CN117756892A - 生物治疗药物的靶点结合特异性的高通量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种抗体或CAR‑T细胞的靶点结合特异性的高通量检测方法，所述特异性特别是针对膜蛋白。本发明还提供了一种蛋白的结合靶点的筛选方法。本发明的检测方法和筛选方法能够针对人类基因全部6000种膜蛋白，是基于6000种细胞膜蛋白的高通量平台技术，全面、可信，操作简便，检测过程耗时短，可以大幅度提高特异性检测与靶点筛选的准确度、重复性以及效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体而言，本发明涉及生物治疗药物的靶点结合特异性的高通量检测方法。
背景技术
抗体、CAR-T细胞及其他生物治疗药物对其结合靶点的特异性是评价该药物质量的重要指标。这类药物与其靶点以外的蛋白或其他分子的非特异性结合可能会带来严重的毒副反应，因此特异性检测是成药过程中的重要评估环节。但是，目前抗体药物或CAR-T细胞疗法往往仅在临床实验阶段发现严重不良反应后再来验证过程中是否存在非特异性结合，这可能会导致用药安全事故及前期研究的前功尽弃。
抗体药物的治疗与作用机制之一为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用(ADCC，antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)。ADCC是指抗体的Fab段结合病毒感染细胞或肿瘤细胞的抗原表位，Fc段与杀伤细胞表面的FcR结合，从而介导杀伤细胞直接杀伤该靶细胞。在ADCC作用的发生过程中，抗体与靶细胞上相应抗原表位特异性结合，故抗体与靶细胞上的靶点结合应是特异性的。CAR-T(CAR-T，chimeric antigen receptor T-cell)细胞疗法应用经构建具有肿瘤嵌合抗原受体的T细胞即CAR-T细胞，利用这种细胞对肿瘤细胞上相应抗原配体的特异性结合，通过免疫作用释放大量的多种效应因子而杀灭该靶细胞。故CAR-T细胞与靶细胞上的靶点结合也应是特异性的。
因此，可以考虑利用抗体和CAR-T细胞的上述特定作用机制来开发生物治疗药物的靶点结合特异性的检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种生物治疗药物(例如抗体或CAR-T细胞)的靶点结合特异性的检测方法。本发明的另一个目的是提供一种蛋白(例如抗体或CAR蛋白)的结合靶点的筛选方法。
本发明的技术方案如下。
一方面，本发明提供一种抗体或CAR-T细胞的靶点结合特异性的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
(1)通过瞬时转染将膜蛋白表达载体转染进入靶细胞，使所述靶细胞在细胞膜上表达所述膜蛋白；
(2)向步骤(1)得到的靶细胞加入具有NFAT-luc2荧光素酶报告系统并表达FcγRⅢA的效应细胞和待检测抗体，孵育；或者
向步骤(1)得到的靶细胞加入具有NFAT-luc2荧光素酶报告系统的CAR-T细胞，孵育；
(3)向步骤(2)得到的反应体系中加入荧光素酶检测试剂，孵育，检测荧光信号值；
(4)基于步骤(3)得到的荧光信号值来判断所述抗体或CAR-T细胞是否特异性结合所述膜蛋白。
在本发明提供的所述检测方法的步骤(1)中，优选地，所述膜蛋白为选自人类基因全部6000种细胞膜蛋白的一种、多种或全部。
优选地，瞬时转染为瞬时且反向转染。
优选地，转染时间为24h。
优选地，所述靶细胞本身不表达所述膜蛋白。根据需要选择培养速度快、转染效率高的细胞作为靶细胞。根据本发明的具体实施方式，所述靶细胞为选自HEK-293T、QT6和B16F10细胞的一种或多种。
优选地，步骤(1)中使所述靶细胞在细胞膜上过量表达所述膜蛋白。
在本发明提供的所述检测方法的步骤(2)中，优选地，加入的效应细胞或CAR-T细胞与靶细胞的数量比值为1:1。
优选地，所述抗体为Fc段为人源的抗体。例如，所述抗体为人源单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
