CN117693589A - 用于调节基因表达的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含第一RNA序列、第二RNA序列和接头RNA序列的重组多核酸或RNA构建体的组合物，其中接头RNA连接第一RNA序列和第二RNA序列。此外，描述了增强重组RNA构建体的切割的接头。本文还公开了所述组合物在治疗疾病和调节两种或更多种基因的表达中的用途。

Description

用于调节基因表达的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年6月23日提交的美国临时申请No.63/213,830的权益，该临时申请的全部内容通过引用并入本文。
序列表
本申请包含序列表。
背景
许多人类疾病和病症是由某些蛋白质的表达水平与没有疾病或病症的人类中这些蛋白质的表达水平相比较高和/或较低的表达水平的组合引起的。增加靶蛋白表达和/或分泌和降低一种或多种其它不同的靶蛋白的表达的联合疗法，可能具有治疗效果。例如，皮肤病肌肉疾病或癌症的治疗需要有效和特异性地减少一种或多种靶基因产物的产生并同时增加其它产物的产生。
简要总结
本文提供了使用一种重组多核酸或RNA构建体同时调节两种或更多种蛋白质或核酸序列的表达的组合物和方法。
在一些方面，本文提供了包含重组RNA构建体的组合物，所述重组RNA构建体包含第一RNA序列、第二RNA序列和接头RNA序列，其中：(i)第一RNA序列是第一小干扰RNA(siRNA)序列；(ii)第二RNA序列是第二siRNA序列或编码目的基因(GOI)的第一信使RNA(mRNA)序列；和(iii)接头RNA序列连接第一RNA序列和第二RNA序列，其中接头RNA序列具有选自以下式组成的组群的结构：式(I)：XmCAACAAXn，其中X是任何核苷酸，m为1至12的整数，n为0至4的整数；式(II)：XpTCCCXr，其中X是任意核苷酸，p是0至17的整数，r是0至13的整数。
在一些方面，本文提供了包含重组RNA构建体的组合物，所述重组RNA构建体包含第一RNA序列、第二RNA序列和接头RNA序列，其中：(i)第一RNA序列是第一小干扰RNA(siRNA)序列；(ii)第二RNA序列是第二siRNA序列或编码目的基因(GOI)的第一信使RNA(mRNA)序列；和(iii)接头RNA序列连接第一RNA序列和第二RNA序列，其中接头RNA序列包含ACAACAA或由ACAACAA组成。
在一些方面，本文提供了包含重组RNA构建体的组合物，所述重组RNA构建体包含第一RNA序列、第二RNA序列和接头RNA序列，其中：(i)第一RNA序列是第一小干扰(siRNA)序列；(ii)第二RNA序列是第二siRNA序列或编码目的基因(GOI)的第一信使(mRNA)序列；和(iii)接头RNA序列连接第一RNA序列和第二RNA序列，其中(a)接头RNA序列不是TTTATCTTAGAGGCATATCCCTACGTACCAACAA或ATAGTGAGTCGTATTAACGTACCAACAA；或(b)接头RNA序列不形成根据RNAfold WebServer的二级结构。
在一些方面，本文提供了本文所述的组合物，其用于调节细胞中两种或更多种基因的表达。在一些方面，本文提供了药物组合物，其包含治疗有效量的本文所述的任意一种组合物和药学上可接受的赋形剂。在一些方面，本文提供了包含本文所述的任何一种组合物的细胞。在一些方面，本文提供了包含编码本文所述的任何一种组合物的重组多核酸构建体的载体。
在一些方面，本文提供了从细胞中的单个RNA转录物产生siRNA和mRNA的方法，包括将本文所述的任何一种组合物或本文所述的载体引入细胞中。在一些方面，本文提供了调节蛋白质表达的方法，其包括将本文所述的任何一种组合物或本文所述的任何一种载体引入细胞中，其中由靶RNA编码的蛋白质的表达降低。在一些方面，本文提供了调节蛋白质表达的方法，其包括将本文所述的任何一种组合物或本文所述的任何一种载体引入细胞中，其中由目的基因(GOI)编码的蛋白质的表达增加了。在一些方面，本文提供了调节蛋白质表达的方法，其包括将本文所述的任何一种组合物或本文所述的任何一种载体引入细胞中，其中由靶RNA编码的蛋白质的表达降低，并且其中由目的基因(GOI)编码的蛋白质的表达增加。
在一些方面，本文提供了治疗疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用本文所述的任何一种组合物或本文所述的任何一种药物组合物。
在一些方面，本文提供了包含重组RNA构建体的组合物，所述重组RNA构建体包含第一RNA序列、第一接头RNA序列、第二RNA序列和第二接头RNA序列，其中：(i)第一RNA序列是编码白细胞介素4(IL-4)的信使RNA(mRNA)；(ii)第二RNA序列包含两个或更多个能够结合肿瘤坏死因子α(TNF-α)mRNA的小干扰RNA(siRNA)；(iii)第一接头RNA序列存在于第一RNA序列和第二RNA序列之间，并且(iv)第二接头RNA序列连接两个或更多个siRNA中的每一个并且包含根据SEQ ID NO:23的序列。
在一些方面，本文提供了包含重组RNA构建体的组合物，所述重组RNA构建体包含第一RNA序列、第一接头RNA序列、第二RNA序列和第二接头RNA序列，其中：(i)第一RNA序列是编码胰岛素样生长因子1(IGF1)的信使RNA(mRNA)；(ii)第二RNA序列包含两个或更多个能够结合激活素受体样激酶2(ALK2)mRNA的小干扰RNA(siRNA)；(iii)第一接头RNA序列存在于第一RNA序列和第二RNA序列之间，并且(iii)第二接头RNA序列连接两个或更多个siRNA中的每一个并且包含根据SEQ ID NO:23的序列。
在一些方面，本文提供了包含重组RNA构建体的组合物，所述重组RNA构建体包含第一RNA序列、第一接头RNA序列、第二RNA序列和第二接头RNA序列，其中：(i)第一RNA序列是编码白细胞介素2(IL-2)的信使RNA(mRNA)；(ii)第二RNA序列包含两个或更多个能够结合血管内皮生长因子A(VEGFA)mRNA的小干扰RNA(siRNA)；(iii)第一接头RNA序列存在于第一RNA序列和第二RNA序列之间；(iv)第二接头RNA序列连接两个或更多个siRNA中的每一个并且包含选自SEQ ID NO:23和67-70组成的组群的序列。
在一些方面，本文提供了包含重组RNA构建体的组合物，所述重组RNA构建体包含第一RNA序列、第一接头RNA序列、第二RNA序列和第二接头RNA序列，其中：(i)第一RNA序列是编码白细胞介素12(IL-12)的信使RNA(mRNA)；(ii)第二RNA序列包含两个或更多个能够结合细胞性骨髓细胞瘤病(c-Myc)、Kirsten大鼠肉瘤(KRAS)、蛋白激酶B-1(Akt1)、Akt2和/或Akt3的mRNA的小干扰RNA(siRNA)；(iii)第一接头RNA序列存在于第一RNA序列和第二RNA序列之间；和(iv)第二接头RNA序列连接两个或更多个siRNA中的每一个并且包含根据SEQID NO:23的序列。
在一些方面，本文提供了包含重组多核酸构建体的组合物，所述重组多核酸构建体包含选自SEQ ID NO：1-18和76-108组成的组群的核酸序列。
引用并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体且单独地指示通过引用并入一样。
附图简述
本公开的特征在所附权利要求中具体阐述。通过参考以下阐述说明性实施方案的详细描述，将更好地理解本公开的特征和优点，其中利用了本公开的原理，并且附图中：
图1描绘了结构设计的示意图。多核酸(例如，DNA)构建体可以包含位于目的基因序列上游的T7启动子序列，用于T7 RNA聚合酶结合以及目的基因(例如，IGF-1或IL-4)和单个siRNA的在RNA转录物中的成功体外转录。目的基因的信号肽在灰色框中突出显示。连接mRNA与siRNA或siRNA与siRNA的接头分别用水平条纹框或方格条纹框表示。T7：T7启动子，siRNA：小干扰RNA。
图2A-2B显示了通过ELISA测量THP-1细胞中A1接头或A2接头影响的TNF-α表达的干扰和IL-4蛋白水平的过表达的图。图2A显示了在经刺激的THP-1细胞的内源性TNF-α表达中，化合物1(Cpd.1)和化合物2(Cpd.2)的RNA干扰，所述化合物1(Cpd.1)和化合物2(Cpd.2)在3'端包含3x靶向TNF-α的siRNA，其分别具有A1接头和A2接头。THP-1细胞用大肠杆菌衍生的脂多糖(10μg/mL)和R848(1μg/mL)刺激，然后转染(600ng/孔)Cpd.1、Cpd.2和乱序siRNA(sc-siRNA)。未转染的样品用作对照并设置为100％，并计算TNF-α敲低的百分比。数据代表四次重复平均值的平均值±标准误差。Cpd.1和Cpd.2的显著性(***，p<0.001)通过单因素方差分析以及与对照相关的Dunnet’s多重比较检验进行评估。图2B显示了与图1A相同的细胞(THP-1)培养物上清液中Cpd.1和Cpd.2的IL-4表达。数据代表四次重复平均值的平均值±标准误差。通过Cpd.1和Cpd2的IL-4表达的Student’s t检验评估显著性(**，<0.01)。
