CN117724233A - 轴向脉冲分时复用结合扩展焦深的双光子成像方法与装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供轴向脉冲分时复用结合扩展焦深的双光子成像方法与装置，涉及双光子显微成像技术领域，该装置包括飞秒激光器、轴向脉冲分时多路复用模块、多角度投影的扩展焦深模块、二维双光子显微镜、中央控制与处理模块。本发明通过轴向脉冲分时多路复用模块进行多路分束延时和引入变焦量，实现轴向脉冲分时复用功能，通过多角度投影的扩展焦深模块将焦斑在轴向上拉长，以及产生多角度的投影，能有效结合轴向脉冲分时多路复用方法和扩展焦深方法，实现优势互补，并通过采用FPGA与GPU两级数据加速处理的方式，解决两种体成像方法结合随之带来的海量计算量问题。

Description

轴向脉冲分时复用结合扩展焦深的双光子成像方法与装置

技术领域

本发明涉及双光子显微成像技术领域，特别涉及轴向脉冲分时复用结合扩展焦深的双光子成像方法与装置。

背景技术

双光子显微镜由于其在较深的生物组织内仍能保持良好的层析能力和高空间分辨率，目前已在脑科学、肿瘤等研究领域中获得了广泛的应用。

双光子荧光激发效应属于非线性光学现象，需要依赖飞秒激光光源结合物镜实现激光聚焦，才能在焦点处有效激发出双光子荧光，因此每个时间点仅获得焦点上的样品信息。目前结合共振扫描镜、声光偏转器、多面棱镜等高速快轴扫描器件，以及常规慢轴检流计振镜，进行二维点阵扫描(光栅扫描)，已能获得实时(10～30Hz)的平面双光子成像，但结合轴向扫描的三维体成像方法待在持续优化发展过程中。

早些年，通过远程变焦器件或以压电陶瓷驱动物镜轴向快速移动的方式，可以做到以近实时速度(～10Hz)将轴向2～4个层面进行连续切换成像。但这些早期方法的轴向层数较少，三维信息依然较少。

近年来，新出现的一些策略，如轴向脉冲分时复用、扩展焦深等，能有效地提高双光子体积成像的轴向层数与信息量。

如期刊文献”High-speed,cortex-wide volumetric recording ofneuroactivity at cellular resolution using light beads microscopy”,JeffreyDemas et al,Nature Methods,2021，使用轴向脉冲分时复用方法，在轴向范围内产生了30个焦点，相邻轴向焦点对应的脉冲间均延时6.7ns，以达到时间错位以有效避免串扰，后端通过电子电路或重建算法将各焦点的成像信息进行解调提取。轴向脉冲分时复用方法有效地提高了轴向成像的层数和速度，轴向覆盖范围也十分可观，达到500μm以上。但脉冲分时复用方法的缺点也十分明显，脉冲间的延时量需要不小于荧光探针的荧光寿命，一般设置3～7ns，因此成像通量存在着上限，在140～330M像素每秒范围。而且当轴向分焦点数量多了以后，留给横向的像素通量将变小，具体表现为需要的激光重复频率降低，以及为保持成像视野大小，像素采样尺寸增大，成像细节效果降低。

扩展焦深的方法是将激光焦点在轴向上拉长但横向尽量仍维持原样，形成类似针状的焦斑，拉长后多层的信息将投影在同一层，从而提高信息通量。通常使用贝塞尔光束或Airy光束实现轴向拉长而保持横向分辨率。这种多层信息投影在同一层的方式，对于稀疏样品是很好，信息重叠率低，但对于较稠密的样品，信息重叠率将大幅上升，影响信息保真度。

近年来，扩展焦深法通过结合计算成像，通过进行多角度的投影成像，计算重建还原三维信息。通常采用双针状光束并行扫描，两光束呈一定夹角，如V型，或两光束形成轴向相反方向梯度光场，通过引入差别，结合重建算法，能有效计算重建出三维信息。如期刊文献”Volumetric Two-photon Imaging of Neurons Using Stereoscopy(vTwINS)”,Alexander Song et al,Nature Methods,2017，在样品空间产生呈“V”布局的二根针状光束，同时进行扫描，相当于两角度的投影叠加，可通过反解计算还原重建三维图像。也可以不同时产生多角度针状光束，每一帧图像以其中一个角度进行投影，综合多帧多角度图像进行三维重建计算。如期刊文献”Two-photon synthetic aperture microscopy forminimally invasive fast 3D imaging of native subcellular behaviors in deeptissue”,Zhifeng Zhao et al,Cell,2023，进行13个角度的投影，每一帧进行其中1个角度，通过13帧图像重建还原出三维图像。

