CN117752861A - 基于多糖Lubcan的可注射皮下填充水凝胶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于多糖Lubcan的可注射皮下填充水凝胶及其制备方法。所述方法将多糖Lubcan溶解于NaOH溶液中，搅拌均匀后加入交联剂聚乙二醇二缩水甘油醚，经交联反应后得到Lubcan水凝胶。本发明的制备条件温和，方法简单，成本低，容易实现产业化，制得的Lubcan水凝胶的耐降解性能优良、机械性能可调，生物相容性好，在体内持续时间长，适用于皮下软组织填充、除皱及关节腔润滑液替代等领域。

Description

基于多糖Lubcan的可注射皮下填充水凝胶及其制备方法

技术领域

本发明属于水凝胶领域，涉及一种基于多糖Lubcan的可注射皮下填充水凝胶及其制备方法。

背景技术

肿瘤切除、创伤性损伤、脂肪萎缩、先天性缺陷和衰老过程会导致皮下脂肪、胶原蛋白和肌肉等软组织的正常结构缺损。为了修复缺损，有许多人工填充物已被广泛应用于临床软组织填充。近年来用于微整形美容的可注射水凝胶发展尤为迅速，其中透明质酸作为天然细胞外基质的重要组成部分，具有十分良好的生物相容性，在保健和化妆品市场占据主导地位。然而，由于透明质酸酶的存在，透明质酸在体内极易被降解。现有的商用透明质酸水凝胶是将透明质酸和1,4丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)按一定条件交联制成的，一定程度上延长了降解时间，是现在面部年轻化医美中最为常用的皮下填充剂，但仍需在一年以内重复注射，增加了病人的痛苦。

中国专利CN111909872B中公开了一株类芽孢杆菌及其胞外多糖Lubcan的生产和制备方法，该类芽孢杆菌分泌的胞外多糖经过碱热法处理即可得到多糖Lubcan，多糖Lubcan具有与透明质酸相当的水分吸收和保持能力。同时，在发明人后续发表的论文中(The chemical properties and hygroscopic activity of the exopolysaccharidelubcan from Paenibacillus sp.ZX1905.Int J Biol Macromol.2020Dec 1；164:2641-2650.)发现多糖Lubcan在整个pH范围表现出剪切稀化效果。在低剪切速率下，多糖Lubcan在pH值为5.0～7.0时表现出良好的剪切稳定性。此外，与未经处理的皮肤相比，涂抹多糖Lubcan可以降低皮肤的摩擦系数，对皮肤具有良好的润滑效果，提高润滑性能。目前还未有将多糖Lubcan制备成水凝胶作为可注射皮下填充材料的文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种安全性高、力学性能优良、生物相容性好、体内降解时间长的基于多糖Lubcan的可注射皮下填充水凝胶及其制备方法。本发明以多糖Lubcan为原料，在碱性条件下，通过聚乙二醇二缩水甘油醚(PEGDE)与多糖Lubcan交联反应，制得多糖Lubcan基水凝胶。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

基于多糖Lubcan的可注射皮下填充水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

(1)将多糖Lubcan溶解于0.2M NaOH溶液中，在室温下搅拌，得到均匀的多糖溶液；

(2)在多糖溶液中加入聚乙二醇二缩水甘油醚，在室温下搅拌，经化学反应交联后得到Lubcan水凝胶；

(3)将Lubcan水凝胶用酸性溶液中和，再用水清洗除去多余的酸性溶液，然后在水中溶胀，得到多糖Lubcan含量为18～24mg/mL的中性Lubcan水凝胶；

(4)将中性Lubcan水凝胶高温灭菌，得到无菌、中性的Lubcan水凝胶。

进一步地，步骤(1)中，多糖溶液中多糖Lubcan的浓度为6～12wt％。

进一步地，步骤(2)中，多糖Lubcan和聚乙二醇二缩水甘油醚的质量体积比为1:0.3125～1:2，g:mL，该比例下均可形成生物相容性好、力学性能优良的可注射水凝胶。

进一步地，步骤(3)中，交联温度为30～60℃，反应时间为6～16h。

进一步地，步骤(3)中，酸性溶液为0.2M的HCl溶液。

进一步地，步骤(3)中，水为去离子水，清洗次数为8～15次。

进一步地，步骤(4)中，高温灭菌条件为121℃，20min。

进一步地，步骤(1)中，多糖溶液中多糖Lubcan的浓度为8wt％；步骤(2)中，多糖Lubcan和聚乙二醇二缩水甘油醚的质量体积比为1:0.85，g:mL；步骤(3)中，交联温度为40℃，反应时间为10～14h；步骤(4)中，中性Lubcan水凝胶中多糖Lubcan含量为20mg/mL。