优选地，加入的待检测抗体在步骤(2)的反应体系中的浓度为区分因子最大时的相应的浓度，所述区分因子是加入抗体与不加抗体进行所述检测方法得到的两个荧光信号值的比值。优选地，加入抗体使其在步骤(2)的反应体系中的浓度为1μg/mL。
优选地，步骤(2)中孵育6h。
根据本发明的具体实施方式，所述效应细胞或CAR-T细胞为Jurkat细胞。
在本发明提供的所述检测方法的步骤(3)中，优选地，加入荧光素酶检测试剂后，在室温下孵育10-15min。
根据本发明的具体实施方式，所述荧光素酶检测试剂为Bright-Lite Luciferase检测试剂。
根据本发明的具体实施方式，所加入荧光素酶检测试剂的体积与步骤(2)的反应体系的体积相等。
优选地，本发明提供的所述检测方法的步骤(4)包括：
将步骤(1)得到的靶细胞替换为未经膜蛋白表达载体转染的靶细胞，进行步骤(2)和步骤(3)，检测得到的荧光信号值作为背景值；将步骤(3)得到的荧光信号值与背景值的比值作为结合倍数，当结合倍数＝0.8-1.2时，确定所述抗体或CAR-T细胞与所述膜蛋白不结合；当结合倍数>1.2且<最大结合倍数时，确定所述抗体或CAR-T细胞与所述膜蛋白非特异性结合，其中，所述最大结合倍数为所述抗体或CAR-T细胞结合其阳性靶点的结合倍数。在本发明的上下文中，抗体的阳性靶点是指抗体的已知靶标抗原，例如获得所述抗体的抗原或免疫原；CAR-T细胞的阳性靶点是指嵌合抗原受体的已知配体。
另一方面，本发明提供一种蛋白的结合靶点的筛选方法，所述筛选方法包括以下步骤：
(1)通过瞬时转染将膜蛋白表达载体转染进入靶细胞，使所述靶细胞在细胞膜上表达所述膜蛋白；
(2)向步骤(1)得到的靶细胞加入具有NFAT-luc2荧光素酶报告系统并表达FcγRⅢA的效应细胞和待检测蛋白，孵育；或者
将待检测蛋白作为胞外结构域或其一部分而构建得到CAR蛋白，并将所述CAR蛋白构建到具有NFAT-luc2荧光素酶报告系统的T细胞中得到CAR-T细胞；向步骤(1)得到的靶细胞加入所述CAR-T细胞，孵育；
(3)向步骤(2)得到的反应体系中加入荧光素酶检测试剂，孵育，检测荧光信号值；
(4)基于步骤(3)得到的荧光信号值来判断所述膜蛋白是否为所述蛋白的结合靶点。
在本发明提供的所述筛选方法的步骤(1)中，优选地，所述膜蛋白为选自人类基因全部6000种细胞膜蛋白的一种、多种或全部。
优选地，瞬时转染为瞬时且反向转染。
优选地，转染时间为24h。
优选地，所述靶细胞本身不表达所述膜蛋白。根据需要选择培养速度快、转染效率高的细胞作为靶细胞。根据本发明的具体实施方式，所述靶细胞为选自HEK-293T、QT6和B16F10细胞的一种或多种。
优选地，步骤(1)中使所述靶细胞在细胞膜上过量表达所述膜蛋白。
在本发明提供的所述筛选方法的步骤(2)中，优选地，加入的效应细胞与靶细胞的数量比值为1:1。
优选地，所述待检测蛋白是以膜蛋白为靶点的蛋白，例如靶点为膜蛋白的抗体，或包含所述抗体的抗原结合片段的多肽分子。优选地，所述抗体为Fc段为人源的单克隆抗体，例如人源单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
优选地，加入的待检测蛋白在步骤(2)的反应体系中的浓度为区分因子最大时的相应的浓度，所述区分因子是加入蛋白与不加蛋白进行所述筛选方法得到的两个荧光信号值的比值。优选地，加入蛋白使其在步骤(2)的反应体系中的浓度为1μg/mL。
优选地，步骤(2)中孵育6h。
根据本发明的具体实施方式，所述效应细胞或CAR-T细胞为Jurkat细胞。
在本发明提供的所述筛选方法的步骤(3)中，优选地，加入荧光素酶检测试剂后，在室温下孵育10-15min。
根据本发明的具体实施方式，所述荧光素酶检测试剂为Bright-Lite Luciferase检测试剂。
根据本发明的具体实施方式，所加入荧光素酶检测试剂的体积与步骤(2)的反应体系的体积相等。
优选地，本发明提供的所述筛选方法的步骤(4)包括：
将步骤(1)得到的靶细胞替换为未经膜蛋白表达载体转染的靶细胞，进行步骤(2)和步骤(3)，检测得到的荧光信号值作为背景值；将步骤(3)得到的荧光信号值与背景值的比值作为结合倍数，当结合倍数＝0.8-1.2时，确定所述膜蛋白不是所述蛋白的结合靶点；当结合倍数>1.2时，确定所述膜蛋白是所述蛋白的结合靶点。
