达进行了调查。B：分化14天后Wright-Giemsa染色细胞的代表性细胞离心涂片(cytospin)图像。C、通过Sanger测序和序列痕量分解算法(TIDE)评估p.G214V的等位基因特异性基因编辑效率，发现64％的插入/删除突变(indel)。HDR百分比约为36％。通过计算R2来评估ICE算法的拟合度，R2>0.9被认为是可靠的预测。
具体实施方式
1.靶向突变ELANE的sgRNA的等位基因特异性设计策略和验证
本发明人产生了选择性靶向突变的ELANE基因的等位基因特异性单向导RNA(sgRNA)(表1)。利用CCTop网站设计了用于敲除ELANE基因的突变等位基因的p.A57V突变特异性sgRNA(切割位点：chr19[+852,969:-852,969]，NM_001972.3外显子2，161bp；NP_001963.1p.F54)，并由Integrated DNA technologies(IDT)合成为化学修饰sgRNA。利用CCTop网站设计了用于选择性靶向ELANE基因突变等位基因的p.G214V突变特异性sgRNA(切割位点：chr19[+856,001:-856,001],NM_001972.3外显子5,641bp；NP_001963.1p.V214)，并由Integrated DNA technologies(IDT)合成为化学修饰的sgRNA。
V57 sgRNA与重组HiFi-Cas9蛋白孵育以产生CRISPR/Cas9-gRNA RNP复合物。选择靶向突变的ELANE外显子2的V57 sgRNA来引入终止密码子突变，并仅诱导ELANE突变mRNA的无义介导的mRNA降解(NMD)，这是由突变等位基因的ELANE mRNA起始处的终止密码子或移码突变引起的，据推测可恢复CN/SCN患者受损的粒细胞生成(图1A)。为了评估V57 sgRNA的等位基因选择性，将HiFi Cas9-V57 sgRNA的RNP复合物电穿孔到具有p.A57V突变的CN/SCN患者HSPCs和健康对照的HSPCs中。发明人的研究结果表明，根据电穿孔后96小时的Sanger测序结果，V57 sgRNA对突变等位基因具有高选择性的靶向活性。V57突变特异性sgRNA在健康对照HSPCs上没有引入DSB(图1B)，这再次证明了V57 sgRNA的等位基因特异性。
表1：sgRNA和ssODN序列
为了进一步评估基于CRISPR/Cas9的等位基因特异性设计策略在广泛的ELANE突变中的适用性，本发明人设计了针对ELANE第5外显子p.G214V突变的sgRNA，命名为V214sgRNA(切割位点:chr19[+856,002:-856,002])。HiFi Cas9-V214 sgRNA复合物与基于单链寡核苷酸DNA(ssODN)(表1)的修复模板一起电穿孔到带有p.G214V的CN/SCN患者HSPCs中。Sanger测序分析显示了R214 sgRNA的高水平的等位基因选择性。R214突变特异性sgRNA在健康对照组HSPCs上没有引入DSB(图2A)。
这些结果证实了基于等位基因特异性CRISPR/Cas9的基因编辑对ELANE相关的先天性中性粒细胞减少症的适用性。
2.ELANE-CN/SCN患者HSPCs中的ELANE基因敲除恢复减弱的粒细胞分化
为了进一步评估等位基因特异性ELANE基因敲除作为ELANE相关CN/SCN治疗机会的临床适用性，本发明人使用V57 sgRNA在具有p.A57V突变的ELANE-CN/SCN患者的原代骨髓CD34+HSPC中进行CRISPR/Cas9 RNP介导的基因编辑，并在体外将细胞分化为中性粒细胞。用组装的V57 sgRNA和HiFi-Cas9蛋白电穿孔人CD34+HSPC，实现了CD34+HSPC的等位基因特异性ELANE敲除。通过评估CD15+CD11b+CD45+、CD16+CD11b+CD45+和CD15+CD16+CD45+细胞的百分比(图1C)和对液体培养的体外粒细胞分化第14天产生的成熟粒细胞的离心涂片(cytospin)样品的形态学检查(图1D)，等位基因特异性ELANE敲除会导致了增强的粒细胞分化。此外，用等位基因特异性基因敲除CN/SCN患者的CD34+细胞进行CFU检测显示，与源自非靶向RNP MOCK处理的CN/SCN HSPCs的CD34+细胞(用HiFi-Cas9组装的在人类基因组中无靶标的sgRNA电穿孔)相比，CFU-G水平升高，但CFU-M克隆数减少(图1E)。这些数据表明，等位基因特异性ELANE敲除可恢复CN/SCN的粒细胞分化。发明人从CFU试验中挑选了CFU-G菌落，并通过对ELANE外显子2进行Sanger测序对编辑结果进行了基因分型。发明人可以证明，66.67％的CFU-Gs是由等位基因特异性ELANE敲除的HSPCs产生的，而13.33％的CFU-Gs是由自发校正的HSPCs产生的，20％是未经编辑的(图1F)。
3.由ELANE KO HSPC生成的中性粒细胞在体外活化时的ROS生成不受影响
