CN117729944A - 自组装生物相容性成像颗粒,其合成及其在成像技术中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物相容性颗粒,其包含包埋在聚儿茶酚胺或聚血清素基质内的氧化铁纳米颗粒,所述颗粒的悬浮液,用于制备所述颗粒的悬浮液的方法,包含所述颗粒的缀合物,以及所述颗粒和所述缀合物在成像技术中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及生物相容性颗粒,其包含包埋在聚儿茶酚胺或聚血清素基质内的氧化铁纳米颗粒,所述颗粒的悬浮液,用于制备所述颗粒的悬浮液的方法,包含所述颗粒的缀合物以及所述颗粒和所述缀合物在成像技术中的用途。
背景技术
磁共振成像(MRI)是一种很有前景的分子成像方式,但仍然受到低灵敏度的限制(Lohrke,J.et al.,Adv.Ther.,2016,33,1-28)。在人类组织中分子成像的相关靶的浓度通常为约10-9-10-12M,而MRI检测到的临床上批准的钆螯合物浓度超过10-6M。因此,有必要采取旨在将许多造影剂产生的原子与分子靶标结合的放大策略。迄今为止,纳米尺寸的造影剂,诸如直径为10-50nm的超小颗粒氧化铁(USPIO)已成为分子MRI研究的主要焦点(Laurent,S.et al.,Chem.Rev.,2008,108,2064-2110)。USPIO可以与靶向部分(诸如肽或抗体)缀合,且在人类中具有良好的安全特性。然而,低灵敏度(由于每个颗粒的铁有效负载量小)、低特异性(由于通过渗透的内皮屏障被动外渗)和给药与成像之间的较长延迟(静脉内注射后长达24小时)阻碍了USPIO作为靶向分子成像剂的用途(Gauberti,M.et al.,Front.Cell.Neurosci.,2014,8,389)。
最近,直径接近1μm的氧化铁(MPIO)微粒已被用作用于分子MRI的新型造影剂(McAteer,M.A.et al.,Nat.Med.,2007,13,1253-1258)。由于铁含量较高,MPIO显示出比USPIO更高的灵敏度(Gauberti,M.et al.,Theranostics,2018,8,1195-1212)。靶向MPIO用于分子MRI的适用性已在几种实验模型中得到证实,包括心血管(von zur Muhlen,C.etal.,Circulation,2008,118,258-267;von Zur Muhlen,C.et al.,J.Clin.Invest.,2008,118,1198-1207)和神经血管疾病(Quenault,A.et al.,Brain,2017,140,146-157),自身免疫性疾病(Fournier,A.P.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2017,114,6116-6121;Fournier,A.P.et al.,Sci.Transl.Med.,2020,12,eaaz4047)和癌症(Serres,S.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2012,109,6674-6679)。值得注意的是,MPIO会被网状内皮系统从循环中快速消除,从而限制了其到达其靶标的能力(Belliere,J.et al.,Theranostics,2015,5,1187-1202)。因此,MPIO的结构和涂层受到严格的限制,以使其积聚到足以被MRI检测的高浓度。不幸的是,临床前研究中使用的MPIO由聚苯乙烯基质制成,且在临床上不相容(Gauberti,M.et al.,Front.Cell.Neurosci.,2014,8,389)。USPIO与肽酶可降解键的共价组装被描述为MPIO的替代物,但所得产物对分子成像缺乏灵敏度(Perez-Balderas,F.et al.,Nature communications,2017,8,14254)。
因此,目前仍然没有一种造影剂,将当前可获得的MPIO的高灵敏度与USPIO的生物相容性和生物可降解性相结合。
发明简述
发明人现已成功地开发了由USPIO的自组装亚微米团簇制成的新型造影剂,其使用聚儿茶酚胺或聚血清素,特别是聚多巴胺(PDA)作为包埋基质。仅使用三种试剂(氯化铁、聚儿茶酚胺或聚血清素,以及氨),产生平均直径为250nm-900nm的USPIO和聚儿茶酚胺或聚血清素的亚微米团簇。由于生物相容的,亲水的和反应性的聚儿茶酚胺或聚血清素的包被(Lee,H.et al.,Science,2007,318,426-430;Wu,D.et al.,Chem.Soc.Rev.,2021,50,4432-4483),USPIO和聚儿茶酚胺或聚血清素的簇可以用靶向部分,诸如单克隆抗体(免疫-MRI),有效地官能化。这种新平台可用于体内成像方法,特别是脑、肾和肠粘膜中炎症的超灵敏分子成像。
因此,本发明涉及流体动力学直径为200-2000nm的颗粒,所述颗粒包含包埋在聚合物基质内的氧化铁纳米颗粒,所述聚合物基质选自聚儿茶酚胺或聚血清素。
本发明还涉及所述颗粒的悬浮液。
在另一方面,本发明提供用于制备本发明的颗粒的悬浮液的方法,其包括以下步骤:
a)制备氧化铁纳米颗粒的悬浮液;
b)用儿茶酚胺或血清素包被所述氧化铁纳米颗粒;
c)在所述氧化铁纳米颗粒的存在下,聚合所述儿茶酚胺或血清素;
d)终止所述聚合;以及
e)回收颗粒的悬浮液。
本发明还涉及包含本发明的颗粒或本发明的颗粒的悬浮液以及包含游离胺或硫醇基的分子(特别是单克隆抗体)的缀合物。
本发明还涉及本发明的颗粒,本发明的颗粒的悬浮液或本发明的缀合物,其用于体内成像方法。
本发明还涉及本发明的颗粒,本发明的颗粒的悬浮液或本发明的缀合物在成像技术中作为造影剂或作为示踪剂的用途。
发明详述
如上详述,本发明涉及流体动力学直径为200-2000nm,优选250-1250nm,更优选300-1000nm,还更优选500-1000nm的颗粒,所述颗粒包含包埋在聚合物基质内的氧化铁纳米颗粒,优选超小颗粒,所述聚合物基质选自聚儿茶酚胺或聚血清素。
如本文所用,表述“包含于……和……之间”应理解为包括所述范围的边界。如本文所用,相对于纳米颗粒和聚合物基质的表面的术语“包埋”是指纳米颗粒至少部分地延伸到表面,使得聚合物与纳米颗粒接触程度大于如果纳米颗粒简单地放置在聚合物基质的表面上所能达到的程度。
在本发明的上下文中,术语“流体动力学直径”是指以与被测量的颗粒相同的速度扩散的假想硬球的直径。其反映了溶液中颗粒的尺寸,并包括对相关颗粒进行的包被或表面改性。
本发明颗粒的流体动力学直径可根据本领域技术人员已知的任何方法测定。特别地,本发明的颗粒的流体动力学直径可以通过动态光散射(DLS)测定,使用例如配备有633nm激光器的仪(Malvern Instruments,Worcestershire,UK),在173°的固定散射角下,池(cell)温保持恒定在25℃。用于该测量的颗粒以20μg-200μg铁/mL水的浓度置于水中的悬浮液中。其他已知的方法是颗粒跟踪分析(PTA)或其变体纳米颗粒跟踪分析(PTA)。
例如,本发明颗粒的流体动力学直径可包含于200-2000nm、200-1250nm、200-1000nm、200-900nm、200-800nm、200-700nm、250-2000nm、250-1250nm、250-1000nm、250-900nm、250-800nm、250-700nm、300-2000nm、300-1250nm、300-1000nm、300-900nm、300-800nm、300-700nm、400-2000nm、400-1250nm、400-1000nm、400-900nm、400-800nm、400-700nm、500-2000nm、500-1250nm、500-1000nm、500-900nm、500-800nm或500-700nm。