相对于现有技术，本发明构建了抗体或CAR-T细胞的靶点结合特异性的新型检测方法。其中，所构建的抗体靶点结合特异性检测方法基于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)；CAR-T细胞靶点结合特异性检测方法基于CAR-T细胞上嵌合抗原受体与其配体的特异结合作用。所述的特异性检测包括了膜蛋白表达载体、细胞表面过表达膜蛋白的靶细胞、具有NFAT-luc2荧光素酶报告系统的效应细胞或具有NFAT-luc2荧光素酶报告系统的CAR-T细胞的利用。
在本发明提供的检测方法中，所述膜蛋白表达载体覆盖人类基因全部6000种细胞膜蛋白，即结合特异性的筛选位点包括全部人类细胞膜蛋白。因此，本发明提供的检测方法为基于人类基因全部6000种细胞膜蛋白的高通量平台技术，特别适用于对针对膜蛋白的抗体或CAR-T细胞的靶点结合特异性进行高通量筛选。
在本发明提供的检测方法中，针对本领域目前常规使用、开发的生物治疗药物，在本发明提供的检测方法中选用了HEK-293T、QT6或B16F10细胞作为过量表达膜蛋白的靶细胞，根据膜蛋白不同而选用不同的靶细胞，以达到背景干扰最低。
在检测抗体的特异性时，构建了具有NFAT-luc2荧光素酶报告系统和FcγRⅢA的效应细胞。膜蛋白表达载体瞬时转染进入靶细胞并在细胞膜上过量表达膜蛋白；待检测抗体、效应细胞与靶细胞共同孵育；当待检测抗体识别并与靶细胞膜上膜蛋白表位结合，其Fc段与效应细胞表面的FcγRⅢA结合，激活荧光素酶报告系统释放荧光素酶，进而与加入的荧光素底物反应产生荧光信号。通过荧光信号的大小来判断所释放的荧光素酶的量，由此反映抗体与膜蛋白的结合效果。
在检测CAR-T细胞的特异性时，构建了具有NFAT-luc2荧光素酶报告系统的CAR-T细胞。膜蛋白表达载体瞬时转染进入靶细胞并在细胞膜上过量表达膜蛋白；CAR-T细胞与靶细胞共同孵育；当CAR-T细胞上的嵌合抗原受体识别并与靶细胞膜上膜蛋白表位结合，激活荧光素酶报告系统释放荧光素酶，进而与加入的荧光素底物反应产生荧光信号。通过荧光信号的大小来判断所释放的荧光素酶的量，由此反映CAR-T细胞与膜蛋白的结合效果。
本发明的检测方法利用了抗体及CAR-T细胞与靶点结合后激发NFAT-luc2荧光素酶报告系统释放荧光素酶的能力，产生的发光信号与靶点的结合严格对应，由此反映其与膜蛋白的结合能力。本发明的检测方法能够用于检测全部6000个可能结合的膜蛋白靶点，靶点蛋白全面，结果可信，操作简便，检测过程耗时短，可以大幅度提高特异性检测的准确度、重复性以及效率。
进一步地，本发明的检测方法不仅适用于抗体、CAR-T细胞及其他生物治疗药物靶点结合特异性的分析，还适用于蛋白的可能的结合位点筛选。因此，本发明还提供了蛋白的结合靶点的筛选方法，该蛋白可以为抗体，直接加入；也可以作为CAR胞外结构域或其部分构建成CAR-T细胞而加入。通过比较在膜蛋白过量表达情况下加入蛋白或CAR-T细胞检测到的荧光信号与无膜蛋白表达情况下加入蛋白或CAR-T细胞检测到的荧光信号，可以确认该膜蛋白是否为所检测蛋白的潜在或可能的结合靶点，为进一步的研究或应用提供信息。同样，这一结合靶点的筛选方法为基于人类基因全部6000种细胞膜蛋白的高通量平台技术，特别适合于在该膜蛋白范围内进行蛋白可能结合靶点的全面、可信、简便、高效筛选。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为本发明的检测方法和筛选方法的示意图，(A)针对膜蛋白的抗体/蛋白结合检测；(B)针对膜蛋白的CAR-T细胞结合检测。
图2为SHR-1210抗体特异性检测结合倍数分布。
图3为CAR-T细胞特异性检测结合倍数分布。
图4为B7H3单克隆抗体在不同靶细胞情况下的特异性检测结果。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
本发明的检测方法为一种高通量的针对膜蛋白的生物治疗药物靶点结合特异性检测方法，具体地，包括以下步骤：
