CN117777312B - 一种靶向EGFRvIII的嵌合抗原受体（CAR）及其抗癌的用途 - Google Patents
一种靶向EGFRvIII的嵌合抗原受体（CAR）及其抗癌的用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种靶向EGFRvIII的嵌合抗原受体(CAR)及其抗癌的用途，所述嵌合抗原受体包括靶向EGFRvIII的单链可变区、铰链区、跨膜区和胞内信号区，所述靶向EGFRvIII的单链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的轻链可变区；进一步的，述胞内信号区包括CD28胞内信号域、CD3ζ胞内信号域和FcRγ胞内信号域。使用该CAR结构构建CAR‑M细胞，所述细胞以肿瘤特异性抗原EGFRvIII为靶点，能够有效治疗实体肿瘤，体内、体外有效抑制肿瘤细胞生长，并促进体内免疫环境，发挥协同抗肿瘤作用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术研发领域，具体提供了一种靶向EGFRvIII的嵌合抗原受体(CAR)及其抗癌的用途。
背景技术
近年来，细胞免疫疗法已成一种有前途的癌症治疗方法，其利用免疫系统清除外来病原体或肿瘤细胞。表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞代表了一类主要的细胞免疫疗法，可对免疫细胞进行编程以启动靶向抗肿瘤效应。搭载CAR的T细胞(CAR-T)已在多种血液恶性肿瘤中显示出临床疗效，多款CD19和BCMA靶向的CAR-T产品获得批准，并取得了令人震惊的治疗效果。
但是，随着研究的深入，CAR-T细胞在癌症免疫治疗中的局限性也逐渐显现。首先，抗原选择困难。尽管CAR-T疗法取得了巨大成功，但到目前为止，所有FDA批准的CAR疗法都针对B谱系标记。实体瘤的CAR-T疗法落后于血液恶性肿瘤，缺乏癌症特异性靶点是主要障碍之一。尽管靶向CD19的CAR-T疗法会导致B细胞发育不全，但静脉注射免疫球蛋白补充剂可以轻松补偿大部分B细胞功能。实体瘤中很少有这样的不影响正常功能的特异性抗原。CAR-T细胞针对实体瘤中的肿瘤相关抗原，通常会发生靶向肿瘤外副作用，且有时无法通过轻松逆转，这种毒性可能在缺乏抗肿瘤活性或抗肿瘤活性极低的情况下发生(参见Parkhurst MR,Yang JC,Langan RC,Dudley ME,Nathan DA,Feldman SA,et al.T cellstargeting carcinoembryonic antigen can mediate regression of metastaticcolorectal cancer but induce severe transient colitis.Mol Ther.2011，19(3):620–626)。
其次，CAR-T细胞运输和浸润肿瘤的效率低下。CAR-T细胞运输和浸润到肿瘤部位是静脉注射后需要克服的下一个主要障碍，异常的血管系统和粘附分子的异常表达会降低CAR-T细胞对肿瘤部位的附着、迁移和浸润；致密的细胞外基质，包括癌症相关成纤维细胞(CAF)，为CAR-T细胞进入肿瘤部位创造了物理屏障；细胞因子表达失调会优先吸引抑制性免疫细胞，为此人们已经探索了多种策略来增加T细胞对肿瘤的浸润(参见Kevin P，HizraF，Veera C et al,CAR race to cancer immunotherapy:from CAR-T,CAR NK to CARmacrophage therapy,J Exp Clin Cancer Res.2022，41:119)。
第三，恶劣的肿瘤微环境。进入体内后，免疫抑制环境会抑制CAR-T细胞功能。在某些癌症中尤其如此，例如胰腺癌(参见Looi CK,Chung FF,Leong CO,Wong SF,Rosli R,MaiCW.Therapeutic challenges and current immunomodulatory strategies intargeting the immunosuppressive pancreatic tumor microenvironment.J Exp ClinCancer Res.2019，38(1):162)，细胞和基质成分都为癌症免疫治疗创造了不利的微环境。细胞成分，如肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、调节性T(Treg)细胞、骨髓源性抑制细胞(MDSC)和肿瘤相关成纤维细胞(TAF)可以直接抑制CAR-T功能，促进免疫抑制细胞因子和代谢微环境，从而抑制CAR-T细胞功能。血管内皮生长因子(VEGF)在肿瘤新生血管形成中发挥着关键作用，最近发现VEGF几乎可以影响免疫系统的各个方面，导致抗癌免疫受到抑制。此外，转化生长因子β(TGF-β)、IL-4、IL-10等也会导致T细胞功能障碍并促进抑制性免疫细胞的浸润(参见Hou AJ,Chen LC.Chen YY.Navigating CAR-T cells through the solid-tumourmicroenvironment，Nat Rev Drug Discov，2021，20(7):531-550)。