本发明还提供上述制备方法制得的基于多糖Lubcan的可注射皮下填充水凝胶。

进一步地，本发明提供上述水凝胶在制备可注射皮下填充物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明制备工艺简单，反应条件温和，易于合成。

(2)本发明以多糖Lubcan为原料，无毒且易在体内降解清除的聚乙二醇二缩水甘油醚为交联剂，制得的可注射Lubcan水凝胶具有生物相容性好、力学性能优良，体内持续时间长的优点。

(3)本发明的Lubcan水凝胶注射力小于30N，不会对周围的组织施加过大的压力而造成疼痛，也不会因为注射力过大造成穿孔、出血等风险。本发明的Lubcan水凝胶作为一种软组织增强生物材料，可以满足皮下软组织填充的需求，同时通过调节交联剂的使用量、交联时间、交联温度可以实现水凝胶的力学性能的调控，以满足不同填充部位的力学要求，在美容医疗中有巨大的应用潜力。

附图说明

图1为Lubcan水凝胶成胶的形态图。

图2为Lubcan水凝胶可注射性示意图，其中(a)为Lubcan水凝胶剪切速率扫描曲线和Lubcan水凝胶通过25号和27号针注射的注射力图，(b)为Lub-1水凝胶和Lub-2水凝胶通过25号针注射的示意图。

图3为Lubcan水凝胶在小鼠背部注射的效果图，其中(a)为术后第1周、第2周、第4周、第6周和第16周剖开小鼠背部皮肤后所展现的Lubcan水凝胶的宏观实物图，(b)为Lubcan水凝胶在小鼠体内的降解趋势图。

图4为Lubcan水凝胶生物安全性的效果图，其中(a)为用不同浓度的Lubcan溶液和Lubcan水凝胶提取物培养24小时的L929细胞的存活率图，(b)为皮下注射Lubcan水凝胶1周后主要器官(心、肝、脾、肺、肾)的组织学评估。

具体实施方式

除非另有限定，本发明所用所有技术和科学术语都具有为本发明所属领域普通技术人员所普遍理解的含义。如无特殊说明，下述实施例中采用的试剂或材料可通过商业购买或参考现有方法合成。

实施例1

基于多糖Lubcan的可注射皮下填充水凝胶的制备：

(1)将多糖Lubcan粉末溶解于浓度为0.2M的NaOH水溶液中，在室温下搅拌，得到均匀的Lubcan浓度为8wt％的多糖溶液；

(2)在多糖溶液中加入聚乙二醇二缩水甘油醚交联剂，使得多糖和交联剂的质量体积比为1:0.85(g:mL)，在室温下搅拌均匀，分别在40℃经化学交联反应14h和10h，得到Lub-1水凝胶和Lub-2水凝胶；

(3)分别将Lub-1水凝胶和Lub-2水凝胶用0.2M的HCl溶液中和，再用中性去离子水清洗8～15次，加入适量去离子水溶胀到一定的体积，得到多糖含量为20mg/mL的中性Lub-1水凝胶和Lub-2水凝胶；

(4)分别将中性Lub-1水凝胶和Lub-2水凝胶于121℃、20min条件下高温高压灭菌，得到无菌、中性的Lub-1水凝胶和Lub-2水凝胶。

如图1所示，交联后，多糖溶液实现了凝胶化。

对比例1

本对比例与实施例1基本相同，不同之处在于步骤(1)中NaOH溶液的浓度为0.1M。该条件下，多糖Lubcan无法成胶。

实施例2

基于多糖Lubcan的可注射皮下填充水凝胶的可注射性的测定：

将上述无菌、中性的Lub-1水凝胶和Lub-2水凝胶分别进行测试，用流变仪对Lubcan水凝胶的可注射性进行了表征。在复合粘度测试中测量水凝胶的粘度随剪切速率(0.1-10001/s)的变化。再使用25号和27号针头分别将Lub-1水凝胶和Lub-2水凝胶装入1mL针筒中进行可注射性测试。