A、膜蛋白表达载体的瞬时反向转染
膜蛋白表达载体与转染试剂按照1:2(w/v)的比例溶解在转染缓冲液，孵育10min后转移至96孔细胞培养板中，加入靶细胞转染24小时。
B、加入与靶细胞等量的效应细胞，加入区分因子最大时相应浓度的待检测抗体，或加入相应CAR-T细胞，共同孵育6小时。
C、加入与反应体积相等的荧光素底物，室温放置10分钟，检测荧光素酶发光。
D、计算对各个膜蛋白的结合倍数，分析是否结合或是否为特异性结合。
根据本发明，各实验组荧光素酶发光读值与背景读值相比较为该实验组结合倍数，并且检测得到抗体对其阳性靶点的结合倍数，将该结合倍数作为最大结合倍数。当结合倍数≈1(0.8-1.2)时，认为被检测抗体与该靶点不结合；当结合倍数>1.2且<最大结合倍数时，认为被检测抗体与该靶点非特异性结合。
本发明的筛选方法为一种高通量的针对膜蛋白的生物治疗药物结合靶点筛选方法，具体地，包括以下步骤：
A、膜蛋白表达载体的瞬时反向转染
膜蛋白表达载体与转染试剂按照1:2(w/v)的比例溶解在转染缓冲液，孵育10min后转移至96孔细胞培养板中，加入靶细胞转染24小时。
B、加入与靶细胞等量的效应细胞，加入区分因子最大时相应浓度的待检测生物治疗药物，或将该生物治疗药物构建得到CAR-T细胞并加入，共同孵育6小时。
C、加入与反应体积相等的荧光素底物，室温放置10分钟，检测荧光素酶发光。
D、计算对各个膜蛋白的结合倍数，分析是否为结合靶点。
根据本发明，各实验组荧光素酶发光读值与背景读值相比较为该实验组结合倍数。当结合倍数≈1(0.8-1.2)时，认为该膜蛋白不是蛋白的结合靶点；当结合倍数>1.2时，认为该膜蛋白是蛋白的结合靶点。
图1为本发明的检测方法和筛选方法的示意图。
实施例1SHR-1210抗体(卡瑞利珠单抗)的特异性检测与靶点筛选
(1)转染体系的建立
膜蛋白表达载体加入96孔细胞培养板中，转染试剂按照1:2(w/v)的比例溶解在转染缓冲液中加入至96孔细胞培养板，与表达载体共同孵育10min，加入2×104个HEK-293T细胞至反应体积为75μL，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养24h。
(2)待测抗体对效应细胞的激活
使用工程改造的Jurkat细胞作为细胞的效应细胞，该细胞稳定表达FcγRⅢA受体，由NFAT应答元件驱动表达荧光素酶，转染后的反应体系中加入2×104个效应细胞，体积为15μL。待检测抗体稀释至浓度为10μg/mL，反应体系中加入10μL待检测抗体。置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养6h。
(3)荧光素酶的检测
培养箱中取出细胞培养板，平衡至室温。加入100μL Bright-Lite Luciferase检测试剂混合均匀，室温放置10min，检测萤火虫荧光素酶发光。
(4)数据分析及检测抗体结合靶点的判定
未经膜蛋白表达载体转染的靶细胞、效应细胞及检测抗体体系的读值求取平均值为该实验的背景读值。各孔荧光素酶发光读值与背景读值相比较为结合倍数。检测得到抗体对其阳性靶点(PD1)的结合倍数，将该结合倍数作为最大结合倍数。当结合倍数≈1(0.8-1.2)时，认为被检测抗体与该靶点不结合；当结合倍数>1.2且<最大结合倍数时，认为被检测抗体与该靶点非特异性结合。
检测结果表明，相对于该抗体的阳性靶点PD1，确定该抗体的非特异性结合靶点为VEGFR2、ULBP2、FZD5，这一检测结果与本领域在先报道的SHR-1210抗体非特异性结合靶点(参见William J.J.Finlay等人，“Anti-PD1“SHR-1210”aberrantly targets pro-angiogenic receptors and this polyspecificity can be ablated by paratoperefinement”，MABS 2019,VOL.11,NO.1,26-44)相一致。结果见图2。
实施例2CD19 CAR-T细胞的特异性检测与靶点筛选
(1)转染体系的建立
参见实施例1中的(1)。
(2)待测CAR-T细胞与靶点的结合
