CN117794588A - 可选择性渗透的环带纤维及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明的方面包括用于产生可选择性渗透的载有细胞的实心芯纤维结构和用于产生用于数字文件的三维(3D)生物结构的系统和方法。在实施方案中，所述打印纤维包含包埋在至少一个环带层中的活细胞，或者所述打印纤维包含至少一种生物材料的实心芯。所述组织纤维可作为合成组织结构用于组织工程中。

Description

可选择性渗透的环带纤维及其使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年5月24日提交的美国临时申请号63/192,552的优先权权益。

技术领域

本发明涉及用于产生可选择性渗透和免疫保护的实心芯纤维结构的系统和方法，并且涉及根据数字文件对此类结构的三维(3D)打印。在一些实施方案中，打印纤维包括活细胞。

背景技术

组织工程领域长期以来一直在寻求使用多种材料和方法来制造能够模仿和/或替代活器官和活组织的可存活合成结构。特别是已经反复探索了细胞包封作为直接组织移植和随后终生免疫抑制的潜在替代方案，但仍存在许多挑战。该方法的本质是在治疗性细胞群(例如，胰岛细胞)周围放置半透膜，该半透膜可有效地排除免疫细胞、抗体和补体成分，同时确保小分子(例如，葡萄糖、氧)和期望的生物活性剂(例如，分泌肽/蛋白质)的充分扩散。De Vos等人,Adv Drug Deliv Rev.2014；67–68:15–34。然而，重要的是，虽然葡萄糖和氧以大致相同的摩尔速率消耗，但后者在生理学上的丰度低约100倍。Colton,Adv DrugDeliv Rev.2014；67–68:93–110。因此，氧的充分通过一直是细胞包封装置的有效临床设计中的主要限制因素之一。

已经探索了多种装置几何形状，包括在球体中的微包封和在平面扩散室中的宏观包封。虽然水凝胶珠中的微包封提供了用于氧输送的更高的表面积与体积比，但已报道植入后珠的沉降和堆积导致氧剥夺。Vaithilingam等人Rev Diabet Stud.2017；14(1):51–78。相反，尽管平面扩散室在小动物研究中显示出一些前景，但由于其固有的低传质表面积而在扩大到人患者的规模方面也受到相当大的挑战。Calafiore和Basta,Adv Drug DelivRev.(2014)；67-68:84-92。所有这些方法的一般限制是缺乏对细胞在包封装置的含细胞部分内的布置及其对氧供应的影响的控制。因此，尽管全世界进行了数十年的研究，但细胞包封的有效临床应用仍难以捉摸(Orive等人,Trends Pharmacol Sci.(2015)；36:537-546)。

此外，植入体内会触发先天和适应性免疫系统两者针对装置的协同生物反应，目的是对其进行消除。针对太大而不能被吞噬的感知病原体的细胞反应部分地由巨噬细胞介导，这些巨噬细胞过表达ECM蛋白，诸如纤连蛋白，并且还产生促纤维生成因子，该促纤维生成因子增强成纤维细胞的纤维生成，从而导致在装置周围形成纤维化囊。这种纤维囊可干扰装置功能，特别是当它们含有需要接近营养物和氧气流以便执行其预期功能的治疗性细胞群时。尽管增加植入装置的直径可帮助减少这种异物反应(FBR)和随后的纤维化发展，参见例如Watanabe等人,Biomaterials(2020),doi.org/10.1016/j.biomaterials.2020.120162，但尺寸的必要增加也可导致装置中细胞的缺氧和凋亡。

因此，仍然需要对设计和材料两者进行改进，以适应免疫保护和营养物通过的相对目的，并帮助减轻FBR反应，并使得用于合成结构制造的纤维-纤维沉积一致。因此，需要这样的合成组织结构，其有效地平衡降低或避免免疫系统识别和/或破坏这些合成组织结构的能力与确保氧和营养物充分通过合成结构的细胞而不损害其分泌能力的能力。

本文列出的所有现有技术参考文献均以引用方式全文并入。

发明内容

本发明用一种可选择性渗透的生物打印纤维成功地解决了本领域的上述多个相互矛盾的目的，该可选择性渗透的生物打印纤维包括实心芯和围绕该实心芯的一个或多个壳层，其中生物材料，例如产生和分泌所关注的生物活性剂的活细胞，被径向置换到该实心芯的外部。在实施方案中，该纤维包括打印在实心芯与至少一个外壳层之间的至少一个环带层，其中这些细胞包埋在该至少一个环带层内，并且优选地其中这些细胞均匀地分散在整个该至少一个环带层中。在一些实施方案中，细胞沿生物打印纤维的长度被分段/分隔，和/或该至少一个外壳层是免疫保护的和/或促血管生成的。如本文所证明的，与常规芯-壳纤维相比，在实心芯外部的至少一个环带层中径向置换包埋的细胞群改善了细胞生存力和功能两者，增加了分泌能力，并且能够实现更高的细胞负荷。

根据一个方面，提供了一种生物打印的可选择性渗透纤维，其包括：实心芯；围绕所述实心芯的至少一个环带层，该至少一个环带层包含包埋在生物相容性材料内的至少一种生物材料；和围绕所述至少一个环带层的至少一个外壳层。在实施方案中，该至少一个外壳层包含交联的水凝胶材料。在实施方案中，该至少一种生物材料均匀地分散在整个该至少一个环带层中。在实施方案中，生物材料沿纤维的长度被分段/分隔。在实施方案中，生物打印的可选择性渗透纤维的至少一个外壳层是免疫保护的和/或促血管生成的。

优选地，生物材料包括产生/分泌所关注的生物活性剂(例如，治疗性蛋白质或核酸)的细胞群和/或细胞来源的胞外囊泡群，或胞外囊泡。在一些实例中，该细胞群包含：来自选自由胰腺、肝脏、甲状腺、甲状旁腺、松果体腺、垂体腺、胸腺、肾上腺、卵巢、睾丸组成的组的内分泌腺和外分泌腺的细胞，肠内分泌细胞，干细胞，干细胞来源的细胞，或工程化以分泌所关注的生物活性剂的细胞。在一些实例中，细胞群释放含有治疗性蛋白质或核酸的外来体形式的细胞来源的胞外囊泡。在一些实例中，生物相容性材料选自藻酸盐、官能化藻酸盐、胶原蛋白-1、基底膜蛋白、胶原蛋白-4、胶原蛋白-2、纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白、脱细胞化的胞外基质、透明质酸、聚乙二醇(PEG)、聚(乙二醇)二丙烯酸酯(PEGDA)和其他官能化PEG、纤维蛋白、明胶、甲基丙烯酰明胶(GEL-MA)、丝、壳聚糖、纤维素、聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)(POEGMA)、自组装肽水凝胶、以及它们的组合。在实施方案中，官能化藻酸盐可包括甲基丙烯酸酯化藻酸盐、呋喃藻酸盐、硫醇藻酸盐、马来酰亚胺藻酸盐、四嗪藻酸盐、降冰片烯藻酸盐、酰肼藻酸盐、RGD-藻酸盐(精氨酸-胍-天冬氨酸盐)、YIGSR-藻酸盐(Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg)和共价点击藻酸盐(例如，与2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]二甲基-(3-磺丙基)氢氧化铵(DMAPS)-Ald和/或DMAPS-Hzd共混的藻酸盐)中的一种或多种。

在一些实施方案中，生物打印的可选择性渗透纤维是增强的。例如，实心芯可为总体纤维(例如，本公开的芯-壳或环带纤维)提供增强。作为代表性实例，增强纤维可由芯材料组成，该芯材料被选择为具有比环带层和/或一个或多个外壳层更高的拉伸强度和/或模量。在一些实施方案中，所述实心芯包含不可生物降解的材料。在一些实例中，实心芯包含聚合物材料，该聚合物材料选自包括以下或由以下组成的组：PEGDA和其他官能化PEG、POEGMA、聚乙烯醇(PVA)丙烯酰胺、GEL-MA或官能化藻酸盐(例如能够共价交联的官能化藻酸盐)。官能化藻酸盐可包括甲基丙烯酸酯化藻酸盐、呋喃藻酸盐、硫醇藻酸盐、马来酰亚胺藻酸盐、四嗪藻酸盐、降冰片烯藻酸盐、酰肼藻酸盐和共价点击藻酸盐(例如，与DMAPS-Ald和/或DMAPS-Hzd共混的藻酸盐)中的一种或多种。

在一些实施方案中，生物打印的可选择性渗透纤维的至少一个外壳层是免疫保护的。在一些实例中，外壳层包含免疫保护水凝胶材料，该免疫保护水凝胶材料选自藻酸盐、壳聚糖、GEL-MA、PEG、PEGDA和其他官能化PEG(多臂PEG丙烯酸酯诸如4-臂PEG-四丙烯酸酯(PEGTA)和PEFOA，以及其他基于PEG的材料)、POEGMA、聚-L-赖氨酸(PLL)、甲基丙烯酸酯化透明质酸(HA)、硫醇化透明质酸、三唑、以及它们的组合。在一些实例中，免疫保护水凝胶材料包含官能化藻酸盐。官能化藻酸盐可包括甲基丙烯酸酯化藻酸盐、呋喃藻酸盐、硫醇藻酸盐、马来酰亚胺藻酸盐、酰肼藻酸盐、四嗪藻酸盐、降冰片烯藻酸盐和共价点击藻酸盐(例如，与DMAPS-Ald和/或DMAPS-Hzd共混的藻酸盐)中的一种或多种。在一些实例中，免疫保护水凝胶材料包含或进一步包含丙烯酸酯化两性离子单体磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯(SBMA)和/或PEGDA。在一些实例中，免疫保护水凝胶材料包含或进一步包含用官能化藻酸盐或PEG(例如藻酸盐-马来酰亚胺或PEG-马来酰亚胺)官能化的透明质酸(例如硫醇化HA)。

在一些实施方案中，生物打印的可选择性渗透纤维的至少一个外壳层是促血管生成的。在一些实施方案中，该至少一个促血管生成层位于包含免疫保护材料的至少一个外壳层的外部。在一些实施方案中，除了一种或多种免疫保护材料外，该至少一个外壳层可由一种或多种促血管生成材料组成。在一些实施方案中，本公开的纤维可包括由促血管生成材料组成的至少一个外壳层，但可缺乏免疫保护外壳层。促血管生成材料可包括可生物降解材料，包括但不限于纤维蛋白、胶原蛋白、明胶、GEL-MA、脱细胞化的胞外基质(dECM)、聚甲基丙烯酸、RGD-藻酸盐、YIGSR-藻酸盐、透明质酸等。

在一些实施方案中，生物打印的可选择性渗透纤维的直径在约2.0mm至0.25mm之间，更优选地在约0.7mm与约1.7mm之间，更优选地在约1.5mm至0.45mm之间，并且最优选地在约1.1mm至0.7mm之间。

在一些实施方案中，生物打印的可选择性渗透纤维的实心芯的直径在约1.92mm至0.05mm之间，更优选地在约1.1mm至0.41mm之间，或在约0.030mm与约1.0mm之间，并且最优选地在约0.5mm至0.1mm之间，例如约0.3mm。

在一些实施方案中，生物打印的可选择性渗透纤维的外壳层的厚度在约0.01mm至0.3mm之间，或在约0.015mm与约0.5mm之间，更优选地在约0.025mm至0.2mm之间，或在约0.05mm至0.125mm之间。在实施方案中，厚度为约0.150mm。

在一些实施方案中，生物打印的可选择性渗透纤维的环带层的厚度在约0.01mm至0.4mm之间，更优选地在约0.025mm至0.3mm之间，更优选地在约0.1mm至约0.3mm之间，并且最优选地在约0.05mm至0.2mm之间。在实施方案中，厚度为约0.2mm。

在另一方面，提供了用于生物打印可选择性渗透的环带纤维的方法，该方法包括经由同轴微流体装置或多壳打印头通过芯通道分配芯材料，通过第一壳通道分配第一环带层材料和任选的第二环带层材料，以及通过第二壳通道分配可交联材料，其中优选地在生物相容性材料中，该第一环带层材料或第二环带层材料中的一者包含生物材料，任选地其中该环带层材料被交替地分配以沿纤维的长度产生生物材料的区段/隔室。在一些实施方案中，第一环带层材料和第二环带层材料包含相同的生物相容性材料。

根据另一方面，提供了一种生物打印的可选择性渗透组织纤维，其包括实心芯和围绕所述实心芯的至少一个外壳层，该实心芯包含沿纤维的长度在生物相容性材料中被分段/分隔的至少一种生物材料，该至少一个外壳层包含交联水凝胶材料。优选地，该生物材料包括产生/分泌所关注的生物活性剂例如治疗性蛋白质或核酸的细胞群，或包含它们的细胞囊泡。在一些实例中，该细胞群包含：来自选自由胰腺、肝脏、甲状腺、甲状旁腺、松果体腺、垂体腺、胸腺、肾上腺、卵巢、睾丸组成的组的内分泌腺和外分泌腺的细胞，肠内分泌细胞，干细胞，干细胞来源的细胞，或工程化以分泌所关注的生物活性剂的细胞。在一些实例中，细胞群释放含有治疗性蛋白质或核酸的外来体形式的细胞来源的胞外囊泡。在一些实例中，生物相容性材料选自藻酸盐、官能化藻酸盐、胶原蛋白-1、基底膜蛋白、胶原蛋白-4、胶原蛋白-2、纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白、脱细胞化的胞外基质、透明质酸、PEG、PEGDA和其他官能化PEG、纤维蛋白、明胶、GEL-MA、丝、壳聚糖、纤维素、POEGMA、自组装肽水凝胶、以及它们的组合。在实施方案中，官能化藻酸盐可包括甲基丙烯酸酯化藻酸盐、呋喃藻酸盐、硫醇藻酸盐、马来酰亚胺藻酸盐、四嗪藻酸盐、降冰片烯藻酸盐、酰肼藻酸盐、RGD-藻酸盐(精氨酸-胍-天冬氨酸盐)、YIGSR-藻酸盐(Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg)和共价点击藻酸盐(例如，与DMAPS-Ald和/或DMAPS-Hzd共混的藻酸盐)中的一种或多种。

在一些实施方案中，实心芯还包含用于从内向外交联外壳层的交联剂。例如，实心芯可包含能够交联外壳材料的交联剂，而对应于实心芯的材料可通过不同的机制交联。作为代表性实例，实心芯可包括PEGDA+钙+光引发剂，而外壳可包含藻酸盐。芯中的钙离子可从内向外交联基于藻酸盐的外壳。对纤维的照射可引起光引发剂的活化，并且因此引起芯的交联。

在一些实施方案中，生物打印的可选择性渗透纤维的外壳层是免疫保护的和/或促血管生成的。在一些实例中，生物打印的可选择性渗透纤维具有由免疫保护材料组成的免疫保护壳，该免疫保护壳继而被由促血管生成材料组成的促血管生成壳围绕。在一些实例中，免疫保护材料选自藻酸盐、壳聚糖、GEL-MA、PEG、PEGDA和其他官能化PEG(多臂PEG丙烯酸酯诸如PEGTA和PEFOA，以及其他基于PEG的材料)、POEGMA、PLL、三唑、以及它们的组合。在一些实例中，免疫保护水凝胶材料包含官能化藻酸盐。官能化藻酸盐可包括甲基丙烯酸酯化藻酸盐、呋喃藻酸盐、四嗪藻酸盐、降冰片烯藻酸盐、硫醇藻酸盐、马来酰亚胺藻酸盐、酰肼藻酸盐和共价点击藻酸盐(例如，与DMAPS-Ald和/或DMAPS-Hzd共混的藻酸盐)中的一种或多种。在一些实例中，免疫保护水凝胶材料包含或进一步包含丙烯酸酯化两性离子单体(SBMA)和/或PEGDA。在一些实例中，免疫保护水凝胶材料包含或进一步包含用官能化藻酸盐或PEG(例如藻酸盐-马来酰亚胺或PEG-马来酰亚胺)官能化的透明质酸(例如硫醇化HA)。在一些实例中，促血管生成材料选自纤维蛋白、胶原蛋白、明胶、GEL-MA、脱细胞化的胞外基质(dECM)、聚甲基丙烯酸、RGD-藻酸盐、YIGSR-藻酸盐、透明质酸等。

在一些实施方案中，生物打印的可选择性渗透纤维的直径在约2.0mm至0.2mm之间，更优选地在约1.5mm至0.5mm之间，并且最优选地在约1.1mm至0.8mm之间。

在一些实施方案中，生物打印的可选择性渗透纤维的实心芯的直径在约1.98mm至0.18mm之间，更优选地在约1.48mm至0.48mm之间，并且最优选地在约0.9mm至0.50mm之间。

在一些实施方案中，生物打印的可选择性渗透纤维的外壳层的厚度在约0.01mm至0.3mm之间，更优选地在约0.025mm至0.2mm之间，并且最优选地在约0.05mm至0.15mm之间。

在另一方面，提供了用于生物打印可选择性渗透纤维的方法，该可选择性渗透纤维包括实心芯，该实心芯包含沿纤维的长度被分段/分隔的至少一种生物材料。在一个实施方案中，该方法包括通过同轴微流体装置或多壳打印头的芯通道不连续地分配包含生物材料的生物相容性材料，同时通过至少一个壳通道连续地分配免疫保护可交联材料，其中该壳材料填充在芯的区段之间的纤维中。在另一个实施方案中，该方法包括在通过同轴微流体装置或多壳打印头的芯通道分配第一芯材料和第二芯材料之间交替，同时通过至少一个壳通道连续分配免疫保护可交联材料，其中优选地在生物相容性材料中，该第一芯材料或该第二芯材料中的一者包含生物材料，使得交替的芯材料沿纤维的长度产生生物材料的区段/隔室。在一些实施方案中，第一芯材料和第二芯材料包含相同的生物相容性材料。在实施方案中，生物打印的可选择性渗透纤维的该至少一个外壳层是免疫保护的和/或促血管生成的。

在一些实施方案中，生物材料包括产生/分泌所关注的生物活性剂(例如，治疗性蛋白质/肽、核酸)的细胞群，或胞外囊泡。在一些实例中，该细胞群包含：来自选自由胰腺、肝脏、甲状腺、甲状旁腺、松果体腺、垂体腺、胸腺、肾上腺、卵巢、睾丸组成的组的内分泌腺和外分泌腺的细胞，肠内分泌细胞，干细胞，干细胞来源的细胞，或工程化以分泌所关注的生物活性剂的细胞。在一些实例中，细胞群释放含有治疗性蛋白质或核酸的外来体形式的细胞来源的胞外囊泡。在一些实例中，生物相容性材料选自藻酸盐、胶原蛋白-1、基底膜蛋白、胶原蛋白-4、胶原蛋白-2、纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白、脱细胞化的胞外基质、透明质酸、PEG、PEGDA和其他官能化PEG、纤维蛋白、明胶、GEL-MA、丝、壳聚糖、纤维素、POEGMA、自组装肽水凝胶和/或官能化藻酸盐。官能化藻酸盐的实例包括但不限于甲基丙烯酸酯化藻酸盐、呋喃藻酸盐、硫醇藻酸盐、马来酰亚胺藻酸盐、四嗪藻酸盐、降冰片烯藻酸盐、酰肼藻酸盐、RGD-藻酸盐、YIGSR-藻酸盐和共价点击藻酸盐(例如，与DMAPS-Ald和/或DMAPS-Hzd共混的藻酸盐)。

在一些实施方案中，生物打印的可选择性渗透纤维的至少一个外壳层是免疫保护的和/或促血管生成的。在一些实施方案中，包含免疫保护材料的外壳层继而被包含促血管生成材料的外壳层围绕。在一些实例中，免疫保护材料选自藻酸盐、壳聚糖、GEL-MA、PEG、PEGDA和其他官能化PEG(多臂PEG丙烯酸酯诸如PEGTA和PEFOA，以及其他基于PEG的材料)、POEGMA、PLL、三唑、以及它们的组合。在一些实例中，免疫保护水凝胶材料包含官能化藻酸盐。官能化藻酸盐可包括甲基丙烯酸酯化藻酸盐、呋喃藻酸盐、四嗪藻酸盐、降冰片烯藻酸盐、硫醇藻酸盐、马来酰亚胺藻酸盐、酰肼藻酸盐和共价点击藻酸盐(例如，与DMAPS-Ald和/或DMAPS-Hzd共混的藻酸盐)中的一种或多种。在一些实例中，免疫保护水凝胶材料包含或进一步包含丙烯酸酯化两性离子单体(SBMA)和/或PEGDA。在一些实例中，免疫保护水凝胶材料包含或进一步包含用官能化藻酸盐或PEG(例如藻酸盐-马来酰亚胺或PEG-马来酰亚胺)官能化的透明质酸(例如硫醇化HA)。在一些实例中，促血管生成材料选自纤维蛋白、胶原蛋白、明胶、GEL-MA、脱细胞化的胞外基质(dECM)、聚甲基丙烯酸、RGD-藻酸盐、YIGSR-藻酸盐、透明质酸等。