图3A-3B显示通过ELISA测量的HEK293细胞中A1接头或A2接头影响的TNF-α表达的干扰和IL-4蛋白水平的过表达的图。图3A显示了在HEK293细胞中TNF-α过表达模型中Cpd.1和Cpd.2的RNA干扰，所述Cpd.1和Cpd.2在3’侧包含3x靶向TNF-α的siRNA,其分别具有A1接头和A2接头。用TNF-αmRNA(600ng/孔)和Cpd.1或Cpd.2(900ng/孔)共转染HEK293细胞。TNF-α水平通过ELISA计算。未转染的样品用作对照并设置为100％，并计算TNF-α敲低的百分比。数据代表四次重复平均值的平均值±标准误差。Cpd.1和Cpd.2的显著性(**，p<0.01)通过单因素方差分析以及与对照相关的Dunnet’s多重比较检验进行评估。图3B显示了与图2A相同的细胞(HEK293)培养物上清液中Cpd.1和Cpd.2的IL-4表达。数据代表4次重复平均值±平均值的标准误差。通过Cpd.1和Cpd.2的IL-4表达的Student’s检验评估显著性(*，<0.05)。
图4A-4D显示了在A1接头或A2接头影响下，A549细胞和HEK293细胞中通过ELISA测量的IGF-1蛋白水平和通过qPCR评估的ALK2表达干扰的图。图4A显示了在内源表达ALK-2的肺上皮细胞(A549细胞)中Cpd.3和Cpd.4的IGF-1表达，所述Cpd.3和Cpd.4在3’侧包含3x靶向ALK2的siRNA，其分别具有A1接头和A2接头。用Cpd.3或Cpd.4RNA以增加的nM浓度(0.65、1.33、2.7、5.4和10.8)转染A549细胞。数据代表4次重复平均值±平均值的标准误差。通过双因素方差分析和Tukey’s多重比较检验评估Cpd.3和Cpd.4之间的显著性(***，p<0.001)。图4B显示了Cpd.3和Cpd.4对如图3A所示相同细胞(A549)培养物裂解物中ALK2表达的RNA干扰。通过相对定量(通过18s基因归一化)，通过qPCR计算ALK2 mRNA水平。未转染的样品用作对照并设置为100％，并计算ALK2敲低的百分比。Cpd.3和Cpd.4之间的ALK2 RNA干扰没有显著差异。图4C和图4D分别显示HEK293细胞和A549细胞中Cpd.3和Cpd.4的IGF-1表达(1.33nM/孔)。数据代表12次重复平均值±平均值的标准误差。通过Cpd.3和Cpd.4的IGF-1表达的Student’s t检验评估显著性(HEK293中*，<0.05；A549细胞中***，<0.001)。
图5A-5C显示了在A1接头或A2接头的影响下，人舌细胞癌细胞(SCC-4)中通过ELISA测量的IGF-1蛋白水平和通过显微镜评估的外源表达的Turbo GFP的干扰的图。图5A显示Cpd.5至Cpd.9的IGF-1表达，所述Cpd.5至Cpd.9在3’侧包含要么1x要么2x靶向TurboGFP的siRNA，其具有A1接头和A2接头。用0.3μg Turbo GFP编码和30nM Cpd.5至Cpd.9之一共转染SCC4细胞。转染后24小时，通过特异性ELISA测量细胞培养物上清液中的IGF-1水平。数据代表4次重复平均值±平均值的标准误差。相比于Cpd.6，Cpd.5的显著性(***，p<0.001)通过单因素方差分析(ANOVA)，然后通过Dunnet’s多重比较检验进行评估。相比于Cpd.9，通过单因素方差分析然后通过Dunnet多重比较检验评估Cpd.7和Cpd.8的显著性(***，p<0.001)。图5B显示了通过显微镜观察的Cpd.5至Cpd.9共转染影响下的外源表达的Turbo GFP(300ng/孔)的干扰。30nM的乱序siRNA(sc-siRNA)用作阴性对照。图5C显示了具有Turbo GFP表达的对照、sc-siRNA、Cpd.5和Cpd.6的代表性显微图像。使用ImageJ分析工具将Turbo GFP阳性细胞转化为灰度图(来自一孔的代表性图)。
图6A是显示A549细胞中由包含不同接头的化合物(Cpd.10-Cpd.15；接头A1、A2、B-E)诱导的IL-2的剂量依赖性分泌水平的图。转染后24小时，通过ELISA测量细胞培养物上清液中的IL-2水平。X轴表示用于转染A549细胞的每种化合物的浓度(1、3、10和30nM/孔)。Y轴显示细胞培养物上清液中IL-2蛋白水平(pg/mL)的测量值。数据代表3次重复平均值±平均值的标准误差。
图6B是显示A549细胞中由包含不同接头(Cpd.10-Cpd.15；接头A1、A2、B-E)的化合物诱导的内源表达的VEGFA的剂量依赖性下调的图。X轴表示用于转染A549细胞的每种化合物的浓度(1、3、10和30nM/孔)。未转染细胞上清液中的VEGFA蛋白水平设定为100％。Y轴表示针对未转染样本(基础水平)归一化的VEGFA水平的下调。数据代表平均值±3次重复平均值的标准误差。
图6C是用浓度为10nM的Cpd.10-Cpd.15(接头A1、A2、B-E)转染的A549细胞中IL-2水平和VEGFA水平的比较表。与用其他化合物转染的A549细胞相比，用Cpd.11(A2接头)和Cpd.15(E接头)转染的A549细胞显示出高1.5至2.5倍的IL-2水平。用不同化合物转染的A549细胞表现出相同的VEGFA下调。
图7A是显示SCC-4细胞中由包含不同接头的化合物(Cpd.10-Cpd.15；接头A1、A2、B-E)诱导的IL-2的剂量依赖性分泌水平的图。转染后24小时，通过ELISA测量细胞培养物上清液中的IL-2水平。X轴表示用于转染至SCC-4细胞的每种化合物的浓度(1、3、10和30nM/孔)。Y轴显示细胞培养物上清液中IL-2蛋白水平(pg/mL)的测量值。数据代表3次重复平均值±平均值的标准误差。
图7B是显示SCC-4细胞中由包含不同接头的化合物(Cpd.10-Cpd.15；接头A1、A2、B-E)诱导的内源表达的VEGFA的剂量依赖性下调的图。X轴表示用于转染至SCC-4细胞的每种化合物的浓度(1、3、10和30nM/孔)。未转染细胞的VEGFA水平设置为100％。Y轴表示针对未转染样本(基础水平)归一化的VEGFA水平的下调。数据代表3次重复平均值±平均值的标准误差。
图7C是用浓度为10nM的Cpd.10-Cpd.15(接头A1、A2、B-E)转染的SCC-4细胞中IL-2水平和VEGFA水平的比较表。与用其他化合物转染的SCC-4细胞相比，用Cpd.11(A2接头)和Cpd.14(E接头)转染的SCC-4细胞显示出高1.2至2.5倍的IL-2水平。与用其他化合物转染的SCC-4细胞相比，用Cpd.12转染的SCC-4细胞表现出改善的VEGFA下调。
图8A-8B显示了在人原代肌细胞(HSMM)中通过ELISA测量的A1接头或A2接头影响下的IGF-1蛋白水平的图。图8A显示了在生长培养基中培养的HSMM细胞中来自Cpd.3和Cpd.4的IGF-1表达，所述Cpd.3和Cpd.4在3’侧包含3x靶向ALK2的siRNA，其分别具有A1接头和A2接头。图8B显示在分化培养基中培养的HSMM细胞中来自Cpd.3和Cpd.4的IGF-1表达。用Cpd.3或Cpd.4RNA以递增的nM浓度(0.1、0.3、1、3、10和30nM)转染HSMM细胞。数据代表4次重复平均值±平均值的标准误差。通过双因素方差分析和Tukey’s多重比较测试评估Cpd.3和Cpd.4之间的显著性(***，p<0.001)。
图9A显示A-172细胞中Cpd.16和Cpd.17诱导的IL-12分泌长达24小时的时程。转染(10nM/孔)后0至24小时，通过ELISA测量细胞培养物上清液中的IL-12水平。X轴表示转染后的时间(小时)，Y轴显示细胞培养物上清液中IL-12蛋白质水平(pg/mL)的测量值。数据代表3次重复平均值±平均值的标准误差。
图9B是显示由rhIL-12或来自用Cpd.16或Cpd.17(0.3μg/孔)转染的人胚肾(HEK293)上清液的IL-12并通过ELISA进行定量(0.001ng至300ng)诱导的HEK-BlueTMIL-12报道细胞中STAT4途径的剂量依赖性激活的图。X轴表示Cpd.16或Cpd.17衍生的IL-12或rhIL-12的不同浓度。Y轴表示针对rhIL-12归一化(rhIL-12的最低SEAP值设置为0，rhIL-12的最高SEAP值设置为100％)的IL-12信号传导激活。数据代表每剂量3次重复的平均值±平均值的标准误差。