扩展焦深法结合三维重建计算，能显著增加或还原轴向信息量，但扩展焦深法所覆盖的轴向范围并不大，一般在100μm以内。因为同时覆盖的轴向范围越大，意味着焦深在轴向需要被拉长得更大，就越难于在横向上仍保持较高的分辨率。

如果能结合轴向脉冲分时多路复用法与扩展焦深法，两者的缺点能有效抵消：一方面扩展焦深法能覆盖一定轴向范围，并有效还原三维图像信息，意味着脉冲分时复用的数量能减少，从而减少对横向采样率的影响；另一方面，通过进行少量如4～8个焦点的轴向脉冲分时复用，能弥补扩展焦深覆盖范围有限的缺点，使轴向覆盖范围达到500μm以上。

但两者的结合存在困难，主要在于解决计算量大问题。因为扩展焦深结合投影三维重建，本身计算量较大，再加上脉冲分时各焦点信号的解调提取，也需要消耗巨大的计算资源，而且原来仅对100μm以内的图像信息做三维重建，现在需要对多段100μm以内的图像信息做三维重建，综合起来将产生巨大的实时计算量，单纯使用常规的GPU加速技术也难以做到实时处理与重建。其次，在光路布局上也需要一定优化处理。

发明内容

为了实现本发明的上述目的和其他优点，本发明的第一目的是提供一种轴向脉冲分时复用结合扩展焦深的双光子成像装置，包括飞秒激光器、轴向脉冲分时多路复用模块、多角度投影的扩展焦深模块、二维双光子显微镜、中央控制与处理模块；所述中央控制与处理模块包括高速数据采集卡、逻辑芯片、图形处理芯片，所述高速数据采集卡、所述逻辑芯片、所述图形处理芯片依次通信连接，所述高速数据采集卡与所述二维双光子显微镜通信连接，所述飞秒激光器与所述逻辑芯片通信连接；

所述飞秒激光器发射飞秒脉冲激光并输入到所述轴向脉冲分时多路复用模块，所述轴向脉冲分时多路复用模块对输入的激光进行多路分束延时和引入变焦量，实现轴向脉冲分时复用功能，所述轴向脉冲分时多路复用模块输出的激光输入到所述多角度投影的扩展焦深模块，所述多角度投影的扩展焦深模块将焦斑在轴向上拉长，以及产生多角度的投影，所述多角度投影的扩展焦深模块输出的激光输入到所述二维双光子显微镜，所述二维双光子显微镜进行二维扫描成像、提供显微物镜实现聚焦以及荧光探测光电转换，荧光图像信号输入到所述中央控制与处理模块，所述高速数据采集卡对输入的信号进行采集，所述逻辑芯片对所述高速数据采集卡产生的高通量数据进行处理，结合所述飞秒激光器提供的脉冲同步信号进行各焦点数据的解调提取，并进行像素处理，然后将像素处理结果输入到所述图形处理芯片，所述图形处理芯片对输入数据进行处理，实现多角度投影图像的三维重建。

进一步地，所述轴向脉冲分时多路复用模块包括多个分束器、多个第一透镜、多个微型反射镜、第二透镜，飞秒脉冲激光通过多个所述分束器进行分束，然后分别经过不同延时量的光路长度，再分别经过各支路的所述第一透镜进行聚焦，在焦点附近，分别通过对应的所述微型反射镜进行反射，耦合到所述第二透镜。

进一步地，所述多角度投影的扩展焦深模块包括波前调制器、第三透镜、多角度产生器、第四透镜，输入激光先到达所述波前调制器，所述波前调制器对激光束进行像差波前校正，以及修饰物镜下焦斑形状或分布，经过所述第三透镜后光束聚焦并到达所述多角度产生器，所述多角度产生器产生多个角度的图像投影，最后激光经过所述第四透镜准直后输出。