掺入本发明颗粒中的氧化铁纳米颗粒,优选超小颗粒,可选自式Fe2O3的磁铁矿,式Fe3O4的磁铁矿或Fe2O3和Fe3O4的混合物。这些不同类型的氧化铁都是超顺磁性的和生物相容的,使得它们特别地用作磁共振成像(MRI)中的造影剂或用作磁性颗粒成像(MPI)中的示踪剂。
如本文所用,术语“纳米颗粒”是指粒度小于1000nm,特别地为1-500nm,更特别地为1-300nm的材料。
如本文所用,术语“超小颗粒”是指粒度小于50nm,特别地为1-50nm,更特别地为1-30nm的材料。
特别地,掺入本发明颗粒中的氧化铁纳米颗粒,优选超小颗粒的直径为1-50nm,更特别地为1-30nm。
例如,掺入本发明颗粒中的氧化铁的超小颗粒的直径可为1-45nm、1-40nm、1-35nm、1-30nm、2-50nm、2-45nm、2-40nm、2-35nm、2-30nm、3-50nm、3-45nm、3-40nm、3-35nm、3-30nm、5-50nm、5-45nm、5-40nm、5-35nm、5-30nm、10-50nm、10-45nm、10-40nm、1-35nm或10-30nm。
本发明颗粒的聚合物基质选自聚儿茶酚胺或聚血清素。
特别地,本发明颗粒中的生物可降解聚合物基质可选自聚多巴胺(PDA)、聚去甲肾上腺素(PNE)、聚肾上腺素(PEP)和聚血清素,更特别地选自聚多巴胺(PDA)和聚去甲肾上腺素(PNE)。更特别地,本发明颗粒中的生物可降解聚合物基质是聚多巴胺(PDA)。
除它们的生物可降解性外,这些不同类型的聚合物对于本发明颗粒的合成及其应用具有许多优点。特别地,多种配体可以通过Michael加成或Schiff碱反应以高密度与聚儿茶酚胺或聚血清素缀合(Lee,H.et al.,Adv Mater.2009,21,431-434)。需要在USPIO簇的表面上缀合大量靶向部分的能力以最大化与靶标的结合并实现高灵敏度。第三,聚儿茶酚胺或聚血清素在生理pH下是亲水性的和带负电荷的,为包覆颗粒提供负ζ-电势并防止它们在溶液中积聚。它们与氧化铁形成强键,使得即使在超声处理下获得稳定的颗粒,允许分散积聚的颗粒而不破坏簇或分离缀合配体。
在一个实施方案中,相对于颗粒的总重量,本发明颗粒中的氧化铁浓度可为50重量%-95重量%。
本发明颗粒中的铁浓度可通过本领域技术人员已知的任何合适的方法测定。特别地,本发明颗粒中的铁浓度可通过菲洛嗪(ferrozine)方法或通过质谱测定。
本发明的颗粒可通过其多分散指数来表征。在一个实施方案中,本发明颗粒的多分散指数低于0.3,特别地,本发明颗粒的多分散指数为0.01-0.2。
本发明颗粒的多分散指数可以通过本领域技术人员已知的任何合适的方法测定。特别地,本发明的颗粒的多分散指数可通过动态光散射(DLS)通过使用例如与用于流体动力学直径测量的相同的装置和测量条件来确定。
例如,本发明颗粒的多分散指数可以为0.01-0.3、0.02-0.3、0.03-0.3、0.05-0.3、0.07-0.3、0.1-0.3、0.01-0.2、0.02-0.2、0.03-0.2、0.05-0.2、0.07-0.2或0.1-0.2。
本发明的颗粒的特征还在于它们的ζ-电势。在一个实施方案中,本发明颗粒的ζ-电势为-50至-20mV,特别是-45至-25mV,更特别是-42至-37mV。
ζ-电势可通过本领域技术人员已知的任何合适的方法测定。特别地,本发明颗粒的ζ-电势可通过电泳光散射(ELS)测定,其中对悬浮在1mM氯化钠溶液中的颗粒进行测量。
在本发明的上下文中,术语“ζ-电势”是指在界面处的电势,其将可流动流体与仍附着于颗粒表面的流体分离。
本发明的另一个目的是根据本发明的颗粒的悬浮液。这种颗粒的悬浮液含有溶剂,该溶剂可选自水性溶液,例如水,或盐水溶液,或甘油,或甘露醇,其中悬浮本发明所述的颗粒。
换言之,根据本发明的颗粒的悬浮液包含悬浮在溶剂中的根据本发明的颗粒,所述溶剂选自水性溶液,例如水、盐水溶液、甘油溶液和甘露醇溶液。特别地,根据本发明的颗粒的悬浮液包含悬浮在水溶液或盐水溶液中的根据本发明的颗粒。更特别地,根据本发明的颗粒的悬浮液包含悬浮在水溶液,优选水,更优选蒸馏水中的根据本发明的颗粒。
根据本发明的颗粒的悬浮液中颗粒的平均流体动力学直径为250-900nm。
例如,根据本发明的颗粒的悬浮液中的颗粒的流体动力学直径可为200-2000nm、200-1250nm、200-1000nm、200-900nm、200-800nm、200-700nm、250-2000nm、250-1250nm、250-1000nm、250-900nm、250-800nm、250-700nm、300-2000nm、300-1250nm、300-1000nm、300-900nm、300-800nm、300-700nm、400-2000nm、400-1250nm、400-1000nm、400-900nm、400-800nm、400-700nm、500-2000nm、500-1250nm、500-1000nm、500-900nm、500-800nm或500-700nm。
有利地,可以控制根据本发明的颗粒的悬浮液中的颗粒的平均流体动力学直径。
在一个实施方案中,本发明颗粒的悬浮液中颗粒的平均流体动力学直径为250-400nm,特别为250-350nm,更特别地,本发明颗粒的平均流体动力学直径为约300nm。
在另一个实施方案中,本发明颗粒的悬浮液中颗粒的平均流体动力学直径为400-600nm,特别是450-550nm,更特别地,本发明颗粒的平均流体动力学直径为约500nm。
在另一个实施方案中,本发明颗粒的悬浮液中颗粒的平均流体动力学直径为600-900nm,特别是650-750nm,更特别地,本发明颗粒的平均流体动力学直径为约700nm。
本发明的另一个目的是用于制备本发明的颗粒的悬浮液的方法,其包括以下步骤:
a)制备氧化铁的纳米颗粒,优选超小颗粒的悬浮液,特别是具有1-50nm,更特别为1-30nm的直径;
b)用儿茶酚胺或血清素,特别地用儿茶酚胺,更特别地用多巴胺包被氧化铁的纳米颗粒,优选超小颗粒;
c)在氧化铁的纳米颗粒,优选超小颗粒的存在下,聚合儿茶酚胺或血清素;
d)终止所述聚合;
e)回收颗粒的悬浮液。
本发明方法的步骤a)包括制备氧化铁的纳米颗粒,优选超小颗粒的悬浮液,特别是在水中,更特别是在蒸馏水中的悬浮液。特别地,氧化铁的纳米颗粒,优选超小颗粒可选自式Fe2O3的磁铁矿,式Fe3O4的磁铁矿或Fe2O3和Fe3O4的混合物。更特别地,氧化铁的纳米颗粒,优选超小颗粒是Fe3O4。
本发明方法的步骤a)可以根据本领域技术人员已知的任何合适的方法进行,包括例如共沉淀、溶剂热合成、热分解、多元醇法、声化学反应和溶胶-凝胶反应。特别地,本发明方法的步骤a)可以通过在碱性缓冲液中共沉淀法进行。典型地,共沉淀方法通过在碱性缓冲液中混合FeCl3和FeCl2(优选以2:1的摩尔比),并逐步加入氨溶液,所述氨溶液优选浓度为10%-15%(w/v),更优选浓度为13%(w/v),特别地以0.1-0.3mL/min,更特别地0.15-0.25mL/min,还更特别是以0.2mL/min的速率,直到氧化铁沉淀来进行。任选地,洗涤沉淀,优选用蒸馏水洗涤,并且再悬浮,优选在蒸馏水中。