第四，CAR-T细胞扩增和持久性不足。CAR-T细胞在体内的扩增和持续存在被认为对于长期缓解至关重要，特别是对于那些需要长期治疗的恶性肿瘤，例如ALL。对于其他恶性肿瘤，例如非霍奇金淋巴瘤，这种情况可能不太重要，这种情况下，短期强化化疗无需巩固和维持治疗就足以诱导缓解。尽管抗CD19 CAR-T疗法后检测不到CAR-T细胞且B细胞恢复，但仍持续完全缓解。CAR-T细胞持久性的缺乏可能与宿主对CAR-T细胞的抗转基因免疫反应有关。在这种情况下，氟达拉滨的淋巴清除条件治疗可以减弱抗转基因免疫反应，改善CAR-T细胞扩增和持久性，增强CAR-T细胞的功效(参见Turtle CJ,Hanafi LA,Berger C,Hudecek M,Pender B,Robinson E,et al.Immunotherapy of non-Hodgkin’s lymphomawith a defined ratio of CD8+and CD4+CD19-specific chimeric antigen receptor-modified T cells.Sci Transl Med.2016，8(355):355)。
巨噬细胞和其他髓系细胞有可能克服迄今为止阻碍CAR-T治疗实体瘤的障碍。巨噬细胞是先天免疫系统的吞噬细胞，对于清除外来病原体至关重要，与基于淋巴细胞的疗法不同，巨噬细胞很容易定位并持续存在于体内。巨噬细胞可通过促炎和抗炎的方式影响周围的免疫细胞，并且擅长重塑细胞外基质(ECM)(参见Franken L,Schiwon M,KurtsC.Macrophages:Sentinels and Regulators ofthe Immune System.Cell Microbiol，2016，18:475–87)。巨噬细胞还具有强大吞噬和细胞毒性能力的先天免疫细胞，可以通过T细胞募集、抗原呈递、共刺激来启动和增强适应性免疫反应(参见Yang L,Zhang Y.Tumor-Associated Macrophages:From Basic Research to Clinical Application.J HematolOncol，2017，10:58)。
研究发现，T细胞领域的基本CAR设计原则也适用于巨噬细胞，传统的CAR是模块化跨膜蛋白，由胞外抗原识别结构域、铰链结构域和一个或多个胞质信号结构域组成。已经证明，包含针对广泛代表性靶点CD19、HER2和间皮素的scFv、CD8铰链和跨膜结构域以及CD3ze胞内结构域的CAR能够有效地重定向巨噬细胞，引导抗原依赖性吞噬作用、细胞因子释放和抗肿瘤活性(参见Eshhar Z,Waks T,Gross G,Schindler DG.Specific Activation andTargeting of Cytotoxic Lymphocytes Through Chimeric Single Chains Consistingof Antibody-Binding Domains and the Gamma or Zeta Subunits of theImmunoglobulin and T-Cell Receptors.Proc Natl Acad Sci，1993，90:720–724)。CD3δ由于其在T细胞激活中的作用而被用于CAR，但其胞质结构域与驱动ADCP的巨噬细胞天然Fc受体共同伽马链(FcRγ)具有显着的同源性，都具有3个ITAM结构域，用CD3z或FcRγ激活结构域构建的嵌合抗原受体巨噬细胞(CAR-M)在吞噬试验中功能相似。
在上述研究基础上，本发明首先构建了靶向EGFRvIII的嵌合抗原受体，并对其胞内信号域进行了调整和强化，随后在此基础上制备CAR-M细胞，以便提高抗肿瘤能力，有助于开发新型肿瘤免疫治疗药物。
发明内容
本发明中的第一方面提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括靶向EGFRvIII的单链可变区、铰链区、跨膜区和胞内信号区，所述靶向EGFRvIII的单链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的轻链可变区。
CAR-M疗法能够清除肿瘤细胞，CAR-M可以通过招募T细胞和交叉提呈被吞噬细胞的抗原来协调抗肿瘤T细胞反应，增加了瘤内T细胞浸润、NK细胞浸润、树突状细胞浸润/激活和TIL激活，还促进血清中促炎细胞因子IL-6和TNF-α的水平，表明出现了全身免疫反应(参见Morrissey MA,Williamson AP,Steinbach AM,Roberts EW,Kern N,Headley MB,etal..Chimeric Antigen Receptors That Trigger Phagocytosis.Elife，2018，7:e36688)。此外，巨噬细胞可以直接感知缺氧条件及其代谢物，例如低pH值，并迁移到肿瘤环境中，因而具有治疗优势。