将靶向CD19的CAR蛋白构建在工程改造后由NFAT应答元件驱动表达荧光素酶的Jurkat细胞上，该细胞作为效应细胞，转染后的反应体系中加入2×104个效应细胞，体积为25μL。置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养6h。
(3)荧光素酶的检测
参见实施例1中的(3)。
(4)数据分析及检测CAR-T细胞结合靶点的判定
未经膜蛋白表达载体转染，靶细胞、效应细胞体系的读值求取平均值为该实验的背景读值。各孔荧光素酶发光读值与背景读值相比较为结合倍数。检测得到CAR-T细胞对其阳性靶点(CD19)的结合倍数，将该结合倍数作为最大结合倍数。当结合倍数≈1(0.8-1.2)时，认为被检测CAR-T细胞与该靶点不结合；当结合倍数>1.2且<最大结合倍数时，认为被检测CAR-T细胞与该靶点非特异性结合。
检测结果表明，该检测CAR-T细胞仅对其阳性靶点CD19具有特异性，其结合特异性良好，这一检测结果与所构建的CAR蛋白为靶向CD19的CAR蛋白相一致。结果见图3。
实施例3抗B7H3单克隆抗体的特异性检测与靶点筛选
(1)转染体系的建立
膜蛋白表达载体加入96孔细胞培养板中，转染试剂按照1:2(w/v)的比例溶解在转染缓冲液中加入至96孔细胞培养板，与表达载体共同孵育10min，分别加入2×104个HEK-293T、QT6细胞或B16F10细胞至反应体积为75μL，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养24h。
(2)待测抗体激活效应细胞
参见实施例1中的(2)。
(3)荧光素酶的检测
参见实施例1中的(3)。
(4)数据分析及检测抗体结合靶点的判定
参见实施例1中的(4)。
检测结果表明，由于HEK-293T细胞表面本身即表达有B7H3，因此造成了较强的背景值干扰；QT6及B16F10细胞本身不表达B7H3，经转染表面表达了该抗体的结合靶点，能够用于特异性检测。结果见图4。
此外，上述实施例的检测结果表明，在蛋白靶点未知的情况下，通过本发明提供的方法，可以筛选得到该蛋白的潜在或可能的结合靶点，为进一步的研究或应用提供信息。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
Claims (10)
1.一种抗体或CAR-T细胞的靶点结合特异性的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
(1)通过瞬时转染将膜蛋白表达载体转染进入靶细胞，使所述靶细胞在细胞膜上表达所述膜蛋白；
(2)向步骤(1)得到的靶细胞加入具有NFAT-luc2荧光素酶报告系统并表达FcγRⅢA的效应细胞和待检测抗体，孵育；或者
向步骤(1)得到的靶细胞加入具有NFAT-luc2荧光素酶报告系统的CAR-T细胞，孵育；
(3)向步骤(2)得到的反应体系中加入荧光素酶检测试剂，孵育，检测荧光信号值；
(4)基于步骤(3)得到的荧光信号值来判断所述抗体或CAR-T细胞是否特异性结合所述膜蛋白。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述膜蛋白为选自人类基因全部6000种细胞膜蛋白的一种、多种或全部；
优选地，瞬时转染为瞬时且反向转染；
优选地，转染时间为24h；
优选地，所述靶细胞本身不表达所述膜蛋白；进一步优选地，所述靶细胞为选自HEK-293T、QT6和B16F10细胞的一种或多种；
优选地，使所述靶细胞在细胞膜上过量表达所述膜蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，加入的效应细胞或CAR-T细胞与靶细胞的数量比值为1:1；
优选地，所述抗体为Fc段为人源的单克隆抗体，例如人源单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体；
优选地，加入的待检测抗体在步骤(2)的反应体系中的浓度为区分因子最大时的相应的浓度，所述区分因子是加入抗体与不加抗体进行所述检测方法得到的两个荧光信号值的比值；进一步优选地，加入抗体使其在步骤(2)的反应体系中的浓度为1μg/mL；