本发明方法的步骤b)包括用儿茶酚胺或血清素包被铁氧化物纳米颗粒。典型地,将从步骤a)获得的氧化铁纳米颗粒的悬浮液与儿茶酚胺或血清素的溶液(特别是儿茶酚胺的溶液,更特别是多巴胺的溶液)混合,优选铁/儿茶酚胺或血清素的重量比为0.5-3.0,特别地为0.5-2.5,更特别地为1.0-2.0,还更特别地为1.0-1.5,甚至更特别地,铁/儿茶酚胺或血清素的质量比为1.2。
在将从步骤a)获得的氧化铁纳米颗粒的悬浮液与儿茶酚胺或血清素的溶液混合之后,本发明方法的步骤b)可包括使所得混合物均化的步骤,特别是通过超声处理,例如使用UP200ST超声波仪(Hielscher)在70%振幅和26KHz下,特别地持续1-30min,更特别地10-20min,在0℃-100℃,优选40℃-100℃的温度下。
本发明方法的步骤b)可进一步包括离心步骤,特别是在3000G下。
本发明方法的步骤c)包括聚合儿茶酚胺或血清素,特别是儿茶酚胺,更特别是多巴胺,其中包被氧化铁纳米颗粒。
聚合步骤可通过本领域技术人员已知的任何合适的方法进行。特别地,聚合步骤可如下进行:将碱溶液,优选氨和氧,优选来自环境空气的氧加入到在步骤b)中获得的包被有儿茶酚胺或血清素的氧化铁的超小颗粒中,并将所得混合物搅拌15min-6h,优选30min-90min,更优选60min。这使得具有聚儿茶酚胺或聚血清素的氧化铁纳米颗粒自组装。
在步骤c)期间添加的氨的量可以控制本发明的颗粒的尺寸。
在一个实施方案中,在步骤c)期间加入的氨相对于1重量份铁为2.17-3.25重量份。典型地,对于120mg铁,加入2.0mL-3.0mL的13%(w/v)氨溶液。
根据该实施方案,颗粒的平均流体动力学直径为250-400nm,特别是250-350nm,更特别地,颗粒的平均流体动力学直径为约300nm。
在另一个实施方案中,在步骤c)期间加入的氨的量相对于1重量份铁为0.33-2.17重量份。典型地,对于120mg铁,加入0.3mL-2.0mL的13%(w/v)氨溶液。
根据该实施方案,颗粒的平均流体动力学直径为400-600nm,特别是450-550nm,更特别地,颗粒的平均流体动力学直径为约500nm。
在另一个实施方案中,在步骤c)期间加入的氨的量相对于1重量份铁为0.05-0.33重量份。典型地,对于120mg铁,加入0.05mL-0.3mL的13%(w/v)氨溶液。
根据该实施方案,颗粒的平均流体动力学直径为600-750nm,特别是650-750nm,更特别地,颗粒的平均流体动力学直径为约700nm。
本发明方法的步骤d)包括终止步骤c)的聚合。
终止步骤可通过本领域技术人员已知的任何合适的方法进行,例如,加入酸以在反应混合物中获得酸性pH,加入聚合抑制剂或替换反应介质。特别地,终止步骤通过替换反应介质来进行。典型地,将颗粒从其中进行聚合步骤c)的碱溶液中分离,特别是使用分离磁体或离心步骤,更特别是离心步骤,从而可以将颗粒保持在底层中且碱溶液作为上清液。然后,除去上清液并替换为洗涤溶液,特别是水,更特别是蒸馏水。该操作可进行多次以确保来自步骤c)的碱溶液被完全除去并被洗涤溶液替代。
本发明方法的步骤e)包括回收本发明颗粒的悬浮液。然后,可将这些颗粒在约3-10℃的低温下储存在水或盐水溶液中。
在将其注射至患者前,将本发明的颗粒的悬浮液在搅拌下保持在0-37℃,特别是4℃的温度下。
本发明的另一个目的是通过根据本发明的方法获得的颗粒或颗粒的悬浮液。
本发明的另一个目的是在通过除去步骤e)后获得的悬浮液的溶剂而分离所述颗粒的其他步骤之后,通过根据本发明的方法获得的颗粒。
本发明还涉及包含本发明颗粒或本发明的颗粒的悬浮液以及包含游离胺或硫醇基团分子的缀合物。
特别地,包含游离胺或硫醇基的分子选自蛋白质、肽、纳米抗体、单克隆抗体或包含放射性标记的金属的分子。优选地,包含游离胺或硫醇基的分子是单克隆抗体。
在一个实施方案中,所述缀合物包含本发明的颗粒或通过本发明的方法获得的颗粒以及至少包含游离胺或硫醇基团的分子。特别地,至少包含游离胺或硫醇基团的分子或蛋白质可以是肽、纳米抗体、单克隆抗体、包含放射性标记的金属的分子或小分子,诸如N-乙酰基半胱氨酸。更特别地,至少包含游离胺或硫醇基团的分子或蛋白质可以是肽、纳米抗体、单克隆抗体、包含放射性标记的金属的分子或N-乙酰基半胱氨酸。甚至更特别地,至少包含游离胺或硫醇基团的分子或蛋白质可以是肽、纳米抗体或单克隆抗体。优选地,至少包含游离胺或硫醇基团的分子或蛋白质可以是单克隆抗体。
在一个实施方案中,至少包含游离胺或硫醇基团的分子可以是用至少包含游离胺或硫醇基团的连接子修饰的分子。换言之,至少包含游离胺或硫醇基团的分子是其中游离胺或硫醇基团由连接子部分保持的分子。
在本发明的上下文中,术语“连接子(linker)”或“连接子部分”是指用于将分子连接至本发明的颗粒或通过本发明的方法获得的颗粒的接头。
在本发明的上下文中,术语“缀合物”是指由连接在一起的两个或更多个分子组成的分子。本发明的缀合物典型地由根据本发明的颗粒与蛋白质、肽、纳米抗体或单克隆抗体连接组成。本发明的颗粒还可以与放射性标记的金属,诸如铜64或镓68连接,特别是在用于正电子发射断层扫描(PET)成像技术的情况下。
特别地,所述单克隆抗体可选自免疫球蛋白G(IgG)、血管细胞粘附分子1(VCAM-1)、细胞间粘附分子1(ICAM-1)、P-选择素、E-选择素或粘膜地址素细胞粘附分子1(MAdCAM-1)。更特别地,所述单克隆抗体可选自血管细胞粘附分子1(VCAM-1)、细胞间粘附分子1(ICAM-1)或粘膜地址素细胞粘附分子1(MAdCAM-1)。更特别地,所述单克隆抗体可以是血管细胞粘附分子1(VCAM-1)或粘膜地址素细胞粘附分子1(MAdCAM-1)。
在一个实施方案中,所述单克隆抗体可选自血管细胞粘附分子1(VCAM-1)、细胞间粘附分子1(ICAM-1)、P-选择素、E-选择素或粘膜地址素细胞粘附分子1(MAdCAM-1)。更特别地,所述单克隆抗体可选自血管细胞粘附分子1(VCAM-1)、细胞间粘附分子1(ICAM-1)或粘膜地址素细胞粘附分子1(MAdCAM-1)。更特别地,所述单克隆抗体可以是血管细胞粘附分子1(VCAM-1)或粘膜地址素细胞粘附分子1(MAdCAM-1)。
特别地,至少包含游离胺或硫醇基团的分子可以是纤维蛋白溶解剂。在一个实施方案中,所述纤维蛋白溶解剂通过具有至少一种游离胺或硫醇基团的连接子部分与本发明的颗粒或通过本发明的方法获得的颗粒结合。
特别地,至少包含游离胺或硫醇基团的分子是可以是组织纤溶酶原激活物或其片段的蛋白质,例如重组组织纤溶酶原激活物(rtPA),诸如阿替普酶(alteplase)、瑞替普酶(reteplase)或替奈普酶(tenecteplase)。在一个实施方案中,可以是组织纤溶酶原激活物或其片段的蛋白质通过至少具有游离胺或硫醇基团的连接子部分与本发明的颗粒或通过本发明的方法获得的颗粒结合。
相对于缀合物的总重量,缀合物中根据本发明颗粒的量可为50重量%-99重量%,特别是65重量%-95重量%,更特别是80重量%-95重量%,还更特别是85重量%-95重量%。
在制备后,将本发明的缀合物在搅拌下保持在0-37℃,特别是4℃的温度下,直至其注射至患者。
为用于体内成像方法,本发明的颗粒或通过本发明的方法获得的颗粒或本发明的缀合物必须在成像步骤之前施用于患者。本发明的颗粒或本发明的缀合物可作为制剂以有效量通过任何可接受的施用方式施用,优选通过静脉内、动脉内或口服途径。
因此,本发明的另一个目的是本发明的颗粒,本发明的颗粒的悬浮液,通过本发明的方法获得的颗粒或颗粒的悬浮液或本发明的缀合物,其用于体内成像方法中。