靶抗原的选择至关重要，在CAR疗法中，理想的靶抗原是那些仅在恶性细胞上表达的肿瘤特异性抗原，但在实体肿瘤抗原中却存在困难，几乎所有肿瘤细胞抗原均在正常细胞中表达。本发明中选择表皮生长因子受体变异体III(EGFRvIII)作为目标抗原，其在正常组织中表达很少，是理想的肿瘤靶点，已有多种免疫疗法基于该抗原展开。本发明中选择了与其具有较高亲和力的scFv构建嵌合抗原受体结构。
进一步的，所述铰链区为CD8α铰链区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步的，所述跨膜区为CD8α跨膜区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步的，所述胞内信号区包括CD28胞内信号域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；CD3ζ胞内信号域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；和FcRγ胞内信号域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
进一步的，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
如第一代CAR-T细胞所示，含有CD3结构域但不含共刺激结构域的CAR-T细胞体内活性有限，所有FDA批准的CAR-T产品都含有共刺激胞内结构域，如CD28或4-1BB。在CAR巨噬细胞中也观察到了类似的发现，据报道，磷酸肌醇3激酶(PI3K)信号传导对于大颗粒的吞噬作用很重要，CD19 PI3K招募结构域与CAR FcRγ的串联融合使目标全细胞的吞噬作用增加了三倍(参见Morrissey MA,Williamson AP,Steinbach AM,Roberts EW,Kern N,HeadleyMB,et al.Chimeric antigen receptors that trigger phagocytosis.Elife.2018；7)。本发明优选方案中使用CD3ζ、FcRγ和对PI3K具有激活作用的CD28共同作为胞内信号域，可以发挥更强的抗肿瘤作用。
本发明中的第二方面提供了一种表达载体，所述表达载体携带编码所述的嵌合抗原受体的核苷酸。
进一步的，所述表达载体选自慢病毒表达载体、逆转病毒表达载体或腺病毒表达载体中的至少一种。
本发明中的第三方面提供了一种嵌合抗原受体巨噬细胞，所述巨噬细胞表达所述的嵌合抗原受体。
本发明中的第四方面提供了一种所述的嵌合抗原受体巨噬细胞在制备肿瘤治疗药物中的应用，所述肿瘤为实体瘤。
进一步的，所述肿瘤为脑胶质瘤、膀胱癌、肝癌、肺癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌或乳腺癌中的至少一种。
有益效果
本发明提供了一种嵌合抗原受体(CAR)及其制备抗肿瘤药物的用途，具体如下有益效果：
(1)以肿瘤特异性抗原EGFRvIII为靶点，并提供了具有独特重链和轻链结构的单链可变区，能够与目标抗原高特异性结合；
(2)对CAR结构中的胞内信号域进行了选择和改进，提供了具有高细胞激活能力的胞内信号域结构；
(3)所述CAR-M细胞能够在体内、体外有效抑制肿瘤细胞生长，并促进体内免疫环境，发挥协同抗肿瘤作用。
附图说明
图1：CAR结构示意图；
图2：CAR-M细胞抑制胶质母细胞瘤细胞生长；
图3：CAR-M细胞抑制膀胱癌细胞生长；
图4：肿瘤动物模型生存期；
图5：动物血清中IL-1β表达水平；
图6：动物血清中TNF-α表达水平。
具体实施方式
以下实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂生物材料、检测试剂盒，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1巨噬细胞的制备
本发明中使用THP-1细胞(人急性单核细胞白血病细胞株)诱导制备巨噬细胞，该方法操作简单，研究背景成熟，且具有稳定可靠的细胞来源，相比于IPS诱导巨噬细胞存在癌变的安全性风险，单个核细胞诱导巨噬细胞中细胞来源受限，具有较强的应用前景。
复苏THP-1细胞(购买于美国标准微生物菌种保藏中心，ATCC)，从液氮中取出冻存的THP-1细胞，将其迅速放入37℃恒温水浴中，轻摇冻存管使冻存液快速融化，将细胞悬液加入37℃含10％FBS的细胞完全培养液中，放置于37℃、5％CO2恒温细胞培养箱中培养。