进一步地，所述二维双光子显微镜包括两维光束扫描器、第五透镜、第六透镜、二向色镜片、物镜、红外截止片、第七透镜、光电倍增管、前置互阻放大器，所述两维光束扫描器使光束发生偏振，形成两维激光光栅扫描，然后通过所述第五透镜与所述第六透镜形成的4-f透镜组，将所述两维光束扫描器与所述物镜在光学上形成共轭关系，所述物镜将激光束聚焦在样品空间，所述二向色镜片和所述红外截止片将红外激光与可见光荧光的光谱分离，与激光分离后，荧光信号通过探测光路端的所述第七透镜，聚焦在所述光电倍增管的光阴极面上，经过光电转换产生光电流信号，光电流信号经过所述前置互阻放大器转换成幅度更大的电压信号，作为数据源输出到所述中央控制与处理模块。

进一步地，所述中央控制与处理模块与所述波前调制器、所述多角度产生器、所述两维光束扫描器、所述光电倍增管通信连接，所述中央控制与处理模块对所述波前调制器、所述多角度产生器、所述两维光束扫描器、所述光电倍增管进行参数设置以及生成扫描驱动波形曲线。

进一步地，所述波前调制器为液晶空间光调制器、可变性镜或数字微镜阵列。

进一步地，所述多角度产生器为被动的偏振分光的多棱镜元件或主动式的扫描器件。

进一步地，所述两维光束扫描器包括一维快轴扫描器和一维慢轴扫描器。

进一步地，所述中央控制与处理模块还包括图像显示器、存储器，所述图像显示器、所述存储器与所述图形处理芯片通信连接，所述图像显示器对图像进行实时显示，所述存储器对数据进行存储。

进一步地，所述逻辑芯片为FPGA，所述图形处理芯片为GPU。

本发明的第二目的是提供一种上述的装置的轴向脉冲分时复用结合扩展焦深的双光子成像方法，包括以下步骤：

通过飞秒激光器发射飞秒脉冲激光，输入至轴向脉冲分时多路复用模块；

通过所述轴向脉冲分时多路复用模块对飞秒脉冲激光进行多路分束延时和引入变焦量，实现轴向脉冲分时复用功能，再输入至多角度投影的扩展焦深模块；

通过所述多角度投影的扩展焦深模块将焦斑在轴向上拉长，以及产生多角度的投影，再输入至二维双光子显微镜；

通过所述二维双光子显微镜进行二维扫描成像、提供显微物镜实现高质量聚焦以及荧光探测光电转换，将荧光图像信号输入到中央控制与处理模块；

通过所述中央控制与处理模块中的高速数据采集卡对输入的信号进行采集，通过所述中央控制与处理模块中的逻辑芯片对所述高速数据采集卡产生的高通量数据进行处理，结合所述飞秒激光器提供的脉冲同步信号进行各焦点数据的解调提取，并进行像素处理，然后将像素处理结果输入到所述中央控制与处理模块中的图形处理芯片，通过所述图形处理芯片对输入数据进行处理，实现多角度投影图像的三维重建。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供轴向脉冲分时复用结合扩展焦深的双光子成像方法与装置，涉及双光子显微成像技术领域，通过轴向脉冲分时多路复用模块进行多路分束延时和引入变焦量，实现轴向脉冲分时复用功能，通过多角度投影的扩展焦深模块将焦斑在轴向上拉长，以及产生多角度的投影，能有效结合轴向脉冲分时多路复用方法和扩展焦深方法，实现优势互补，并通过采用FPGA与GPU两级数据加速处理的方式，解决两种体成像方法结合随之带来的海量计算量问题。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。本发明的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给出。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为实施例1的轴向脉冲分时复用结合扩展焦深的双光子成像装置原理框图；

图2为实施例1的轴向脉冲分时多路复用模块示意图；

图3为实施例1的多角度投影的扩展焦深模块示意图；

图4为实施例1的二维双光子显微镜示意图；

图5为实施例1的轴向脉冲分时多路复用结合扩展焦深的双光子体成像方法在样品空间内形成大轴向覆盖范围的多段扩展焦深光斑示意图；

图6为实施例2的轴向脉冲分时复用结合扩展焦深的双光子成像方法流程图。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。