如图2中的(a)图所示，随着剪切速率的增加，Lub-1水凝胶和Lub-2水凝胶的粘度迅速降低了三个数量级。该结果在宏观水平上验证了可注射性。

如图2中的(b)图所示，2种水凝胶都能通过25号和27号针头顺利挤出，并整合在一起形成有粘性的整个凝胶，进一步直观地验证了Lubcan水凝胶的可注射性。

实施例3

基于多糖Lubcan的可注射皮下填充水凝胶的小鼠体内试验：

造模过程中，将小鼠随机分为3组，Lub-1水凝胶、Lub-2水凝胶和商用透明质酸水凝胶对照组，对小鼠背部进行脱毛处理，将Lub-1水凝胶、Lub-2水凝胶和商用透明质酸水凝胶注射入小鼠背侧。在注射水凝胶第1周、第2周、第4周、第6周、第16周后对小鼠进行处死，切下水凝胶区域的皮肤组织和水凝胶，观察水凝胶形态、大小以及测量水凝胶的质量变化。

如图3中的(a)图所示，对照组为商用透明质酸水凝胶，随着植入体内时间的变化，由于体内透明质酸酶的存在，对照组水凝胶的形态大小发生了较明显的变化；Lubcan水凝胶形态大小也发生了变化，Lub-2水凝胶稀软，可能是因为交联强度较弱，机械性能难以在皮下长时间维持，而Lub-1水凝胶则有较好的维持效果，但仍没有商用透明质酸水凝胶的皮下支撑力好。

如图3中的(b)图所示，商品透明质酸水凝胶在体内时间超过16周后已经降解到原来的43％左右。而Lub-1水凝胶则保有75％以上的质量，在体内不易降解，Lub-2由于交联强度较弱，其降解到原来质量的55％左右。

实施例4

基于多糖Lubcan的可注射皮下填充水凝胶的安全性评价：

(1)细胞毒性实验：

本实验采取MTT法和活/死显像法评价Lubcan和Lubcan水凝胶的体外细胞毒性。将L929细胞接种于96孔板中，培养24小时。将1ml水凝胶在DMEM中孵育48小时，在37℃下制备Lubcan水凝胶提取物，然后用含有不同浓度的Lubcan水凝胶提取物的常规DMEM培养基代替继续培养24小时。MTT处理后，在570nm处测定细胞活力。

(2)内脏安全性评价：

本实验通过在Balb/c小鼠背部皮下植入评估Lubcan水凝胶的体内降解和生物相容性。用27号针头皮下注射200μL无菌水凝胶至小鼠背侧。在植入7天后对小鼠进行安乐死。取主要脏器(心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏)进行H&E染色和Masson染色，分析Lubcan水凝胶是否对小鼠内脏器官具有毒性。

如图4中的(a)图所示，细胞活力在所有范围内都超过90％，这些结果表明Lubcan水凝胶具有良好的体外生物相容性。

如图4中的(b)图所示，从H&E染色图像中没有观察到明显的炎症反应或组织坏死。这进一步证实了Lubcan水凝胶的低体内毒性，具有良好的生物相容性。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.基于多糖Lubcan的可注射皮下填充水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将多糖Lubcan溶解于0.2 M NaOH溶液中，在室温下搅拌，得到均匀的多糖溶液；

（2）在多糖溶液中加入聚乙二醇二缩水甘油醚，在室温下搅拌，经化学反应交联后得到Lubcan水凝胶；

（3）将Lubcan水凝胶用酸性溶液中和，再用水清洗除去多余的酸性溶液，然后在水中溶胀，得到多糖Lubcan含量为18~24 mg/mL 的中性Lubcan水凝胶；

（4）将中性Lubcan水凝胶高温灭菌，得到无菌、中性的Lubcan水凝胶。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，多糖溶液中多糖Lubcan的浓度为6~12wt%。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，多糖Lubcan和聚乙二醇二缩水甘油醚的质量体积比为1:0.3125~1:2，g:mL。

4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，交联温度为30~60 ℃，反应时间为6~16h。

5. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，酸性溶液为0.2 M的HCl溶液。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，水为去离子水，清洗次数为8~15次。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，高温灭菌条件为121℃，20min。

8. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，多糖溶液中多糖Lubcan的浓度为8wt%；步骤（2）中，多糖Lubcan和聚乙二醇二缩水甘油醚的质量体积比为1:0.85，g:mL；步骤（3）中，交联温度为40 ℃，反应时间为10~14h；步骤（4）中，中性Lubcan水凝胶中多糖Lubcan含量为20 mg/mL。

9.根据权利要求1~8任一所述的制备方法制得的水凝胶。

10.根据权利要求9所述的水凝胶在制备可注射皮下填充物中的应用。