细胞传代培养，每日观察细胞生长状态，当细胞融合度达到85％以上时，弃去原细胞培养液，使用无菌PBS洗涤2次，胰酶消化后，1000rpm离心5min收集细胞，然后将1×105个细胞接种于细胞培养皿中，加入含10％FBS的细胞完全培养液，置于37℃、5％CO2恒温细胞培养箱中培养。
巨噬细胞诱导培养，细胞传代3次后，调整THP-1细胞密度至5×105个/ml，在细胞悬液中加入佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)使其终浓度为100ng/ml，随后将细胞悬液接种于培养板中，在培养液中诱导分化培养24h，获得巨噬细胞。
实施例2嵌合抗原受体的设计
本发明中选择EGFRvIII为目标抗原，经噬菌体展示文库筛选出与目标抗原具有高亲和力的抗体，经测定其亲和力可达1.54nM。随后对该抗体进行序列测定，其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的。
研究表明，经典的嵌合抗原受体结构可用于巨噬细胞中，但在胞内信号域的选择方面有所不同，除经典的CD3ζ胞内信号域外，还可用FcRγ或Megf10等其他刺激激活域。并且，在胞内加入PI3K募集结构域可增强吞噬作用，如Meghan等在CAR结构中加入CD19细胞质结构域的募集PI3K的p85亚基的部分(氨基酸500至534)，形成“串联”CAR，大幅提高了CAR-M的抗肿瘤作用(参见Morrissey MA,Williamson AP,Steinbach AM,Roberts EW,Kern N,Headley MB,et al..Chimeric Antigen Receptors That Trigger Phagocytosis.Elife，2018，7:e36688)。CD28共刺激支持PI3k激活，从而导致细胞周期进程、抗凋亡和细胞代谢(参见T Sasaki，et al，Function ofPI3Kgamma in thymocyte development,T cellactivation,and neutrophil migration，Science，2000，11；287(5455):1040-1046)。因此，本发明中在CAR的胞内信号域部分添加CD28激活域，以便提高抗肿瘤疗效。
如图1所示，为了便于分析和比较，本发明中设计了4种CAR，均包括靶向EGFRvIII的单链可变区、铰链区、跨膜区和胞内信号区等元件，区别在于CAR01的胞内信号区仅为CD3ζ胞内信号域，CAR02的胞内信号区仅为FcRγ胞内信号域，CAR03的胞内信号区为CD3ζ胞内信号域和FcRγ胞内信号域，CAR04的胞内信号区为CD28、CD3ζ胞内信号域和FcRγ胞内信号域。其中，所述铰链区为CD8α铰链区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述跨膜区为CD8α跨膜区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；CD28胞内信号域氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；CD3ζ胞内信号域氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；FcRγ胞内信号域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。所述CAR-4的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。将所述4种嵌合抗原受体结构交由生工生物工程(上海)股份有限公司进行人工合成，获得嵌合抗原受体的序列结构。
实施例3CAR-M制备
构建携带所述嵌合抗原受体核苷酸的慢病毒载体，将所述慢病毒载体与实施例1中制备的巨噬细胞按10:1比例混合，置于37℃、5％CO2恒温细胞培养箱中培养。48h后，弃去含有病毒的培养基，加入新鲜培养液后，继续培养24-48h，通过荧光显微镜或流式细胞仪检测阳性率。经鉴定阳性率达85％以上，符合后续实验要求。所述CAR-M细胞分别记为CAR01-M、CAR02-M、CAR03-M、CAR04-M。
实施例4体外抗肿瘤实验
EGFR vIII是胶质母细胞瘤(GB)的完美治疗靶点，它在28-30％的GB细胞中表达，还有研究表明EGFR vIII在胃癌、结直肠癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌肝癌等多种肿瘤细胞表达(参见Adrianna R，et al，EGFRvIII:An Oncogene with Ambiguous Role，J Oncol.2019，1092587)，因此靶向EGFR vIII的CAR-M可用于多种实体肿瘤的治疗。本发明中选择胶质母细胞瘤细胞系U87和膀胱癌细胞系T24为对象，考察CAR-M的抑癌作用。
4.1CAR-M抑制胶质母细胞瘤细胞生长