在一些实施方案中，该方法还包括与生物相容性材料同时通过芯通道分配一种或多种交联剂，以便从内向外交联可选择性渗透纤维。在一些实施方案中，用于产生可选择性渗透组织纤维的方法还包括通过鞘通道分配包含一种或多种交联材料的一种或多种鞘液，以便从外向内交联可选择性渗透纤维。

在一些实施方案中，可选择性渗透组织纤维的直径在约2.0mm至0.2mm之间，更优选地在约1.5mm至0.5mm之间，并且最优选地在约1.1mm至0.8mm之间。

在一些实施方案中，所述实心芯的直径在约1.98mm至0.18mm之间，更优选地在约1.48mm至0.48mm之间，并且最优选地在约0.9mm至0.5mm之间。

在一些实施方案中，所述免疫保护外壳层的厚度在约0.01mm至0.3mm之间，更优选地在约0.025mm至0.2mm之间，并且最优选地在约0.05mm-0.15mm之间。

在另一方面，提供了用于产生/分泌所关注的生物剂的方法，该方法包括在体外或体内(包括在有需要的患者体内)培养上述生物打印的可选择性渗透纤维中的一种或多种，其中该可选择性渗透纤维包含能够产生/分泌所关注的生物活性剂的生物材料，该生物材料沿生物打印纤维的长度被分段/分隔，和/或其中所述纤维的外壳层是免疫保护的。

附图说明

图1描绘了藻酸盐的甲基丙烯酸酯化的反应方案。

图2描绘了两性离子单体(例如，磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯(SBMA))和聚(乙二醇)二丙烯酸酯(PEGDA)的化学结构，并且说明SBMA与PEGDA的光交联产生具有两性离子侧基的交联水凝胶的网络。

图3描绘了根据实施方案的导致纤维-纤维粘附的示例性纤维构架和交联策略。

图4描绘了根据实施方案的可经由点击化学交联水凝胶材料的两性离子聚合物的化学结构。

图5A-图5F描绘了所公开的分析氧输送模型的纤维几何形状。所示的是芯-壳(图5A)和芯-环带-壳(图5D)纤维的代表性实例。将在有限的纤维体积中含有大量不同大小的细胞(即胰岛)的这些藻酸盐纤维的几何形状简化为其中胰岛体积以平均细胞体积分数ε(图5C、图5F)均匀分布(图5B、图5E)的细胞区域。

图6A-图6D描绘了所公开的氧输送模型的纤维横截面。所示的是在不存在(图6A、图6B)和存在(图6C、图6D)氧限制的情况下示出的芯-壳(图6A、图6C)和芯-环带-壳纤维(图6B、图6D)的示意性横截面。包封剂材料以绿色示出；氧合和缺氧细胞层分别以红色和灰色示出。由R₁、R₂和R₃表示的纤维尺寸对应于纤维、细胞区域和无细胞芯的半径。纤维周围的氧分压和细胞死亡时的氧分压由R_E和P_D指示。在存在氧限制的情况下，迭代计算缺氧细胞层(r_A)的径向边界。

图7A-图7D描绘了所公开的胰岛素分泌速率模型的纤维横截面。所示的是在不存在(图7A、图7B)和存在(图7C、图7D)氧限制的情况下示出的芯-壳(图7A、图7C)和芯-环带-壳纤维(图7B、图7D)的横截面。包封剂材料以绿色示出；具有最大和次最大胰岛素分泌率的细胞层分别以红色和橙色示出；缺氧细胞层以灰色示出。由R₁、R₂和R₃表示的纤维尺寸对应于纤维、细胞区域和无细胞芯的半径。纤维周围的氧分压、最大胰岛素分泌速率所需的氧分压和细胞死亡时的氧分压由P_E、P_I和P_D指示。在适用的情况下，迭代计算具有次最大胰岛素分泌速率的细胞层(r_I)和缺氧细胞层(r_A)的径向边界。

图8A-图8F描绘了完全氧合和最大胰岛素分泌速率情况的纤维横截面。所示的是芯-壳(图8A、图8C、图8E)和芯-环带-壳纤维(图8B、图8D、图8F)的横截面，其中调整细胞体积分数ε以获得具有最大胰岛素分泌速率(图8A、图8B)或完全氧合(图8C、图8D)的细胞区域。增加细胞体积分数导致超过完全氧合的细胞区域的最大ε，导致缺氧细胞层的形成(图8E、图8F)。包封剂材料以绿色示出；具有最大和次最大胰岛素分泌率的细胞层分别以红色和橙色示出；缺氧细胞层以灰色示出。由R₁、R₂和R₃表示的纤维尺寸对应于纤维、细胞区域和无细胞芯的半径。纤维周围的氧分压、最大胰岛素分泌速率所需的氧分压和细胞死亡时的氧分压由P_E、P_I和P_D指示。在适用的情况下，迭代计算具有次最大胰岛素分泌速率的细胞层(r_I)和缺氧细胞层(r_A)的径向边界。

图9A-图9E描绘了暴露于40mm Hg的具有150μm免疫保护壳的1mm纤维的理论氧合。求解方程7至9(参考下面的实施例1)，以计算具有不同水平的细胞体积分数ε的芯-壳(图9A、图9C、图9E)和芯-环带-壳(图9B、图9D)纤维的氧分布。具有芯-壳几何形状的纤维具有350-μm半径细胞区域芯；芯-环带壳纤维具有150-μm的无细胞芯，被厚度为200μm的细胞区域围绕。在这些图中，橙色虚线表示具有次最大胰岛素分泌速率的细胞层的存在。

图10A-图10C描绘了暴露于40mm Hg的具有150μm免疫保护壳的1mm纤维的理论胰岛素分泌速率。纤维中的每一者的细胞负荷(图10A)。相同纤维(图10B)以及具有经调整以获得最大胰岛素分泌速率的各种细胞区域厚度和细胞体积分数ε的芯-环带-壳纤维(图10C)的分泌能力。在方程11-16(参考下面的实施例1)中使用氧分布来估计纤维横截面中的胰岛素分泌速率。

图11描绘了用于将来自灵敏度分析的结果转换为纤维横截面的关键，并且与结合图12A-图13D的使用相关。

图12A-图12E说明了在氧输送和胰岛素分泌速率模型中使用的参数的灵敏度分析。对于细胞体积分数ε＝22.4％(所有图中的虚线)的1mm芯-环带-壳纤维，当改变从文献中检索的模型参数值时获得导致细胞层径向边界的氧分布并示于表2中。包封剂材料以绿色示出；具有最大和次最大胰岛素分泌率的细胞层分别以红色和橙色示出；缺氧细胞层以灰色示出。植入物表面处的氧分压P_E(图12A)、最大胰岛素分泌速率所需的氧分压P_I(图12B)和细胞死亡时的氧分压P_D(图12C)、细胞的最大氧消耗速率V_max(图12D)、细胞中氧的扩散系数(αD)_细胞(图12E)和藻酸盐水凝胶中氧的扩散系数((αD)₁和(αD)_c,2的平均值)(图12F)的值的增加/减少的影响。

图13A-图13D说明了纤维参数的灵敏度分析。对于细胞体积分数ε＝22.4％(所有图中的虚线)的1-mm芯-环带-壳纤维，当改变纤维参数时，获得氧分布和所得细胞层径向边界。包封剂材料以绿色示出；具有最大和次最大胰岛素分泌率的细胞层分别以红色和橙色示出；缺氧细胞层以灰色示出。在R₂恒定下增加/减少细胞体积分数ε(图13A)、壳厚度的影响。(图13B)，在环带面积恒定(图13C)和环带厚度R₂-R₃恒定(图13D)下的无细胞芯半径R₃。

图14A-图14B说明了在本公开的分析模型中使用的实心芯单壳纤维的实际图像和简化的几何形状。

图15A-图15B说明了本公开的环带纤维的简化几何形状的不同视图。

图16是具有关于在本公开的环带纤维的一些模型中使用的模型参数的各种假设的表。

图17A说明了来自由球形和圆柱形几何形状组成的装置的氧分布模型的示例性输出。

图17B说明了用于获得图17A所示输出的装置尺寸。

图18A说明了来自本公开的环带装置的氧分布模型的示例性输出，其与来自由球形和圆柱形几何形状组成的装置的输出(图17A)重叠。

图18B说明了用于从如图18A所示的环带装置的氧分布模型获得输出的装置尺寸。

图19A说明了本公开的两个其他环带装置的氧分布模型的示例性输出。

图19B说明了用于从如图19A所示的环带装置的氧分布模型获得输出的装置尺寸。

图20A-图20I说明了各种环带装置的随径向距离变化的模型化氧分压(图20A、图20D、图20G)，以及各种环带装置的随径向距离变化的模型化局部胰岛素分泌(最大值％)(图20B、图20E、图20H)。图20C、图20F和图20I说明了各种装置的参数。

图21A-图21C示出了对于具有如图21C所示参数的各种装置，基于图21B的一般纤维结构，随环带芯界面处外壳厚度变化的模型化氧分压(图21A)。

图22A-图22C说明了本公开的O₂传递和胰岛素分泌速率模型的情况。所描绘的是最大胰岛素分泌速率(图22A)、完全氧合芯(图22B)和内部缺氧区域(图22C)的示意图。

图23A-图23B是说明从关于图22A-图22C讨论的分析模型导出的芯-壳纤维中的氧合和胰岛素分泌速率的图。所示的是体积细胞分数(图23A)和壳厚度(图23B)对完全氧合层(黑色)和具有最大胰岛素分泌速率的层(红色)的横截面积的影响。图23B中的虚线说明了FITC-葡聚糖纤维。

图24A-图24F说明了对应于FITC-葡聚糖从芯-壳纤维中释放的数据。图24A说明了从四种类型纤维(n＝3)的上清液中回收的FITC-葡聚糖。图24B-图24E描绘了4kDa(图24B)、70kDa(图24C)、100kDa(图24D)和250kDa(图24E)的实际释放曲线。图24F是示出随分子大小变化的总葡聚糖的90％释放的时间的图。

图25A-图25B是示出关于图22A-图23B讨论的模型参数的单次单因子灵敏度分析的图。所示的是氧合层上的胰岛氧消耗速率值(图25A)和藻酸盐水凝胶中氧的有效扩散率值(图25B)的不确定性的效果。

图26A是示出在具有不同比例的两性离子藻酸盐与SLG100的C/S纤维中打印的Min6簇在打印后约一个月的拉伸强度以及机械强度降低百分比的图。

图26B-图26E是用于获得图26A所示数据的纤维的明场图像。

图27A-图27D表示对于在芯中含有1.5％SLG和不同壳材料特别是SLG 100藻酸盐(图27A)、纯两性离子藻酸盐(UBC)(图27B)、纯两性离子藻酸盐(内部)(图27C)和DMAPS-Ald/酰肼DMAPS-Hzd(图27D)的芯壳(C/S纤维)在24小时时原代人胰岛(PHI)的活/死图像。

图27E-图27H表示在打印后7天图27A-图27D的相同纤维的PHI的活/死图像。具体地，壳材料包括SLG100(图27E)、纯两性离子藻酸盐(UBC)(图27F)、纯两性离子藻酸盐(内部)(图27G)和DMAPS-Ald/酰肼DMAPS-Hzd(图27H)。

图28A-图28C说明了片上交联的由特定组合物(图28A)组成的纤维的F-F粘附的评估。图28B说明了所测试的图案化结构的图像，并且图28C说明了图28B的图案化结构的纤维的高分辨率图像。

图28D-图28F说明了打印后交联的由特定组合物(图28D)组成的纤维的F-F粘附的评估。图28E说明了所测试的图案化结构的图像，并且图28F说明了图28E的图案化结构的纤维的高分辨率图像。

图28G-图28I描绘了如本文所公开的从内向外(I-O)交联方法的图示(图28G)，以及经由从外向内(O-I)交联方法交联的纤维(图28H)与经由I-O交联方法交联的纤维(图28I)的比较。

图29描绘了示出来自小鼠的基础c-肽血浆水平的图，其中将实心芯单壳纤维(C/S)植入健康C57BL/6小鼠。

图30是示出将包含PHI细胞的由不同比例的两性离子藻酸盐组成的C/S纤维植入糖尿病免疫活性小鼠后血糖水平随天数变化的图(图30)。

图31A-图31B是示出在免疫活性糖尿病C57BL/6小鼠中植入生物打印的C/S人胰岛纤维后在腹膜内葡萄糖耐量测试后，血糖水平随时间变化的图。

图32A-图32B是示出来自植入有生物打印的C/S人胰岛纤维的三只代表性免疫活性糖尿病C57BL/6小鼠的数据的图，这些数据与葡萄糖注射后的C-肽水平有关。

图33A-图33C是从三只代表性免疫活性糖尿病C57BL/6小鼠中取回的生物打印的C/S人胰岛纤维的活/死染色图像。

图34A-图34B描绘了免疫缺陷型糖尿病小鼠中葡萄糖水平随C/S人胰岛纤维植入后天数变化的图。

图35A-图35D描绘了示出在将生物打印的C/S人胰岛纤维植入免疫缺陷型糖尿病小鼠后36天和39天(图35A-图35B)、以及植入后82天和85天(图35C-图35D)开始的葡萄糖耐量测试后，葡萄糖水平随时间变化的图。

图36A-图36B是示出从植入了C/S人胰岛纤维的免疫缺陷型糖尿病小鼠中获得的植入前、植入后72天和植入后90天(OGTT后)的c-肽测量结果的图。

图37描绘了对在植入后72天和88天从免疫缺陷型糖尿病小鼠取回的纤维装置进行的活/死染色。

图38描绘了具有含有原代人胰岛细胞聚集体的环带层的打印环带纤维。

图39A-图39B描绘了具有含有原代人肝细胞(PHH)的环带层的环带纤维的图像。图39B包括用于划分各层的参考圆圈。

图40A-图40D描绘了示出与本公开的芯壳纤维相比的环带纤维的生存力和功能性的数据。图40A示出了芯壳和环带纤维在打印后不同时间点的活/死染色图像。图40B是示出芯壳纤维相对于环带纤维在不同时间点的阿尔玛蓝(alamar blue)荧光强度的图。图40C是示出芯壳纤维相对于环带纤维的白蛋白产生(ng/百万个细胞/天)的图。图40D是示出芯壳纤维相对于环带纤维的尿素产生(μg/百万个细胞/天)的图。

图41A-图41C描绘了关于本公开的纤维的区段的材料转换的实例。图41A是本公开的一个实施方案中的芯-壳纤维的图示，图41B描绘了具有两种不同壳材料的纤维，并且图41C描绘了具有两种不同芯材料的纤维。

具体实施方式

细胞包封可潜在地减少或消除对与常规细胞替代疗法相关的终生免疫抑制的需要。由于包封的细胞经由被动扩散氧合，并且通常植入具有相对低氧浓度的部位，因此确保足够的氧扩散以维持细胞生存力和功能是关键的。在本发明中，提供了多层载有细胞的纤维，其中含细胞层被限制在两个无细胞层之间，即从实心芯径向置换到环带层中。基于与常规的芯-壳纤维相比的氧传递建模提供优选的几何形状，并且灵敏度分析说明了模型参数和纤维尺寸的变化对包封细胞的氧分布及其分泌速率的影响。值得注意的是，如本文进一步证明的，本发明还能够增加细胞负载能力，而不损害包封细胞的分泌能力和/或触发包封细胞的缺氧条件。

本发明的方面包括包含生物打印的和可选择性渗透的纤维的组合物，所述纤维具有实心(即非中空)的芯和围绕该芯的一个或多个壳层，其中该纤维包含至少一种能够产生和/或分泌所关注的生物活性剂的生物材料，例如包埋在所述实心芯与外壳层之间的环带层中的治疗性蛋白质或核酸。在一些实施方案中，生物材料沿纤维的长度被分段/分隔。在一些实施方案中，纤维的最外壳可以是免疫保护的和/或促血管生成的。在一些实施方案中，至少一个免疫保护层围绕环带层，并且至少一个促血管生成层围绕所述至少一个免疫保护层。

在一些实施方案中，生物打印纤维的芯可包含至少一种生物材料，并且芯可被单个壳层围绕。在此类实例中，单个壳层可包含免疫保护水凝胶材料和/或促血管生成材料。在一些实施方案中，芯可包含至少一种生物材料，并且芯可被免疫保护水凝胶层围绕，该免疫保护水凝胶层继而被促血管生成层围绕。

在一些实施方案中，生物打印纤维的芯可不含生物材料，并且芯可被多个壳层围绕。在此类实例中，包括细胞层(即，环带层)的内层可夹在例如芯与至少一个外壳层之间。在此类实例中，该至少一个外壳层可包含免疫保护水凝胶材料和/或促血管生成材料。在一些实施方案中，环带层可以被免疫保护层围绕，免疫保护层继而被促血管生成层围绕。任选地，在一些实施方案中，芯可包含拉伸强度和/或模量比用于增强的周围层高的非材料。

在本文所述的附加实施方案中，生物相容性材料可沿纤维的长度被分段/分隔，以便在纤维(例如，被免疫效应细胞)破损或其他破裂的情况下减少总细胞损失。在一些实施方案中，生物打印纤维的芯包含至少一种能够产生所关注的生物活性剂的生物材料。在一些实施方案中，芯不含生物材料，并且纤维进一步包括围绕该芯的至少一个内环带层，该至少一个内环带层包含能够产生所关注的生物活性剂的该至少一种生物材料。例如，在芯包含生物材料的情况下，芯可包含沿纤维的长度被分段/分隔的至少一种生物材料。在实例中，芯可以是连续的，但生物材料可以是分段的/分隔的。在包括环带层的实施方案中，环带层可以是连续的，但其中的生物材料可以是分段的/分隔的。

定义：

出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在任何适当的时候，以单数形式使用的术语也将包括复数形式且反之亦然。在所阐述的任何定义与以引用方式并入本文的任何文件相矛盾时，应以下文示出的定义为准。

如本文所用，当提及“细胞”、“细胞系”、“细胞培养物”或“细胞群”或“细胞的群体”时，术语“分离的”是指与细胞来源基本上分离，使得活细胞、细胞系、细胞培养物、细胞群或细胞的群体能够在体外培养延长的时间段。此外，术语“分离”可用于指从一组两个或更多个细胞中物理选择一个或多个细胞，其中基于细胞形态和/或各种标志物的表达来选择细胞。

如本文所用，术语“置换”是指第一材料或流体从给定位置移除第二材料或流体的能力。例如，在一些实施方案中，缓冲溶液被配置为从分配通道内的位置(例如，从分配通道的近侧端部)置换输入材料。在一些实施方案中，置换是瞬时置换，所述瞬时置换在小于约一秒内，例如在约900、800、700、600、500、400、300、200或100毫秒或更短时间内发生。

如本文所用，术语“固化”是指在沉积时保持其形状保真度和结构完整性的固态或半固态材料。如本文所用，术语“形状保真度”表示材料保持其三维形状而不显著扩散的能力。在一些实施方案中，固化材料是具有在约30秒或更长时间，例如约1、10或30分钟或更长时间，例如约1、10、24或48小时或更长时间的时间段内保持其三维形状的能力的材料。如本文所用，术语“结构完整性”表示材料在包括其自身重量在内的负载下保持在一起，同时抵抗断裂或弯曲的能力。

在一些实施方案中，固化组成是弹性模量大于约5、10、15、20或25千帕(kPa)，更优选地大于约30、40、50、60、70、80或90kPa，还更优选地大于约100、110、120或130kPa的组成。优选的弹性模量范围包括约5、10、15、20、25或50Pa至约80、100、120或140kPa。根据本发明，可根据输入材料的预期功能有利地改变输入材料的弹性模量。在一些实施方案中，较低的弹性模量用于支持细胞生长和迁移，而在其他实施方案中，可使用高得多的弹性模量。在一些实施方案中，弹性模量可在纤维内的不同层之间变化。在示例性实施方案中，纤维的芯可具有相对高的弹性模量，内部细胞层可具有比芯更低的模量，外壳可甚至更低以降低FBR。

如本文所用，术语“水凝胶”是指包含水和亲水性聚合物链的网络或晶格的组合物。

如本文所用，术语“鞘液”或“鞘溶液”是指在材料通过流体通道时至少部分地用于包封或“包裹”材料的流体。在一些实施方案中，鞘液包括水溶剂，例如水或甘油。在一些实施方案中，鞘液包含化学交联剂。交联剂的非限制性实例包括二价阳离子(例如，Ca²⁺、Ba²⁺、Sr²⁺等)、凝血酶和改变pH的化学品，诸如碳酸氢钠。

如本文所用，术语“分段/分隔”是指包含在本文所公开的纤维的芯或细胞层中的生物材料的不连续性质，例如其中在生物材料沿纤维长度的沉积中存在有意的间隙。此类区段/隔室之间的间隔(例如，长度)可以是规则的(例如，生物材料的区域之间的间隔大致相同)，或者间隔可不同。在一些实施方案中，生物材料的区域可在长度上大致相同，或者可不同。沿纤维长度的不同区段/隔室中的细胞密度在不同区段/隔室之间可相同或不同。