实施例1

一种轴向脉冲分时复用结合扩展焦深的双光子成像装置，如图1所示，包括飞秒激光器、轴向脉冲分时多路复用模块、多角度投影的扩展焦深模块、二维双光子显微镜、中央控制与处理模块；中央控制与处理模块包括高速数据采集卡、逻辑芯片、图形处理芯片；优选的，逻辑芯片为FPGA，图形处理芯片为GPU。高速数据采集卡、逻辑芯片、图形处理芯片依次通信连接，高速数据采集卡与二维双光子显微镜通信连接，飞秒激光器与逻辑芯片通信连接；

飞秒激光器发射飞秒脉冲激光并输入到轴向脉冲分时多路复用模块，轴向脉冲分时多路复用模块对输入的激光进行多路分束延时和引入变焦量，实现轴向脉冲分时复用功能，轴向脉冲分时多路复用模块输出的激光输入到多角度投影的扩展焦深模块，多角度投影的扩展焦深模块将焦斑在轴向上拉长，以及产生多角度的投影，多角度投影的扩展焦深模块输出的激光输入到常规二维双光子显微镜，二维双光子显微镜进行二维扫描成像、提供显微物镜实现高质量聚焦以及荧光探测光电转换等，荧光图像信号输入到中央控制与处理模块，高速数据采集卡对输入的信号进行采集，逻辑芯片对高速数据采集卡产生的高通量数据进行第一轮处理，结合飞秒激光器提供的脉冲同步信号进行各焦点数据的解调提取，并进行像素多采样点平均、图像滤波、去卷积等操作以进一步提高数据信噪比，然后将像素处理结果输入到图形处理芯片，图形处理芯片通过GPU加速技术对输入数据进行第二轮处理，实现多角度投影图像的三维重建，最后进行图像的实时显示以及数据保存等操作。

在一些实施例中，轴向脉冲分时多路复用模块包括多个分束器、多个第一透镜、多个微型反射镜、第二透镜，飞秒脉冲激光通过多个分束器进行分束，然后分别经过不同延时量的光路长度，实现不同程度的飞秒脉冲延时，再分别经过各支路的第一透镜进行聚焦，在焦点附近，分别通过对应的微型反射镜进行反射，耦合到同一个长焦距第二透镜。

如图2所示，输入到轴向脉冲分时多路复用模块的飞秒脉冲激光通过分束器B21、B22、B23进行四分束，然后分别经过不同延时量的光路长度(此处图2中为了方便没有标出)，实现不同程度的飞秒脉冲延时，然后分别经过第一透镜L21、L22、L23、L24进行聚焦，在焦点附近，分别通过微型反射镜M21、M22、M23、M24进行反射，耦合到第二透镜L25。由于各支路焦点与第二透镜L25的距离均不同，相当于引入不同的变焦量，最后映射到物镜下样品空间不同的轴向位置。而且由于各路焦点存在距离，经发散后，光束直径远大于相邻微型反射镜的尺寸，因此引入微型反射镜进行合束并不会造成过大的光束遮拦。

通常选用的飞秒脉冲激光的初始重复频率为40～80MHz，脉冲间隔12～25ns，经四分束和延时后，相邻分束之间的延时量为3～7ns，实际重复频率增加到原来的4倍。

需要说明的是，图2提供了一种四分束的实施方式，但实际上分束数量并不限定为四束。

如图3所示，多角度投影的扩展焦深模块包括波前调制器S31、第三透镜L31、多角度产生器S32、第四透镜L32，输入激光先到达波前调制器S31，波前调制器S31可以是液晶空间光调制器SLM或可变性镜DM或数字微镜阵列DMD，主要用于对激光束进行像差波前校正，校正光学系统像差或降低生物组织散射影响，以及修饰物镜下焦斑形状或分布，例如产生贝塞尔光束或艾里光斑等常见扩展焦深光斑，或产生强度随轴向位置变化的梯度光场，这些均属于扩展焦深法常见的几种设置。经过第三透镜L31后光束聚焦并到达多角度产生器S32，多角度产生器S32既可以是被动的偏振分光的多棱镜元件，固定输出偏振不同的呈一定夹角的两束光，也可以是主动式的扫描器件，如检流计振镜，主动控制让激光偏转到想要的角度。多角度产生器S32产生多个角度的图像投影，最后激光经过第四透镜L32准直后输出到后续模块。