优选地，孵育6h；
优选地，所述效应细胞或CAR-T细胞为Jurkat细胞。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中，加入荧光素酶检测试剂后，在室温下孵育10-15min；
优选地，所述荧光素酶检测试剂为Bright-Lite Luciferase检测试剂；
优选地，所加入荧光素酶检测试剂的体积与步骤(2)的反应体系的体积相等。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤(4)包括：
将步骤(1)得到的靶细胞替换为未经膜蛋白表达载体转染的靶细胞，进行步骤(2)和步骤(3)，检测得到的荧光信号值作为背景值；将步骤(3)得到的荧光信号值与背景值的比值作为结合倍数，当结合倍数＝0.8-1.2时，确定所述抗体或CAR-T细胞与所述膜蛋白不结合；当结合倍数>1.2且<最大结合倍数时，确定所述抗体或CAR-T细胞与所述膜蛋白非特异性结合，其中，所述最大结合倍数为所述抗体或CAR-T细胞结合其阳性靶点的结合倍数。
6.一种蛋白的结合靶点的筛选方法，所述筛选方法包括以下步骤：
(1)通过瞬时转染将膜蛋白表达载体转染进入靶细胞，使所述靶细胞在细胞膜上表达所述膜蛋白；
(2)向步骤(1)得到的靶细胞加入具有NFAT-luc2荧光素酶报告系统并表达FcγRⅢA的效应细胞和待检测蛋白，孵育；或者
将待检测蛋白作为胞外结构域或其一部分而构建得到CAR蛋白，并将所述CAR蛋白构建到具有NFAT-luc2荧光素酶报告系统的T细胞中得到CAR-T细胞；向步骤(1)得到的靶细胞加入所述CAR-T细胞，孵育；
(3)向步骤(2)得到的反应体系中加入荧光素酶检测试剂，孵育，检测荧光信号值；
(4)基于步骤(3)得到的荧光信号值来判断所述膜蛋白是否为所述蛋白的结合靶点。
7.根据权利要求6所述的筛选方法，其特征在于，步骤(1)中，所述膜蛋白为选自人类基因全部6000种细胞膜蛋白的一种、多种或全部；
优选地，瞬时转染为瞬时且反向转染；
优选地，转染时间为24h；
优选地，所述靶细胞本身不表达所述膜蛋白；进一步优选地，所述靶细胞为选自HEK-293T、QT6和B16F10细胞的一种或多种；
优选地，步骤(1)中使所述靶细胞在细胞膜上过量表达所述膜蛋白。
8.根据权利要求6或7所述的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，加入的效应细胞与靶细胞的数量比值为1:1；
优选地，所述待检测蛋白是以膜蛋白为靶点的蛋白，例如靶点为膜蛋白的抗体，或包含所述抗体的抗原结合片段的多肽分子；优选地，所述抗体为Fc段为人源的单克隆抗体，例如人源单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体；
优选地，加入的待检测蛋白在步骤(2)的反应体系中的浓度为区分因子最大时的相应的浓度，所述区分因子是加入蛋白与不加蛋白进行所述筛选方法得到的两个荧光信号值的比值；进一步优选地，加入蛋白使其在步骤(2)的反应体系中的浓度为1μg/mL；
优选地，步骤(2)中孵育6h；
优选地，所述效应细胞或CAR-T细胞为Jurkat细胞。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的筛选方法，其特征在于，步骤(3)中，加入荧光素酶检测试剂后，在室温下孵育10-15min；
优选地，所述荧光素酶检测试剂为Bright-Lite Luciferase检测试剂；
优选地，所加入荧光素酶检测试剂的体积与步骤(2)的反应体系的体积相等。
10.根据权利要求6至9中任一项所述的筛选方法，其特征在于，步骤(4)包括：
将步骤(1)得到的靶细胞替换为未经膜蛋白表达载体转染的靶细胞，进行步骤(2)和步骤(3)，检测得到的荧光信号值作为背景值；将步骤(3)得到的荧光信号值与背景值的比值作为结合倍数，当结合倍数＝0.8-1.2时，确定所述膜蛋白不是所述蛋白的结合靶点；当结合倍数>1.2时，确定所述膜蛋白是所述蛋白的结合靶点。
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