如本文所用，术语“可选择性渗透的”是指本公开的纤维的芯和/或壳层允许一些分子或离子通过同时防止其他分子或离子通过的性质。在一些实施方案中，可选择性渗透性质允许较小分子种类通过而排除较大分子种类。

如本文所用，术语“实心芯”是指本公开的纤维的芯，其由特定材料(例如，可通过化学交联剂交联的水凝胶)构成，使得芯不包括沿纤维的整个长度的内腔。该术语不旨在指沿其长度完全不可渗透的芯，因为本公开的实心芯可使特定流体、分子和/或离子种类能够通过整个芯。

如本文所用，术语“环带纤维”是指由实心芯和围绕该实心芯的一个或多个壳层组成的纤维。在实施方案中，环带纤维的芯被第一内壳和第二外壳围绕，尽管具有更多数量的壳(例如，三个、四个、五个或更多个)的纤维包括在本公开的环带纤维的定义内。在芯被第一内壳和第二外壳围绕的实施方案中，第一内壳可包含生物材料，例如细胞群，并且第二外壳可包含免疫保护层和/或促血管生成层。在具有超过两个围绕芯的壳层的实施方案中，围绕芯的环带层可包含生物材料，免疫保护层可围绕环带层，并且促血管生成层可围绕免疫保护层。在实施方案中，生物材料沿包含生物材料的特定壳层的长度被分段/分隔。

如本文所用，术语“生物相容性材料”是指如下材料，其中生物材料(包括但不限于细胞)可并入到所述生物相容性材料中和/或与所述生物相容性材料接触并且其中所述生物相容性材料对生物材料执行一种或多种功能(例如，细胞功能，包括但不限于生物相关分子种类的分泌、激动剂/受体结合、信号转导等)的能力不表现出不利影响。如本文所公开的生物相容性材料的实例可包括但不限于藻酸盐、官能化藻酸盐(例如RGD-藻酸盐、YIGSR-藻酸盐)、胶原蛋白、胶原蛋白-1、基底膜蛋白、胶原蛋白-4、胶原蛋白-2、纤连蛋白、纤维蛋白、明胶、玻连蛋白、层粘连蛋白、脱细胞化的胞外基质(dECM)、透明质酸(HA)、聚乙二醇(PEG)、PEGDA和其他官能化PEG、纤维蛋白、明胶、甲基丙烯酰明胶(GEL-MA)、丝、壳聚糖、纤维素、聚低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯(POEGMA)、自组装肽水凝胶、或它们的组合。

如本文所用，术语“官能化藻酸盐”是指经化学修饰以包括在制造本公开的纤维中有利的一种或多种特性的藻酸盐。官能化藻酸盐的实例包括但不限于甲基丙烯酸酯化藻酸盐、呋喃藻酸盐、硫醇藻酸盐、马来酰亚胺藻酸盐、RGD-藻酸盐、YIGSR-藻酸盐和共价点击藻酸盐(例如，与DMAPS-Ald和/或DMAPS-Hzd共混的藻酸盐)。

如本文所用，术语“免疫保护”广泛地指本公开的纤维的设计方面，其用于减少、防止或消除宿主免疫反应，包括例如在将纤维植入身体(例如哺乳动物身体)后纤维的免疫细胞侵袭。在一些实施方案中，本公开的外壳层可不含任何细胞材料。在一些实施方案中，外壳层可由水凝胶材料组成，例如包含藻酸盐、壳聚糖、GEL-MA、PEG、PEDGA、多臂PEG丙烯酸酯(PEGTA和PEFOA)(和其他基于PEG的材料)、POEGMA、甲基丙烯酸酯化透明质酸、硫醇化透明质酸、DMAPS-Ald、DMAPS-Hzd、聚-L-赖氨酸(PLL)、三唑(Qingsheng等人,Biomaterials.2020；230:119640)等中的一种或多种的水凝胶材料。在一些实例中，免疫保护水凝胶材料可包含例如官能化藻酸盐。

如本文所用，术语“促血管生成”广泛地指用于促进血管生长到本公开的纤维中和/或其周围的本公开的纤维的设计方面。促血管生成材料可包括可生物降解材料，包括但不限于纤维蛋白、胶原蛋白、明胶、GEL-MA、脱细胞化的胞外基质(dECM)、聚甲基丙烯酸、RGD-藻酸盐、YIGSR-藻酸盐、透明质酸(HA)等。

如本文所用，术语“剂”是指任何蛋白质、核酸分子(包括经化学修饰的核酸分子)、抗体、小分子、有机化合物、无机化合物或其他所关注的分子。剂可包括生物相关剂、治疗剂、诊断剂或药剂。治疗剂或药剂是当以与本公开一致的方式向受试者施用时单独或与附加化合物一起诱导期望的反应(诸如诱导治疗或预防效果)的治疗剂或药剂。生物相关剂是支持另一生物过程的剂，例如支持细胞生存力的剂。

输入材料：

本发明的方面包括可以用于打印纤维结构的输入材料。在一些实施方案中，输入材料包括水凝胶。水凝胶的非限制性实例包括藻酸盐、琼脂糖、胶原蛋白、纤维蛋白原、明胶、壳聚糖、基于透明质酸的凝胶，或它们的任何组合。多种合成水凝胶是已知的并且可以用于本文提供的系统和方法的实施方案中。例如，在一些实施方案中，一种或多种水凝胶形成用于打印的三维结构的结构基础的至少一部分。在一些实施方案中，水凝胶具有支持一种或多种细胞类型的生长和/或增殖的能力，所述细胞类型可以分散在水凝胶内或在其以三维构造打印后添加到水凝胶中。在一些实施方案中，水凝胶可通过化学交联剂交联。例如，包含藻酸盐的水凝胶在存在二价阳离子的情况下可以是可交联的，包含壳聚糖的水凝胶可以使用例如三聚磷酸钠(STP)的多价阴离子进行交联，包含纤维蛋白原的水凝胶在存在凝血酶等酶的情况下可以是可交联的，并且包含胶原、明胶、琼脂糖或壳聚糖的水凝胶在存在热或碱性溶液的情况下可以是可交联的。在一些实施方案中，当暴露于可与输入材料混溶的交联剂材料时，可通过经由来自输入材料的溶剂萃取实现的沉淀反应来生成水凝胶纤维。经由沉淀反应形成纤维的输入材料的非限制性实例包括胶原蛋白和聚乳酸(PLA)。能够形成沉淀介导的水凝胶纤维的交联材料的非限制性实例包括聚乙二醇(PEG)和藻酸盐。水凝胶的交联将增加水凝胶的硬度，在一些实施方案中允许形成固化的水凝胶。

在一些实施方案中，水凝胶包含藻酸盐。当与二价阳离子接触时，藻酸盐会形成固化的胶体凝胶(高含水量凝胶或水凝胶)。任何合适的二价阳离子可以用于与包含藻酸盐的输入材料形成固化的水凝胶。在藻酸盐离子亲和系列Cd²⁺>Ba²⁺>Cu²⁺>Ca²⁺>Ni²⁺>Co²⁺>Mn²⁺中，Ca²⁺最具特征并且最常用于形成藻酸盐凝胶(Ouwerx,C.等人,Polymer Gels andNetworks,1998,6(5):393-408)。研究表明，海藻酸钙凝胶通过相邻聚合物链上的聚G嵌段协同结合Ca²⁺离子形成，即所谓的“蛋盒”模型(ISP Alginates,第3节:Algin-Manufactureand Structure,in Alginates:Products for Scientific Water Control,2000,International Specialty Products:SanDiego,第4-7页)。富含G的藻酸盐倾向于形成热稳定、强而脆的Ca凝胶，而富含M的藻酸盐倾向于形成热稳定性较差、较弱但更有弹性的凝胶。在一些实施方案中，水凝胶包含解聚的藻酸盐。

在一些实施方案中，水凝胶可使用自由基聚合反应交联以在分子之间产生共价键。自由基可以通过将光引发剂暴露于光(通常是紫外线)，或通过将水凝胶前体暴露于自由基的化学源，例如过二硫酸铵(APS)或过二硫酸钾(KPS)分别与作为引发剂和催化剂的N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED)组合而产生。光可交联的水凝胶的非限制性实例包括：甲基丙烯酸酯化水凝胶，诸如明胶甲基丙烯酸酯(GEL-MA)或基于聚(乙二醇)丙烯酸酯(PEG-丙烯酸酯)的水凝胶，由于其在暴露于UV光后在自由基存在下交联的能力以及由于其对细胞的惰性而用于细胞生物学。聚乙二醇二丙烯酸酯(PEG-DA)通常在组织工程中用作支架，因为在室温下聚合反应迅速发生，所需能量输入低，含水量高、具有弹性并且可定制以包含各种生物分子。

在一些实施方案中，水凝胶包含经化学修饰的藻酸盐。在实例中，经化学修饰的藻酸盐包括用甲基丙烯酸酯基团官能化的藻酸盐，本文称为“Alg-MA”(图1)。在一些实施方案中，Alg-MA可经由与两性离子藻酸盐共混而用于免疫保护壳层，本文称为“Alg-zw”。由于Alg-MA的双重交联能力，在实施方案中，Alg-MA可首先经由物理交联用Alg-zw打印。在打印时，然后可进一步照射纤维以诱导跨纤维的共价交联，从而导致纤维-纤维(F-F)粘附。在一些实施方案中，经化学修饰的藻酸盐可包括硫醇化藻酸盐。官能化藻酸盐的其他实例包括呋喃藻酸盐、马来酰亚胺藻酸盐、四嗪藻酸盐、降冰片烯藻酸盐、酰肼藻酸盐、RGD-藻酸盐和YIGSR-藻酸盐。

在一些实施方案中，可将一种或多种合成组分添加到水凝胶材料中。合成组分可用于增加F-F粘附和/或体内稳定性。在实例中，壳材料可包含丙烯酸酯化两性离子单体(例如，磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯(SBMA))和交联剂(例如，聚(乙二醇)二丙烯酸酯(PEGDA))。在此类实例中，两性离子单体与PEGDA的光介导交联可使所得交联聚合物基质(图2)超亲水，并且因此较不易于产生异物反应(FBR)。在图3中示例性地描述了示例性打印策略和交联机制。

在一些实施方案中，水凝胶材料可经由点击化学交联。例如，可使用包含两性离子单体和醛基序(例如，[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]二甲基-(3-磺丙基)氢氧化铵(DMAPS)-醛，在本文中称为“DMAPS-Ald”)以及两性离子单体和酰肼基序(例如，DMAPS-酰肼，在本文中称为“DMAPS-Hzd”)的共聚物。DMAPS-Ald(也称为Zwitt A)和DMAPS-Hzd(也称为Zwitt H)的化学结构在图4中描绘。醛易于与酰肼反应，从而形成共价交联的水凝胶。由于聚合物主链中存在两性离子单体，这些聚合物可表现出低蛋白质结合特性。在实施方案中，这些聚合物中的一种可与壳中的藻酸盐共混。在打印之后，可将该结构浸没在含有抗衡组分的溶液中，这继而将导致纤维之间的共价交联桥，从而导致F-F粘附。

在一些实施方案中，输入材料可包含不可生物降解的聚合物。在实例中，输入材料可以是合成聚合物，例如聚乙酸乙烯酯(PVA)。在一些实施方案中，输入材料可包含透明质酸(HA)。

在一些实施方案中，输入材料可包含自组装肽。本文所讨论的自组装肽是指包含组装形成纳米结构的短氨基酸序列或重复氨基酸序列的单体的材料。肽组装显示出独特的物理化学和生物化学活性，这取决于它们的形态、大小和反应性表面积的可及性(Lee S等人,Int J Mol Sci.(2019)；23:5850；Yu Z等人,Curr.Pharm.Des.(2015)；21:4342–4354；KisidayJ等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(2002)；99:9996.doi:10.1073/pnas.142309999；XingR等人,Biomacromolecules.(2017)；18:3514–3523)。

下表1是本公开所涵盖的生物材料的列表。应当理解，在本公开的纤维及其构造方法中可使用其他材料。表1不仅包括输入材料，还包括如下面进一步详细讨论的附加材料。

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附加的组分：

根据本发明的实施方案的输入材料可包含支持活细胞生存力的多种天然或合成聚合物中的任一种，包括例如藻酸盐、层粘连蛋白、纤维蛋白、透明质酸、基于聚乙二醇的凝胶、明胶、壳聚糖、琼脂糖或它们的组合。在一些实施方案中，主题生物墨水组合物在生理上是相容的，即有利于细胞生长、分化和通讯。在某些实施方案中，输入材料包括一种或多种生理基质材料或它们的组合。“生理基质材料”是指在天然哺乳动物组织中发现的生物材料。此类生理基质材料的非限制性实例包括：纤连蛋白、血小板反应蛋白、糖胺聚糖(GAG)(例如，透明质酸、6-硫酸软骨素、硫酸皮肤素、4-硫酸软骨素或硫酸角蛋白)、脱氧核糖核酸(DNA)、粘附糖蛋白和胶原蛋白(例如，胶原蛋白I、胶原蛋白II、胶原蛋白III、胶原蛋白IV、胶原蛋白V、胶原蛋白VI或胶原蛋白XVIII)。

治疗性细胞群

根据本发明的实施方案的输入材料可并入有任何哺乳动物细胞类型，包括但不限于干细胞(例如，胚胎干细胞、成体干细胞、诱导多能干细胞)、生殖细胞、内胚层细胞(例如，肺细胞、肝细胞、胰腺细胞、胃肠道细胞或泌尿生殖道细胞)、中胚层细胞(例如，肾脏细胞、骨细胞、肌细胞、内皮细胞或心脏细胞)和外胚层细胞(皮肤细胞、神经系统细胞、垂体细胞或眼细胞)、干细胞来源的细胞或它们的任何组合。

例如，输入材料可包含来自内分泌腺和外分泌腺的细胞，包括胰腺(α、β、δ、ε、γ)、肝脏(肝细胞、Kuppfer细胞、Stelate细胞、窦状隙细胞)、甲状腺(滤泡细胞)、松果体腺(松果体细胞)、垂体腺(促生长激素细胞、乳促素细胞、促性腺激素细胞、促肾上腺皮质激素细胞和促甲状腺激素细胞)、胸腺(胸腺细胞、胸腺上皮细胞、胸腺基质细胞)、肾上腺(皮质细胞、嗜铬细胞)、卵巢(颗粒性细胞)、睾丸(间质细胞)、胃肠道(肠内分泌细胞-肠、胃、胰腺)、成纤维细胞、软骨细胞、半月板纤维软骨细胞、骨髓基质(干)细胞、胚胎干细胞、间充质干细胞、诱导多能干细胞、分化干细胞、组织来源的细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、上皮细胞、内皮细胞、成肌细胞、成软骨细胞、成骨细胞、破骨细胞以及它们的任何组合。

细胞可以从供体(同种异体)或接受者(自体)获得。具体地，在实施方案中，细胞可从合适的供体诸如人或动物获得，或从将要植入细胞的受试者获得。哺乳动物物种包括但不限于人、猴、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔和大鼠。在一个实施方案中，细胞是人细胞。在其他实施方案中，细胞可以来源于动物，例如狗、猫、马、猴或任何其他哺乳动物。

在一些实施方案中，输入材料可包含：人尸体胰岛、干细胞来源的β细胞、异种胰岛和分离的人或异种β细胞。在一些实施方案中，治疗性细胞或细胞群是胰腺祖细胞或细胞群、或PDX1阳性胰腺祖细胞或细胞群、或内分泌前体细胞或细胞群、或多激素或单激素内分泌细胞、和/或它们的任何组合，包括它们经纯化或经富集的细胞或细胞群。

在一些实施方案中，输入材料可包含：人尸体肝脏肝细胞和/或胆管细胞、干细胞来源的肝细胞和软骨细胞、或异种肝细胞。在一些实施方案中，治疗性细胞或细胞群是肝细胞祖细胞或细胞群，具有或不具有间充质细胞，包括成纤维细胞、MSC。

在一些实施方案中，该至少一种生物材料包含表达/分泌一种或多种内源性生物活性剂(例如胰岛素、胰高血糖素、饥饿素、胰多肽、血管生成因子、生长因子、激素、抗体、酶、蛋白质、外来体等)的细胞群。本文所讨论的内源性生物活性剂包括细胞在生物环境中天然产生的那些剂(例如，响应于升高的葡萄糖浓度的胰岛素释放)。内源性生物活性剂可构成本公开的上下文中的治疗剂。

在一些实施方案中，输入材料可包含分泌特定因子的基因工程化细胞。如上所讨论的细胞群在实施方案中可包含分泌特定因子的工程化细胞(例如基因工程化细胞)，这在本公开的范围内。细胞也可以来自已建立的细胞培养系，或者可以是经过基因工程和/或操作以实现所需基因型或表型的细胞。在一些实施方案中，也可以使用组织片，所述组织片可以在相同结构内提供多种不同的细胞类型。

适用于本公开的基因工程技术可包括但不限于：重组DNA(rDNA)技术(Stryjewska等人,Pharmacologial Reports.2013；65:1075)；基于使用靶向核酸酶(例如大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、成簇规则间隔的短回文重复序列相关核酸酶Cas₉(CRISPR-Cas₉)等的细胞工程(Lim等人,NatureCommunications.2020；11:4043；Stoddard BL,Structure.2011；19(1):7-15；Gaj等人,Trends Biotechnol.2013；31(7):397-405；Hsu等人,Cell.2014；157(6):1262；Miller等人,Nat Biotechnol.2010；29(2):143-148)；基于使用重组酶系统(例如，Cre-Lox)的位点特异性重组的细胞工程(Osborn等人,Mol Ther.2013；21(6):1151-1159；Hockemeyer等人,Nat Biotechnol.2009；27(9):851-857；Uhde-Stone等人,RNA.2014；20(6):948-955；Ho等人,Nucleic Acids Res.2015；43(3):e17；Sengupta等人,Journal of BiologicalEngineering.2017；11(45):1-9)等。在一些实施方案中，可使用上述用于细胞工程的技术的一些组合。

本公开涵盖能够产生一种或多种治疗剂的工程化细胞，该一种或多种治疗剂包括但不限于蛋白质、肽、核酸(例如，DNA、RNA、mRNA、siRNA、miRNA、核酸类似物)、肽核酸、适体、抗体或其片段或部分、抗原或表位、激素、激素拮抗剂、生长因子或重组生长因子及其片段和变体、细胞因子、酶、抗生素或抗微生物化合物、抗炎剂、抗真菌剂、抗病毒剂、毒素、前药、小分子、药物(例如，药物、染料、氨基酸、维生素、抗氧化剂)、或它们的任何组合。

在一些实例中，本公开的工程化细胞包括工程化以释放胞外囊泡(EV)(例如外来体和微泡)的细胞。不同细胞类型可产生具有不同货物(例如蛋白质、RNA、siRNA等)的EV，并且特定细胞类型可被基因工程化以产生具有特定货物的EV也在本公开的范围内。EV包括用于增强例如外来体介导的向所关注组织的递送的靶向技术也在本公开的范围内。此类技术可与例如外来体的固有生物学组合以驱动体内行为(Zeh等人,PLOS One.2019；14(8):e0221679；Gurung等人,American Society for Cell and Gene Therapy PosterPresentation,2020；Zickler和Andaloussi,Nature Biomedical Engineering.2020；4:9-11；Zipkin,Nature Biotechnology.2019；37(12):1395-1400；Wiklander等人,ScienceTranslational Medicine.2019；11(492):eeav8521；等人,JExtracellVesicles.2019；8(1):1587567；Wiklander等人,Front Immunol.2018；13(9):1326；Corso等人,Scientific Reports.2017；7:11561；Cooper等人,Mov Disord.2014；29(12):1476-85；Andaloussi等人,Nature Reviews Drug Discovery.2013；12:347-357；Alvarez-Erviti等人,Nature Biotechnology.2011；29:341-345；美国专利申请号2019/0167810；美国专利申请号2020/0109183)。在一些实施方案中，EV本身可并入到本公开的纤维的特定层中(Kaiqi等人,Theranostics.2019；9(24):7403-7416)。

在实施方案中，本公开的治疗性细胞可被修饰以包含至少一种机制，用于在移植到同种异体宿主中，例如在本公开的组织纤维中时，在移植部位提供局部免疫抑制。在实例中，一个或多个细胞可包含一组转基因，每个转基因编码细胞质的、膜结合的或局部作用的基因产物，并且其功能可包括但不限于减轻抗原呈递细胞的活化和功能；减轻移植物攻击白细胞活性或细胞溶解功能；减轻巨噬细胞的细胞溶解功能和同种异体移植物细胞的吞噬作用；在攻击移植物的白细胞中诱导凋亡；减轻局部炎性蛋白；以及防止白细胞介导的细胞凋亡(WO2018/227286；Harding等人,BioRxiv.2019；DOI:10.1101/716571；Lanza等人,Nature Reviews Immunology.2019；19:723-733l；Harding等人,Cell Stem Cell.2020；27(2):198-199)。