需要说明的是，实图3中仅示意出了两个投影角度，但实际上不限定于多个角度，可以是任意多个角度。

如图4所示，二维双光子显微镜包括两维光束扫描器S41、第五透镜L41、第六透镜L42、二向色镜片S42、物镜S43、红外截止片S44、第七透镜L43、光电倍增管S45、前置互阻放大器S46，输入激光先到达两维光束扫描器S41，两维光束扫描器S41为一维快轴扫描器和一维慢轴扫描器，快轴扫描器可以是检流计振镜、共振扫描镜、声光偏转器、多面旋转棱镜等，慢轴扫描器通常是检流计振镜。两维光束扫描器S41使光束发生偏振，形成两维激光光栅扫描，是双光子二维平面成像的基础。然后通过第五透镜L41与第六透镜L42形成的4-f透镜组，将两维光束扫描器S41与物镜S43在光学上形成共轭关系，显微物镜S43将激光束高质量地聚焦在样品空间，二向色镜片S42和红外截止片S44将红外激光与可见光荧光的光谱分离，与激光分离后，荧光信号通过探测光路端的第七透镜L43，聚焦在光电倍增管S45的光阴极面上，被光电倍增管S45所收集，经过光电转换产生光电流信号，光电流信号经过前置互阻放大器S46进行进一步转换成幅度更大的电压信号，作为数据源输出到中央控制与处理模块。

需要说明的是，图4中仅示意出了单个荧光探测通道，实际上，通过在探测光路增加二向色片和带通滤光片等，可以将可见光荧光进行多个谱端的进一步划分，如常见的红、绿、蓝谱段划分，增加光电倍增管，可以实现多通道探测。

图5为轴向脉冲分时多路复用结合扩展焦深的双光子体成像方法在样品空间内形成大轴向覆盖范围的多段扩展焦深光斑的示意图。其中，图5中(1)是仅采用轴向脉冲分时多路复用时的效果，每个焦斑在轴向上并不太长，通常是1～15μm，若要形成相对连续的大范围覆盖，需要的分焦点数量将需要很多，脉冲总延时时长大，需要降低激光初始重复频率，从而降低横向采样精度；图5中(2)是仅采用扩展焦深法的效果，通过拉伸焦斑在轴向的长度，提高单个焦斑的轴向覆盖范围，配合多个角度投影，结合算法重建三维图像，但焦斑拉伸的长度有限，通常在100μm以内；图5中(3)是结合轴向脉冲分时多路复用与扩展焦深法的效果，两者的缺点得到相互弥补，使用分量分焦点能实现较大范围的轴向连续覆盖。

两种方法结合后将产生大量的数据量与海量计算量，通过中央控制与处理模块进行消化。荧光图像信号输入到中央控制与处理模块后，被高速数据采集卡所采集，产生的高通量数据先经过内置的FPGA模组进行第一轮处理，结合飞秒激光器提供的脉冲同步信号，进行各焦点数据的解调提取，并进行像素多采样点平均、图像滤波、去卷积等操作，以进一步提高数据信噪比。由于FPGA处理器强大的硬件逻辑门高度并行计算的特点，这些复杂的逻辑与时序运算实际耗时并不多，但需要注意测算并保留充足的可编程逻辑门资源数量。然后输入到显卡GPU，通过GPU加速技术实现多角度投影图像的三维重建。图像多维投影重建对于GPU这种基于矩阵并行计算来说是很合适的，计算速度会数十倍到上百倍的提高，需要注意的是根据多段扩展焦深图像重建的数据量，可以使用多张高性能显卡进行GPU加速，能进一步提高在线处理的实时性和处理系统整体鲁棒性。

在一些实施例中，中央控制与处理模块与波前调制器、多角度产生器、两维光束扫描器、光电倍增管通信连接，中央控制与处理模块除了数据处理功能，还包括硬件控制功能，主要包括对波前调制器S31、多角度产生器S32、两维光束扫描器S41、光电倍增管S45等器件进行参数设置以及生成扫描驱动波形曲线等。