本发明的颗粒,本发明的颗粒的悬浮液,通过本发明的方法获得的颗粒或颗粒的悬浮液或本发明的缀合物在成像领域中具有多种应用。
特别地,本发明的颗粒,本发明的颗粒的悬浮液,通过本发明的方法获得的颗粒或颗粒的悬浮液或本发明的缀合物可用于成像技术,诸如磁共振成像(MRI)、磁性颗粒成像(MPI)、光声成像或正电子发射断层扫描(PET)。更特别地,它们可用于磁共振成像(MRI)。
在光声成像的情况下,本发明颗粒的吸收光谱特别适于获得良好的可视化。实际上,例如聚多巴胺主要在近红外(波长约700nm)吸收,且与主要在远红外(波长约900nm)吸收的氧合血红蛋白有很好的区别。
在正电子发射断层摄影术(PET)的情况下,本发明的颗粒或通过本发明的方法获得的颗粒可在缀合和/或放射性标记步骤之后使用。然后,可使用放射性标记的金属,诸如铜64或镓68。
所有这些技术都可用于体内诊断。本发明颗粒的作用方式使它们适用于所有类型的成像。特别地,本发明的缀合物可用于脑、心脏、肺、肾和肠粘膜中炎症的分子成像,更特别地用于脑、肾和肠粘膜中炎症的分子成像。
本发明还涉及使用本发明的颗粒,本发明的颗粒的悬浮液,通过本发明的方法获得的颗粒或颗粒的悬浮液或本发明的缀合物的体内诊断方法。
本发明还提供了包含本发明的颗粒,本发明的颗粒的悬浮液,通过本发明的方法获得的颗粒或颗粒的悬浮液或本发明的缀合物的组合物。所述组合物还可包含至少一种药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂和/或佐剂。
此类组合物可含有本发明的颗粒,本发明的颗粒的悬浮液,通过本发明的方法获得的颗粒或颗粒的悬浮液,或在溶剂中的本发明的缀合物,例如0.3M甘露醇的溶液。
在其注射前,本发明的颗粒可悬浮在与向人类患者注射相容的任何生理介质中。这种生理介质的实例是甘露醇或甘油,特别是甘露醇溶液或甘油溶液,更特别是0.3M甘露醇溶液。
本发明的另一个目的是一种成像方法,其中例如通过注射施用于患者含有本发明颗粒的组合物,本发明颗粒的悬浮液,通过本发明方法获得的颗粒或颗粒的悬浮液或本发明的缀合物,且包括成像步骤。
本发明的另一个目的是本发明的颗粒,本发明的颗粒的悬浮液,通过本发明的方法获得的颗粒或颗粒的悬浮液或本发明的缀合物在成像技术中作为造影剂或作为示踪剂的用途。
定义
下面的定义和解释是针对整个申请中,包括说明书和权利要求书,使用的术语。
除非另外指明,当描述本发明的颗粒时,所用术语应根据以下定义来解释。
如本文所用,术语“生物相容的”是指,当与活组织接触放置时,例如体内,不会对活组织造成显著损害的材料。在某些实施方案中,如果材料对细胞无毒,则是“生物相容的”。在某些实施方案中,如果材料在体外添加到细胞中导致小于或等于20%的细胞死亡,和/或它们在体内施用不诱导显著的炎症或其他的这类不良作用,则其为“生物相容的”。
如本文所用,术语“生物可降解的”是指当引入细胞中时分解成(例如,通过细胞机制,诸如通过酶促降解,通过水解和/或通过其组合)细胞可再使用或处置而对细胞无显著毒性作用的组分的材料。在某些实施方案中,通过生物可降解材料的分解产生的组分是生物相容的,因此在体内不诱导显著的炎症和/或其他不良作用。在一些实施方案中,生物可降解的聚合物材料分解成它们的组分单体。在一些实施方案中,生物可降解材料(包括例如生物可降解聚合物材料)的分解涉及酯键的水解。可替代地或另外地,在一些实施方案中,生物可降解材料(包括例如生物可降解聚合物材料)的分解涉及氨基甲酸酯键的裂解。在本发明的上下文中,示例性的可生物降解的聚合物包括,例如,聚多巴胺(PDA)、聚去甲肾上腺素(PNE)、聚肾上腺素(PEP)和聚血清素(PST),特别优选聚多巴胺(PDA)。
如本文所用,相对于纳米颗粒和聚合物基质的表面的术语“包埋”,是指纳米颗粒至少部分地延伸到表面中,使得聚合物与纳米颗粒接触的程度相比如果纳米颗粒简单地放置在聚合物基质表面上所能达到的程度更高。
如本文所用,术语“悬浮液”是指包含液体和精细分散的固体材料的材料的非均质混合物。
术语“患者”是指等待或接受医疗治疗,或者正在或将是医疗过程的对象的温血动物,更优选人。
术语“人”是指两种性别和处于任何发育阶段(即新生儿、婴儿、少年、青少年、成人)的受试者。在一个实施方案中,人是青少年或成人,优选成人。
术语“施用(administration)”或其变体(例如“施用(administering)”)是指将活性剂或活性成分,单独或作为药学上可接受的组合物的一部分,提供给具有待治疗的病症、症状或疾病的患者。
“药学上可接受的”是指药物组合物的成分彼此相容且对其患者无害。
如本文所用,术语“赋形剂”是指与药物组合物或药物中的活性剂或活性成分一起配制的物质。用于治疗用途的可接受的赋形剂在药学领域中是熟知的,且描述于,例如Remington's Pharmaceutical Sciences,21st Edition 2011中。赋形剂的选择可根据预期的施用途径和标准药学实践来选择。赋形剂在对其接受者无害的意义上必须是可接受的。至少一种药学上可接受的赋形剂可以是,例如粘合剂、稀释剂、载体、润滑剂、崩解剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂等。
如本文所用,术语“药物载体”是指用作溶剂或稀释剂的载体或惰性介质,在其中配制和/或施用药物活性剂。药物载体的非限制性实例包括乳膏、凝胶、洗剂、溶液和脂质体。
参考以下实施例和附图将更好地理解本发明。这些实施例旨在示例本发明的具体实施方案,而不旨在限制本发明的范围。
附图说明
图1.通过在合成期间使用不同浓度的氨获得的不同尺寸的USPIO(n)@PDA的代表性相显微图像。
图2.通过动态光散射评估的USPIO(n)@PDA的尺寸分布(代表三个独立批次中的3个独立实验)。
图3.使用7T临床前MRI对大700nm USPIO(n)@PDA的弛豫度测量:(a)小(左)、中等(中)和大(右)的USPIO(n)@PDA簇在5K的磁滞循环;(b)小(左)、中等(中)和大(右)USPIO(n)@PDA簇在300K的磁滞循环;(c)结果汇总。Hc:矫顽磁场。Ms:饱和磁化强度。
图4.通过目视检查和紫外-可见光谱法评估大USPIO(n)@PDA簇在不同缓冲液中的降解:大USPIO(n)@PDA簇(700nm)在PBS(a)、ALF(v)、柠檬酸盐(c)和含H2O2的柠檬酸盐(d)中在不同时间点的紫外-可见(UV-Vis)光谱。
图5.在含有过氧化氢的柠檬酸盐缓冲液中孵育7天后大USPIO(n)@PDA簇的降解:大USPIO(n)@PDA簇(700nm)和USPIO@多巴胺在PBS(b)、柠檬酸盐(c)和含H2O2的柠檬酸盐(d)中的紫外-可见光谱。
图6.静脉内注射4mg/kg大USPIO(n)@PDA后的T2加权成像:(a)肝T2加权成像信号强度的演变(每组n=7)。以椎旁肌信号为参照计算比值;(b)脾脏T2加权成像信号强度的演变(每组n=7);(c)右肾T2加权成像信号强度的演变(每组n=7)。相对于基线*p<0.05。
图7.大USPIO@PDA簇对人静脉内皮细胞(HUVEC)的细胞毒性:(a-b)与不同浓度的大USPIO@PDA簇孵育3小时(a)和24小时(b)后,通过乳酸脱氢酶(LDH)测定评估的HUVEC细胞的活力(每组n=5);(c-d)与不同浓度的大USPIO@PDA簇孵育3小时(c)和24小时(d)后,通过水溶性四唑-1(WST-1)测定评估的HUVEC细胞的活力(每组n=5)。与对照组相比*p<0.05(0μg/ml)。