在实施方案中，本公开的治疗性细胞可以对细胞增殖发挥控制的方式进行修饰。作为实例，细胞可在细胞分裂基因座(CDL)处被基因修饰以包含负选择性标记和/或基于诱导型激活因子的基因表达系统，由此通过添加或去除适当的诱导物使得能够控制允许、消除和/或抑制经基因修饰的细胞的增殖(WO2016/141480；Liang等人,Nature.2018；563(7733):701-704)。

哺乳动物细胞的适当生长条件在本领域中是众所周知的(Freshney,R.I.(2000)Culture of Animal Cells,a Manual of Basic Technique.Hoboken N.J.,John Wiley&Sons；Lanza等人Principles of Tissue Engineering,Academic Press；第2版,2000年5月15日；和Lanza&Atala,Methods of Tissue Engineering Academic Press；第1版,2001年10月)。细胞培养基通常包括必需的营养物和任选的附加元素，例如生长因子、盐、矿物质、维生素等，它们可以根据所培养的细胞类型进行选择。可以选择特定成分以增强细胞生长、分化、特定蛋白质的分泌等。通常，标准生长培养基包括杜尔贝科改良伊格尔培养基、低葡萄糖(DMEM)，含有110mg/L丙酮酸和谷氨酰胺，辅以10％至20％胎牛血清(FBS)或小牛血清和100U/ml青霉素，这与本领域技术人员熟知的各种其他标准培养基一样合适。生长条件将根据使用的哺乳动物细胞类型和所需组织而有所不同。

在一些实施方案中，细胞类型特异性试剂可以有利地用于受试者输入材料中以用于对应细胞类型。例如，可以直接从所关注的组织中提取细胞外基质(“ECM”)，然后将其溶解并结合到输入材料中，以生成用于打印组织的组织特异性输入材料。此类ECM可以容易地从患者样本中获得和/或可从例如zPredicta(rBone^TM，可在zpredicta.com/home/products获得)的供应商商购。

活性剂：

在一些方面，本发明的实施方案可包含在打印期间添加到本公开的纤维中的至少一种活性剂，例如帮助促进细胞生长和/或分化的生物相关剂。此类活性剂的非限制性实例包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-12、BMP-13、碱性成纤维细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-1、成纤维细胞生长因子-2、血小板源性生长因子-AA、血小板源性生长因子-BB、富血小板血浆、IGF-I、IGF-II、GDF-5、GDF-6、GDF-8、GDF-10、血管内皮细胞源性生长因子、多效生长因子、内皮素、烟酰胺、胰高血糖素样肽-I、胰高血糖素样肽-II、甲状旁腺激素、腱生蛋白-C、原弹性蛋白、凝血酶源性肽、层粘连蛋白、含有细胞结合域的生物肽和含有肝素结合结构域的生物肽、治疗剂，以及它们的任何组合。

附加活性剂可包括但不限于蛋白质、肽、核酸类似物、核苷酸、寡核苷酸、核酸(DNA、RNA、siRNA、mRNA)、肽核酸、适体、抗体或其片段或部分、抗原或表位、激素、激素拮抗剂、生长因子或重组生长因子及其片段和变体、细胞因子、酶、抗生素或抗微生物化合物、抗炎剂、抗真菌剂、抗病毒剂、毒素、前药、小分子、药物(例如，药物、染料、氨基酸、维生素、抗氧化剂)或它们的任何组合。

适于包含作为输入材料的抗炎和抗纤维化因子的非限制性实例包括：类固醇(地塞米松)、吡非尼酮、前列腺素激动剂(布他前列素)、雷帕霉素、GW2580等。

适合包含在输入材料中的抗生素的非限制性实例包括：氨基糖苷类(例如，新霉素)、安沙霉素类、碳头孢烯、碳青霉烯类、头孢菌素类(例如，头孢唑啉、头孢克洛、头孢托仑、头孢托仑、头孢托罗)、糖肽类(例如，万古霉素)、大环内酯类(例如，红霉素、阿奇霉素)、单内酰环类、青霉素类(例如，阿莫西林、氨苄青霉素、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林)、多肽类(例如，杆菌肽、多粘菌素B)、喹诺酮类(例如，环丙沙星、依诺沙星、加替沙星、氧氟沙星等)、磺胺类(例如，柳氮磺胺吡啶、甲氧苄啶、甲氧苄啶-磺胺甲恶唑(复方新诺明))、四环素类(例如，强力霉素、米诺环素、四环素等)、氯霉素、林可霉素、克林霉素、乙胺丁醇、莫匹罗星、甲硝唑、吡嗪酰胺、甲砜霉素、利福平、甲砜霉素、氨苯砜、氯法齐明、奎奴普丁、甲硝唑、利奈唑胺、异烟肼、磷霉素、夫西地酸，或它们的任何组合。

抗体的非限制性实例包括：阿昔单抗、阿达木单抗、阿仑单抗、巴西利昔单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、赛妥珠单抗、达克珠单抗、依库珠单抗、依法珠单抗、吉妥珠单抗、替伊莫单抗、英夫利昔单抗、莫罗莫那—CD3、那他珠单抗、奥法木单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、雷珠单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗、喷替酸阿妥莫单抗、阿西莫单抗、托西珠单抗、贝妥莫单抗、贝利木单抗、贝索单抗、比西单抗、卡那单抗、卡罗单抗喷地肽、卡妥索单抗、地诺单抗、依决洛单抗、依芬古单抗、厄妥索单抗、达珠单抗、法索单抗、芳妥珠单抗、吉妥珠单抗、英西单抗、拉贝珠单抗、美泊利单抗、莫维组单抗、尼妥珠单抗、诺非妥莫单抗、奥戈伏单抗、佩图莫单抗、帕妥珠单抗、罗维珠单抗、卢利珠单抗、硫索单抗、替他珠单抗、替非组单抗、托珠单抗、优特克单抗、维西珠单抗、伏妥莫单抗、扎芦木单抗、扎木单抗，或它们的任何组合。

适用于本文所描述的输入材料的酶的非限制性实例包括：过氧化物酶、脂肪酶、直链淀粉、有机磷酸酯脱氢酶、连接酶、限制性核酸内切酶、核糖核酸酶、DNA聚合酶、葡萄糖氧化酶和漆酶。

适合与主题输入材料一起使用的活性剂的附加非限制性实例包括：细胞生长培养基，诸如杜尔贝科改良伊格尔培养基、胎牛血清、非必需氨基酸和抗生素；生长和形态发生因子，诸如成纤维细胞生长因子、转化生长因子、血管内皮生长因子、表皮生长因子、血小板衍生生长因子、胰岛素样生长因子)、骨形态发生生长因子、骨形态发生样蛋白、转化生长因子、神经生长因子和相关蛋白(生长因子是本领域已知的，参见例如Rosen&Thies,CELLULAR&MOLECULAR BASIS BONE FORMA TION&REPAIR(R.G.Landes Co.,Austin,Tex.,1995)；抗血管生成蛋白，诸如内皮抑素和其他天然衍生或遗传工程蛋白；多糖、糖蛋白或脂蛋白；抗感染药物，诸如抗生素和抗病毒剂、化学治疗剂(即，抗癌剂)、抗排异药、镇痛药和镇痛药组合、抗炎剂、类固醇或它们的任何组合。

打印系统：

优选地，本文所述的生物打印的组织纤维使用如PCT/CA2014/050556、PCT/CA2018/050315和USSN 62/733,548中所述的LOP^TM技术打印；所述文献的公开内容以引用方式明确地并入本文。如其中详述的，LOP^TM生物打印系统使得能够进行多材料转换，并且因此可在连续打印的同时沿通道的长度修改血管壁的组成(细胞类型和生物材料组成)。

在示例性实施方案中，打印系统包括打印头，该打印头包括分配通道，其中一个或多个材料通道和芯通道在分配通道的近侧端部处会聚。主题打印头可被配置为与一种或多种可交联材料同时分配缓冲溶液和/或鞘液。在一些实施方案中，打印头被配置为保持通过分配通道的恒定质量流率。以这种方式，本发明的打印头被配置为便于一种或多种输入材料(或一种或多种输入材料的混合物)和缓冲溶液和/或鞘液通过分配通道的平稳连续流动。在主题打印头的使用中，流过分配通道的输入材料可从内部通过流过芯通道的流体交联和/或从外部通过流过下游鞘液通道的鞘液交联，如在WO2020/056517中更具体地描述的，其公开内容以引用方式明确地并入本文。

在优选的实施方案中，一种打印头包括：分配通道，该分配通道具有近侧端部和远侧端部；分配孔口，该分配孔口定位于分配通道的远侧端部处；一个或多个壳通道，该一个或多个壳通道在分配通道的远侧端部处与分配通道依次会聚，其中每个壳通道具有在约20度至90度之间的会聚角；芯通道，该芯通道在分配通道的近侧端部处与分配通道会聚，其中该芯通道具有0度的会聚角；以及任选的鞘流通道，该鞘流通道分为两个鞘流子通道，其中这些鞘流子通道在鞘液交汇处与分配通道会聚并且具有在约30度和60度之间、更优选地在约40度和50度之间、最优选约45度的会聚角。

附加的方面包括被配置为与主题打印头协同工作以制备主题纤维的打印系统和相关联的部件。在一些实施方案中，打印系统包括单个打印头，如本文所述。在一些实施方案中，打印系统包括多个打印头，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个单独的打印头，如本文所述。在一些实施方案中，打印头与打印系统流体隔离，使得与打印过程有关的所有流体在打印头内保持隔离，并且在打印过程期间仅与打印系统的接收表面(如下所述)接触。在一些实施方案中，打印头被配置为可操作地耦合至打印系统，而不会使打印过程所涉及的流体与打印系统的组件接触。在一些实施方案中，在打印过程之前、期间和/或之后，可以移除一个或多个打印头和/或将一个或多个打印头添加到打印系统。因此，在一些实施方案中，本发明的打印头是本发明的打印系统的模块化组件。

在一些实施方案中，打印系统包括接收表面，从打印头的分配孔口分配的第一层材料沉积在所述接收表面上。在一些实施方案中，接收表面包括固体材料。在一些实施方案中，接收表面包括多孔材料。例如，在一些实施方案中，多孔材料的孔隙率足以允许流体从中通过。在一些实施方案中，接收表面是基本上平面的，从而提供平坦表面，第一层分配材料可以沉积在所述平坦表面上。在一些实施方案中，接收表面具有对应于待打印的三维结构的形貌，从而促进具有非平面第一层的三维结构的打印。

在一些实施方案中，接收表面包括真空组件，所述真空组件被配置为将来自一个或多个真空源的吸力施加到接收表面。在一些实施方案中，接收表面包括一个或多个真空通道，所述真空通道被配置为向接收表面施加吸力。在一些实施方案中，包括真空组件的接收表面被配置为在执行打印过程之前、期间和/或之后从接收表面抽吸过量流体。

在一些实施方案中，打印系统通过相对于打印机台或适于接收打印材料的接收表面移动打印头来实现特定几何形状。在其他实施方案中，打印系统通过相对于打印头移动打印机台或接收表面来实现特定几何形状。在某些实施方案中，打印系统的至少一部分保持在无菌环境中(例如，在生物安全柜(BSC)内)。在一些实施方案中，打印系统被配置为完全适合无菌环境。

在一些实施方案中，打印系统包括3D电动台，所述3D电动台包括用于在打印床上方的三维空间中定位打印头和分配孔口的三个臂，所述打印床包括用于接收打印材料的表面。在一个实施方案中，可以控制3D电动台(即，定位单元)以定位竖直臂，所述竖直臂沿着3D电动台的z轴延伸，使得打印头孔口指向下方。沿着电动台的x轴延伸的第一水平臂固定至固定的基础平台。沿着电动台的y轴延伸的第二水平臂可移动地耦合至第一水平臂的上表面，使得第一和第二水平臂的纵向彼此垂直。应当理解，上文关于臂使用的术语“竖直”和“水平”意在描述打印头移动的方式，而不一定限制臂本身的物理方向。

在一些实施方案中，接收表面位于平台的顶部上，所述平台耦合至第二水平臂的上表面。在一些实施方案中，3D电动台臂分别由三个对应的电机驱动，并由例如计算机的可编程控制处理器控制。在优选实施方案中，打印头和接收表面通过3D电动台沿着笛卡尔坐标系的所有三个主轴共同地移动，并且使用计算机软件定义台的移动。应当理解，本发明不仅限于所描述的定位系统，并且其他定位系统在本领域中是已知的。当从打印头上的分配孔口分配材料时，定位单元以由软件控制的模式移动，从而在接收表面上产生分配材料的第一层。然后将分配材料的额外层堆叠在另一层的顶部上，使得分配材料层的最终3D几何形状通常是由软件提供的3D几何形状设计的复制品。3D设计可以使用典型的3D CAD(计算机辅助设计)软件创建或从数字图像生成，如本领域已知。此外，如果软件生成的几何形状包含关于要使用的特定材料的信息，则根据本发明的一个实施方案，可以将特定的输入材料类型分配给不同的几何位置。例如，在一些实施方案中，打印的3D结构可以包括两种或更多种不同的输入材料，其中每种输入材料具有不同的特性(例如，每种输入材料包括不同的细胞类型、不同的细胞浓度、不同的ECM组成等)。

本发明的打印系统的方面包括软件程序，所述软件程序被配置为促进本发明的输入材料以特定图案且在特定位置沉积，以便形成特定纤维、平面或3D结构。为了制造此类结构，本发明的打印系统将本发明的输入材料沉积在接收表面上的精确位置(以二维或三维)。在一些实施方案中，打印系统沉积材料的位置由用户输入定义，并被翻译成计算机代码。在一些实施方案中，计算机代码包括一连串指令序列，所述指令可在数字处理装置的中央处理单元(CPU)中执行，被写入以执行指定任务。在一些实施方案中，打印参数(包括但不限于打印纤维尺寸、泵速、打印头定位系统的移动速度以及交联剂强度或浓度)由用户输入定义，并且被转换成计算机代码。在一些实施方案中，打印参数不由用户输入直接定义，而是由计算机代码从其他参数和条件导出。

在一些实施方案中，打印系统沉积输入材料的位置由用户输入定义并且被翻译成计算机代码。在一些实施方案中，本文公开的装置、系统和方法还包括非暂时性计算机可读存储介质或用计算机可读程序代码编码的存储介质。在一些实施方案中，计算机可读存储介质是数字处理装置的有形组件，例如生物打印机(或其组件)或连接至生物打印机(或其组件)的计算机。在一些实施方案中，计算机可读存储介质可选地可从数字处理装置中移除。在一些实施方案中，作为非限制性实例，计算机可读存储介质包括CD-ROM、DVD、快闪存储器装置、固态存储器、磁盘驱动器、磁带驱动器、光盘驱动器、云计算系统和/或服务等。在一些情况下，程序和指令被永久地、基本上永久地、半永久地或非暂时地编码在存储介质上。

在一些实施方案中，本文所描述的装置、系统和方法包括软件、服务器和数据库模块。在一些实施方案中，“计算机模块”是与更大的计算机系统交互的软件组件(包括代码段)。在一些实施方案中，软件模块(或程序模块)以一个或多个文件的形式出现，并且通常处理较大软件系统内的特定任务。

在一些实施方案中，模块包括在一个或多个软件系统中。在一些实施方案中，模块与一个或多个其他模块集成到一个或多个软件系统中。计算机模块可选地是独立的代码段，或者可选地是不可单独识别的代码。在一些实施方案中，模块在单个应用程序中。在其他实施方案中，模块在多个应用程序中。在一些实施方案中，模块托管在一个机器上。在一些实施方案中，模块托管在多个机器上。在一些实施方案中，模块在一个位置中托管在多个机器上。在一些实施方案中，模块在多于一个位置中托管在多个机器上。根据本发明的实施方案的计算机模块允许最终用户使用计算机来执行本文所描述的方法的一个或多个方面。

在一些实施方案中，计算机模块包括图形用户界面(GUI)。如本文所用，“图形用户界面”是指使用应用程序的输入和输出的图像以及文本表示以及存储信息的分层或其他数据结构的用户环境。在一些实施方案中，计算机模块包括显示屏。在另外的实施方案中，计算机模块通过显示屏呈现二维GUI。在一些实施方案中，计算机模块通过显示屏呈现三维GUI，例如虚拟现实环境。在一些实施方案中，显示屏是触摸屏并且呈现交互式GUI。

这些方面还包括一个或多个质量控制部件，该一个或多个质量控制部件被配置为监视和/或调节主题打印系统的一个或多个参数，以便确保一个或多个打印纤维具有合适的特性。例如，在一些实施方案中，如果沉积过程进行得太快，则在已分配纤维之后，打印的纤维结构可开始在分配通道内或在分配通道外形成盘绕结构。在一些实施方案中，质量控制组件包括相机，所述相机被配置为通过收集打印纤维结构的一个或多个图像来监测沉积过程，并确定打印纤维结构是否已形成盘绕结构。在一些实施方案中，质量控制组件被配置为调节沉积过程的一个或多个参数(例如，降低压力和/或降低沉积速度)，从而减少或避免由打印纤维结构形成盘绕结构。

这些方面进一步包括一个或多个流体储存器，该一个或多个流体储存器被配置为储存流体并通过一个或多个流体通道将流体输送到打印系统(例如，打印头)，该流体通道在打印系统与储存器之间提供流体连通。在一些实施方案中，打印系统包括与流体通道流体连通的一个或多个流体储存器。在一些实施方案中，流体储存器连接至流体通道的输入孔口。在一些实施方案中，流体储存器被配置为容纳范围从约100μL至约1L的流体体积，例如约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100mL，或例如约150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900或950mL。

在一些实施方案中，打印系统包括压力控制单元，所述压力控制单元流体耦合至一个或多个储存器。压力控制单元被配置为提供力以使一种或多种流体移动通过打印系统。在一些实施方案中，压力控制单元通过一个或多个连接管向一种或多种流体提供气压。施加的压力迫使流体流出储存器并通过相应的流体通道进入打印头。在一些实施方案中，可使用替代构件来将流体移动通过通道。例如，可使用一系列电子控制的注射泵来提供使流体移动通过打印头的力。

在一些实施方案中，打印系统包括光模块(如上所述)，该光模块用于任选地使可光交联输入材料暴露于光以便交联该材料。根据本发明的实施方案的光模块可被集成到打印头中，或者可以是打印系统的部件。

额外流体：

本发明的方面包括一种或多种缓冲溶液。根据本发明的实施方案的缓冲溶液可与输入材料(例如，水凝胶)混溶，并且不交联输入材料。在一些实施方案中，缓冲溶液包含水性溶剂。缓冲溶液的非限制性实例包括聚乙烯醇、水、甘油、丙二醇、蔗糖、明胶或它们的任何组合。

根据本发明的实施方案的缓冲溶液的粘度的范围可以从约1mPa·s至约5,000mPa·s，例如约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,250、2,500、2,750、3,000、3,250、3,500、3,750、4,000、4,250、4,500，或4,750mPa·s。在一些实施方案中，可以调节缓冲溶液的粘度以使其与一种或多种输入材料的粘度相匹配。

本发明的方面包括一种或多种鞘液。根据本发明的实施方案的鞘液是可至少部分地用于将从分配通道分配的输入材料包封或“入鞘”的流体。在一些实施方案中，鞘液包括水溶剂。鞘液的非限制性实例包括聚乙烯醇、水、甘油、丙二醇、蔗糖、明胶或它们的任何组合。根据本发明的实施方案的鞘液的粘度的范围可以从约1mPa·s至约5,000mPa·s，例如约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,250、2,500、2,750、3,000、3,250、3,500、3,750、4,000、4,250、4,500，或4,750mPa·s。在一些实施方案中，可以调节鞘液的粘度以使其与一种或多种输入材料的粘度相匹配。

在一些实施方案中，鞘液包含化学交联剂。在一些实施方案中，化学交联剂包含二价阳离子。二价阳离子的非限制性实例包括Cd²⁺、Ba²⁺、Cu²⁺、Ca²⁺、Ni²⁺、Co²⁺或Mn²⁺。在优选实施方案中，使用Ca²⁺作为二价阳离子。在一些实施方案中，鞘液中的二价阳离子的浓度的范围从约80mM至约140mM，例如约90、100、110、120或130mM。

使用方法：

本发明的方面包括打印线性纤维结构、包括一个或多个纤维结构的平面结构、或包括两层或更多层平面结构的三维(3D)结构的方法。在一些实施方案中，一种方法首先包括为要打印的平面或3D结构提供设计。所述设计可以使用市售的CAD软件创建。在一些实施方案中，所述设计包括关于特定材料的信息(例如，对于包括多种材料的异质结构)，所述特定材料将被指派给到要打印的结构中的特定位置。