在一些实施例中，中央控制与处理模块还包括图像显示器、存储器，图像显示器、存储器与图形处理芯片通信连接，图像显示器对图像进行实时显示，存储器对数据进行存储。

本发明既能优势结合轴向脉冲分时多路复用方法和扩展焦深方法，又能解决随之带来的海量计算量的问题

实施例2

实施例1提供的轴向脉冲分时复用结合扩展焦深的双光子成像装置对应的轴向脉冲分时复用结合扩展焦深的双光子成像方法，关于轴向脉冲分时复用结合扩展焦深的双光子成像装置的详细描述，可以参照上述装置实施例中的对应描述，在此不再赘述。如图6所示，该方法包括以下步骤：

S1、通过飞秒激光器发射飞秒脉冲激光，输入至轴向脉冲分时多路复用模块；

S2、通过轴向脉冲分时多路复用模块对飞秒脉冲激光进行多路分束延时和引入变焦量，实现轴向脉冲分时复用功能，再输入至多角度投影的扩展焦深模块；

S3、通过多角度投影的扩展焦深模块将焦斑在轴向上拉长，以及产生多角度的投影，再输入至二维双光子显微镜；

S4、通过二维双光子显微镜进行二维扫描成像、提供显微物镜实现高质量聚焦以及荧光探测光电转换，将荧光图像信号输入到中央控制与处理模块；

S5、通过中央控制与处理模块中的高速数据采集卡对输入的信号进行采集，通过中央控制与处理模块中的逻辑芯片对高速数据采集卡产生的高通量数据进行处理，结合飞秒激光器提供的脉冲同步信号进行各焦点数据的解调提取，并进行像素处理，然后将像素处理结果输入到中央控制与处理模块中的图形处理芯片，通过图形处理芯片对输入数据进行处理，实现多角度投影图像的三维重建。

还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、商品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、商品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括要素的过程、方法、商品或者设备中还存在另外的相同要素。

本说明书中的各个实施例均采用递进的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。

以上仅为本说明书实施例而已，并不用于限制本说明书一个或多个实施例。对于本领域技术人员来说，本说明书一个或多个实施例可以有各种更改和变换。凡在本说明书一个或多个实施例的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本说明书一个或多个实施例的权利要求范围之内。

Claims (11)

1.一种轴向脉冲分时复用结合扩展焦深的双光子成像装置，其特征在于：包括飞秒激光器、轴向脉冲分时多路复用模块、多角度投影的扩展焦深模块、二维双光子显微镜、中央控制与处理模块；所述中央控制与处理模块包括高速数据采集卡、逻辑芯片、图形处理芯片，所述高速数据采集卡、所述逻辑芯片、所述图形处理芯片依次通信连接，所述高速数据采集卡与所述二维双光子显微镜通信连接，所述飞秒激光器与所述逻辑芯片通信连接；

所述飞秒激光器发射飞秒脉冲激光并输入到所述轴向脉冲分时多路复用模块，所述轴向脉冲分时多路复用模块对输入的激光进行多路分束延时和引入变焦量，实现轴向脉冲分时复用功能，所述轴向脉冲分时多路复用模块输出的激光输入到所述多角度投影的扩展焦深模块，所述多角度投影的扩展焦深模块将焦斑在轴向上拉长，以及产生多角度的投影，所述多角度投影的扩展焦深模块输出的激光输入到所述二维双光子显微镜，所述二维双光子显微镜进行二维扫描成像、提供显微物镜实现聚焦以及荧光探测光电转换，荧光图像信号输入到所述中央控制与处理模块，所述高速数据采集卡对输入的信号进行采集，所述逻辑芯片对所述高速数据采集卡产生的高通量数据进行处理，结合所述飞秒激光器提供的脉冲同步信号进行各焦点数据的解调提取，并进行像素处理，然后将像素处理结果输入到所述图形处理芯片，所述图形处理芯片对输入数据进行处理，实现多角度投影图像的三维重建。

2.如权利要求1所述的一种轴向脉冲分时复用结合扩展焦深的双光子成像装置，其特征在于：所述轴向脉冲分时多路复用模块包括多个分束器、多个第一透镜、多个微型反射镜、第二透镜，飞秒脉冲激光通过多个所述分束器进行分束，然后分别经过不同延时量的光路长度，再分别经过各支路的所述第一透镜进行聚焦，在焦点附近，分别通过对应的所述微型反射镜进行反射，耦合到所述第二透镜。