图8.小鼠和人血液的溶血试验:(a)在与不同浓度的大USPIO(n)@PDA簇孵育并离心后,含有小鼠血液的试管的上清液的光谱;(b)在与不同浓度的大USPIO(n)@PDA簇孵育和离心后,含有人血的试管的上清液的光谱;(c)通过540nm吸光度测量的每种条件的溶血率汇总(代表每组n=3)。没有超过5%溶血的情形。
图9.人全血中存在大USPIO(n)@PDA簇时的旋转血栓弹力测定法(ROTEM):(a)使用EXTEM测定法对不同浓度的大USPIO@PDA簇进行代表性ROTEM曲线;(b)相应的主要ROTEM参数,表明大的USPIO@PDA簇对凝块形成没有显著影响。
图10.在大USPIO(n)@PDA簇存在下,使用人血浆的凝块溶解测定:(a)代表性凝块溶解测定曲线,其显示如何测量75%凝固时间(75%CT)和50%溶解时间(50% LT);(b)不同浓度的大USPIO(n)@PDA簇存在下,人血浆的平均75% CT(每组n=5);(c)不同浓度的大USPIO(n)@PDA簇存在下,人血浆的平均50% LT(每组n=5)。在未溶解的样品中,50% LT设定为350min。
图11.在大USPIO(n)@PDA簇存在下,使用小鼠血浆的凝块溶解测定:(a)代表性凝块溶解测定曲线,其显示如何测量75%凝固时间(75%CT)和50%溶解时间(50% LT);(b)不同浓度的大USPIO(n)@PDA簇存在下,小鼠血浆的平均75% CT(每组n=5);(c)不同浓度的大USPIO(n)@PDA簇存在下,小鼠血浆的平均50% LT(每组n=5)。在未溶解的样品中,50% LT设定为350min。
图12.静脉内注射大USPIO(n)@PDA簇(4mg/kg)后基线和不同时间点的小鼠体重。
图13.通过ELISA评估的小鼠静脉内注射大USPIO(n)@PDA簇(4mg/kg)后不同时间点的肝酶血浆浓度。在未接受USPIO(n)@PDA的对照小鼠中收集阴性对照(阴性对照)样品。在腹膜内注射5mg/kg大肠杆菌脂多糖(LPS)后24小时收集阳性对照(阳性对照)样品。相对于阴性对照*p<0.05。ALAT:丙氨酸转氨酶。ASAT:天冬氨酸转氨酶。
图14.通过ELISA评估的小鼠静脉内注射大USPIO(n)@PDA簇(4mg/kg)后不同时间点的一组关键细胞因子和趋化因子的血浆浓度。在未接受USPIO(n)@PDA的对照小鼠中收集阴性对照(阴性对照)样品。在腹膜内注射5mg/kg大肠杆菌脂多糖(LPS)后24小时收集阳性对照(阳性对照)样品。相对于阴性对照*p<0.05。TNF:肿瘤坏死因子。IL:白介素。IFN:干扰素。CXCL1:趋化因子(C-X-C基序)配体1。
图15.免疫球蛋白与USPIO(n)@PDA的复合:(a)USPIO(n)@PDA@IgG与不同剂量的IgG(80-400μg/mg)复合后上清液的紫外-可见光谱;(b)USPIO(n)@PDA@IgG与不同剂量的IgG复合后的上清液的SDS-PAGE;(c)使用抗大鼠或对照(抗山羊)二抗与不同剂量的IgG(大鼠)复合后,对USPIO(n)@PDA@IgG进行流式细胞术。
图16.与靶向小鼠血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)的单克隆抗体复合后大USPIO(n)@PDA簇的表征:根据荧光二抗的类型定量颗粒荧光(每组n=25)。
图17.抗人USPIO(n)@PDA@αVCAM-1或对照USPIO(n)@PDA@IgG与静态(用PBS处理)或活化(用TNF处理)的人内皮细胞(HCMECD/3)孵育后,每个视野的颗粒数量(每组n=5)的定量。相对于所有其他组,*p<0.05。
图18.通过流式细胞术评估的,用TNF刺激后的人脑内皮细胞(HCMECD/3)过表达VCAM-1:(a)左:用TNF(50ng/ml,24小时)刺激后,使用一抗VCAM-1抗体或对照免疫球蛋白(IgG)的流式细胞术结果。右:相应的密度图;(b)在未刺激的细胞中与(a)中相同。
图19.在向右纹状体中注射1μg LPS后24小时,使用高达4mg/kg(当量的铁)的单克隆抗体(USPIO(n)@PDA@αVCAM-1)连续静脉内注射靶向VCAM-1的USPIO(n)@PDA后,右纹状体中USPIO(n)@PDA@αVCAM-1诱导的信号缺失的定量(n=5)。
图20.在右纹状体中注射不同剂量的LPS(0-1.0μg)后24小时,静脉注射4mg/kgUSPIO(n)@PDA@αVCAM-1后,右纹状体中USPIO(n)@PDA@αVCAM-1诱导的信号缺失的定量(每组n=5)。
图21.在右纹状体中注射1μg LPS后24小时,静脉内注入4mg/kg USPIO(n)@PDA@IgG或USPIO(n)@PDA@αVCAM-1后,右纹状体中信号缺失的定量(每组n=5)。
图22.USPIO(n)@PDA@αVCAM-1在LPS处理的小鼠的发炎纹状体中积聚:脑内注射LPS(1.0μg)后24小时以及静脉内注射USPIO(n)@PDA@αVCAM-1后60min,小鼠纹状体中的定量(每组n=4)。对于USPIO(n)@PDA@αVCAM-1和对照USPIO(n)@PDA@IgG,呈现来自三个不同动物的三个图像。
图23.USPIO(n)@PDA表面上更高密度的抗VCAM-1单克隆抗体提高分子MRI的灵敏度:纹状体内注射LPS(1.0μg)后以及静脉内注射USPIO(n)@PDA(4mg/kg)后,脑中的定量(每组n=4),在USPIO(n)@PDA的表面有100% IgG(上),50%对照IgG和50%抗VCAM-1抗体(中)或100%抗VCAM-1抗体。
图24.用游离抗VCAM-1单克隆抗体饱和USPIO(n)@PDA@αVCAM-1结合位点防止USPIO(n)@PDA@αVCAM-1在发炎的脑中结合:在成像前15min,在接受静脉内注射100μg对照免疫球蛋白(左)或抗VCAM-1单克隆抗体(右)的小鼠中,在静脉内注射USPIO(n)@PDA@αVCAM-1(4mg/kg)前和后,在纹状体内注射LPS(1.0μg)后的脑中,USPIO(n)@PDA@αVCAM-1诱导的信号缺失的定量(每组n=4)。
图25.USPIO(n)@PDA@IgG和USPIO(n)@PDA@αVCAM-1在神经炎症的LPS模型中的结合动力学的分析:(a)纹状体内注射LPS(1.0μg)后24小时,静脉注射USPIO(n)@PDA@IgG后,右纹状体(橙色)和眼静脉(蓝色)中MRI信号的纵向演变;(b)纹状体内注入LPS(1.0μg)后24小时,静脉注射USPIO(n)@PDA@αVCAM-1后,右纹状体(橙色)和眼静脉(蓝色)中MRI信号的纵向演变。
图26.USPIO(n)@PDA@αVCAM-1诱导的信号缺失的纵向随访揭示颗粒的渐进性不结合:单次静脉内注射USPIO(n)@PDA@αVCAM-1(4mg/kg)前,以及注射后的不同时间点,纹状体内注射LPS(1.0μg)后,在脑中的定量(每个时间点n=3只鼠)。
图27.未结合的USPIO(n)@PDA@IgG在肝的巨噬细胞中积聚:静脉注射USPIO(n)@PDA@IgG(4mg/kg)后60min的小鼠或对照小鼠的肝中的定量(每组n=4)。USPIO(n)@PDA@IgG通过荧光二抗大鼠抗体显示。
图28.USPIO(n)@PDA积聚成亚微米颗粒提高VCAM-1分子MRI的灵敏度:在右纹状体中注射1μg LPS后24小时静脉内注射4mg/kg颗粒后定量(每组n=4)。