所述方法的方面包括提供将由打印头分配的一种或多种输入材料。在一些实施方案中，一种或多种细胞类型与输入材料相容并且任选地分配在输入材料内。在一些实施方案中，鞘液用作润滑剂，用于润滑打印头内的输入材料的移动。在一些实施方案中，鞘液包含交联剂，其用于在从打印头分配之前或期间固化水凝胶的至少一部分。在一些实施方案中，交联剂可包含在输入材料中，例如对应于本公开的纤维的芯的输入材料。

所述方法的方面包括将设计传送给3D打印机。在一些实施方案中，例如可以通过可编程控制处理器来实现通信。在一些实施方案中，这些方法包括：控制打印头和接收表面在三维空间中的相对定位，以及同时单独地或组合地从打印头分配输入材料和在一些实施方案中的鞘液。在一些实施方案中，同轴地分配从打印头分配的材料，使得鞘液包封输入材料。这种同轴布置允许鞘液中的交联剂固化输入材料，从而产生从打印头分配的固化纤维结构。

在一些实施方案中，一种方法包括：将分配的纤维结构的第一层沉积在接收表面上，所述第一层包括由设计指定的纤维结构的布置，并且迭代地重复沉积步骤；将随后的纤维结构沉积到第一和随后层上，从而以设计指定的几何布置逐层沉积分配的纤维结构以产生3D结构。

在一些实施方案中，以受控顺序沉积多种输入材料，例如多种水凝胶，其中的至少一些包括一种或多种细胞类型，从而允许以设计指定的几何布置沉积输入材料和细胞类型的受控布置。

在一些实施方案中，一种方法包括从接收表面以及可选地从分配的纤维结构的表面去除过量流体。例如，可以在整个打印过程中连续地进行去除过量流体的步骤，从而去除过量流体，否则这些过量流体可能会干扰在由设计提供的几何布置中对分配的纤维结构进行分层。或者，可以在整个打印过程中与一个或多个沉积步骤按顺序间歇地或同时地进行去除过量流体的步骤。在一些实施方案中，通过将流体从接收表面以及可选地从分配的纤维结构的表面抽出而实现去除过量流体。在一些实施方案中，通过将过量流体抽吸通过接收表面来实现去除过量流体，接收表面包括尺寸被设定成允许流体通过的孔。在一些实施方案中，通过提供在从分配孔口分配之后蒸发的流体来实现去除过量流体。

本发明的方面包括制造包括一种或多种输入材料的3D结构的方法。3D结构可用于修复和/或置换受试者中受损或患病组织的至少一部分。

如上所述，任何合适的二价阳离子可与主题方法结合使用以固化可化学交联的输入材料，包括但不限于Cd²⁺、Ba²⁺、Cu²⁺、Ca²⁺、Ni²⁺、Co²⁺或Mn²⁺。在优选实施方案中，使用Ca²⁺作为二价阳离子。在一个优选的实施方案中，使可化学交联的输入材料与包含Ca²⁺的溶液接触以形成固化的纤维结构。在一些实施方案中，鞘液中的Ca²⁺的浓度的范围为约80mM至约140mM，诸如约90、100、110、120或130mM。

在某些实施方案中，输入材料在小于约5秒，例如小于约4秒、小于约3秒、小于约2秒或小于约1秒内固化。

本发明的方面包括使用软件工具以图案化方式沉积一种或多种输入材料以形成固化结构层的方法，所述固化结构层形成为多层3D组织结构。在一些实施方案中，多层3D组织结构包括多个哺乳动物细胞。有利地，通过调节本发明的输入材料的组分(例如，哺乳动物细胞类型、细胞密度、基质组分、活性剂)，可以使用本发明的方法创建多层3D组织结构，其中多层3D组织结构在三维空间中的任何特定位置都具有精确控制的组成。因此，主题方法有助于产生复杂的三维组织结构。

制备方法：

从外向内交联

基于挤出的生物打印方法通常涉及由水凝胶和其他生物材料形成的纤维的产生，这些水凝胶和其他生物材料在沉积时使用取决于被挤出的生物材料类型的多种机制交联。例如，将挤出的纤维打印到引起纤维固化的交联剂材料浴中。然后，从浴中收集纤维，例如在芯轴上收集，然后可用于多种应用，包括组织工程应用。

相比之下，诸如本文所公开的微流体生物打印减少了打印到液浴中的需要，因为交联剂材料可围绕所关注的材料以同轴方式共挤出，导致胶凝过程在沉积时立即开始。如本文所讨论的，通过使用细胞相容性浓度的CaCl₂或其他阳离子溶液进行阳离子交联来实现可交联的细胞相容性水凝胶诸如藻酸盐与活细胞的微流体打印。在本公开的范围内，交联可使用“从外向内”的方法进行，其中在其最简单的形式中，打印头中的通道引导一个材料流，诸如藻酸盐，被交联剂材料的鞘围绕。如本文所讨论的，可开发更复杂的微流体打印头构架，从而利用层流的特性来生成多层芯-壳纤维，其中多层壳材料围绕中心芯。在从外向内交联中，Ca²⁺离子从鞘材料扩散到芯中，使藻酸盐交联，并且因此纤维的最外层几乎瞬间固化，而芯在一段时间内固化。在一些情况下，将从外向内交联的纤维图案化以构建组织构建体可能是有挑战性的，并且特别是当沉积到前一层上的纤维不能有效地与前一层融合，从而导致它们在沉积期间滑动时。这可能使得精确且一致地图案化结构具有挑战性。也就是说，在实施方案中，本公开的装置可至少部分地经由从外向内交联的方法来制备。

从内向外交联

在实施方案中，本公开的装置可经由从内向外交联方法制备。在从内向外交联方法中，可与形成实心芯的输入材料一起以另外在从外向内方法中使用的类似浓度包含离子交联剂(例如CaCl₂)。例如，围绕芯的一个或多个壳可以是基于藻酸盐的，并且当离子从非藻酸盐芯向外扩散时，该一个或多个壳可从内向外交联。在此类实例中，外壳的最外表面是最后交联的。这可能导致纤维的外表面在从打印头挤出时保持“粘性”。当这些粘性纤维沉积在也处于固化过程中的前一层上时，相邻纤维的外表面可有效地融合在一起。以这种方式，与其中单个纤维使用从外向内方法交联的类似方法相比，可改善由本公开的纤维形成的3D宏观结构的制造中的控制。

在一个实例中，纤维装置的芯可包含合成材料(例如PVA)，并且芯材料可被一种或多种壳材料(例如包含环带层的内壳材料和包含免疫保护层的外壳)围绕。该一个或多个壳可以是例如基于藻酸盐的。在该实例中，PVA将不受离子交联剂(例如CaCl₂)的影响，并且将通过其他机制交联，例如光交联。当离子从芯向外扩散时，环带层材料将首先交联，随后是外壳的交联。此类实例意在是代表性的而非限制性的。

在实例中，纤维装置可包括被一个或多个壳围绕的由生物材料组成的芯，这些壳中的至少一者可包括免疫保护层和/或血管生成层。在此类实例中，可类似地进行从内向外交联。然而，与其中芯包含合成材料的实例相对，在该实例中，芯将包含生物相容性材料，诸如藻酸盐。

在单芯、多壳纤维装置的实例中，从内向外交联可通过使用单一离子交联剂进行，例如在围绕芯的壳层各自由藻酸盐组成的情况下使用CaCl₂。在其他实例中，在从内向外交联方法中可使用多于一种交联剂。作为代表性实例，芯可以是基于合成的，内壳(例如环带层)可以是基于藻酸盐的，并且外壳可以是基于壳聚糖的。一种离子交联剂(例如CaCl₂)可用于从内向外交联内壳，而另一种交联剂(例如三聚磷酸钠(STP))可用于从内向外交联外壳。作为进一步的代表性实例，芯可以是基于合成的，内壳可以是基于藻酸盐的，并且外壳可以是基于PEGDA的，具有合适的光引发剂诸如Irgacure 2959或LAP。一种离子交联剂可用于从内向外交联内壳，而UV或可见光可用于部分交联外壳。此类实例意在是代表性的而非限制性的。

径向置换

本文的实施方案涉及由芯、至少一个环带层和至少一个外部且优选地免疫保护的壳层组成的环带纤维，该环带层包含围绕该芯的至少一种生物材料，该壳层继而围绕该至少一个环带层。在实施方案中，芯由增强聚合物组成，其为整个纤维提供机械强度。在一些实例中，构成芯的聚合物是不可生物降解的，然而在其他实例中，构成芯的聚合物可包含可生物降解的材料，而不脱离本公开的范围。

在实施方案中，增强聚合物用于朝向整个纤维结构的周边径向置换包埋在至少一个环带层中的生物材料。这种定位改善了包埋细胞对纤维周围的氧的接近，并有助于保持生物材料的生存力和/或功能。在实施方案中，本公开的环带纤维的芯直径范围在约1.9mm至0.1mm之间，更优选地在约1.45mm至0.38mm之间，并且最优选地在约0.98mm至0.45mm之间。在一些实施方案中，本公开的环带纤维的芯直径范围在约1.92mm至0.05mm之间，更优选地在约1.1mm至0.41mm之间，或在约0.030mm与约1.0mm之间，并且最优选地在约0.5mm至0.1mm之间，例如约0.3mm。

评价β-胰岛胰腺细胞的氧消耗速率的计算机研究(参见实施例1、2和3)已经提供了关于最佳芯大小的数据，以使细胞外周化，从而接近氧扩散以保持生存力和功能。

在环带纤维实施方案中，围绕芯的是包含容纳生物材料的生物相容性水凝胶(例如藻酸盐)的至少一个环带层。生物相容性水凝胶材料是可选择性渗透的，以允许选定的生物活性剂和材料通过(例如，对于用于治疗糖尿病诸如1型或2型糖尿病的装置，葡萄糖、胰岛素和氧的通过)，但其限制生物材料本身(例如，细胞、外来体等)的通过。在实施方案中，该至少一个环带层的厚度在约0.01mm至0.3mm的范围内，更优选地在约0.025mm至0.2mm之间，并且最优选地在约0.05mm至0.125mm之间。在一些实施方案中，环带层的厚度在约0.01mm至0.4mm之间，更优选地在约0.025mm至0.3mm之间，更优选地在约0.1mm至约0.3mm之间，并且最优选地在约0.05mm至0.2mm之间。在实施方案中，厚度为约0.2mm。

在环带纤维实施方案中，围绕至少一个环带层的是至少一个外壳，优选地由免疫保护材料(例如两性离子改性的藻酸盐)组成，其也是可选择性渗透的以允许选定的剂和材料通过(例如，对于用于治疗糖尿病的装置，葡萄糖、胰岛素和氧的通过)，但其限制免疫细胞的通过，从而提供对T细胞、B细胞和其他免疫细胞的物理屏障，这可保护包封的生物材料免于直接细胞介导的杀伤和适应性免疫系统的植入物排斥。在实施方案中，经由在至少一个外壳中使用特异性修饰的材料(例如官能化藻酸盐)可减少或避免经由纤维化FBR的植入物排斥，这些特异性修饰的材料减少蛋白质结合，并且继而减少巨噬细胞、嗜中性粒细胞、成纤维细胞和与FBR相关的其他细胞类型的后续结合和活化(Qingsheng等人,NatureCommunications.2019；10:5262)。

因此，如本文所讨论的，至少一个外部壳层(例如，与包含生物材料的至少一个环带层相比定位在外部的壳)充当针对宿主的适应性和先天性免疫反应的免疫保护层，同时仍允许氧、营养物以及在实施方案中由包封的生物材料释放的治疗剂的扩散。在实施方案中，该至少一个外壳的厚度(例如，在多于一个外壳的情况下的总厚度)可在约50-200μm的范围内。在一些实施方案中，厚度可在约0.01mm至0.3mm之间，或在约0.015mm和约0.5mm之间，更优选地在约0.025mm至0.2mm之间，或在约0.05mm至0.125mm之间。在实施方案中，厚度为约0.150mm。较薄的外壳可能是易碎的并且易于在处理时降解。在一些实施方案中，本公开的环带纤维具有至少1mm的总直径。大小/直径小于1mm的植入材料易于引发FBR，并相应地发展成包封植入材料的纤维化(Watanabe等人,Biomaterials.2020；255:120162)。

在如本文所讨论的环带纤维的一些实施方案中，该至少一个外壳层包含免疫原性材料和/或促血管生成材料。例如，围绕环带层的外壳层可包含免疫原性材料和促血管生成材料两者。在实施方案中，环带纤维可包含含有生物材料的环带层，其中所述环带层被免疫保护壳层围绕，该免疫保护壳层继而被促血管生成壳层围绕。在一些实施方案中，环带纤维可被免疫保护层围绕，并且可不包括促血管生成层。在一些实施方案中，环带纤维可被促血管生成层围绕，并且可不包括免疫保护层。类似的逻辑适用于本公开的芯-壳纤维，其中生物材料包含在芯中(因此不径向置换)。对于此类芯-壳纤维，所述芯可被包含免疫保护材料和/或促血管生成材料的外壳围绕。在实施方案中，芯-壳纤维的所述芯可被免疫保护壳层围绕，并且可不包括促血管生成层。在实施方案中，芯-壳纤维的所述芯可被促血管生成壳层围绕，并且可不包括免疫保护层。

作为代表性实例，可能存在期望包括促血管生成层但不一定包括免疫保护层的情况。实例包括含有同基因型生物材料(即同基因型细胞)、经基因修饰的鞘细胞的纤维，或用于接受免疫抑制方案的患者。

分段/分隔

本文的实施方案还涉及本公开的组织纤维的一个或多个层(例如，在芯-壳纤维的情况下为芯和/或外层；在环带纤维的情况下为芯和/或内部壳层和/或外部壳层)的分段/分隔。在实施方案中，芯和/或壳层的一个或多个区段/隔室可由生物材料(例如细胞)组成。

隔室大小可以是一个或多个变量的函数，该一个或多个变量包括但不限于组织纤维尺寸(例如，长度和/或直径)、纤维类型(例如，芯-壳纤维、环带纤维)、组织纤维生成过程中使用的材料类型等。在一些实施方案中，纤维可由包含生物材料的至少两个区段/隔室组成，其中该至少两个区段/隔室侧翼的其他区段不含生物材料。例如，在芯-壳纤维的情况下，在芯中可包括包含生物材料的至少两个区段。在另一个实例中，在环带纤维的情况下，在环带层内可包括包含生物材料的至少两个区段。在实施方案中，包含生物材料的区段可具有比缺乏生物材料的区段更长的长度。在实施方案中，与缺乏生物材料的区段相比，包含生物材料的区段在长度方面可基本上类似。在实施方案中，包含用于特定组织纤维的生物材料的区段不必具有相同的长度，但不同的区段可具有不同的长度。在实施方案中，缺乏用于特定组织纤维的生物材料的区段不必具有相同的长度，但不同的区段可具有不同的长度。在一些实施方案中，本公开的组织纤维中包含生物材料(例如，细胞)的隔室/区段之间的间隔可在1-5mm之间，例如间隔1mm、2mm、3mm、4mm或5mm。

由生物材料组成的区段/隔室可包含例如特定密度的细胞。在实施方案中，隔室之间的密度可相同，或者可不同。在实施方案中，隔室之间的生物材料可相同，或者可不同。在实施方案中，生物材料的密度可根据具体应用(例如糖尿病的治疗)、细胞生存力决定因素、其中包含生物材料的材料(例如生物相容性材料)等中的一种或多种来选择。作为一个实例，生物密度可介于60,000-70,000个胰岛当量(IEQ)/ml之间，例如65,000个IEQ/ml。其他生物材料(例如，肝细胞)可以类似或不同的密度用于本公开的组织纤维中。

在实施方案中，包含生物材料的一个或多个区段/隔室的侧翼可以是包含例如本公开的免疫保护材料的区段。例如，在芯-壳纤维的情况下，其中芯包括包含生物材料的两个或更多个区段，该两个或更多个区段的侧翼可以是包含如本文所公开的免疫保护材料的其他区段。在其他实施方案中，包含生物材料的两个或更多个区段的侧翼可以是不包含例如免疫保护材料的其他区段，而不脱离本公开的范围。类似的逻辑适用于本公开的环带纤维。例如，环带纤维可由两个或更多个区段/隔室组成，这些区段/隔室由生物材料组成，其中该两个或更多个区段/隔室中的每一者的侧翼可以是并入例如本公开的免疫保护材料的区段。在其他实施方案中，包含生物材料的两个或更多个区段的侧翼可以是不包含例如免疫保护材料的区段，而不脱离本公开的范围。

涂覆

用赋予生物打印纤维一种或多种期望特性的材料涂覆生物打印纤维在本公开的范围内。因此，涂覆可用于向生物打印纤维添加最外面的外壳层。生物打印纤维可通过将生物打印纤维浸没在涂覆材料中或以其他方式将涂覆材料施加到生物打印纤维(例如，通过打印头或其他分配装置(即，泵)等将涂覆材料喷涂、分配到生物打印纤维上)而涂覆有涂覆材料。作为代表性实例，生物打印纤维可包括由芯、环带层和免疫保护外壳层组成的环带纤维。促血管生成层可通过涂覆的方式添加，例如生物打印纤维可涂覆有促血管生成材料，诸如聚甲基丙烯酸或其他聚合材料。应当理解，以所述方式添加涂覆层不限于促血管生成层，而是可包括例如由促血管生成材料和免疫保护材料、或仅免疫保护材料组成的最外层。

本文引用的所有专利和专利出版物特此以引用方式全文并入。

实施例：

实施例1：对包封细胞的径向布置进行控制的生物打印纤维的设计

本实施例涉及作为宏观包封装置的多层藻酸盐纤维的生物打印，其中含细胞层被限制在两个无细胞层之间，即径向置换以形成环带。这些多层藻酸盐纤维的几何形状基于氧传递模型确定，并与没有含细胞层的径向置换的双层纤维比较。进行灵敏度分析以检查模型参数和纤维尺寸的变化对包封细胞的氧分布和它们的胰岛素分泌速率的影响。如图所示，具有径向置换的细胞层的多层藻酸盐纤维的区别特征是它们增加的细胞负载能力，同时防止形成具有次最大胰岛素分泌和/或缺氧条件的细胞层。

如本实施例中所讨论的，我们扩展了氧传递的分析模型以分析由三个藻酸盐层纤维组成的圆柱形细胞(例如胰岛)包封装置，其中细胞层的径向置换产生环带细胞区域。我们的理论模型将在存在和不存在氧限制的情况下胰岛素分泌速率分数的估计与来自两个先前公布的用于圆柱形细胞包封装置中的氧消耗和扩散的分析解决方案的要素组合。将它们的每包封体积的细胞负荷和胰岛素分泌能力与两层圆柱形几何形状进行比较。对在细胞类型之间变化或不确定的参数值进行灵敏度分析，以便提供关于这种可变性对三层纤维的模型化设计的影响的信息。进行三层纤维的设计参数的第二灵敏度分析，以便提供关于过程可变性对细胞氧合和分泌能力的影响的信息。

氧传递模型

在本实施例中讨论，我们扩展了氧传递的分析模型以分析由三个藻酸盐层纤维组成的圆柱形细胞包封装置。如上所述，我们组合了来自由Avgoustiniatos和Colton,Ann NY Acad Sci.1997；831(1):145–67以及Iwata等人,ArtifOrgans.2018；42(8):E168–85提出的氧传质模型的要素。两者都考虑了包封细胞对氧的稳态扩散和零级消耗。前者分析了在包封装置表面形成纤维化或血管细胞层后的包封细胞氧合，并探索了由于氧限制导致的坏死细胞层的形成Avgoustiniatos和Colton,Ann N Y Acad Sci.1997；831(1):145–67。相反，后一种模型集中在被免疫保护膜围绕的完全氧合的内细胞层Iwata等人,ArtifOrgans.2018；42(8):E168–85。这里，我们对由两层或三层组成的没有囊外细胞过度生长的纤维进行建模，其中细胞以平均细胞体积分数ε均匀地分布在整个内层中(图5A-图5F)。该假设存在于Avgoustiniatos模型中，但不存在于Iwata模型中。因此，双层纤维的横截面可由具有平均细胞体积分数ε的芯细胞区域表示，该芯细胞区域被包封剂的壳围绕(图5A-图5C)。类似地，对于细胞均匀地分布在其中层的三层纤维，纤维横截面可由围绕包封剂芯的环带细胞区域表示，该这两者都由包封剂壳包围(图5D-图5F)。对于这两种纤维横截面，细胞区域的每单位体积氧消耗速率为

其中V_max表示每单位体积细胞的最大氧消耗速率。

如上所述，Avguistinatos和Iwata还假定了氧消耗的零级动力学，以便分析地求解氧传质方程(Avgoustiniatos和Colton,Ann N Y Acad Sci.1997；831(1):145–67；Iwata等人,ArtifOrgans.2018；42(8):E168–85)。此外，使用有限差分法，Avgoustiniatos后来报道了用圆柱形几何形状中的Michaelis-Menten动力学预测的氧合细胞层厚度的轻微增加，但警告这片细胞暴露于极低的氧浓度并且不大可能对胰岛素分泌能力有很大贡献(Avgoustiniatos ES,Massachusetts Institute of Technology；2001)。