3.如权利要求1所述的一种轴向脉冲分时复用结合扩展焦深的双光子成像装置，其特征在于：所述多角度投影的扩展焦深模块包括波前调制器、第三透镜、多角度产生器、第四透镜，输入激光先到达所述波前调制器，所述波前调制器对激光束进行像差波前校正，以及修饰物镜下焦斑形状或分布，经过所述第三透镜后光束聚焦并到达所述多角度产生器，所述多角度产生器产生多个角度的图像投影，最后激光经过所述第四透镜准直后输出。

4.如权利要求3所述的一种轴向脉冲分时复用结合扩展焦深的双光子成像装置，其特征在于：所述二维双光子显微镜包括两维光束扫描器、第五透镜、第六透镜、二向色镜片、物镜、红外截止片、第七透镜、光电倍增管、前置互阻放大器，所述两维光束扫描器使光束发生偏振，形成两维激光光栅扫描，然后通过所述第五透镜与所述第六透镜形成的4-f透镜组，将所述两维光束扫描器与所述物镜在光学上形成共轭关系，所述物镜将激光束聚焦在样品空间，所述二向色镜片和所述红外截止片将红外激光与可见光荧光的光谱分离，与激光分离后，荧光信号通过探测光路端的所述第七透镜，聚焦在所述光电倍增管的光阴极面上，经过光电转换产生光电流信号，光电流信号经过所述前置互阻放大器转换成幅度更大的电压信号，作为数据源输出到所述中央控制与处理模块。

5.如权利要求4所述的一种轴向脉冲分时复用结合扩展焦深的双光子成像装置，其特征在于：所述中央控制与处理模块与所述波前调制器、所述多角度产生器、所述两维光束扫描器、所述光电倍增管通信连接，所述中央控制与处理模块对所述波前调制器、所述多角度产生器、所述两维光束扫描器、所述光电倍增管进行参数设置以及生成扫描驱动波形曲线。

6.如权利要求3所述的一种轴向脉冲分时复用结合扩展焦深的双光子成像装置，其特征在于：所述波前调制器为液晶空间光调制器、可变性镜或数字微镜阵列。

7.如权利要求3所述的一种轴向脉冲分时复用结合扩展焦深的双光子成像装置，其特征在于：所述多角度产生器为被动的偏振分光的多棱镜元件或主动式的扫描器件。

8.如权利要求4所述的一种轴向脉冲分时复用结合扩展焦深的双光子成像装置，其特征在于：所述两维光束扫描器包括一维快轴扫描器和一维慢轴扫描器。

9.如权利要求1所述的一种轴向脉冲分时复用结合扩展焦深的双光子成像装置，其特征在于：所述中央控制与处理模块还包括图像显示器、存储器，所述图像显示器、所述存储器与所述图形处理芯片通信连接，所述图像显示器对图像进行实时显示，所述存储器对数据进行存储。

10.如权利要求1所述的一种轴向脉冲分时复用结合扩展焦深的双光子成像装置，其特征在于：所述逻辑芯片为FPGA，所述图形处理芯片为GPU。

11.一种如权利要求1～10任一项所述的装置的轴向脉冲分时复用结合扩展焦深的双光子成像方法，其特征在于，包括以下步骤：

通过飞秒激光器发射飞秒脉冲激光，输入至轴向脉冲分时多路复用模块；

通过所述轴向脉冲分时多路复用模块对飞秒脉冲激光进行多路分束延时和引入变焦量，实现轴向脉冲分时复用功能，再输入至多角度投影的扩展焦深模块；

通过所述多角度投影的扩展焦深模块将焦斑在轴向上拉长，以及产生多角度的投影，再输入至二维双光子显微镜；

通过所述二维双光子显微镜进行二维扫描成像、提供显微物镜实现高质量聚焦以及荧光探测光电转换，将荧光图像信号输入到中央控制与处理模块；

通过所述中央控制与处理模块中的高速数据采集卡对输入的信号进行采集，通过所述中央控制与处理模块中的逻辑芯片对所述高速数据采集卡产生的高通量数据进行处理，结合所述飞秒激光器提供的脉冲同步信号进行各焦点数据的解调提取，并进行像素处理，然后将像素处理结果输入到所述中央控制与处理模块中的图形处理芯片，通过所述图形处理芯片对输入数据进行处理，实现多角度投影图像的三维重建。