图9C-9D是显示用Cpd.16(图9C)或Cpd.17(图9D)转染的A172细胞中KRAS和pan-Akt(Akt1、Akt2和Akt3)水平的时间依赖性下调的图。转染后24小时内，通过qPCR技术一式三份测量细胞裂解物中KRAS和pan-Akt的RNA水平。X轴表示转染后的时间(小时)。Y轴表示针对未转染样本(基础水平)归一化的KRAS和pan-Akt水平的下调。数据代表3次重复平均值±平均值的标准误差。
图9E-9F是显示用Cpd.16(图9E)或Cpd.17(图9F)转染的A172细胞中c-Myc水平的时间依赖性下调的图。转染后12-24小时，通过qPCR从细胞裂解液中测量c-Myc的RNA水平，一式三份。X轴表示转染后的时间(小时)。Y轴表示针对未转染样本(基础水平)进行归一化的c-Myc水平的下调。数据代表3次重复平均值±平均值的标准误差。
发明详述
本文提供了用于调节两种或更多种基因的表达的组合物和方法，其包含重组多核酸或RNA构建体，所述重组多核酸或RNA构建体包含至少一种编码目的基因的核酸序列和/或至少一种编码或包含调节靶RNA表达的遗传元件的核酸序列。本文提供的重组多核酸或RNA构建体组合物还可包含一种或多种接头。在一种情况下，重组多核酸或RNA构建体可包含编码或包含调节一种或多种靶RNA表达的一种或多种遗传元件的核酸序列和一种或多种接头，其中接头可存在于调节一种或多种靶RNA表达的一个或多个遗传元件的每一个之间。在另一种情况下，重组多核酸或RNA构建体可包含编码一种或多种目的基因的核酸序列和一个或多个接头，其中接头可存在于一种或多种目的基因的每一个之间。在一些情况下，重组多核酸或RNA构建体可包含编码一种或多种目的基因的核酸序列、编码或包含调节一种或多种靶RNA表达的一种或多种遗传元件的核酸序列、以及一种或多种接头，其中接头可以存在于编码一种或多种目的基因的核酸序列与编码或包含调节一种或多种靶RNA表达的一种或多种遗传元件的核酸序列之间；调节一种或多种靶RNA表达的一种或多种遗传元件的每一个之间；和/或一种或多种目的基因之间。
本文还提供了包含本文所述的重组多核酸构建体或编码本文所述的重组RNA构建体的载体。本文提供了包含本文所述的重组多核酸或RNA构建体组合物或载体的细胞。本文所述的重组多核酸或RNA构建体组合物可以配制成药物组合物。本文进一步提供了平行调节两个或更多个基因的表达的组合物和方法。
本文提供了用于治疗疾病或病症的组合物和方法，包括向有需要的受试者施用本文所述的组合物或药物组合物。本文提供的重组多核酸或RNA构建体组合物可包含第一RNA序列、第二RNA序列和接头RNA序列，其中接头RNA序列的接头连接第一RNA序列和第二RNA序列。在一个实例中，第一RNA序列或第二RNA序列可以包含一个或多个信使RNA(mRNA)，并且可以增加由mRNA编码的蛋白质的水平。在另一个实例中，第一RNA序列或第二RNA序列可以是调节靶RNA表达的遗传元件。例如，第一RNA序列或第二RNA序列可以包含能够结合一个或多个靶RNA的小干扰RNA(siRNA)，并且可以下调由靶RNA编码的蛋白质的水平。例如，mRNA和靶RNA可以是与本文描述的疾病和病症相关的基因。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文所述的那些类似或等同的方法和材料可用于本公开的实践或测试，但下文描述了合适的方法和材料。
定义
阐述本描述的某些具体细节是为了提供对各种实施方案的透彻理解。然而，本领域技术人员将理解，没有这些细节也可以实践本公开。在其他情况下，未详细示出或描述众所周知的结构，以避免不必要地模糊实施方案的描述。除非上下文另有要求，否则在整个说明书和随后的权利要求书中，词语“包括”及其变体，例如“包括”和“包含”应以开放的、包容性的意义解释，换言之，即“包括，但不限于”。此外，本文提供的标题仅为了方便起见，并不解释所要求保护的公开内容的范围或含义。
如本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指示物，除非内容另外明确指出。还应当注意的是，术语“或”通常以其包括“和/或”的含义使用，除非内容明确地另有说明。本文使用的术语“和/或”和“其任何组合”及其语法等同物可以互换使用。这些术语可以表达任何组合都是特别考虑的。仅出于说明性目的，以下短语“A、B和/或C”或“A、B、C或其任意组合”可以表示“单独的A；单独的B；单独的C；A和B；B和C；A和C；以及A、B和C。”术语“或”可以连接或分离使用，除非上下文特定指分离使用。
术语“大约”或“大概”可以表示在由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受的误差范围内，这将部分取决于该值是如何测量或确定的，即，测量系统的局限。例如，根据本领域的实践，“大约”可以表示在1个标准差内或多于1个标准差。或者，“大约”可表示给定值的最多20％、最多10％、最多5％或最多1％的范围。或者，特别是对于生物系统或过程，该术语可以表示在数值的一个数量级内、5倍内或2倍内。当在申请和权利要求中描述特定值时，除非另有说明，否则应当假定术语“约”意味着在特定值的可接受的误差范围内。
如本说明书和权利要求中所使用的，词语“包含”(以及任何形式的等同表达)、“具有”(以及任何形式的等同表达)、“包括”(以及任何形式的等同表达)或“含有”(以及任何形式的等同表达)是包容性或开放式的并且不排除额外的、未列举的元素或方法步骤。预期本说明书中讨论的任何实施方案可以基于本公开的任何方法或组合物来实现，反之亦然。此外，本公开的组合物可用于实现本公开的方法。
本说明书中提及的“实施方案”、“某些实施方案”、“优选实施方案”、“特定实施方案”、“一些实施方案”、“实施方案(非特指)”、“一个实施方案”或“其他实施方案”意味着结合实施方案描述的特定特征、结构或特性被包含在本公开的至少一些实施方案中，但不一定包含在本公开的所有实施方案中。为了便于理解本公开，下面定义了许多术语和短语。
本文使用的术语“RNA”包括编码氨基酸序列的RNA(例如，mRNA等)，以及不编码氨基酸序列的RNA(例如，siRNA、shRNA、miRNA等)。本文所用的RNA可以是编码RNA，即编码氨基酸序列的RNA。此类RNA分子也称为mRNA(信使RNA)并且是单链RNA分子。本文使用的RNA可以是非编码RNA，即不编码氨基酸序列或不翻译成蛋白质的RNA。非编码RNA可包括但不限于小干扰RNA(siRNA)、短或小发夹RNA(shRNA)、microRNA(miRNA)、piwi-interacting RNA(piRNA)和长非编码RNA(IncRNA)。本文使用的siRNA可包含双链RNA(dsRNA)区域、发夹结构、环结构或其任何组合。在一些实施方案中，siRNA可包含至少一种shRNA、至少一种dsRNA区域或至少一种环结构。在一些实施方案中，siRNA可以由dsRNA或shRNA加工而成。在一些实施方案中，siRNA可以被内源蛋白质(例如DICER)从shRNA加工或切割。在一些实施方案中，发夹结构或环结构可以从siRNA中切割或去除。例如，shRNA的发夹结构或环结构可以被切割或去除。在一些实施方案中，本文所述的RNA可通过本领域普通技术人员已知的合成、化学或酶促方法制备，通过本领域普通技术人员已知的重组技术制备，或从天然来源分离，或通过其任意组合制备。RNA可包含修饰的或未修饰的核苷酸或其混合物，例如，RNA可任选地包含本领域已知的化学和天然存在的核苷修饰(例如，N1-甲基假尿苷，在本文中也称为甲基假尿苷)。
术语“核酸序列”、“多核酸序列”和“核苷酸序列”在本文中可互换使用并且在本文中具有相同的含义并且是指DNA或RNA。在一些实施方案中，核酸序列是包含核苷酸单体或由核苷酸单体组成的聚合物，所述核苷酸单体通过糖/磷酸酯-主链的磷酸二酯键彼此共价连接。术语“核酸序列”、“多核酸序列”和“核苷酸序列”可以涵盖未修饰的核酸序列，即包含未修饰的核苷酸或天然核苷酸。术语“核酸序列”、“多核酸序列”和“核苷酸序列”还可以涵盖修饰的核酸序列，例如碱基修饰的、糖修饰的或主链修饰的等，DNA或RNA。
术语“天然核苷酸”和“标准核苷酸”在本文中可互换使用并且在本文中具有相同的含义并且是指天然存在的核苷酸碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)、胸腺嘧啶(T)。