按10:1的比例，将实施例3中制备的CAR-M细胞与U87细胞置于96孔板中共培养，每组设置5个复孔，于37℃、5％CO2培养箱中培养。以CAR-M细胞单独培养，作为对照组效应细胞，单独培养U87细胞作为对照组靶细胞。共培养24h后，每孔加入10μL CCK-8溶液，孵育2h，酶标仪于450nm处检测各孔吸光度OD值。计算出每组肿瘤细胞杀伤率＝[1-(共培养OD值-对照效应细胞OD值)/对照靶细胞OD值]×100％。
如图2所示，靶向EGFR vIII的CAR-M细胞能够有效杀死胶质母细胞瘤细胞，说明本发明中所提供的scFv片段能够有效识别EGFR vIII抗原，进而诱导巨噬细胞发挥吞噬作用。在胞内信号域方面，CD3ζ和FcRγ的差别不大，二者无显著差异，但二者同时使用时，似乎能够更有效的激活巨噬细胞，其抗肿瘤活性更强。并且，当在胞内信号域中加入CD28后，肿瘤杀伤能力明显提高，说明这种组合的胞内信号域更具优势。
4.2CAR-M抑制膀胱癌细胞生长
肿瘤抑制实验方法同4.1节，结果如图3所示，虽然靶向EGFR vIII的CAR-M细胞能够抑制膀胱癌细胞的生长，但是选用CD3ζ或FcRγ以及二者的组合，肿瘤杀伤效率近似，未见显著差异，而引入CD28后，提高了巨噬细胞的激活程度，使得肿瘤抑制率大幅提高。
实施例5体内抗肿瘤实验
5.1给药治疗和动物存活时间
复苏并培养U87细胞至对数生长期，取5×106个U87细胞接种于裸鼠背部，每天观察成瘤情况并记录，肿瘤体积生长至100mm3以上时，表示造模成功。取50只造模成功小鼠，随机分为5组，分别为CAR01-M组：静脉注射1×106个CAR01-M细胞；CAR02-M组：静脉注射1×106个CAR02-M细胞；CAR03-M组：静脉注射1×106个CAR02-M细胞；CAR04-M组：静脉注射1×106个CAR02-M细胞；对照组，注射等体积生理盐水。每天观察动物生长状态，记录动物存活时间。
如图4所示，CAR-M治疗可以延长动物生存期间，并且CAR03-M和CAR04-M的效果更为明显，这与体外细胞实验结果一致，说明这两种CAR-M的抗肿瘤作用更强。
5.2调节免疫因子水平
治疗2周后，收集动物血液，2500rpm离心5min获得上层血清，使用ELISA试剂盒(购自MABTECH公司)检查血清中IL-1β和TNF-α表达水平，具体步骤按照试剂盒说明书进行。结果如图5、图6所示，与对照组相比，CAR-M细胞治疗能够明显提升IL-1β和TNF-α表达量，分别采用CD3ζ和FcRγ构建的CAR-M细胞差别不大，但似乎CD3ζ的CAR-M细胞在促进IL-1β分泌方面更具优势；CD3ζ和FcRγ共同使用，在促进免疫因子分泌方面更加有效，并且在引入CD28后，这种作用得到进一步强化，相关免疫因子，尤其是TNF-α表达水平进一步提高。
以上所述技术方案，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (9)
1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括靶向EGFRvIII的单链可变区、铰链区、跨膜区和胞内信号区，所述靶向EGFRvIII的单链可变区包括氨基酸序列如SEQID NO.1所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的轻链可变区。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述铰链区为CD8α铰链区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜区为CD8α跨膜区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内信号区包括CD28胞内信号域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；CD3ζ胞内信号域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；和FcRγ胞内信号域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
5.根据权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体携带编码权利要求1-5任一项所述的嵌合抗原受体的核苷酸。
7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体选自慢病毒表达载体、逆转病毒表达载体或腺病毒表达载体中的至少一种。
8.一种嵌合抗原受体巨噬细胞，其特征在于，所述巨噬细胞表达权利要求1-5任一项所述的嵌合抗原受体。
9.权利要求8所述的嵌合抗原受体巨噬细胞在制备肿瘤治疗药物中的应用，所述肿瘤为脑胶质瘤或膀胱癌。
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