在Avgoustiniatos(Avgoustiniatos和Colton,Ann N Y Acad Sci.1997；831(1):145–67)提出的模型中，由氧溶解系数α和氧扩散系数D的乘积得到每种材料的有效氧扩散系数αD(以mol·cm^-3·mmHg^-1·s^-1为单位)。这包括将氧浓度转化为分压，并通过避免使用分配系数的需要而简化了界面处的边界条件(Avgoustiniatos ES,MassachusettsInstitute of Technology；2001)。使用用于复合介质的麦克斯韦关系计算由分散相(d)和连续相(c)(例如，由水中的藻酸盐构成的包封剂，由包封剂中的细胞构成的细胞区域)组成的纤维层的氧的有效扩散系数k：

其中φ表示分散相的体积分数，并且ρ＝(αD)_d/(αD)_c表示分散相与连续相之间修正的有效扩散系数的比率。

从这里开始，我们遵循由Iwata提出的用于圆柱形几何形状的分析解决方案(Iwata等人,Artif Organs.2018；42(8):E168–85)，但是纤维层被向内标记并包括R_min，其在不存在氧限制的情况下用作虚拟变量。因此，层1对应于包封剂壳，层2对应于细胞区域，并且层3对应于包封剂芯(如果存在)。而且，两层和三层纤维分别被称为芯-壳和芯-环带-壳纤维。

假设纤维周围的径向扩散和恒定氧分压P_E使得能够对物种守恒方程进行分析求解。给定这些条件，通过包封剂壳的氧的量与被细胞区域消耗的氧平衡：

其中在不存在氧限制的情况下，对于芯-壳纤维R_min＝0(图6A)并且对于芯-环带-壳纤维R_min＝R₃(图6B)。相反，对于在存在缺氧情况下的两种纤维R_min＝r_A，其中r_A是根据径向距离的细胞区域中缺氧层的边界(图6C、图6D)。由于r_A通常是未知的，因此在下面的“模型化参数的灵敏度分析”部分中描述了其估计。壳的表面处的氧分压等于P_E。在方程3中插入该边界条件产生壳中的氧分压曲线(R₂≤r≤R₁)

以及壳与细胞区域之间的界面处的氧分压

在细胞区域中，所递送的和被消耗的氧的量也是平衡的：

壳-细胞区域界面处的氧分压可从方程4获得，并且细胞区域(R_min≤r≤R₂)中的氧分压分布为：

细胞区域中缺氧的存在与否

由Avgoustiniatos(Avgoustiniatos和Colton,Ann N Y Acad Sci.1997；831(1):145–67)提出的模型假设存在细胞变为缺氧并死亡的临界氧分压P_D，没有缺氧的细胞区域具有将该边界条件插入方程7中：/>

其中对于芯-壳纤维R_min＝0并且对于芯-环带-壳纤维R_min＝R₃。在缺氧的细胞区域中，并且R_min＝r_A，其中对于芯-壳纤维r_A>0并且对于芯-环带-壳纤维r_A>R₃。将该边界条件插入方程7中：

可迭代地求解方程8以找到确保完全氧合的细胞区域的一组纤维尺寸(由R₁、R₂和R₃表示)或细胞体积分数(嵌入(αD)₁和中)。当方程8的右手侧产生负值时，应当使用方程9通过迭代估计r_A。

最后，纤维的每单位长度的细胞负荷为：

其中在芯-壳纤维中R_min＝0并且在芯-环带-壳纤维中R_min＝R₃。在存在缺氧的情况下，对于两种纤维几何形状的细胞负荷可通过替代R_m＝rA_仅针对细胞区域中的完全氧合区域来计算。

胰岛素分泌速率模型

使用作为局部氧分压的函数的胰岛素分泌速率的双线性模型(AvgoustiniatosES,Massachusetts Institute of Technology；2001；Johnson等人,Chem Eng Sci.2009；64(22):4470–87)来估计每单位长度纤维的净胰岛素分泌速率。

第一模型假设表示P_I，局部氧分压，低于该局部氧分压细胞以较低速率分泌胰岛素。所得的具有次最大胰岛素分泌速率的细胞层具有径向边界r_I，并且因为P_I>P_D，即使存在缺氧，对于两种类型的纤维它也遵循r_I≥R_min。将该边界条件插入方程7中：

其中对于具有完全氧合的细胞区域，在芯-壳纤维中R_min＝0(图7A)并且在芯-环带-壳纤维中R_min＝R₃(图7B)；而在存在缺氧的情况下，对于两种纤维R_min＝r_A(图7C、图7D)。当该方程的右手侧产生大于P_I的值时，这意味着r_I＝R_min并且不存在具有次最大胰岛素分泌速率的细胞层。

第二模型假设规定：对于

/>

并且对于

f(r)＝1(13)

其中f是最大胰岛素分泌速率的分数。因此，具有最大胰岛素分泌速率的细胞层的横截面积：

而具有次最大胰岛素分泌速率的细胞层的净横截面积：

其中对于具有完全氧合的细胞区域，在芯-壳纤维中R_min＝0并且在芯-环带-壳纤维中R_min＝R₃；而在存在缺氧的情况下，对于两种纤维R_min＝r_A。最后，纤维的每单位长度的分泌能力为：

模型实现

在MS Excel中进行随径向距离变化的氧分压和胰岛素分泌速率分数的计算。当给定设定为P_D或P_I的目标和恒定纤维尺寸时，其中纤维直径为2R₁，壳厚度为R₁-R₂，环带厚度为R₂-R₃(如果适用)，并且芯直径为2R₂或2R₃，使用Goal Seek求解方程8中的ε。另选地，当方程8的右侧尺寸产生负值时，在方程9中使用相同的/>目标、纤维尺寸和ε，以经由Goal Seek找到r_A。然后，使用单独的Goal Seek从方程11估计r_I。Visual Basic脚本用于方程15的自动化迭代计算和积分。

模型参数选择

从文献中检索模型参数的值(参见表2)。尽管在一些参数值中遇到了可变性，但这些参数值中的大多数是从由Avgoustinitos、Colton等人(Avgoustiniatos ES,Massachusetts Institute of Technology；2001；Johnson等人,Chem Eng Sci.2009；64(22):4470–87)进行的建模工作中获得的。然而，我们选择根据Pappas及其同事报道的人胰岛氧消耗速率的测量结果(Papas等人,PLoS One.2015；10(8):e0134428)和人胰岛细胞组成的测量结果(Pisania等人,Lab Investig.2010；90(11):1661–75；Pisania等人,LabInvestig.2010；90(11):1676–86)来估计V_max。为了解决参数值的可变性，进行单次单因子灵敏度分析，其中输入变量的变化范围覆盖了文献中报道的那些(参见以下标题为“模型化参数的灵敏度分析”的部分)。

结果

芯-壳和芯-环带-壳几何形状的比较

在同轴流动聚焦纤维打印中，可通过操纵流速、材料粘度以及打印头设计来调节尺寸。我们集中在1mm纤维上，因为1-1.5mm的特征(例如微球体)与较小的微球体相比已经显示出具有降低的FBR(Veiseh等人,Nat Mater.2015年6月；14(6):643-51)。分析氧消耗以比较芯-壳和芯-环带-壳纤维，两者均具有由4％藻酸盐组成的150μm免疫保护壳和具有2％藻酸盐的细胞区域。对暴露于40mmHg腹膜内氧分压的这些纤维进行模拟，改变细胞体积分数(ε)以鉴定细胞区域被完全氧合或具有最大胰岛素分泌速率的最大细胞负荷(图8A-图8D)。增加细胞体积分数超过前者导致氧限制(图8E-图8F)，并且因此只有当芯-壳纤维的细胞负荷与芯-环带-壳纤维的细胞负荷匹配时我们才对芯-壳纤维探索这种情况(参见下文)。

首先计算完全氧合细胞区域的最大细胞体积分数，即模拟目标为0.1mmHg的最小氧浓度。如图9A所示，对于待完全氧合的芯-壳纤维细胞区域，最大ε为16.5％。这包括具有跨越350-μm细胞区域半径的159μm的次最大胰岛素分泌速率的内细胞层(在图8C中示意为橙色区域)。添加150μm半径的无细胞芯并因此添加200-μm厚的细胞环带，在芯-环带-壳几何形状中，最大ε增加到25.3％，并且具有次最大胰岛素分泌速率的细胞层的厚度仅为94μm(图9B)。对于所有以最大速率产生胰岛素并因此使其效用最大化的细胞，附加的模拟以5.1mmHg的最小氧浓度为目标(表2)。这将芯-壳纤维的最大ε从16.5％降低到14.6％(图9C)，并且将芯-环带-壳纤维的该值从25.4％降低到22.4％(图9D)。将芯-壳纤维的细胞体积分数从16.5％增加到18.4％导致跨越细胞区域半径68μm的缺氧细胞层，并且被具有次最大胰岛素分泌速率的123-μm细胞层包封(图9E)。

与芯-壳纤维中的49％相比，芯-环带-壳纤维中的无细胞芯将细胞区域面积限制为纤维面积的40％。然而，细胞区域的径向置换基本上使细胞比具有芯-壳几何形状的纤维更靠近氧源，使得细胞体积分数和最大胰岛素分泌时的细胞比例均增加。例如，在最小氧浓度目标为5.1mmHg的具有最大胰岛素分泌速率的纤维中，细胞负荷(参见方程10)对于芯-壳为纤维面积的7.1％，并且对于芯-环带-壳几何形状为9％(图10A)。尽管这看起来只是微不足道的增加，但要在具有350-μm半径细胞区域的芯-壳纤维中匹配后一种细胞负荷需要将ε增加到18.4％，但这导致3.7％的细胞区面积变为缺氧，并且25.9％的细胞区面积具有次最大胰岛素分泌。这两种细胞层都可在体内释放损伤相关的分子模式(DAMP)并引起移植失败(Paredes-Juarez等人,Sci Rep.2015；5(9月):1–12)。

此外，如图10B所示，该芯-壳纤维的分泌能力仅为纤维面积的7.4％，而具有最大胰岛素分泌(即，等于其细胞负荷)的芯-环带-壳纤维的分泌能力为9％。对于具有完全氧合细胞区域的芯-壳纤维，分泌能力为纤维面积的7.3％。总之，当与芯-壳纤维相比时，具有最大胰岛素分泌速率的环带细胞区域使分泌能力增加至少20％。有趣的是，具有完全氧合细胞区域的芯-环带-壳纤维的细胞负荷为10.1％(图10A)，高于其具有最大胰岛素分泌速率的对应物，但其分泌能力仅为纤维面积的7.9％(图10B)，因为内部37％的细胞区域面积暴露于低于5.1mmHg的氧浓度(图9B)。分泌能力的14％降低突出了环带细胞区域靶向最大胰岛素分泌的重要性，而不是旨在包封可氧合的细胞的最大数量。

对于具有150μm免疫保护壳的1mm纤维，增加细胞体积分数导致芯-壳纤维分泌能力的微小增加。相反，具有较高细胞体积分数的芯-环带-壳纤维具有较低的分泌能力。然而，这些纤维的几何形状使得能够在纤维半径和壳厚度保持恒定的同时调节环带厚度。因此，我们探索了改变细胞区域环带厚度对分泌能力的影响。在这些模拟中，调整细胞体积分数(ε)以鉴定细胞区域具有最大胰岛素分泌速率时的最大细胞负荷。如图10C所示，随着环带细胞区域厚度的增加，最大ε和分泌能力均降低。换句话讲，减小细胞区域的径向置换基本上将细胞放置得更远离氧源并且接近芯-壳纤维。在另一方面，具有较薄的环带细胞区域的纤维，除了增加的分泌能力之外，还可潜在地最小化径向堆叠的细胞聚集体竞争向内扩散氧的发生。诸如胰岛的产生胰岛素的细胞聚集体的尺寸和大小分布(Tse等人,FrontBioeng Biotechnol.2021；9:634403；Huang等人,Cell Transplant.2018年7月28日；27(7):1017–26；Schulz等人,PLoS One.2012年1月；7(5):e37004；Rezania等人,NatBiotechnol.2014；32(11):1121–33；Pagliuca等人,Cell.2014；159(2):428–39)对用于包封的最小环带厚度形成下限。然而，较小的再聚集胰岛(Kojima等人,Organogenesis.2014；10(2):225–30)可用于实现使用和利用进一步减小环带细胞区域尺寸的益处。

芯-环带-壳纤维的灵敏度分析

数学模型提供了有用的预测，而不管诸如在上述分析中使用的模型参数值的不确定性以及真实可变性。如果模型可探索这种可变性的结果，则该模型甚至更有用，并且这是通过进行单次单因子灵敏度分析以探索表2(图12A-图12F)中所示的模型参数的变化来完成的。在改变纤维参数(细胞体积分数、壳厚度、环带厚度和无细胞芯直径)的同时进行类似的分析，以评估在打印时可能发生的一系列不同的纤维设计和/或变化(图13A-图13D)。在两种灵敏度分析中，选择图9D中的芯-环带-壳纤维作为基础情况，因为预测其具有最高的细胞负荷，同时保持所有植入细胞的最大胰岛素分泌速率。如图11所示，这些分析的结果被概括为不同纤维层的径向边界，这些纤维层可围绕x轴垂直旋转以形成纤维横截面。

模型参数的灵敏度分析

在第一灵敏度分析中，我们从解决纤维表面处的氧分压(P_E)的不确定性开始。在动物、非人灵长类动物和人的不同研究中，已经报道和/或腹膜内(和其他植入部位)测量了各种氧浓度(Safley等人,Transplantation.2020；104(2):259–69；Papas等人,Adv DrugDeliv Rev.2019；139:139–56。因此，P_E的分析范围为3-100mmHg，并且包括血液中发现的氧分压。如前所述，当暴露于表面氧分压P_E＝40mmHg时，所分析的芯-环带-纤维在整个细胞区域具有最大的胰岛素分泌。因此，增加P_E超过该基础情况值导致在纤维横截面中遇到的最小氧分压的伴随升高。相反，如图12A中所见，即使P_E的适度的降低也导致具有次最大胰岛素分泌速率的细胞层的形成和快速增厚。在P_E≤34mmHg时，该细胞层的膨胀随着缺氧层的形成而减少。P_E≤15mmHg时不能维持最大胰岛素分泌率。

接下来，我们考察了最大胰岛素分泌速率所需的氧分压(PI)和细胞死亡时的氧分压(P_D)的不确定性。P_I的值由Avgoustiniatos(Avgoustiniatos ES,MassachusettsInstitute of Technology；2001)从暴露于不同体氧浓度的犬和鼠胰岛的胰岛素分泌测量结果(Dionne等人,Diabetes.1993；42(1):12–21)中估计。然而，对于人胰岛，P_I的值可能不同，并且据我们所知，该压力没有被直接测量。因此，P_I的分析范围为0.5-10mmHg，其中下限接近胰腺细胞对氧的Michaelis-Menten常数(Dionne等人,Diabetes.1993；42(1):12–21)并且上限先前被Avgoustiniatos用于开发胰岛素分泌速率分数模型(Avgoustiniatos ES,Massachusetts Institute of Technology；2001)。对于P_D的值，它被确定为诱导肝细胞中缺氧细胞死亡的临界氧分压(Anundi和Groot,Am J Physiol.1989年7月；257(1Pt 1):G58-64。由于该研究被大多数细胞包封氧传递模型所引用，我们采取使用十倍减少/增加(0.01-1mmHg)作为P_D的分析范围。P_I和P_D值的变化并不影响纤维横截面中遇到的最小氧分压。然而，在P_I>5.1mmHg时观察到具有次最大胰岛素分泌速率但无缺氧细胞层的逐渐变厚的细胞层(图12B)。对于P_D>0.1mmHg也观察到这种模式，但具有次最大胰岛素分泌速率的细胞层的生长明显较慢(图12C)。

人胰岛和其他产生胰岛素的细胞的氧消耗速率最近由Tse等人概述(Tse等人,Front Bioeng Biotechnol.2021；9:634403。因此，我们使用这些值(0.01-0.05mol·m³·s^-1)作为细胞最大氧消耗速率的分析范围(V_max)。V_max值的变化与纤维横截面中遇到的最小氧分压成反比。因此，对于V_max>0.014mol·m^-3·s^-1(基础情况值)，存在具有次最大胰岛素分泌速率的细胞层的快速增厚(图12D)。该细胞层的膨胀在V_max≥0.0165mol·m^-3·s^-1时改变了斜率，此时缺氧首次出现。这些观察结果呼应了来自Dionne等人的观点，即除了其他特征外，包封的胰岛素产生细胞应理想地具有低氧消耗速率(Dione等人In:Lanza RP,Chick WL编辑Pancreatic Islet Transplantation:Vol III Immunoisolation of PancreaticIslets.Austin,TX:R G Landes Co；1994.第119–31页；Wright和Pohajdak,CellTransplant.2001；10(2):125-43)。

对于细胞中氧的有效扩散系数(αD)_细胞，Avgoustiniatos和Colton(Avgoustiniatos和Colton,Ann N Y Acad Sci.1997；831(1):145–67)假设其值约等于37℃下水中氧的扩散系数(D_水＝2.78·10^-5cm²·s^-1)与氧溶解度系数(α_水＝1.27·10^-9mol·cm^-3·mmHg^-1)之间的乘积的三分之一。相反，Buchwald(Buchwald,Theor Biol MedModel.2009年4月16日；6(1):5)使用D_水＝3.0·10^-5cm²·s^-1和α_水＝1.45·10^-9mol·cm^-3·mmHg^-1，并且假设氧在细胞中的扩散系数为D_细胞＝2.0·10^-5cm²·s^-1。因此，(αD)_细胞的分析范围为0.35-4.5·10^-14mol·cm^-1·mmHg^-1·s^-1，其中下限为由Avgoustiniatos和Colton(Avgoustiniatos和Colton,Ann N Y Acad Sci.1997；831(1):145–67)所用的值的十分之一，而上限为由Buchwald(Buchwald,Theor Biol Med Model.2009Apr 16；6(1):5)所用的D_水与α_水之间的乘积。增加(αD)_细胞的值导致在纤维横截面中遇到的最小氧分压的伴随升高。将(αD)_细胞降低至基础情况值的10％导致形成具有次最大胰岛素分泌速率的70-μm细胞层(图12E)。这种中等的影响归因于仅为纤维面积的9％的细胞负荷。

如Avgoustinitos和Colton(Avgoustiniatos和Colton,Ann N Y Acad Sci.1997；831(1):145–67)所建议的，使用用于复合介质的麦克斯韦尔关系(方程2)计算用于壳(αD)₁和细胞区域(αD)_c,2的藻酸盐水凝胶中氧的有效扩散系数。相反，Dulong和Legalla使用Mackie-Meares方程来估计藻酸盐浓度的变化对藻酸盐水凝胶中氧扩散系数的影响(Dulong和Legallais,J Biomech Eng.2005年12月1日；127(7):1054–61)。本报道和来自Buchwald的两个报道(Buchwald)均使用2.5·10^-5cm²·s^-1作为氧在1.2％和3％藻酸盐水凝胶中的扩散系数的值。对于相同的藻酸盐水凝胶，当使用D_水＝2.78·10^-5cm²·s^-1以及D_藻酸盐＝0，即由Avgoustiniatos和Colton(Avgoustiniatos和Colton,Ann N Y Acad Sci.1997；831(1):145–67)报道的值时，方程2分别产生2.73和2.66cm²·s^-1。然而，在Buchwald的报道以及Dulong和Legallais的报道中，作者没有规定是否对藻酸盐水凝胶中氧的溶解度系数进行调节。因此，为了确定(αD)₁和(αD)_c,2的分析范围，我们采取使用如针对(αD)_细胞的相同分析范围。尽管将(αD)_细胞的值降低到基础情况的10％具有中等影响，但(αD)₁和(αD)_c,2的值的相同降低导致形成跨越79％细胞区域面积的缺氧细胞层，并且不存在具有最大胰岛素分泌速率的细胞层(图12F)。有效扩散系数的影响的这种差异归因于藻酸盐水凝胶含量高于纤维横截面中细胞的含量。

所分析的芯-环带-壳纤维的目标是通过将最小氧浓度定为5.1mmHg，使所有细胞以最大速率产生胰岛素。然而，在灵敏度分析中，当增加V_max时，以及当减少P_E、(αD)₁和(αD)_c,2时，观察到具有缺氧细胞层的纤维横截面。提出了未来的理论研究，以通过析因灵敏度分析来查看这些变量之间的相互作用。在初步分析中，我们发现纤维设计期间V_max、(αD)₁和(αD)_c,2的值同时变化±25％可能是选择细胞体积分数的实际安全裕度。应用该安全裕度等同于设计P_E降低10-mmHg的纤维。然而，除了模型参数之外，还存在可能影响体内包封装置性能的其他因素，诸如沿纤维的细胞负荷的变化和/或与目标纤维层尺寸的偏差。因此，进行第二灵敏度分析以说明此类可变性并评估一系列不同的纤维设计。