术语“未修饰的核苷酸”在本文中用于指未天然修饰的天然核苷酸，例如未在体内表观遗传修饰或转录后修饰的天然核苷酸。优选地，术语“未修饰的核苷酸”在本文中用于指未天然修饰的天然核苷酸，例如未在体内表观遗传修饰或转录后修饰以及未化学修饰的天然核苷酸，例如未在体外化学修饰的天然核苷酸。
本文使用的术语“修饰的核苷酸”是指天然修饰的核苷酸，例如表观遗传修饰或转录后修饰的核苷酸，以及化学修饰的核苷酸，例如体外化学修饰的核苷酸。
重组RNA构建体
本文提供了包含重组RNA构建体的组合物，所述重组RNA构建体包含至少一种编码目的基因的核酸序列和/或至少一种包含调节靶RNA表达的遗传元件的核酸序列。本文提供的重组RNA构建体组合物还可包含一种或多种接头。在一种情况下，重组RNA构建体可包含核酸序列，所述核酸序列包含调节一种或多种靶RNA表达的一种或多种遗传元件和一种或多种接头，其中接头可存在于调节一种或多种靶RNA表达的一种或多种遗传元件的每一个之间。在另一种情况下，重组RNA构建体可包含编码一种或多种目的基因的核酸序列和一种或多种接头，其中接头可存在于一种或多种目的基因的每一个之间。在一些情况下，重组RNA构建体可包含编码一种或多种目的基因的核酸序列、包含调节一种或多种靶RNA表达的一种或多种遗传元件的核酸序列、以及一种或多种接头，其中接头可以是存在于编码一种或多种目的基因的核酸序列与包含调节一种或多种靶RNA表达的一种或多种遗传元件的核酸序列之间；调节一种或多种靶RNA表达的一种或多种遗传元件中的每一种之间；和/或在一个或多个目的基因中的每一个之间。
本文提供了用于调节包含重组RNA构建体的两种或更多种基因表达的组合物，所述重组RNA构建体包含至少一种编码目的基因的核酸序列和/或至少一种包含调节靶RNA表达的遗传元件的核酸序列。本文还提供了含重组RNA构建体的用于治疗疾病或病症的组合物，所述重组RNA构建体包含至少一种编码目的基因的核酸序列和/或至少一种包含调节靶RNA表达的遗传元件的核酸序列。本文提供的重组RNA构建体组合物可包含第一RNA序列、第二RNA序列和接头序列，其中接头序列连接第一RNA序列和第二RNA序列。在一个实例中，第一RNA序列或第二RNA序列可以包含一个或多个信使RNA(mRNA)，并且可以增加由mRNA编码的蛋白质的水平。在另一个实例中，第一RNA序列或第二RNA序列可以是调节靶RNA表达的遗传元件。在一些实施方案中，调节靶RNA表达的遗传元件可以是能够结合一种或多种靶RNA的小干扰RNA(siRNA)。例如，第一RNA序列或第二RNA序列可以包含能够结合一个或多个靶RNA的siRNA，并且可以下调由靶RNA编码的蛋白质的水平。在一些情况下，调节靶RNA表达的遗传元件不抑制目的基因的表达。在一些情况下，mRNA和靶RNA可以是与本文描述的疾病和病症相关的基因。本文还提供了使用单个RNA转录物并行调节两个或更多个基因的表达的组合物和方法。
本文还提供了重组多核酸或RNA构建体，其包含目的基因和减少另一种基因的表达的遗传元件(例如siRNA)，其中可以从5'到3'方向或从3'到5'方向依次存在目的基因和减少另一种基因的表达的遗传元件(例如siRNA)。如图1所示。在一个实例中，目的基因(例如，IGF-1、IL-2、IL-12或IL-4)可以存在于减少另一基因表达的遗传元件(例如siRNA)的5'侧或上游，目的基因可以通过接头(mRNA至siRNA/shRNA接头，也可以称为“间隔子”)与siRNA连接，如图1所示。在另一个实例中，目的基因可以存在于减少另一个基因表达的遗传元件(例如siRNA)的3'端或下游，并且siRNA可以通过接头(siRNA/shRNA至mRNA接头，也可称为“间隔子”)连接至目的基因。本文提供的重组多核酸或RNA构建体可包含多于一种的siRNA，并且多于一种的siRNA中的每一种可通过接头(siRNA至siRNA接头或shRNA至shRNA接头)连接。在一些实施方案中，mRNA至siRNA/shRNA(或siRNA/shRNA至mRNA)接头的序列和siRNA至siRNA(或shRNA至shRNA)接头的序列可以不同。在一些实施方案中，mRNA至siRNA/shRNA(或siRNA/shRNA至mRNA)接头的序列和siRNA至siRNA(或shRNA至shRNA)接头的序列可以是相同的。本文提供的重组多核酸或RNA构建体可以包含多于一种目的基因，并且多于一种目的基因中的每一种可以通过接头(mRNA至mRNA接头)连接。在一些情况下，目的基因可以在N末端包含信号肽序列，如图1所示。在一些情况下，目的基因可以包含未修饰的(WT)信号肽序列或修饰的信号肽序列。本文提供的重组多核酸构建体(例如，DNA构建体)还可包含用于RNA聚合酶结合的启动子序列。例如，DNA构建体可以包含用于结合DNA依赖性RNA聚合酶以表达本文所述的RNA构建体的启动子序列。作为示例，用于T7 RNA聚合酶结合的T7启动子在图1中示出。在一些实施方案中，本文描述的RNA构建体可以不包含启动子序列。
重组多核酸或重组RNA可以指非天然存在的并且在体外合成或操作的多核酸或RNA。重组多核酸或RNA可以在实验室中合成，并且可以通过使用重组DNA或RNA技术，通过使用DNA或RNA的酶促修饰，例如酶促限制性消化、连接、克隆和/或体外转录来制备。重组多核酸可以在体外转录以产生信使RNA(mRNA)，并且重组mRNA可以被分离、纯化并用于转染到细胞中。本文使用的重组多核酸或RNA可编码蛋白质、多肽、靶基序、信号肽和/或非编码RNA例如小干扰RNA(siRNA)。在一些实施方案中，在合适的条件下，重组多核酸或RNA可以进入细胞中并在细胞内表达。
本文提供了重组RNA构建体，其包含一种或多种包含能够结合靶RNA的siRNA的核酸序列和一种或多种编码目的基因的核酸序列，其中能够结合靶RNA的siRNA不是由目的基因编码的内含子序列的一部分。在某些情况下，目的基因无需RNA剪接即可表达。在一些情况下，能够结合靶RNA的siRNA不由目的基因的内含子序列编码或组成。在一些情况下，能够结合靶RNA的siRNA结合靶RNA的外显子。在一些情况下，能够结合靶RNA的siRNA特异性结合一种靶RNA。
本文提供的重组RNA构建体可包含目的基因的多个拷贝，其中目的基因的多个拷贝中的每一个编码相同的蛋白质。本文还提供了包含重组RNA构建体的组合物，所述重组RNA构建体包含多个目的基因，其中多个目的基因中的每一个编码不同的蛋白质。本文提供的重组RNA构建体可包含多种siRNA，其中多种siRNA中的每一种能够结合相同的靶RNA。在一些实施方案中，多种siRNA中的每一种可以结合相同靶RNA的相同区域。在一些实施方案中，多种siRNA中的每一种可以结合相同靶RNA的不同区域。在一些实施方案中，多种siRNA中的一些可以结合相同的靶RNA，并且多种siRNA中的一些可以结合相同靶RNA的不同区域。本文还提供了包含多种siRNA的重组RNA构建体，其中多种siRNA中的每一种能够结合不同的靶RNA。在一些实施方案中，靶RNA是非编码RNA。在一些实施方案中，靶RNA是信使(mRNA)。
本文提供了包含重组RNA构建体的组合物，所述重组RNA构建体包含第一RNA序列、第二RNA序列和接头序列，其中第一RNA序列和/或第二RNA序列可以编码目的基因或编码调节目标RNA表达的遗传元件。在一个实例中，第一RNA序列或第二RNA序列可以是编码目的基因的mRNA。在另一个实例中，第一RNA序列或第二RNA序列可以是减少靶RNA表达的遗传元件，例如能够结合靶RNA的小干扰RNA(siRNA)。
本文提供的重组RNA构建体可以包含多于一种编码目的基因的核酸序列。例如，重组RNA构建体可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个编码目的基因的核酸序列。在一些情况下，两个或更多个核酸序列中的每一个可以编码相同的目的基因，其中由相同的目的基因编码的mRNA不同于靶向mRNA的siRNA。在一些情况下，两个或更多个核酸序列中的每一个可以编码不同的目的基因，其中由不同的目的基因编码的mRNA不是包含在相同RNA构建体中的siRNA的靶标。在一些情况下，重组RNA构建体可以包含编码目的基因的三个或更多个核酸序列，其中三个或更多个核酸序列中的每一个可以编码相同的目的基因或不同的目的基因，并且其中由相同或不同的目的基因编码的mRNA不是包含在相同RNA构建体中的siRNA的靶标。例如，重组RNA构建体可以包含编码目的基因的四个核酸序列，其中四个核酸序列中的三个编码相同的目的基因并且四个核酸序列之一编码不同的目的基因，并且其中由相同或不同的目的基因编码的mRNA不是包含在相同RNA构建体中的siRNA的靶标。