图29.临床相关实验模型中内皮活化的分子成像。(a)右大脑中动脉电凝诱导缺血性卒中的24小时后静脉注射4mg/kg USPIO(n)@PDA@αVCAM-1(左)或USPIO(n)@PDA@IgG(右)后,右半球信号缺失的相应定量(每组n=5);(b)肌肉注射50%甘油诱导的急性肾损伤(横纹肌溶解症)的48小时后,静脉内注射4mg/kg USPIO(n)@PDA@αVCAM-1(左)或USPIO(n)@PDA@IgG(右)后,肾髓质中信号缺失的相应定量(每组n=5);(c)通过含2.0%葡聚糖硫酸钠的饮用水处理5天而诱导的急性结肠炎模型中,静脉内注射4mg/kg USPIO(n)@PDA@αMAdCAM-1(左)或USPIO(n)@PDA@IgG(右)后,降结肠中信号缺失的相应定量(每组n=5)。
具体实施方式
缩写
DSS:葡聚糖硫酸钠
IgG:免疫球蛋白G
LPS:脂多糖
MAdCAM-1:粘膜地址素细胞粘附分子1
MRI:磁共振成像
MPIO:氧化铁微粒
PBS:磷酸盐缓冲盐水
PDA:聚多巴胺
USPIO:氧化铁超小颗粒
VCAM-1:血管细胞粘附分子1
材料和方法
试剂
以下试剂购自Sigma-Aldrich公司:六水合氯化铁、四水合氯化亚铁、氨溶液、盐酸多巴胺、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、甘露醇。具有COOH表面基团的商售氧化铁微粒(MPIO;直径1.08μm)购自Fisher Technology。
氧化铁的超小颗粒(USPIO)的合成
USPIO通过在碱性缓冲液中共沉淀法制备。在典型的合成中,通过涡旋将540mgFeCl3.6H2O和198.8mg FeCl2.4H2O溶解在5.7mL蒸馏水中,得到均匀的黄色溶液。在室温下连续搅拌下,以0.2mL/min的速率逐渐添加6.3mL 13%(w/v)氨溶液。溶液由黄色变为棕色,最终变为深黑色,对应于磁铁矿的形成。通过磁分离将沉淀用蒸馏水洗涤5次,并重悬于10mL蒸馏水中。
包被有多巴胺的氧化铁超小颗粒(USPIO@多巴胺)的合成
将8mL的USPIO溶液重悬于40mL含有2.5mg/mL多巴胺盐酸盐的溶液中。使用UP200ST超声波仪(Hielscher)以70%振幅和26KHz将所得溶液超声处理15min。溶液的颜色从黑色稍微变为深棕色。然后,将溶液在3000G离心5min以除去大量剩余的USPIO积聚体。将30ml含有USPIO@多巴胺和游离多巴胺盐酸盐的上清液转移到新的小瓶中。
包含包埋在聚多巴胺内的氧化铁超小颗粒(USPIO(n)@PDA)的本发明颗粒的合成
使用Ultra-Turrax T-25分散器以20.500rpm的转速将USPIO@多巴胺/多巴胺盐酸盐溶液置于剧烈搅拌下。为制备大的USPIO(n)@PDA,首先将67μL的13%(w/v)氨溶液加入到该溶液中,使其反应60min。然后,加入203μL 13%(w/v)氨溶液,继续孵育30min以使多巴胺进一步聚合。为制备中等尺寸的USPIO(n)@PDA,一次加入270μL 13%(w/v)氨溶液,使溶液反应60min。为制备小尺寸的USPIO(n)@PDA,一次性加入2160μL 13%(w/v)氨溶液并使溶液反应60min。然后,将溶液在1000G下离心3min以除去最大的积聚体,弃去沉淀并将24mL上清液转移到新的小瓶中。然后,用蒸馏水洗涤USPIO(n)@PDA 5次,最后再悬浮于8mL蒸馏水中,并在4℃下储存直至后续使用。
本发明颗粒的流体动力学直径的测定
使用配备有633nm激光的仪(Malverninstruments,Worcestershire,UK)以173°的固定散射角,使用动态光散射(DLS)测定USPIO(n)@PDA颗粒的平均流体动力学直径、多分散指数(PDI)和按体积计的直径分布。将细胞的温度保持恒定在25℃并在纯水中进行所有稀释。用于该测量的颗粒以20μg-200μg铁/mL水的浓度置于水中的悬浮液中。重复三次进行测量。
本发明颗粒中铁浓度的测定
用FerroZine方法测量USPIO(n)@PDA悬浮液的铁含量。颗粒在室温下在1M HCl中降解过夜,在溶液中释放三价铁(Fe3+)和二价铁(Fe2+)离子。将样品与0.65%(w/v)抗坏血酸孵育30min以减少亚铁离子中的铁离子。用12%(w/v)乙酸铵调节样品pH。加入3-(2-吡啶基)-5,6-二苯基-1,2,4-三嗪-p,p′-二磺酸单钠盐水合物(FerroZine铁试剂,Sigma-Aldrich,1mM),用分光光度计(ELx808吸光度读数器,BioTeK)在562nm处测量吸光度,揭示与亚铁离子形成的复合物的量。铁含量相对于由氯化铁稀释液获得的标准曲线测定。
用抗体包被本发明的颗粒(USPIO(n)@PDA)
在典型的包被方法中,将2.8mg USPIO(n)@PDA用纯水洗涤一次,并重悬于5mL10mM磷酸盐缓冲液(pH8.5)中。然后,将400μg单克隆抗体(或另一适当量)与USPIO(n)@PDA在室温下孵育24小时。使用UP200ST超声波仪在20%振幅和26KHz下将所得溶液超声处理5min以破坏任何积聚体。然后,用0.3M甘露醇溶液洗涤包被的USPIO(n)@PDA三次,最后重悬浮于5mL的0.3M甘露醇溶液中,并在4℃下储存直至后续使用。
通过1H 7T MRI测量弛豫度。
将大的700nm USPIO(n)@PDA以不同浓度分散在三-乙酸-EDTA缓冲液中的琼脂糖凝胶(2%)中。然后,使用BioSpec 7T TEP-MRI对样品成像,并按以下顺序进行:使用流敏交替反转恢复(FAIR)-RARE序列进行T1映射,重复时间(TR)=3000ms且反转时间(TI)范围为6.5ms-2000ms;使用多切片多回波(MSME)序列进行T2映射,TR=4000ms且回波时间(TE)范围为3.65ms-51.11ms;使用多梯度回波(MGE)序列进行T2*映射,TR=4000ms和TE范围为2ms-17.47ms。如上所述计算相应的R1、R2和R2*弛豫度。
动物
所有实验均用8-16周龄雄性Swiss小鼠(Janvier,France)进行。在CentreUniversitaire de Ressources Biologiques(CURB,Basse-Normandie,France)将动物维持在特定的无病原体条件下,且所有动物都可以自由获得食物和自来水。
体内磁共振成像(MRI)
使用表面线圈(Bruker,German)在Pharmascan 7T/12cm系统上进行实验。用异氟烷(1.5%-2.0%)麻醉小鼠,通过集成的加热动物固定器维持在37℃,并在成像过程中监测呼吸速率。使用MSME序列获得T2加权图像:TE/TR 51ms/2500ms,空间分辨率为70μm*70μm*500μm。使用TE/TR 8.6ms/50ms和20°的翻转角(FA)进行具有流量补偿的T2*加权3D快速低角度照射梯度回波成像(FLASH,空间分辨率78μm*78μm*150μm),以揭示USPIO(n)@PDA簇和USPIO(采集时间=17min)。本研究中呈现的高分辨率T2*加权图像是3个连续切片的最小强度投影(产生450μm的Z分辨率)。
统计分析
结果表示为平均值±SD。使用Mann-Whitney's U-检验进行统计学分析。当比较两组以上时,使用Kruskal-Wallis(用于多重比较)进行统计学分析,随后进行事后Mann-Whitney's U-检验。当比较两组时,p值<0.05被认为是显著的(双侧)。
结果
USPIO(n)@PDA亚微米簇的合成