细胞负荷和纤维尺寸的灵敏度分析

该灵敏度分析集中在制造期间可控制的主要纤维设计变量上。首先，我们探索了细胞负荷的可变性的影响，从而探索了细胞区域中的细胞体积分数ε。ε的分析范围为0-100％；尽管在如此高细胞浓度下生物打印的可行性仍有待测试，但Iwata(Iwata等人,Artif Organs.2018；42(8):E168–85)以及Avgoustiniatos(Avgoustiniatos和Colton,AnnN Y Acad Sci.1997；831(1):145–67)报道的模型均探索了类似的场景。将ε降低到低于基础情况值导致纤维横截面中遇到的最小氧分压升高。如图13A所示，增加ε导致具有次最大胰岛素分泌速率的细胞层的形成和快速增厚。在ε≥25.3％时，该细胞层的膨胀随着缺氧层的形成而减少。这些观察结果归因于ε同时影响了细胞区域的氧消耗速率和细胞区域中氧的有效扩散系数(αD)₂(方程1和2)。因此，ε的增加导致/>和(αD)₂的值分别更高和更低。接着，改变壳厚度，同时保持恒定的无细胞芯直径和环带细胞区域厚度。分析范围为15-350μm，其中下限为基础情况下壳厚度的十分之一，并且上限相当于胰岛微包封中的免疫保护膜厚度，即500-μm微囊中的150-μm胰岛。因此，纤维直径≠1mm，基础情况除外。将壳厚度降低到低于基础情况值导致纤维横截面中遇到的最小氧分压升高。如图13B所示，增加壳厚度导致具有次最大胰岛素分泌速率的细胞层的形成和逐渐增厚。在壳厚度≥207μm时，该细胞层的膨胀率随着缺氧层的形成而降低。在该范围的上限，具有最大胰岛素分泌速率的细胞仅占细胞区域的35.3％，而缺氧细胞占细胞区域面积的15.5％。

最初探索了在保持恒定的环带细胞面积和壳厚度时无细胞芯半径的可变性的影响。因此，环带细胞区域厚度≠200μm，基础情况除外。分析范围与如针对壳厚度15-350μm的相同。无细胞芯半径高于基础情况值导致纤维横截面中遇到的最小氧分压升高。如图13C所示，无细胞芯半径的减小导致环带厚度的逐渐增加以及具有次最大胰岛素分泌速率的细胞层的形成和逐渐增厚。在无细胞芯半径≤97μm时，该细胞层的膨胀率随着缺氧层的形成而降低。在该范围的下限，具有最大胰岛素分泌速率的细胞仅占细胞区域的66.6％，而缺氧细胞占细胞区域面积的5.6％。

然后改变无细胞芯半径，同时保持恒定的环带细胞厚度。因此，环带细胞区域面积≠3.14·10^-2mm²，基础情况除外。无细胞芯半径低于基础情况值导致纤维横截面中遇到的最小氧分压升高。无细胞芯半径的增加导致环带厚度的逐渐增加，以及如图13D所示，具有次最大胰岛素分泌速率的细胞层的形成和逐渐增厚，以及在无细胞芯半径≤310μm时缺氧细胞层的形成。在该范围的上限，具有最大胰岛素分泌速率的细胞仅占细胞区域的55％，而缺氧细胞占细胞区域面积的1.3％。而在该范围的下限，所有细胞具有最大的胰岛素分泌速率，但由于环带面积的减少，细胞负荷从9％减少到8.1％。

由于保持恒定的环带厚度改变了所得纤维横截面的细胞区域面积，出现了无细胞芯半径的两种变化的差异。反过来，给定恒定的细胞体积分数ε，这些改变影响细胞负荷。相反，增加无细胞芯半径同时保持恒定的细胞区域面积不引起细胞负荷的增加。

当ε、壳厚度和无细胞芯半径增加而环带厚度恒定时，以及当无细胞芯半径减小而环带面积恒定时，观察到具有缺氧细胞层的纤维横截面。纤维尺寸和打印期间ε的可变性可能比这里研究的范围小得多，即，与期望的纤维尺寸或细胞分布偏离几十微米。然而，导致纤维参数变化的扰动可能不是完全正交的并引起相互作用。例如，与环带的收缩相关的壳厚度的轻微变化也可导致无细胞芯的尺寸变化。这些变化仍在被表征，并且它们的相互作用应在不久的将来通过析因灵敏度分析来探索。此外，复杂的有限元建模方法(Dulong和Legallais,Biotechnol Bioeng.2007年4月1日；96(5):990–8；Johnson等人,Chem EngSci.2009；64(22):4470–87)可用于研究纤维设计对单个细胞聚集体的氧合和分泌能力的影响，这一点不能使用我们的理论模型来计算。

我们的观察结果用于推导纤维设计的一般概念：(i)壳厚度和环带细胞区域面积的增加(由无细胞芯半径的增加或环带增厚引起)提高了氧限制的可能性；(ii)环带细胞区域厚度的减少伴随无细胞芯半径的增加降低了氧限制的可能性。正在进行体外实验，其中将包封在芯-环带-壳纤维中的细胞暴露于受控的氧浓度，并且使用荧光探针检测在细胞水平下的氧限制。

结论

被动扩散到包封的胰岛素产生细胞仍然是有待开发的重要选择，因为这可提供基本上无忧的糖尿病逆转，避免了每天补充氧的需要以及终生使用更复杂装置的固有风险。生物打印的藻酸盐纤维像宏观包封装置一样潜在地可回收，并且还能够以与微胶囊中的细胞负荷相当的细胞负荷(对于500-μm胶囊中150-μm细胞聚集体为2.7％)进行包封。与芯-壳纤维相比，芯-环带-壳纤维中细胞区域的径向置换允许更高的包封细胞负荷。基于对纤维参数的灵敏度分析，我们提供了在设计期间帮助选择纤维尺寸的策略。此外，本文呈现的模型显示，以芯-环带-壳纤维中整个细胞区域的最大胰岛素分泌速率为目标不损害其分泌能力。本文认识到该策略可用于避免氧限制和免疫原性因子诸如引起移植失败的DAMP的随后释放(Paredes-Juarez等人,Sci Rep.2015；5(9月):1–12)。

实施例2：环带包封纤维的计算机分析

如该实施例中所示，可使用建模来提供用于实验测试的纤维尺寸的可靠估计。该实施例进一步表明，相对于实心芯、单壳构架纤维类型，该环带设计可将总移植纤维长度降低约1/2。本实施例另外证明了基于低至约1mmHg的O₂利用的最大细胞负荷和与胰岛素分泌的相关性。

选择氧输送来建模至少是因为1)氧不如例如葡萄糖可溶，但以类似速率消耗，2)模型包封例如通过扩散实现的胰岛氧合，以及3)胰岛素分泌例如是氧依赖性的。

图14A-图14B说明了用于分析模型的简化几何形状。示出了球形几何形状的实际图像(图14A，左)以及球形几何形状的说明性描绘(图14A，右)。还示出了圆柱形几何形状的实际图像(图14B，左)，以及圆柱形几何形状的说明性描绘(图14B，右)。如图所示，每个实施例中的壳包含包封剂，而芯包含细胞区域。细胞区域内的细胞浓度被定义为细胞体积除以细胞区域的体积，乘以100。

图15A-图15B说明了本公开的环带纤维的简化几何形状。图15A示例性地示出了芯、环带和壳区域。细胞区域包含在环带区域内，并且壳和芯区域包含包封剂。图15B描绘了环带纤维的横截面视图，其说明性地示出了O₂的外部分压(外部pO₂)，并且在建模中，假设在芯区域中pO₂大于0。

使用与用于球形和圆柱形纤维类型的假设相同的假设来模拟环带纤维的氧输送。具体地，假设1)系统已达到稳态条件，2)存在通过包封剂和细胞区域的径向扩散，3)氧消耗速率(OCR)与氧浓度无关，4)细胞区域被完全氧合，以及5)细胞分布在细胞区域内是均匀的。关于模型参数的其他假设在图16所示的表中说明。

氧分析仪

所使用的模型输入是各种球形、圆柱形和环带装置尺寸。建模过程包括以1μm步长的传质计算。建模程序的输出是随从芯的中心到特定装置的外边界的径向距离(r_T)变化的分压。

球形和圆柱形几何形状的模型输出在图17A中示出。对于每个分压迹线，描绘了关于半径的壳-芯界面位置。用于生成图17A的数据的装置尺寸在图17B中描绘。

图18A说明了环带装置的氧分布，其与球形和圆柱形装置的氧分布重叠。环带-芯界面处的分压为26.3mmHg。图18A示出的是根据环带-芯界面和壳-环带界面的半径的位置。用于生成图18A的数据的装置尺寸在图18B中描绘。在该实施例中，圆柱形和环带纤维两者中的细胞区域为17.7·10³μm²。其他环带区域的氧分布在图19A中描绘，以及对应的装置尺寸和其他各种参数(图19B)。

氧分布研究的结果表明，随着环带厚度增加，环带-芯界面处的pO₂降低。

胰岛素分泌分析仪

所使用的模型输入是在氧分析仪建模程序中使用的装置尺寸，以及从氧分析仪建模程序获得的氧分布。建模过程包括将输入转化为局部胰岛素分泌(作为正常的％)。建模程序的输出是随径向距离和具有正常胰岛素分泌的细胞区域面积变化的胰岛素分泌。图20A示出的是随第一环带装置的径向距离变化的氧分压，并且随第一装置的径向距离变化的局部胰岛素分泌(最大值的％)在图20B中描绘。第一装置尺寸和相关参数在图20C中示出。

图20D示出的是随第二环带装置的径向距离变化的氧分压，并且随第二装置的径向距离变化的局部胰岛素分泌(最大值的％)在图20E中描绘。第二装置尺寸和相关参数在图16F中示出。作为参考，对应于第一装置(参考图20A-图20C)的数据也在图20D-图20F中示出。

图20G示出的是随第三环带装置的径向距离变化的氧分压，并且随第三装置的径向距离变化的局部胰岛素分泌(最大值的％)在图20H中描绘。第三装置尺寸和相关参数在图20I中示出。作为参考，对应于第一装置(参考图20A-图20C)和第二装置(参考图20D-图20F)的数据也在图20G-图20I中示出。

图20A-图20I的数据说明，具有最大胰岛素分泌的面积是环带厚度的函数，并且从第一装置到第二装置最大胰岛素分泌增加(环带厚度从25μm增加到55μm)，但从第二装置到第三装置具有最大胰岛素分泌的面积减少，即使环带厚度从55μm增加到62μm。

环带构型查看器

在该程序中，所使用的模型输入包括最大总半径，并且任选地包括环带或壳厚度。建模过程包括搜索最大细胞区域面积和与环带-芯界面处的目标pO₂的最小差异。建模过程的输出包括具有最大细胞区域或胰岛素分泌区域的环带构型的尺寸。

图21A说明了在具有不同环带厚度(60μm、70μm、80μm)的环带装置的环带-芯界面处(参考图21B)的pO₂，其随壳厚度(总半径(r_T)减去细胞半径(r₁)变化。图21A中的虚线表示5.1mmHg。所示的是两个点(图示为“i”和“ii”)，它们被进一步分析。转到图21C，由点“i”和“ii”限定的每个装置的尺寸和各种输出参数与特定圆柱形装置的尺寸和各种输出参数一起示出。数据表明，与圆柱形装置相比，通过使用环带装置，可将具有最大胰岛素分泌的面积增加约两倍或更多，并且在环带装置中具有最大胰岛素分泌的面积是芯半径、环带厚度和壳厚度之间的关系的函数。

实施例3：实心芯、单壳构架的理论氧输送和胰岛素分泌速率以及FITC-葡聚糖释放研究

包封是β细胞替代疗法(以及其他细胞替代疗法)的关键最终制造步骤。诸如藻酸盐珠、纤维和厚片的装置旨在保护包封的细胞免受免疫排斥，同时允许例如胰岛素、葡萄糖和氧的输送。与常规的球形藻酸盐珠相比，生物打印的纤维免疫保护的一个重要优点是包封的细胞可被限制在通过半透性外壳与装置表面隔离的芯中。包封的细胞被该壳保护并通过被动扩散氧合，使得主要是氧输送限制了可被包封的细胞的体积。

本实施例的目的包括1)对氧输送建模以设计具有完全氧合芯区域的芯-壳纤维构型，2)使用双线性模型模拟局部氧分压对胰岛素分泌速率的影响来优化对糖尿病治疗中的应用，以及3)使用具有限定分子范围的FITC-葡聚糖缀合物找到充分免疫保护(即排除IgG)的最小壳厚度。

以类似于以上关于实施例1所讨论的方式，腹膜内植入的纤维的氧合的计算基于公开的分析模型(Iwata等人,Artif Organs.2018；42(8):E168-E185；Avgoustiniatos等人,Ann N Y Acad Sci.1997；831(1):145-167)，并使用MSExcel和VisualBasic脚本进行。胰岛氧消耗速率(q_O2)、胰岛中氧的有效扩散率(D₁)和藻酸盐水凝胶中氧的有效扩散率(D_H)以及腹膜内氧分压的值均从文献中检索(Papas等人,PLoS One.2015；10(8):e0134428；Safley等人,Transplantation.2020；104(2):259-269)。胰岛素分泌速率的估计基于模型(Johnson等人,Chem Eng Sci.2009；64(22):4470-4487)，其中假设β细胞在高于5.1mmHg的局部氧分压下保持其最大胰岛素分泌速率。

分析性氧传递模型

负载胰岛的生物打印纤维的实例在图5A中描绘。如图5A所示，胰岛均匀地分布在打印纤维的芯中。通过假设恒定的细胞体积分数(X)简化了芯的纤维几何形状(图5B-图5C)。相应地调节该层中氧的有效扩散率(D_C)和消耗率(q’_O2)：

为了说明缺乏氧和/或产生次最大胰岛素分泌的芯层，包括了这些层的关于径向距离(r_A和r₁)的潜在边界。因此，氧通过壳和芯的稳态扩散和反应速率分别写为：

使用图22A-图22C所示的边界条件组，通过假设1)纤维周围的恒定氧浓度，2)仅径向扩散(即，轴向扩散可忽略)，3)氧消耗的零级动力学，和4)次最大胰岛素分泌速率＝pO₂(r)/5.1，迭代地求解这些方程。

低于20％的细胞体积分数负荷导致整个芯的最大胰岛素分泌速率(图23A)，并且具有较薄壳的纤维改善了芯氧合(图23B)。使用具有限定分子量范围的FITC-葡聚糖缀合物检查具有充分免疫保护(即排除IgG)的最小壳厚度。数据在图24A-图24F中描绘，并说明了从四种类型纤维的上清液中回收的FITC-葡聚糖(图24A-图24E)，以及示出随分子大小变化的总葡聚糖90％释放的时间的图(图24F)。在图24F中，基于公开的文献(Schnell等人,JBiomed Opt.2008；13(6):064037)将葡聚糖MW转化为流体动力学半径。

对模型化参数进行单次单因子灵敏度分析(图25A-图25B)。描绘的胰岛氧消耗速率值(图25A)和藻酸盐水凝胶中氧的有效扩散率值(图25B)的不确定性对氧合层的影响。对胰岛中氧的有效氧扩散率和β细胞保持最大胰岛素分泌速率的局部氧分压进行类似的分析(数据未示出)。由于假设恒定的细胞体积分数，前者对氧输送的影响可忽略不计。后者对芯氧合没有影响。

因此，发现负载最大数量的氧合细胞可降低具有最大胰岛素分泌速率的细胞的比例，并且与氧源的分离(即，壳厚度)影响芯氧合和纤维包封能力。还发现，为了以减小的厚度排除IgG，可能需要对半渗透性外壳中的藻酸盐进行改性。总之，本实施例证明，作为氧输送的关键驱动因素的包封细胞的氧摄取需要仔细的测量和验证。

实施例4：C/S纤维的体外研究

两性离子藻酸盐纤维的机械强度

将Min6簇打印在C/S纤维中，该纤维具有由所示不同比率的两性离子藻酸盐与SLG100组成的壳，在培养基中培养4天，然后在克雷布斯林格氏缓冲液中培养28天(以接近体内条件)。每3天更换一次缓冲液。共混物中两性离子藻酸盐的百分比越高，a)打印后的机械强度越高，但(b)打印后一个月机械强度降低的百分比越高(图26A)。图26B-图26E是对应于图26A所描绘的数据的纤维的明场图像。

打印有由各种抗FBR材料组成的壳的纤维的PHI生存力研究

根据特定的抗FBR材料是否支持原代人胰岛(PHI)生存力，检查打印有由各种抗FBR材料组成的壳的C/S纤维。对于实验，芯总是由1.5％SLG100组成，并且细胞密度为30,000个胰岛当量(IEQ)/mL。所测试的壳材料包括SLG100(对照)、纯两性离子藻酸盐(McLachlan group,University of British Columbia)、纯两性离子藻酸盐(内部合成)和DMAPS-Ald或酰肼DMAPS-Hzd(Hoare Group，参见表1)。所测试的各种壳材料在24小时时的PHI的代表性活/死图像在图27A-图27D中示出。所测试的各种壳材料在7天时的PHI的代表性活/死图像在图27E-图27H中示出。所有测试条件均显示打印后7天的高生存力。

F-F粘附的评估(优化制剂)

打印图案化结构以使用优化制剂评估环带纤维的F-F粘附。在片上(图28A-图28C)和打印后(图28D-图28F)检查纤维的交联。图28A描绘了在片上交联检查中使用的纤维的横截面图示，包括芯、内壳和外壳的组分的指示。图28D描绘了在打印后交联检查中使用的纤维的横截面图示，包括芯、内壳和外壳的组分的指示。在片上交联实验中生成的图案化结构的图像在图28B中描绘，并且图28C示出了图28B中所示图案的纤维的高分辨率图像。在打印后交联实验中生成的图案化结构的图像在图28E中描绘，并且图28F示出了图28E中所示图案的纤维的高分辨率图像。如在高分辨率图像中可以看出，打印保真度对于在片上交联的纤维表现良好，然而在打印后纤维立即散开。相反，打印后交联实验的打印保真度似乎相当差，但仍保持F-F粘附。

图28G描绘了如本文所公开的从内向外(I-O)交联的示例性说明。如图所示，芯中的钙向外扩散(参见方框箭头)以交联一个或多个外壳层。进行比较实验以评估从外向内(O-I)交联纤维与I-O交联纤维相比的F-F粘附。如图28H所示，与I-O交联纤维(图28I)相比，O-I交联纤维表现出降低的F-F粘附。当对应的纤维在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中时，拍摄O-I交联纤维和I-O交联纤维的图像(分别为图28H和图28I)。如图所示，I-O交联可改善保真度和组织完整性。

实施例5：使用基于细胞的方法(MSC)和/或低FBR、免疫保护外壳生物材料在小动物模型中在纤维水平上的免疫保护

将PHI纤维植入健康的免疫活性小鼠

将由不同比率的两性离子藻酸盐组成并包含原代人胰岛(PHI)细胞的实心芯、单壳纤维(C/S)植入健康B6小鼠中。在改良的口服葡萄糖耐量测试(OGTT)后的第-3、7和14天测量血浆C-肽(图29)，并使用血糖仪测量血糖。数据提示两性离子藻酸盐可降低FBR并改善纤维功能。

将PHI纤维植入糖尿病免疫活性小鼠

将由不同比率的两性离子藻酸盐组成并包含PHI细胞的C/S纤维植入糖尿病免疫活性小鼠中，并测量血糖。图30A说明了随手术后天数变化测量的血糖。数据表明两性离子修饰可帮助降低FBR。

人胰岛纤维在STZ诱导的糖尿病B6小鼠中逆转糖尿病的功效

检查了生物打印的C/S人胰岛纤维(芯和外壳中的未修饰藻酸盐)在免疫活性糖尿病C57BL/6小鼠中恢复正常血糖的功效。通过腹膜内单次注射高剂量STZ(200mg)诱导糖尿病。通过2X血糖水平>30mmol/L证实糖尿病。图31A-图31B说明了在长期反应者中腹膜内葡萄糖耐量测试(IPGTT)后(植入后第32-36天)的血糖测量。原始数据在图31B中示出，并且由图31B的数据生成的平均数据在图31A中描绘。对于实验，将每只小鼠禁食6小时并经由IP注射施用2g/kg葡萄糖(植入后第32-36天)。对照是相同年龄的非糖尿病小鼠。数据表明生物打印的人胰岛组织植入物在控制葡萄糖推注后的血糖水平方面是有效的。