本文提供的重组RNA构建体可以包含多于一种的siRNA，其靶向与本文所述的疾病或病症相关的基因的RNA。例如，本文提供的重组RNA构建体可以包含1-10种靶向相同RNA或不同RNA的siRNA。在一些情况下，靶向相同RNA的1-10种siRNA中的每一种可以包含相同的序列，即，1-10种siRNA中的每一种结合至靶RNA的相同区域。在一些情况下，靶向相同RNA的1-10种siRNA中的每一种可以包含不同的序列，即，1-10种siRNA中的每一种结合至靶RNA的不同区域。例如，本文提供的重组RNA构建体可以包含靶向一种RNA的3种siRNA，并且这3种siRNA中的每一种包含相同的核酸序列以靶向RNA的相同区域。在该实例中，3种siRNA中的每一种可包含相同的核酸序列以靶向外显子1。在另一个实例中，3种siRNA中的每一种可包含不同的核酸序列以靶向RNA的不同区域。在这个例子中，3种siRNA中的一种可以包含靶向外显子1的核酸序列，并且3种siRNA中的另一种可以包含靶向外显子2的核酸序列，等等。在又一个例子中，3种siRNA中的每一种可以包含不同的核酸序列以靶向不同的RNA。在所有方面，本文提供的重组RNA构建体中的siRNA可能不影响由相同RNA构建体组合物中的mRNA表达的目的基因的表达。在一些实施方案中，靶RNA是mRNA。
本文提供了包含重组RNA构建体的组合物，所述重组RNA构建体包含第一RNA序列、第二RNA序列和接头RNA序列，其中接头RNA序列连接第一RNA序列和第二RNA序列。在一些情况下，本文所述的接头可具有式(I)XmCAACAAXn的结构，其中X是任何核苷酸，m是1至12的整数，并且n是0至4的整数。在一些情况下，本文所述的接头可以具有式(II)的结构：XpTCCCXr，其中X是任何核苷酸，p是0至17的整数，并且r是0至13的整数。在一个实施方案中，第一RNA序列或第二RNA序列可以包含调节一种或多种靶RNA的表达的一个或多个遗传元件，并且接头RNA序列可以连接调节一种或多种靶RNA的表达的一个或多个遗传元件中的每一个(例如，siRNA至siRNA接头或shRNA至shRNA接头)。在另一个实施方案中，第一RNA序列可以编码目的基因并且第二RNA序列可以包含调节一种或多种靶RNA的表达的一个或多个遗传元件，并且接头RNA序列可以连接目的基因和调节一种或多种靶RNA的表达的一种或多种遗传元件(例如，mRNA至siRNA接头、siRNA至mRNA、mRNA至shRNA接头、或shRNA至mRNA接头)。在一些实施方案中，mRNA至siRNA/shRNA(或siRNA/shRNA至mRNA)接头的序列和siRNA至siRNA(或shRNA至shRNA)接头的序列可以不同。在一些实施方案中，mRNA至siRNA/shRNA(或siRNA/shRNA至mRNA)接头的序列和siRNA至siRNA(或shRNA至shRNA)接头的序列可以是相同的。在一些实施方案中，第一RNA序列可以编码目的基因并且第二RNA序列可以包含调节一种或多种靶RNA的表达的一个或多个遗传元件，并且相同的RNA接头序列可以连接目的基因和调节一种或多种靶RNA的表达的一种或多种遗传元件(例如，mRNA至siRNA/shRNA接头或siRNA/shRNA至mRNA接头)以及调节一种或多种靶RNA的表达的一种或多种遗传元件中的每一个之间(例如，siRNA/shRNA到siRNA/shRNA接头)。
在一些实施方案中，接头的长度为约4至约50、约4至约45、或约4至约40、约4至约35、或约4至约30个核苷酸。在一些实施方案中，接头的长度为约4至约27个核苷酸。在一些实施方案中，接头的长度为约4至约18个核苷酸。例如，接头的长度为约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49或约50个核苷酸。在一些实施方案中，接头的长度可以是至多约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49，或至多约50个核苷酸。在一些实施方案中，接头的长度是4个核苷酸。在一些实施方案中，接头的长度是7个核苷酸。在一些实施方案中，接头的长度是11个核苷酸。在一些实施方案中，接头的长度是12个核苷酸。在一些实施方案中，接头的长度是18个核苷酸。在一些实施方案中，接头的长度是16个核苷酸。在一些实施方案中，接头的长度是20个核苷酸。在一些实施方案中，接头的长度是23个核苷酸。在一些实施方案中，接头的长度是27个核苷酸。
在一些情况下，本文描述的接头可据有式(I)XmCAACAAXn的结构，其中X是任何核苷酸；m为1～12的整数，n为0～4的整数；m是1并且n是0。在一些情况下，本文描述的接头可以包含具有CAACAA(SEQ ID NO:71)、TCCC(SEQ ID NO:69)或ACAACAA(SEQ ID NO:23)的序列。在一些实施方案中，接头可包含选自以下组成的组的序列：ATCCCTACGTACCAACAA(SEQ IDNO:67)、ACGTACCAACAA(SEQ ID NO:68)、TCCC(SEQ ID NO:69)、ACAACAATCCC(SEQ ID NO:70)和ACAACAA(SEQ ID NO：23)。在一些实施方案中，接头可包含具有ACAACAA(SEQ ID NO:23)、ATAGTGAGTCGTATTATCCC(SEQ ID NO:72)、ATAGTGAGTCGTATTAACAACAATCCC(SEQ ID NO:73)、ATAGTGAGTCGTATTAACAACAA(SEQ ID NO:74)、ATAGTGAGTCGTATTAATCCCTACGTACCAACAA(SEQ ID NO：75)，或ATAGTGAGTCGTATTAACGTACCAACAA(SEQ ID NO：21)的序列。在一些实施方案中，接头可包含具有ACAACAA(SEQ ID NO：23)的序列。在一些实施方案中，本文描述的接头可包含选自SEQ ID NO:23、67-75组成的组的序列。在一些实施方案中，本文描述的接头可以不包含具有TTTATCTTAGAGGCATATCCCTACGTACCAA CAA(SEQ ID NO：22)的序列。在一些实施方案中，本文描述的接头可以不包含具有ATAGTGAGTCGTATTAACGTACCAACAA(SEQ IDNO：21)的序列。在一些实施方案中，本文描述的接头不包含TTTATCTTAGAGGCATATCCCTACGTACCAACAA(SEQ ID NO:22)或ATAGTGAGTCGTATTAACGTACCAACAA(SEQ ID NO:21)。
在某些情况下，可以使用tRNA接头。tRNA系统是跨生物体的进化上保守的，利用内源性RNase P和Z来处理多顺反子构建体(Dong etal.,2016)。在一些情况下，本文所述的tRNA接头可包含具有AACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCA CGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCA(SEQ ID NO:39)的核酸序列。在一些情况下，包含核酸序列的接头可用于连接第一RNA序列和第二RNA序列，所述核酸序列包含ATAGTGAGTCGTATTAACGTACCAACAA(SEQ ID NO：21)。在一些实施方案中，包含具有TTTATCTTAGAGGCATATCCCTACGTA CCAACAA(SEQ ID NO：22)的核酸序列的接头可用于连接1-20种或更多种siRNA种类中的每一种。
在一些情况下，本文描述的接头可以不形成二级结构。例如，本文描述的接头可以不与本文提供的重组RNA构建体的核酸序列结合或碱基配对。在一些情况下，本文描述的接头可以不形成接头序列内的二级结构。例如，本文描述的接头在接头序列内可以不具有碱基配对。在一些实施方案中，本文描述的接头RNA序列不形成根据RNAfold WebServer的二级结构。在一些实施方案中，本文描述的siRNA序列可以形成根据RNAfold WebServer的二级结构。
本文进一步提供了包含1-20或更多siRNA种类的重组RNA构建体组合物，其中1-20或更多siRNA种类的每一个通过接头连接，所述接头具有选自以下组成的组的结构：式(I)：XmCAACAAXn，其中X是任意核苷酸，m是1至12的整数，并且n是0至4的整数；式(II)：XpTCCCXr，其中X是任意核苷酸，p是0至17的整数，并且r是0至13的整数。