本发明人进一步评估了等位基因特异性ELANE敲除HSPCs在液体培养14天产生的中性粒细胞的体外活化情况。本发明人评估了fMLP活化的等位基因特异性ELANE敲除的中性粒细胞中的H2O2水平(ROS)。在被fMLP激活后，他们在等位基因特异性敲除的中性粒细胞中检测到明显的ROS产生，而非靶向RNP MOCK中性粒细胞在被fMLP激活后不能产生明显的响应(图1G)。
4.p.G214V ELANE-CN/SCN的HSPC中的ELANE校正可恢复减弱的粒细胞分化。
对于等位基因特异性ELANE校正，本发明人使用V214 sgRNA在具有p.G214V突变的ELANE-CN/SCN患者的原代骨髓CD34+HSPC中进行CRISPR/Cas9 RNP介导的基因校正，并在体外将细胞分化为中性粒细胞。用组装的V214 sgRNA和HiFi Cas9蛋白与作为修复模板的ssODN一起在人CD34+HSPC电穿孔，实现了CD34+HSPC中的基因特异性ELANE校正。V214突变特异性sgRNA在健康对照HSPCs上没有引入DSB(图2A)。通过评估CD45+CD15+CD11b+、CD45+CD11b+CD16+和CD45+CD15+CD16+细胞的百分比，等位基因特异性ELANE校正导致增强的粒细胞分化(图2B)。此外，对体外粒细胞分化第14天生成的成熟粒细胞的离心涂片(cytospin)样品进行形态学检查，结果显示，与对照细胞相比，ELANE校正细胞中的中性粒细胞数量增加(图2C)。这些数据表明，等位基因特异性ELANE校正可恢复CN/SCN中的粒细胞分化。发明人通过进行Sanger测序评估了等位基因特异性突变校正结果，并用ICE算法分析了踪迹，结果显示插入/删除突变(indel)效率为64％，HDR为36％(图2D)。
5.结论
本发明人令人印象深刻地证明了，通过使用根据本发明的核酸分子，特别是包含SEQ ID NO:1和/或2和/或4和/或5的核苷酸序列的核酸分子，可以以等位基因特异性的方式编辑ELANE基因。ELANE基因的这种等位基因特异性编辑可例如通过CRISPR/Cas9技术实现，其中根据本发明的核酸分子被配置为sgRNA。

Claims (15)

1.一种用于对ELANE基因进行等位基因特异性编辑的核酸分子，其包含选自SEQ IDNOS:1-5所组成的组的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的核酸分子，其被配置用于ELANE基因常染色体显性突变的等位基因特异性编辑。
3.根据权利要求1或2所述的核酸分子，其为"单向导RNA"(sgRNA)。
4.根据权利要求1或2所述的核酸分子，其为一种修复模板。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的核酸分子，其用于疾病的预防和/或治疗和/或检查。
6.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于，所述疾病是先天性中性粒细胞减少症，优选重度先天性中性粒细胞减少症(CN/SCN)和/或周期性中性粒细胞减少症(CyN)。
7.一种载体，其包含权利要求1-6中任一项所述的核酸分子。
8.一种组合物，其包含权利要求1-6中任一项所述的核酸分子和/或权利要求7所述的载体。
9.根据权利要求8所述的组合物，进一步包含编码CRISPR相关蛋白9(Cas9)的载体，优选金黄色葡萄球菌CRISPR Cas9(SaCas9)，进一步优选地，所述Cas9受CAG启动子控制。
10.根据权利要求8或9所述的组合物，其为药物组合物，其包含药学上可接受的载体。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的组合物，用于预防和/或治疗和/或检查疾病，优选为先天性中性粒细胞减少症，进一步优选为重度先天性中性粒细胞减少症(CN/SCN)和/或周期性中性粒细胞减少症(CyN)。
12.一种在体外对包含编码所述ELENE基因的遗传物质的生物材料中的ELENE基因进行等位基因特异性编辑的方法，包括将权利要求1-6中任一项所述的核酸分子和/或权利要求7所述的载体和/或权利要求8-11中任一项所述的组合物导入所述生物材料的步骤，优选地，所述编辑通过CRISPR/Cas9技术进行。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述生物材料包括造血干细胞和祖细胞(HSPCs)。
14.一种用于预防和/或治疗和/或检查生物体内疾病的方法，包括通过将权利要求1-6中任一项所述的核酸分子和/或权利要求7所述的载体和/或权利要求8-11中任一项所述的组合物导入所述生物体内，对所述生物体内的ELANE基因进行等位基因特异性编辑的步骤，优选地，所述基因编辑通过CRISPR/Cas9技术进行。
15.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述疾病是先天性中性粒细胞减少症，优选重度先天性中性粒细胞减少症(CN/SCN)和/或周期性中性粒细胞减少症(CyN)。
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