对取回的含胰岛的纤维离体进行葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)测试。在植入后约80天取回纤维。来自三只代表性小鼠(即，从所述小鼠取回的纤维)的数据在图32A-图32B中描绘。图32A说明了每只代表性小鼠的刺激指数，并且图32B说明了相对于浓度的总c-肽％。图33A-图33C描绘了从关于图32A-图32B讨论的代表性小鼠取回的纤维装置的活/死染色。小鼠#23的染色在图33A中描绘，小鼠#25的染色在图33B中描绘，并且小鼠#26的染色在图33C中描绘。外植后GSIS表明来自小鼠#26的组织具有最高的功能。图像显示，尤其是在来自小鼠#25的组织周围存在更多的纤维化囊。因此，数据证明了FBR与功能损失之间的某种相关性。

人胰岛纤维在STZ诱导的糖尿病NSG小鼠中逆转糖尿病的功效

检查了生物打印的C/S人胰岛纤维(芯和壳中的未修饰藻酸盐)在免疫缺陷型糖尿病小鼠中恢复正常血糖的功效。通过腹膜内单次注射单次高剂量或多次低剂量的STZ诱导糖尿病。通过2X血糖水平>30mmol/L证实糖尿病。图34B说明了随个体小鼠植入后天数变化的个体小鼠的随机葡萄糖值，并且图34A示出了来自图34B的个体小鼠的平均数据。该数据显示几乎所有动物的血糖保持在正常血糖长达80天(3000个人IEQ)。

在植入后第36天和第39天(图35A-图35B)以及在植入后第82天和第85天(图35C-图35D)进行葡萄糖耐量测试。对于测试，使每只小鼠禁食4小时并经由口服管饲法施用2g/kg葡萄糖。在所描绘的实验中，对照是相同年龄的小鼠(缺乏C/S装置)。来自个体小鼠的数据在图35B和图35D中示出，并且平均数据在图35A和图35C中描绘。还收集血浆用于GSIS测试。代表性数据在图36A-图36B中描绘。图36A描绘了植入前、植入后72天和植入后90天(OGTT后)的随浓度变化的总c-肽％。图36B描绘了植入前、植入后72天和植入后约90天(OGTT后)的c-肽浓度(pg/150k个细胞)。此外，对在植入后72天和88天从NSG小鼠取回的纤维装置进行活/死染色。数据在图37中示出。该数据证明打印纤维的动力学与天然组织类似。

实施例6：环带纤维的打印

本实施例证明了本公开的环带纤维的有效产生。如图38所示，代表性的环带纤维包括内芯、含细胞层(即环带层)和外壳。细胞层包含原代人胰岛的聚集体。尽管本实施例描绘了具有原代人胰岛的环带纤维，但其他细胞类型也在如本文所讨论的本公开的范围内。环带纤维可用RX1^TM生物打印机(Aspect Biosystems,Vancouver,BC,Canada)打印。环带纤维可用生物打印系统诸如美国临时专利申请号63/290595中公开的系统打印。

尽管没有具体示出，但环带纤维可如本文所公开的那样被分段/分隔。例如，环带纤维可包括环带层(即，含细胞层)，其中生物材料(即，细胞)沿纤维的长度被分段/分隔。可存在生物材料的至少两个区段，但可包括更多，例如3、4、5、6、10或更多等。简而言之，打印此类纤维的方法可包括，经由具有通向环带通道的两个通道的打印头，在含细胞的环带层材料与无细胞的环带层材料之间转换流动。环带层材料在两个通道之间可相同，或者可不同。

在图38所示的实施例中，外壳是生物打印的，然而尽管未具体示出，但在一些实例中，可通过涂覆(例如，将纤维浸没在涂覆溶液中，将涂覆溶液分配到生物打印的纤维上等)将外壳添加到本公开的生物纤维中。例如，纤维可涂覆有促血管生成材料诸如聚甲基丙烯酸或其他聚合材料。

实施例7：与芯-壳纤维相比环带纤维中细胞的生存力和功能研究

该实施例证明，与包封在相同外径的单壳纤维的芯中的原代肝细胞聚集体相比，环带纤维的第一壳中的原代肝细胞聚集体在体外培养中具有增加的生存力和功能性。图39A-图39B描绘了生物打印纤维的横截面的示例性图像，该生物打印纤维由无细胞水凝胶芯、含有HepG2细胞簇的内壳层和无细胞外部壳层组成。图39B表示与图39A相同的图像，但具有清楚地划分不同层的标记。

材料和方法

活/死荧光染色

钙黄绿素-AM是可用于确定大多数真核细胞中的细胞生存力的细胞渗透性染料。钙黄绿素-AM是一种非荧光的亲水性化合物，其易于渗透完整的活细胞。在活细胞中，在乙酰氧基甲基酯被细胞内酯酶水解后，钙黄绿素-AM转化为亲水性的、强绿色荧光的钙黄绿素。细胞可以是活染色的并且定量而无需固定。

碘化丙啶(PI)是一种红色荧光核酸结合染料。由于PI不渗透活细胞，因此其可用于检测群体中的死细胞。

Hoechst 33342是一种与DNA强烈结合的荧光核染料。Hoechst染料是细胞可渗透的并且可结合活细胞和死细胞中的DNA。尽管Hoechst染色的有效性在活细胞中较低，因为染料通过膜的效率较低。

对于染色程序，最终Hoechst浓度为20μg/mL，最终钙黄绿素-AM浓度为5.33μM，并且最终PI浓度为15μg/mL。将纤维置于24孔板中，使得它们被含有染色剂的介质覆盖。选择一种纤维作为死对照，对于该纤维，去除培养基并添加300μL 70％乙醇，并在37℃和5％CO₂下孵育30分钟以杀死该死对照。向剩余的纤维中添加300μL染色混合物。将测试纤维在37℃和5％CO₂(避光)下孵育30分钟。使用ZeissAxio观察显微镜(Jana,Germany)对组织进行成像。Hoechst的设置(385处激发，465处发射)，PI的设置(567处激发，572处发射)，钙黄绿素-AM的设置(475处激发，509处发射)。

阿尔玛蓝测定

刃天青的最大吸光度为605nm，并且试卤灵的最大吸光度为573nm。荧光或吸光度可用于记录结果；然而，荧光是优选的方法，因为它更灵敏。

刃天青可穿透细胞，在细胞中它被还原成荧光试卤灵，这可能是几种不同氧化还原酶作用的结果。荧光试卤灵染料可扩散出细胞并回到周围介质中。从快速生长的细胞收获的培养基不减少刃天青。对各种肝亚细胞级分的能力的分析表明，刃天青可被线粒体酶、胞质酶和微粒体酶还原。

不同细胞类型将刃天青还原为试卤灵的能力根据细胞系的代谢能力和与试剂孵育的时间长度而变化。对于大多数应用，1至4小时的孵育期是足够的，然而对于3D组织，需要24小时-48小时。

添加阿尔玛蓝至终浓度为10％(440μM储备溶液)。将样品孵育确定的时间段(2D培养为1-4小时，3D培养为24-48小时)。然后收集培养基并储存在-20℃。为了进行测定，取出样品并将测试样品、阳性和阴性对照的等分试样(50μL)转移至96孔平底透明板中。在读板器上读板。吸光度：570nm，参比600nm。荧光(这是优选的，因为它更准确)：激发530-570nm，发射580-620nm)。为了计算结果，从实验样品和对照样品中减去平均相关背景对照。绘制每个样品的平均值。更高浓度的试卤灵提示更多的细胞增殖。

白蛋白和尿素产生测定

根据制造商的说明书进行白蛋白(人白蛋白ELISA试剂盒，目录号：ab179887；Abcam,Cambridge,UK)和尿素产生测定(QuantiChro m^TM尿素测定试剂盒，目录号：DIUR-100；BioAssay Systems,Hayw ard,CA)。

结果

原代人肝细胞(PHH)的生存力显示在环带纤维中与芯-壳纤维相比有所改善。图40A描绘了在打印后第1天和第4天芯壳和环带纤维的活(钙黄绿素AM)/死(碘化丙啶)染色。图像显示与环带纤维相比，芯壳纤维中的细胞生存力较低。使用阿尔玛蓝^TM(ThermoFisher,Waltham,MA)(一种检测代谢活性细胞的无毒试剂)定量芯壳纤维和环带纤维中细胞的代谢健康。数据在图40B中描绘。如可以看出的，环带纤维中细胞的代谢健康大于芯壳纤维的细胞。

还检查了芯壳纤维与环带纤维中细胞的功能。与芯壳纤维相比，环带纤维中白蛋白产生增加(图40C)，并且与芯壳纤维相比，在环带纤维中氨解毒更大(图40D)。综合图39A-图40D的数据证明，与芯壳纤维相比，环带纤维中的细胞生存力和功能得到改善。

实施例8：芯和/或壳材料的分段/分隔

该实施例展示了在本公开的芯-壳纤维的生成期间的材料转换。芯-壳纤维在该具体实施例中用作代表性实例，但该概念适用于其他纤维，例如本公开的环带纤维。

图41A描绘了本公开的芯-壳纤维的示例性图示，其中芯由第一芯材料(芯材料A)和第二芯材料(芯材料B)组成，并且其中壳由第一壳材料(壳材料A)和第二壳材料(壳材料B)组成。可以理解，图41A意在为说明性的，并且在本公开的范围内，芯可包括任何数量的不同区段，和/或外壳可包括任何数量的区段。在一些实施方案中，芯可包括至少两个区段，而壳可由单个区段组成。虽然没有明确示出，但类似的逻辑适用于本公开的环带纤维。例如，环带纤维可包括以下中的一者或多者：1)具有任何数量的区段的实心芯，2)具有任何数量的区段的环带层，和3)具有任何数量的区段的外壳层。在一些实施方案中，环带纤维的环带层可以是分段的，而外壳和/或芯可以不是分段的。环带层可包含生物材料(即细胞)。

图41B描绘了其中外壳由两种不同材料组成的芯-壳纤维的实际图像。出于说明的目的，将第一视觉指示器和第二视觉指示器分别并入到第一材料和第二材料中，以便能够看到外壳中的不同材料。如图41B中可以看出的，纤维包括两种不同的壳材料。图41B所描绘的过程可在单个纤维中重复任意次，这取决于应用。在实施方案中，一种材料可包含生物材料(例如细胞)，而另一种材料可不含生物材料。

图41C描绘了其中实心芯由两种不同材料组成的芯-壳纤维的实际图像。类似于关于图41B所讨论的，用于制备图41C所描绘的芯-壳纤维的方法可重复任意次。在实施方案中，一种材料可包含生物材料(例如细胞)，而另一种材料可不含生物材料。

虽然未明确说明，但材料转换的过程可应用于芯和外层(在芯-壳纤维的情况下)两者，或应用于芯和/或一个或多个层(例如，在环带纤维的情况下环带层和/或外壳层)。

虽然出于清晰理解的目的，上述发明已通过图解和实例详细地描述，但是本领域普通技术人员鉴于本发明的教示容易地明白，可以在不背离所附权利要求书的精神或范围的情况下作出某些变化和修改。

因此，以上仅仅说明本发明的原理。应理解，本领域技术人员将能够设计各种布置，这些布置尽管未在本文中明确描述或示出，但是它们体现本发明的原理并且包括在其精神和范围内。此外，本文所叙述的所有实施例和条件语言主要意图帮助读者理解本发明的原理和由发明人提供的促进技术的构想，并且应解释为不对此类具体叙述的实施例和条件构成限制。此外，本文中叙述本发明的原理和方面以及其具体实施例的所有陈述都意图涵盖其结构等效物和功能等效物两者。另外，意图是此类等效物包括目前已知的等效物和未来开发的等效物，即不管结构如何，开发的执行相同功能的任何元件。因此，本发明的范围不意图限于本文所示和描述的示例性方面。而是，本发明的范围和精神由所附权利要求来体现。

Claims (34)

1.一种生物打印的可选择性渗透的组织纤维，其包括：实心芯；围绕所述实心芯的至少一个环带层，所述至少一个环带层包含包埋在可交联的生物相容性材料中的至少一种生物材料；和围绕所述至少一个环带层的至少一个外壳层。

2.根据权利要求1所述的生物打印的可选择性渗透的组织纤维，其中所述实心芯被增强；优选地其中所述实心芯包含不可生物降解的材料。

3.根据权利要求1所述的生物打印的可选择性渗透的组织纤维，其中所述实心芯包含可交联材料，并且所述组织纤维从内向外交联。

4.根据权利要求2所述的生物打印的可选择性渗透的组织纤维，其中所述实心芯包含不可生物降解的聚合物材料，所述不可生物降解的聚合物材料选自包括PVA或由其组成的组。

5.根据权利要求1所述的生物打印的可选择性渗透的组织纤维，其中所述至少一种生物材料包括生物相容性材料中的细胞群和/或细胞来源的胞外囊泡群。

6.根据权利要求5所述的生物打印的可选择性渗透的组织纤维，其中所述至少一种生物材料均匀地分散在整个所述至少一个环带层中；优选地其中所述生物材料沿所述纤维的长度被分段/分隔。

7.根据权利要求1所述的生物打印的可选择性渗透的组织纤维，其中所述生物相容性材料选自藻酸盐、胶原蛋白-1、基底膜蛋白、胶原蛋白-4、胶原蛋白-2、纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白、脱细胞化的胞外基质、透明质酸、PEG、PEGDA和其他官能化PEG、纤维蛋白、明胶、GEL-MA、丝、壳聚糖、纤维素、POEGMA、自组装肽和/或一种或多种选自由以下项组成的组的官能化藻酸盐：甲基丙烯酸酯化藻酸盐、呋喃藻酸盐、硫醇藻酸盐、马来酰亚胺藻酸盐、四嗪藻酸盐、降冰片烯藻酸盐、酰肼藻酸盐、DMAPS-Ald、DMAPS-Hzd、RGD-藻酸盐、YIGSR-藻酸盐、或它们的组合。

8.根据权利要求5所述的生物打印的可选择性渗透的组织纤维，其中所述细胞群包含：来自选自由胰腺、肝脏、甲状腺、松果体腺、垂体腺、胸腺、肾上腺、卵巢、睾丸组成的组的内分泌腺和外分泌腺的细胞，肠内分泌细胞，干细胞，干细胞来源的细胞，或工程化以分泌治疗剂的细胞。

9.根据权利要求5所述的生物打印的可选择性渗透的组织纤维，其中所述细胞来源的胞外囊泡群包含外来体。

10.根据前述权利要求中任一项所述的生物打印的可选择性渗透的组织纤维，其中所述至少一个外壳层包含免疫保护材料和/或促血管生成材料。

11.根据权利要求10所述的生物打印的可选择性渗透的组织纤维，其包含外部外壳层和内部外壳层，其中所述外部壳层由促血管生成材料组成，并且其中所述内部外壳层由免疫保护材料组成。

12.根据权利要求10或权利要求11所述的生物打印的可选择性渗透的组织纤维，其中所述免疫保护材料选自藻酸盐、壳聚糖、GEL-MA、PEGDA、PEG、多臂PEG丙烯酸酯、POEGMA、甲基丙烯酸酯化透明质酸、硫醇化透明质酸、PLL、透明质酸、以及它们的组合。

13.根据权利要求12所述的生物打印的可选择性渗透的组织纤维，其中所述免疫保护材料包含官能化藻酸盐。

14.根据权利要求11-13中任一项所述的生物打印的可选择性渗透的组织纤维，其中所述免疫保护材料包含或进一步包含丙烯酸酯化两性离子单体(SBMA)和PEGDA。

15.根据权利要求10-14中任一项所述的生物打印的可选择性渗透的组织纤维，其中所述促血管生成材料包含纤维蛋白、胶原蛋白、甲基丙烯酸酯化胶原蛋白、明胶、GEL-MA、脱细胞化的胞外基质(dECM)、聚甲基丙烯酸、RGD-藻酸盐、YIGSR-藻酸盐和透明质酸中的一种或多种。

16.根据任何前述权利要求所述的生物打印的可选择性渗透的组织纤维，其中所述纤维的直径在约2.0mm至0.25mm之间，更优选地在约1.5mm至0.45mm之间，并且最优选地在约1.1mm至0.7mm之间。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的生物打印的可选择性渗透的组织纤维，其中所述芯的直径在约1.92mm至0.05mm之间，更优选地在约1.1mm至0.41mm之间，并且最优选地在约0.5mm至0.1mm之间。

18.根据权利要求1-16中任一项所述的生物打印的可选择性渗透的组织纤维，其中所述至少一个环带层的厚度在约0.01mm至0.4mm之间，更优选地在约0.025mm至0.3mm之间，并且最优选地在约0.05mm至0.20mm之间。

19.根据权利要求1-16中任一项所述的生物打印的可选择性渗透的组织纤维，其中所述至少一个外部壳层的厚度在约0.01mm至0.3mm之间，更优选地在约0.025mm至0.2mm之间，并且最优选地在约0.05mm至0.2mm之间。

20.一种生物打印的可选择性渗透的组织纤维，其包括：实心芯，所述实心芯包含至少一种生物材料，其中所述生物材料沿所述纤维的长度被分段/分隔；和围绕所述实心芯的至少一个外壳层，所述外壳层包含交联的水凝胶材料。

21.根据权利要求20所述的可选择性渗透的生物打印组织纤维，其中所述至少一种生物材料包含生物相容性材料中的细胞群。

22.根据权利要求21所述的生物打印的可选择性渗透的组织纤维，其中所述生物相容性材料选自藻酸盐、胶原蛋白-1、基底膜蛋白、胶原蛋白-4、胶原蛋白-2、纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白、脱细胞化的胞外基质、透明质酸、PEG、PEGDA和其他官能化PEG、纤维蛋白、明胶、GEL-MA、丝、壳聚糖、纤维素、POEGMA、自组装肽和/或一种或多种选自由以下项组成的组的官能化藻酸盐：甲基丙烯酸酯化藻酸盐、呋喃藻酸盐、硫醇藻酸盐、马来酰亚胺藻酸盐、四嗪藻酸盐、降冰片烯藻酸盐、酰肼藻酸盐、DMAPS-Ald、DMAPS-Hzd、RGD-藻酸盐、YIGSR-藻酸盐、或它们的组合。

23.根据权利要求20-22中任一项所述的生物打印的可选择性渗透的组织纤维，其中所述细胞群包含：来自选自由胰腺、肝脏、甲状腺、甲状旁腺、松果体腺、垂体腺、胸腺、肾上腺、卵巢、睾丸组成的组的内分泌腺和外分泌腺的细胞，肠内分泌细胞，干细胞，干细胞来源的细胞或工程化以分泌治疗剂的细胞。

24.根据权利要求20-22中任一项所述的生物打印的可选择性渗透的组织纤维，其中所述细胞群包含外来体。

25.根据权利要求20-24中任一项所述的生物打印的可选择性渗透的组织纤维，其中所述至少一个外壳层包含免疫保护材料和/或促血管生成材料。

26.根据权利要求25所述的生物打印的可选择性渗透的组织纤维，其包含外部外壳层和内部外壳层，其中所述外部壳层由促血管生成材料组成，并且其中所述内部外壳层由免疫保护材料组成。

27.根据权利要求25或权利要求26所述的生物打印的可选择性渗透的组织纤维，其中所述免疫保护材料选自藻酸盐、壳聚糖、GEL-MA、PEGDA、PEG、多臂PEG丙烯酸酯、POEGMA、甲基丙烯酸酯化透明质酸、硫醇化透明质酸、PLL、透明质酸、以及它们的组合。

28.根据权利要求27所述的生物打印的可选择性渗透的组织纤维，其中所述免疫保护材料包含官能化藻酸盐。

29.根据权利要求25-28中任一项所述的生物打印的可选择性渗透的组织纤维，其中所述免疫保护材料包含或进一步包含丙烯酸酯化两性离子单体(SBMA)和PEGDA。

30.根据权利要求25-29中任一项所述的生物打印的可选择性渗透的组织纤维，其中所述促血管生成材料包含纤维蛋白、胶原蛋白、甲基丙烯酸酯化胶原蛋白、明胶、GEL-MA、脱细胞化的胞外基质(dECM)、聚甲基丙烯酸、RGD-藻酸盐、YIGSR-藻酸盐和透明质酸中的一种或多种。

31.根据权利要求20-30中任一项所述的生物打印的可选择性渗透的组织纤维，其中所述纤维的直径在约2.0mm至0.2mm之间，更优选地在约1.5mm至0.5mm之间，并且最优选地在约1.1mm至0.8mm之间。

32.根据权利要求20-30中任一项所述的生物打印的可选择性渗透的组织纤维，其中所述实心芯的直径在约1.98mm至0.18mm之间，更优选地在约1.48mm至0.48mm之间，并且最优选地在约0.9mm至0.50mm之间。

33.根据权利要求20-30中任一项所述的生物打印的可选择性渗透的组织纤维，其中所述至少一个外部壳层的厚度在约0.01mm至0.3mm之间，更优选地在约0.025mm至0.2mm之间，并且最优选地在约0.05mm至0.15mm之间。

34.一种用于产生/分泌所关注的生物活性剂的方法，其包括体外或体内培养根据权利要求1-33中任一项所述的生物打印的可选择性渗透的纤维，其中所述可选择性渗透的纤维包含能够产生/分泌所关注的生物活性剂的生物材料。