在一些情况下，本文提供的重组RNA构建体可以被切割。例如，本文提供的重组RNA构建体可以在被细胞摄取后被内源切割。在一些实施方案中，重组RNA构建体可以被细胞内蛋白质或内源蛋白质切割。在一些实施方案中，重组RNA构建体可以被DICER(例如内源DICER)切割。在一些实施方案中，重组RNA构建体包含第一RNA序列、第二RNA序列和接头RNA序列，其中接头RNA序列连接第一RNA序列和第二RNA序列，可以在第一RNA序列和第二RNA序列之间切割。在一些实施方案中，本文提供的重组RNA构建体包含第一RNA序列、第二RNA序列和接头。在该实施方案中，第一RNA序列或第二RNA序列可以包含调节一种或多种靶RNA表达的一个或多个遗传元件，并且重组RNA构建体可以在调节一种或多种靶RNA表达的一个或多个遗传元件的每个之间切割。在另一个实施方案中，第一RNA序列可以编码目的基因并且第二RNA序列可以包含调节一种或多种靶RNA的表达的一个或多个遗传元件，并且重组RNA构建体可以在目的基因和调节一种或多种靶RNA表达的一种或多种遗传元件之间切割。在一些实施方案中，第一RNA序列可以编码目的基因并且第二RNA序列可以包含调节一种或多种靶RNA的表达的一个或多个遗传元件，并且重组RNA构建体可以在目的基因和调节一种或多种靶RNA表达的一种或多种遗传元件之间和/或在调节一种或多种靶RNA表达的一种或多种遗传元件的每一个之间切割。
在一些情况下，与不包含本文所述接头的相应RNA构建体的切割相比，重组RNA构建体的切割增强。例如，与不包含本文所述接头的RNA构建体的切割相比，包含第一RNA序列、第二RNA序列和一个或多个本文所述接头的重组RNA构建体的切割得到增强。例如，与包含不具有选自以下结构的接头的RNA构建体的切割相比，包含本文所述的第一RNA序列、第二RNA序列和接头RNA序列的重组RNA构建体的切割得到增强：式(I)：XmCAACAAXn，其中X是任意核苷酸，m是1至12的整数，并且n是0至4的整数；式(II):XpTCCCXr，其中X是任何核苷酸，p是0至17的整数，并且r是0至13的整数。例如，与包含接头的RNA构建体的切割相比(所述接头不包含具有ACAACAA(SEQ ID NO:23)的序列)，包含本文所述的第一RNA序列、第二RNA序列和接头RNA序列的重组RNA构建体的切割得到增强。例如，与包含形成二级结构的接头的RNA构建体的切割相比，包含本文所述的第一RNA序列、第二RNA序列和接头RNA序列的重组RNA构建体的切割增强。
在一些情况下，与来自不包含本文所述接头的相应重组RNA构建体的目的基因的表达相比，来自本文提供的重组RNA构建体的目的基因的表达增强。例如，与来自不包含本文所述接头的RNA构建体的目的基因的表达相比，来自包含本文所述的第一RNA序列、第二RNA序列和接头RNA序列的重组RNA构建体的目的基因的表达被增强。例如，与来自包含接头的RNA构建体的目的基因的表达相比(所述接头不具有选自以下组成的组的结构：式(I)：XmCAACAAXn，其中X是任何核苷酸，m是1至12的整数，并且n是0至4的整数；和式(II)：XpTCCCXr，其中X是任何核苷酸，p是0至17的整数，并且r是0至13的整数。)，来自包含本文所述第一RNA序列、第二RNA序列和接头RNA序列的相应重组RNA构建体的目的基因的表达被增强。例如，与来自包含接头的RNA构建体的目的基因的表达相比(所述接头不包含具有ACAACAA(SEQ ID NO:23)的序列)，来自包含本文所述的第一RNA序列、第二RNA序列和接头序列的重组RNA构建体的目的基因的表达被增强。例如，与来自包含接头的RNA构建体的目的基因的表达相比(所述接头不包含具有ATCCCTACGTACCAACAA(SEQ ID NO:67)的序列)，来自包含本文所述的第一RNA序列、第二RNA序列和接头序列的重组RNA构建体的目的基因的表达被增强。例如，与来自包含接头的RNA构建体的目的基因的表达相比(所述接头不包含具有ACGTACCAACAA(SEQ ID NO:68)的序列)，来自包含本文所述的第一RNA序列、第二RNA序列和接头序列的重组RNA构建体的目的基因的表达被增强。例如，与来自包含接头的RNA构建体的目的基因的表达相比(所述接头不包含具有TCCC(SEQ ID NO:69)的序列)，来自包含本文所述的第一RNA序列、第二RNA序列和接头序列的重组RNA构建体的目的基因的表达被增强。例如，与来自包含接头的RNA构建体的目的基因的表达相比(所述接头不包含具有ACAACAATCCC(SEQ ID NO:70)的序列)，来自包含本文所述的第一RNA序列、第二RNA序列和接头序列的重组RNA构建体的目的基因的表达被增强。例如，与来自包含形成二级结构的接头的RNA构建体的目的基因的表达相比，来自包含本文所述的第一RNA序列、第二RNA序列和接头RNA序列的重组RNA构建体的目的基因的表达增强。
在一些情况下，与来自具有本文描述的另一个接头的相应重组RNA构建体的目的基因的表达相比，来自包含本文描述的接头的重组RNA构建体的目的基因的表达可以增强。例如，与来自包含本文所述的另一接头(例如，B接头、C接头、D接头或E接头)的RNA构建体的目的基因的表达相比，来自包含本文所述的第一RNA序列、第二RNA序列和A2接头RNA序列的重组RNA构建体的目的基因的表达可以增强。例如，与来自包含本文所述的另一个接头(例如，A2接头、C接头、D接头或E接头)的RNA构建体的目的基因的表达相比，来自包含本文所述的第一RNA序列、第二RNA序列和B接头RNA序列的重组RNA构建体的目的基因的表达可以增强。例如，与来自包含本文所述的另一个接头(例如，A2接头、B接头、D接头或E接头)的RNA构建体的目的基因的表达相比，来自包含本文所述的第一RNA序列、第二RNA序列和C接头RNA序列的重组RNA构建体的目的基因的表达可以增强。例如，与来自包含本文所述的另一个接头(例如，A2接头、B接头、C接头或E接头)的RNA构建体的目的基因的表达相比，来自包含本文所述的第一RNA序列、第二RNA序列和D接头RNA序列的重组RNA构建体的目的基因的表达可以增强。例如，与来自包含本文所述的另一个接头(例如，A2接头、B接头、C接头或D接头)的RNA构建体的目的基因的表达相比，来自包含本文所述的第一RNA序列、第二RNA序列和E接头RNA序列的重组RNA构建体的目的基因的表达可以增强。在一些实施方案中，A2接头可包含具有ACAACAA(SEQ ID NO：23)的序列。在一些实施方案中，B接头可包含具有ATCCCTACGTACCAACAA(SEQ ID NO:67)的序列。在一些实施方案中，C接头可包含具有ACGTACCAACAA(SEQ ID NO：68)的序列。在一些实施方案中，D接头可包含含有TCCC(SEQ IDNO：69)的序列。在一些实施方案中，E接头可包含具有ACAACAATCCC(SEQ ID NO：70)的序列。
在一些实施方案中，目的基因的表达或重组RNA构建体的切割的相对增加或增强为至少约1.3倍、约1.4倍、约1.5倍、约1.6倍、约1.7倍、约1.8倍、约1.9倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、10倍、约15倍、约17倍、约18倍、约19倍、约20倍、约21倍、约22倍或至少约25倍。在一些实施方案中，目的基因的表达或重组RNA构建体的切割的相对增加为约1.3倍至约3倍、约1.5倍至约4倍、约2倍至约5倍、约2倍至约10倍、约2倍至约15倍、约2倍至约17倍、约2倍至约18倍、约2倍至约19倍、约2倍至约20倍、约2倍至约21倍、约2倍至约22倍、约2倍至约25倍、约2倍至约30倍、约5倍至约10倍，约5倍至约15倍、约5倍至约17倍、约5倍至约18倍、约5倍至约19倍、约5倍至约20倍、约5倍至约20倍、约5倍至约21倍、约5倍至约22倍、约5倍至约25倍、约5倍至约30倍、约10倍至约15倍、约10倍至约17倍、约10倍至约18倍、约10倍至约19倍、约10倍至约20倍、约10倍至约21倍、约10倍至约22倍、约10倍至约25倍、约10倍至约30倍、约15倍至约17倍、约15倍至约18倍、约15倍至约19倍、约15倍至约20倍、约15倍至约21倍、约15倍至约22倍、约15倍至约25倍、约15倍至约30倍、约17倍至约18倍、约17倍至约19倍、约17倍至约20倍、约17倍至约21倍、约17倍至约22倍、约17倍至约25倍、约17倍至约30倍、约18倍至约19倍、约18倍至约20倍、约18倍至约21倍、约18倍至约22倍、约18倍至约25倍、约18倍至约30倍、约19倍至约20倍、约19倍至约21倍、约19倍至约22倍、约19倍至约25倍、约19倍至约30倍、约20倍约21倍、约20倍至约22倍、约20倍至约25倍、约20倍至约30倍、约21倍至约22倍、约21倍至约25倍，约21倍至约30倍、约22倍至约25倍、约22倍至约30倍、或约25倍至约30倍。在一些实施方案中，目的基因的表达或重组RNA构建体的切割的相对增加是约1.3倍、约1.4倍、约1.5倍、约1.6倍、约1.7倍、约1.8倍、约1.9倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约15倍、约17倍、约18倍、约19倍、约20倍、约21倍、约22倍、约25倍或约30倍。在一些实施方案中，目的基因的表达或重组RNA构建体的切割的相对增加至多约2倍、约3倍、约5倍、约10倍、约15倍、约17倍。约18倍、约19倍、约20倍、约21倍、约22倍、约25倍或至多约30倍。