在碱性缓冲液中,多巴胺氧化诱导PDA亚微颗粒的形成。为获得USPIO的亚微簇,我们假设包被有多巴胺的USPIO(USPIO@多巴胺)将在PDA颗粒的形成过程中作为结构单元引入。因此,我们使用2:1的FeCl3:FeCl2的比例,通过经典共沉淀法合成USPIO。在大量的洗涤步骤之后,将纯化的USPIO与多巴胺在纯水中连续超声处理孵育15min以获得USPIO@多巴胺。使用机械分散器在室温下搅拌含有USPIO@多巴胺和游离多巴胺的所得溶液,并加入氨以开始多巴胺聚合。这导致了USPIO(n)@PDA亚微米簇的自组装。根据通过动态光散射测量的簇形成过程中的氨浓度,USPIO(n)@PDA的平均流体动力学直径在300nm-700nm的范围内,其中多分散指数<0.2(图1和2)且ζ-电势在-37至-42mV范围内。产生的颗粒足够大,可使用台式磁铁从水溶液中快速分离。
USPIO(n)@PDA亚微米簇的物理表征
使用临床前MRI,在室温和7T(300MHz)下,r1、r2和r2*的弛豫度值分别为0.35、139.9和301.7mM-1.s-1。所有这些参数在使用具有相似微晶尺寸的USPIO的先前报道值的范围内,支持使用PDA的积聚USPIO保持其有利的超顺磁特性。
USPIO(n)@PDA的生物降解性
体外和体内研究700nm USPIO(n)@PDA的生物可降解性。首先,将颗粒在37℃下在磷酸盐缓冲盐水(PBS)、人工溶酶体流体(ALF)、柠檬酸盐缓冲液或具有过氧化氢的柠檬酸盐缓冲液中孵育。这些缓冲液模拟了静脉注射后纳米颗粒积聚的溶酶体环境。通过直接目测和紫外-可见(UV-vis)光谱在1周中在37℃下在温和搅拌下监测降解(图4)。USPIO@多巴胺和USPIO(n)@PDA在PBS中的视觉外观和紫外-可见光谱在监测过程中没有显著变化。在ALF和柠檬酸盐缓冲液中,USPIO@多巴胺溶液的棕色随时间变成预期的游离Fe(III)离子的黄色。对于USPIO(n)@PDA溶液似乎发生相同的现象,但在每个时间点仍存在其他的深色沉淀物。该沉淀物在明场显微镜下呈现深棕色,且不被磁铁吸引。这种外观与USPIO降解后剩余的游离PDA相容。与该假设一致,该沉淀物逐渐溶解在含有过氧化氢的样品中,产生能够降解PDA的羟基自由基。紫外-可见光谱进一步支持这些发现,显示USPIO(n)@PDA在ALF和柠檬酸盐中的逐渐降解,且在近红外区(650nm)具有吸收的化学物质的持久性,与PDA相容(图5)。在含有过氧化氢的柠檬酸盐缓冲液中,最初含有USPIO(n)@PDA的溶液的吸光度在近红外区逐渐减小,直到在孵育7天后达到0。在第7天,最初含有USPIO@多巴胺或USPIO(n)@PDA的溶液间的紫外-可见曲线几乎无法区分,这支持PDA在该缓冲液中完全降解。
其次,在巨噬细胞的细胞培养物中研究了USPIO(n)@PDA的降解,巨噬细胞是在体内静脉内注射后,其中大的颗粒积聚的细胞类型。通过活化人单核细胞系(THP-1)获得巨噬细胞,并与USPIO(n)@PDA或由USPIO包埋在聚苯乙烯基质内制成的不可生物降解的商售MPIO(Dynabeads MyOne)一起孵育。96小时后,通过透射电子显微镜观察细胞和颗粒。这两种类型的颗粒在该时间点被内化。而商售MPIO在形态上保持完整,USPIO(n)@PDA破碎成更小的颗粒,证明当PDA基质内化到巨噬细胞中即快速降解并释放USPIO。
在体内,通过MRI(图6)和使用普鲁士蓝染色的组织化学研究静脉内注射后不同时间点(从1小时至6个月)的小鼠中USPIO(n)@PDA的降解。所有这些方法共同显示USPIO(n)@PDA首先在肝和脾(网状内皮系统)中积聚,且它们的氧化铁和超顺磁性组分随后被降解。在静脉内注射后超过30天没有检测到残留颗粒。重要的是,在任何时间点,在肾脏、肺或心脏中没有USPIO(n)@PDA的显著积聚。未观察到微血管堵塞。
USPIO(n)@PDA的生物相容性
在体外和体内研究了USPIO(n)@PDA的生物相容性。在高达320μg/ml的剂量下持续3小时,未检测到对内皮细胞(HUVEC)的显著细胞毒性(图7)。在24小时时,高剂量组中内皮细胞的活力略微降低。溶血(图8)、凝血(图9)和纤维蛋白溶解(图10和11)都不受使用人或小鼠血液的USPIO(n)@PDA的影响。静脉内注射4mg/kg(当量的铁)的USPIO(n)@PDA后,体重保持在正常范围内(图12),且未发现肝酶(图13)、炎性细胞因子(图14)和组织学具有毒理学意义。
USPIO(n)@PDA与单克隆抗体缀合用于靶向成像
已证明了有利的生物相容性和生物可降解性,我们研究了使用700nm USPIO(n)@PDA亚微米簇作为分子成像平台的可行性。为此,我们用pH 8.5的磷酸盐缓冲液中的抗体包被USPIO(n)@PDA,因为碱性缓冲液比PDA涂层上的儿茶酚基团更有利于活性醌。我们通过在偶联过程中改变溶液中抗体的浓度进行剂量-反应实验。然后,我们通过流式细胞术测量了USPIO(n)@PDA上结合抗体的浓度,并通过SDS-PAGE和紫外-可见光谱测量了溶液中剩余抗体的浓度(图15)。我们选择1mg的USPIO(n)@PDA用160μg抗体的剂量用于进一步实验,因为较高的剂量不会显著增加结合抗体的浓度。使用该比例,我们用靶向小鼠血管-细胞粘附分子1(VCAM-1),粘膜地址素细胞粘附分子1(MAdCAM-1)或对照免疫球蛋白G的单克隆抗体包被USPIO(n)@PDA(分别为USPIO(n)@PDA@αVCAM-1、USPIO(n)@PDA@αMAdCAM-1和USPIO(n)@PDA@IgG)。使用荧光二抗,通过免疫荧光通过显示其表面上的一抗,可以检测缀合的USPIO(n)@PDA簇(图16)。
然后,我们研究了靶向USPIO@PDA的体外结合。为此,将抗人USPIO(n)@PDA@αVCAM-1或对照USPIO(n)@PDA@IgG与静止或活化的脑内皮细胞(hCMECD/3)一起孵育。通过免疫荧光显微镜评估结合颗粒的数量。USPIO(n)@PDA@αVCAM-1与活化的内皮细胞的结合显著高于对照USPIO(n)@PDA@IgG(图17)。此外,USPIO(n)@PDA@αVCAM-1与活化的内皮细胞的结合显著多于静止的内皮细胞,这与前者的VCAM-1的更高表达一致(图18)。这些结果表明用抗VCAM-1单克隆抗体包被的USPIO@PDA能够结合选择性活化的内皮细胞。
USPIO(n)@PDA@αVCAM-1显示高敏感性神经炎症
为确定使用靶向USPIO(n)@PDA的分子MRI的可行性,我们使用由纹状体内注射大肠杆菌脂多糖诱导的神经炎症的实验模型。纹状体内注射LPS(1.0μg)24小时后,在重复注射对应于1.33-4mg/kg铁剂量的USPIO(n)@PDA@αVCAM-1前和后3min进行脑MRI(图19)。在对比前图像上,在T2和T2*加权图像中,在这些小鼠中均未观察到右脑和左脑间的显著差异。在静脉内注射USPIO(n)@PDA@αVCAM-1后,主要在右纹状体中观察到许多信号缺失。反复注射表明较高剂量引起更多的信号缺失。我们选择4mg/kg剂量用于进一步实验以实现高灵敏度,同时保持在铁的临床耐受剂量内。值得注意的是,在该模型和该剂量下,USPIO(n)@PDA@αVCAM-1在临床相关的空间分辨率下是可检测的。
此后,为研究USPIO(n)@PDA@αVCAM-1的信号缺失是否与神经炎症的严重程度相关,我们在幼鼠的右纹状体中施用不同剂量的LPS(0、0.25、0.5或1.0μg)。24小时后,我们静脉内注射4mg/kg的USPIO(n)@PDA@αVCAM-1,并进行脑部对比后T2*加权MRI。与VCAM-1的较高表达一致,在接受最高剂量LPS的小鼠的右脑中观察到更多的信号缺失(图20)。重要的是,在对照小鼠的大脑中几乎没有观察到信号缺失,与VCAM-1的低基础表达一致。此外,通过比较注射后和注射前的图像,我们能够以高空间分辨率生成体内大脑中VCAM-1表达的3D图。