在一些实施方案中，本文提供的重组RNA构建体可以是裸露RNA。在一些实施方案中，本文提供的重组RNA构建体可以进一步包含5'帽、Kozak序列、和/或内部核糖体进入位点(IRES)、和/或聚腺苷酸尾，特别是为了改进翻译。在一些情况下，重组RNA构建体还可包含任何技术人员已知的一个或多个促进翻译的区域。5'帽的非限制性实例可包括抗反向CAP类似物、Clean Cap、Cap 0、Cap 1、Cap 2或锁定核酸帽(LNA-cap)。在一些情况下，5'帽可包含m2 7,3'-O G(5')ppp(5')G、m7G、m7G(5')G、m7GpppG或m7GpppGm。在一些情况下，本文提供的重组RNA构建体可包含编码目的基因的RNA序列上游或5'侧的IRES。在一些情况下，本文提供的重组RNA构建体可包含紧邻编码目的基因的RNA序列上游或5'侧的IRES。在一些情况下，本文提供的重组RNA构建体可包含编码至少一种调节靶RNA表达的遗传元件的RNA序列下游或3’侧的IRES，其中编码至少一种调节靶RNA表达的遗传元件的RNA序列存在于编码目的基因的RNA序列的上游。
本文提供的重组RNA构建体还可包含聚腺苷酸尾。在一些情况下，聚腺苷酸尾包含聚腺苷酸的1至220个碱基对。例如，聚腺苷酸尾包含1、3、5、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215或220个聚腺苷酸碱基对。在一些实施方案中，聚腺苷酸尾包含1至20、1至40、1至60、1至80、1至100、1至120、1至140、1至160、1至180、1至200、1至220、20至40、20至60、20至80、20至100、20至120、20至140、20至160、20至180、20至200、20至220、40至60、40至80、40至100、40至120、40至140、40至160、40至180、40至200、40至220、60至80、60至100、60至120、60至140、60至160、60至180、60至200、60至220、80至100、80至120、80至140、80至160、80至180、80至200、80至220、100至120、100至140、100至160、100至180、100至200、100至220、120至140、120至160、120至180、120至200、120至220、140至160、140至180、140至200、140至220、160至180、160至200、160至220、180至200、180至220、或200至220个聚腺苷酸的碱基对。在一些实施方案中，聚腺苷酸尾包含1、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200或220个聚腺苷酸的碱基对。在一些实施方案中，聚腺苷酸尾包含至少1、20、40、60、80、100、120、140、160、180或至少200个聚腺苷酸碱基对。在一些实施方案中，聚腺苷酸尾包含至多20、40、60、80、100、120、140、160、180、200或至多220个聚腺苷酸碱基对。在一些实施方案中，聚腺苷酸尾包含120个聚腺苷酸碱基对。
本文提供的重组RNA构建体还可包含Kozak序列。Kozak序列可以指充当蛋白质翻译起始位点的核酸序列基序。Kozak序列在文献中详细描述，例如Kozak，M.，Gene 299(1-2)：1-34，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，本文所述的Kozak序列可包含含有GCCACC(SEQ ID NO：19)的序列。在一些实施方案中，本文提供的重组RNA构建体还可包含核定位信号(NLS)。
一方面，本文所述的重组RNA构建体可以不包含核苷酸变体。在一些情况下，本文所述的重组RNA构建体可包含一种或多种尿苷。在一些情况下，本文所述的重组RNA构建体可以不包含修饰的尿苷。在一些情况下，本文所述的重组RNA构建体可以不包含一个或多个N1-甲基假尿苷。在一些实施方案中，包含在重组RNA构建体中的99％至1％、98％至2％、97％至3％、96％至4％、95％至2％、94％至6％、93％至7％、92％至8％、91％至9％、90％至10％、97％至3％的一个或多个尿苷是未修饰的。在一些实施方案中，重组RNA构建体中包含的一个或多个尿苷的至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或至少99.9％是未修饰的。在一些实施方案中，至多1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或至少99.9％的包含在重组RNA构建体中的一个或多个尿苷被修饰。在一个实施方案中，本文所述的重组RNA构建体仅包含未修饰的核苷酸。例如，本文所述的重组RNA构建体仅包含天然核苷酸。例如，本文所述的重组RNA构建体仅包含标准核苷酸。在一个优选的实施方案中，本文所述的重组RNA构建体包含一种或多种尿苷，其中所有一种或多种尿苷都是未修饰的。
另一方面，本文所述的重组RNA构建体可包括一种或多种核苷酸变体，包括非标准核苷酸、非天然核苷酸、核苷酸类似物和/或修饰的核苷酸。修饰核苷酸的例子包括但不限于二氨基嘌呤、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基奎苷(beta-D-galactosylqueosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟嘌呤、5-甲氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基奎苷(beta-D-mannosylqueosine)、5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟基乙酸(v)、怀丁苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟基乙酸甲酯、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w、2,6-二氨基嘌呤、N1-甲基假尿苷等。在一些情况下，核苷酸可在其磷酸部分中包含修饰，包括对三磷酸部分的修饰。此类修饰的非限制性实例包括更长的磷酸链和硫醇部分的修饰。在一些实施方案中，磷酸链可包含4、5、6、7、8、9、10或更多个磷酸部分。在一些实施方案中，硫醇部分可以包括但不限于α-硫代三磷酸和β-硫代三磷酸。在一些实施方案中，本文所述的重组RNA构建体不包含5-甲基胞嘧啶和/或N6-甲基腺苷。
在一些情况下，本文所述的重组RNA构建体可以在碱基部分、糖部分或磷酸主链处进行修饰。例如，修饰可以是在通常可与互补核苷酸形成氢键的一个或多个原子处和/或在通常不能与互补核苷酸形成氢键的一个或多个原子处。在一些实施方案中，主链修饰包括但不限于硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯、氨基磷酸酯和二酰胺磷酸酯键。硫代磷酸酯键用硫原子替换磷酸主链中的非桥接氧，并延迟寡核苷酸的核酸酶降解。磷酸二酰胺键(N3'→P5')可以防止核酸酶识别和降解。在一些实施方案中，主链修饰包括在主链结构中用肽键代替磷，或包括氨基甲酸酯、酰胺以及直链和环状烃基的连接基团。例如，N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元可以通过肽核酸中的肽键连接。以下综述了具有修饰主链的寡核苷酸：Micklefield,Backbone modification ofnucleic acids:synthesis,structure and therapeutic applications,Curr.Med.Chem.,8(10):1157-79,2001and Lyer et al.,Modified oligonucleotides-synthesis,properties and applications,Curr.Opin.Mol.Ther.,1(3):344-358,1999.