USPIO(n)@PDA@αVCAM-1以高灵敏度结合高特异性
为研究我们方法的特异性,我们比较了USPIO(n)@PDA@αVCAM-1与对照USPIO(n)@PDA@IgG。而USPIO(n)@PDA@αVCAM-1在纹状体内注射LPS(1μg)后24小时在右纹状体中诱导许多信号缺失,在接受USPIO(n)@PDA@IgG的鼠中未观察到信号缺失(图21)。通过揭示在LPS处理的鼠的右脑中USPIO(n)@PDA@αVCAM-1显著多于USPIO(n)@PDA@IgG,组织学分析证实了MRI的发现(图22)。通过改变颗粒表面IgG和αVCAM-1的比例,我们观察到靶向抗体的浓度越高,USPIO(n)@PDA@αVCAM-1在炎症纹状体中的结合越高(图23)。此外,当用饱和USPIO(n)@PDA@αVCAM-1结合位点的αVCAM-1单克隆抗体预处理鼠时,未观察到USPIO(n)@PDA@αVCAM-1的显著结合,证实了对比试剂的特异性(图24)。
使用高时间分辨率成像,我们还研究了LPS模型中USPIO(n)@PDA@αVCAM-1与活化的内皮细胞结合的动力学。如图25所示,靶向颗粒快速积聚在右纹状体中,静脉内注射后不到60秒达到接近最大对比度。对照USPIO(n)@PDA@IgG仅在右纹状体中诱导T2*-加权信号的短暂瞬时下降,这与缺乏结合一致。重要的是,两种颗粒从循环中快速清除,估计的初级半衰期为50-70s。在稍后的时间点,T2*-加权成像显示颗粒从右纹状体逐渐地解除结合,在注射后24小时USPIO(n)@PDA@αVCAM-1诱导的信号缺失几乎完全消失(图26)。组织学分析显示未结合的USPIO(n)@PDA@IgG在肝的巨噬细胞中积聚(图27)。
总之,这些实验证明USPIO(n)@PDA@αVCAM-1对于揭示在脑血管系统中VCAM-1的过度表达既敏感又特异。
将USPIO聚类为大亚微米簇提高分子成像的灵敏度
为说明将USPIO积聚成亚微米颗粒带来的灵敏度的增益(gain),我们比较了与抗VCAM-1单克隆抗体缀合的,未成簇的USPIO,小(300nm)和大(700nm)的USPIO(n)@PDA簇的灵敏度以揭示内皮活化。在神经炎症的LPS模型中,小鼠接受4mg/kg的任一颗粒,然后进行20min的MRI(以使得可清除最小的颗粒)。定量分析显示在接受最大颗粒的小鼠中明显更多的信号缺失(图28)。在接受对照的大USPIO(n)@PDA@IgG的小鼠中几乎没有观察到信号缺失。这些结果支持与未成簇的USPIO相比,大的亚微米颗粒对VCAM-1的分子成像的灵敏度有提升。
与靶向活化内皮细胞的抗体缀合的USPIO(n)@PDA揭示在临床相关实验模型中的炎症
然后,我们在更多临床相关的实验模型中进行内皮活化的分子成像。首先,在由大脑中动脉(pMCAo)的永久闭塞诱导的缺血性中风模型中。在该模型中,无菌性炎症在亚急性期(pMCAo后24小时至7天)发展,认为在中风病理生理学中起关键作用。在pMCA0 24小时后,静脉内注入USPIO(n)@PDA@αVCAM-1在右脑缺血损伤的外周诱导许多信号缺失(图29a)。相反,在注射对照USPIO(n)@PDA@IgG后没,有观察到显著的信号缺失。这些数据证明USPIO(n)@PDA@αVCAM-1可以解除在缺血性中风的亚急性期中发生的神经炎症反应。
其次,在由横纹肌溶解诱导的急性肾损伤模型中。在该模型中,在两肢进行肌内注射甘油以诱导横纹肌溶解,从而将肌红蛋白从肌肉释放到血流中,并导致随后的与血容量不足和肌红蛋白对肾小管的直接毒性相关的急性肾损伤。在该模型中,USPIO(n)@PDA@αVCAM-1揭示内皮炎症主要发生在肾髓质中,与肾小管的解剖再分配一致(图29b)。此外,USPIO(n)@PDA@IgG不诱导任何显著的信号缺失。
最后,在炎性肠病模型中。在5天期间,用葡聚糖硫酸钠(DSS)在饮用水中喂养小鼠。DSS通过破坏肠上皮单层内层诱导肠道炎症,导致肠腔细菌和相关抗原进入粘膜,引发免疫应答。在无DSS的情况下2天后,我们在注射USPIO(n)@PDA@MAdCAM-1前和后对降结肠进行分子成像,所述USPIO(n)@PDA@MAdCAM-1靶向粘膜组织中活化的内皮细胞过表达的粘附分子。如图29c所示,静脉内注射USPIO(n)@PDA@MAdCAM-1在DSS处理的小鼠的发炎粘膜中诱导许多信号缺失,而USPIO@PDA@IgG不诱导。
总之,这些结果证明使用靶向USPIO(n)@PDA的免疫-MRI可在临床相关实验模型中揭示炎症,如三个不同器官(脑、肾和肠)中所示,且用两个不同靶标(VCAM-1和MAdCAM-1)进行。
Claims (15)
1.流体动力学直径为200-2000nm的颗粒,所述颗粒包含包埋在聚合物基质内的直径为1-50nm的氧化铁超小颗粒,所述聚合物基质选自聚儿茶酚胺或聚血清素。
2.根据权利要求1所述的颗粒,其中所述氧化铁选自Fe2O3、Fe3O4或Fe2O3和Fe3O4的混合物。
3.根据权利要求1或2所述的颗粒,其中所述聚合物基质来自聚多巴胺(PDA)、聚去甲肾上腺素(PNE)、聚肾上腺素(PEP)和聚血清素。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的颗粒,其中相对于所述颗粒的总重量,所述铁浓度为50重量%-95重量%。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的颗粒的悬浮液。
6.用于制备根据权利要求5所述的颗粒的悬浮液的方法,其包括以下步骤:
a)制备直径为1-50nm的氧化铁超小颗粒的悬浮液;
b)用儿茶酚胺或血清素包被所述氧化铁超小颗粒;
c)在所述氧化铁超小颗粒的存在下,聚合所述儿茶酚胺或血清素,
d)终止所述聚合;以及
e)回收颗粒的悬浮液。
7.通过根据权利要求6所述的方法获得的颗粒的悬浮液或颗粒。
8.缀合物,其包含根据权利要求1-4或7中任一项所述的颗粒或根据权利要求5或7所述的颗粒的悬浮液,以及包含游离胺或硫醇基的分子。
9.根据权利要求8所述的缀合物,其中所述包含游离胺或硫醇基的分子选自蛋白质、肽、纳米抗体、单克隆抗体或包含放射性标记金属的分子,优选地,所述包含游离胺或硫醇基的分子是单克隆抗体。
10.根据权利要求9所述的缀合物,其中所述单克隆抗体选自血管-细胞粘附分子1(VCAM-1)、细胞间粘附分子1(ICAM-1)、P-选择素、E-选择素或粘膜地址素细胞粘附分子1(MAdCAM-1)。
11.根据权利要求1-4或7中任一项所述的颗粒或根据权利要求5或7所述的颗粒的悬浮液或根据权利要求8-10中任一项所述的缀合物,其用于体内成像方法。
12.根据权利要求11所述的用于其用途的颗粒或颗粒的悬浮液或缀合物,其中所述成像方法选自磁共振成像(MRI)、磁颗粒成像(MPI)、光声成像和正电子发射断层扫描(PET)。
13.组合物,其包含根据权利要求1-4或7中任一项所述的颗粒或根据权利要求5或7所述的颗粒的悬浮液或根据权利要求8-10中任一项所述的缀合物。
14.成像方法,其中已向患者施用权利要求13所述的组合物并且包括成像步骤。
15.根据权利要求1-4或7中任一项所述的颗粒或根据权利要求5或7所述的悬浮液或根据权利要求8-10中任一项所述的缀合物在成像技术中作为造影剂或作为示踪剂的用途。
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