本文提供的重组RNA构建体可以包含修饰的和未修饰的核苷酸的组合。在一些情况下，含有腺苷、鸟苷和胞苷的核苷酸是未修饰的或部分修饰的。在一些情况下，对于修饰的RNA构建体，1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的尿苷核苷酸可以是修饰的。在一些实施方案中，重组RNA构建体中5％至25％的尿苷核苷酸被修饰。修饰的尿苷核苷酸的非限制性实例可包括假尿苷、N1-甲基假尿苷或N1-甲基假-UTP，并且可利用本领域已知的任何修饰的尿苷核苷酸。在一些实施方案中，重组RNA构建体可以含有修饰的和未修饰的核苷酸的组合，其中1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的尿苷核苷酸可包含假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-甲基假-UTP或本领域已知的任何其他的修饰的尿苷核苷酸。在一些实施方案中，重组RNA构建体可以含有修饰的和未修饰的核苷酸的组合，其中1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，或100％的尿苷核苷酸可包含N1-甲基假尿苷。
本文提供的重组RNA构建体可以是密码子优化的。通常，密码子优化是指修饰核酸序列以在目的宿主细胞中表达的过程，其通过用在宿主细胞的基因中更频繁或最频繁使用的密码子替换天然序列的至少一个密码子(例如，多于1、2、3、4、5、10、15、20、25、50或更多个密码子)，同时保持天然氨基酸序列。密码子使用表是容易获得的，例如在“密码子使用数据库”中，并且这些表可以以多种方式进行修改。用于密码子优化特定序列以在特定宿主细胞中表达的计算机算法也是可用的，例如优选Gene(Aptagen,PA)和/>(ThermoFischer,MA)。在一些实施方案中，重组RNA构建体可以不是密码子优化的。
在一些情况下，重组RNA构建体可以包含核酸序列，该核酸序列包含选自SEQ IDNO：1-9和76-84组成的组的序列。
RNA干扰和小干扰RNA(siRNA)
RNA干扰(RNAi)或RNA沉默是RNA分子通过中和靶mRNA分子来抑制基因表达或翻译的过程。RNAi过程在Mello&Conte(2004)Nature 431,338-342,Meister&Tuschl(2004)Nature 431,343-349,Hannon&Rossi(2004)Nature 431,371-378,and Fire(2007)Angew.Chem.Int.Ed.46,6966-6984中进行了描述。简而言之，在自然过程中，反应起始于通过dsRNA特异性核酸内切酶Dicer将长双链RNA(dsRNA)裂解成小dsRNA片段或具有发夹结构的siRNA(即shRNA)。然后，这些小dsRNA片段或siRNA被整合到RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，并引导RISC到达目标mRNA序列。在干扰过程中，siRNA双链体解旋，反义链仍与RISC复合，引导RISC到达靶mRNA序列，诱导降解并随后抑制蛋白质翻译。与商业上可获得的合成siRNA不同，本发明中的siRNA可以在细胞摄取后利用细胞质中的内源Dicer和RISC途径从重组RNA构建体(例如，包含mRNA和两个或更多个siRNA的重组RNA构建体)中裂解，且遵循上文详述的自然过程，因为本发明的重组RNA构建体中的siRNA包含发夹环结构。此外，由于在通过Dicer酶切割siRNA之后剩余的重组RNA构建体(即mRNA)保持完整，所以在本发明的重组RNA构建体中实现了来自目的基因的期望的蛋白质表达。
本文提供了包含重组RNA构建体的组合物，所述重组RNA构建体包含至少一种包含能够结合靶RNA的siRNA的核酸序列。在一些情况下，靶RNA是非编码RNA。在一些情况下，靶RNA是mRNA。在一些实施方案中，siRNA能够结合5'非翻译区中的靶mRNA。在一些实施方案中，siRNA能够结合3'非翻译区中的靶mRNA。在一些实施方案中，siRNA能够结合外显子中的靶mRNA。在一些实施方案中，重组RNA构建体可以包含具有有义siRNA链的核酸序列。在一些实施方案中，重组RNA构建体可以包含具有反义siRNA链的核酸序列。在一些实施方案中，重组RNA构建体可包含具有有义siRNA链的核酸序列和包含反义siRNA链的核酸序列。Cheng,et al.(2018)J.Mater.Chem.B.,6,4638-4644描述了本发明中包含的siRNA的细节，其通过引用并入本文。
例如，在某些情况下，重组RNA构建物可包含至少1种siRNA或1拷贝的siRNA，即包含siRNA有义链的核酸序列和包含siRNA反义链的核酸序列。如本文所述，1种或1拷贝的siRNA可以指1种或1拷贝的有义链siRNA和1种或1拷贝的反义链siRNA。在一些情况下，重组RNA构建体可以包含多于1种或1拷贝的siRNA，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个种类或拷贝的包含siRNA的有义链，和siRNA的反义链的siRNA。在一些实施方案中，重组RNA构建体可以包含1至20个种类或拷贝的siRNA。在一些实施方案中，重组RNA构建体可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或至少10个种类或拷贝的siRNA。在一些实施方案中，重组RNA构建体可包含至多3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或至多20个种类或拷贝的siRNA。在一些实施方案中，重组多核酸或RNA构建体具有1至2、1至3、1至4、1至5、1至6、1至7、1至8、1至9、1至10、2至3、2至4、2至5、2至6、2至7、2至8、2至9、2至10、3至4、3至5、3至6、3至7、3至8、3至9、3至10、4至5、4至6、4至7、4至8、4至9、4至10、5至6、5至7、5至8、5至9、5至10、6至7、6至8、6至9、6至10、7至8、7至9、7至10、8至9、8至10或9至10个种类或拷贝的siRNA。在一些实施方案中，重组多核酸或RNA构建体具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个种类或拷贝的siRNA。在一些实施方案中，重组多核酸或RNA构建体具有至少1、2、3、4、5、6、7、8或9个种类或拷贝的siRNA。在一些实施方案中，重组多核酸或RNA构建体具有至多2、3、4、5、6、7、8、9或10个种类或拷贝的siRNA。在一些实施方案中，重组RNA构建体可以包含2种siRNA和10种siRNA之间、3种siRNA和10种siRNA之间、4种siRNA和10种siRNA之间、5种siRNA和10种siRNA之间、6种siRNA和10种siRNA之间、7种siRNA和10种siRNA之间、9种siRNA和10种siRNA之间，优选2种siRNA和6种siRNA之间、3种siRNA和6种siRNA之间、或4种siRNA和6种siRNA之间。
本文提供了包含1-20个或更多个siRNA种类或拷贝的重组RNA构建体的组合物，其中1-20个或更多个siRNA种类或拷贝中的每一个能够结合靶RNA。在一些实施方案中，靶RNA是mRNA或非编码RNA。在一些情况下，每种siRNA种类或拷贝结合相同的靶RNA。在一种情况下，每种siRNA种类或拷贝可以包含相同的序列并且结合至相同靶RNA的相同区域或序列。例如，重组RNA构建体可以包含1、2、3、4、5或更多个siRNA种类或拷贝，并且所述1、2、3、4、5或更多个siRNA种类或拷贝中的每一个都包含靶向靶RNA的相同区域的相同序列，即重组RNA构建体可以包含1、2、3、4、5或更多个冗余siRNA种类或拷贝。在另一种情况下，每种siRNA种类或拷贝可以包含不同的序列，并与相同靶RNA的不同区域或序列结合。例如，重组RNA构建体可以包含1、2、3、4、5或更多种siRNA种类或拷贝，并且所述1、2、3、4、5或更多种siRNA种类或拷贝中的每一种可以包含靶向相同靶RNA的不同区域的不同序列。在该实例中，1、2、3、4、5或更多siRNA种类或拷贝中的一种siRNA可以靶向外显子1，而1、2、3、4、5或更多siRNA种类或拷贝中的另一种siRNA可以靶向相同mRNA的外显子2，等等。在一些情况下，重组RNA构建体可包含1、2、3、4、5或更多个能够结合相同靶RNA的相同和不同区域的siRNA种类或拷贝。例如，重组RNA构建体可以包含1、2、3、4、5或更多个siRNA种类或拷贝，并且1、2、3、4、5或更多个siRNA种类或拷贝中的2个可以包含相同的序列并且结合至靶RNA的相同区域，并且1、2、3、4、5或更多个siRNA种类或拷贝中的3个或更多个可以包含不同的序列并结合至相同靶RNA的不同区域。在一些情况下，每种siRNA种类或拷贝结合不同的靶RNA。在一些情况下，重组RNA构建体可包含1、2、3、4、5或更多个能够结合相同和不同靶RNA的siRNA种类或拷贝。例如，重组RNA构建体可包含1、2、3、4、5或更多个siRNA种类或拷贝，并且1、2、3、4、5或更多个siRNA种类或拷贝中的2个可包含能够与相同靶RNA的相同或不同区域结合的序列，并且1、2、3、4、5或更多个siRNA种类或拷贝中的3个或更多个可以包含能够与不同靶RNA结合的序列。在一些实施方案中，靶RNA可以是mRNA和/或非编码RNA。在一些情况下，每种siRNA种类或拷贝可包含可结合不同靶RNA的相同序列。例如，每种siRNA种类或拷贝可以结合两种或多种靶RNA共享或共有的序列。例子包括但不限于可结合蛋白激酶B-1(Akt1)、Akt2和Akt3(pan-Akt3)所共有或共享的序列的siRNA序列。
本文提供了包含1-20个或更多个siRNA种类的重组RNA构建体的组合物，其中1-20个或更多个siRNA种类中的每一个通过本文描述的接头连接。在一些情况下，接头可以是不可切割的接头。在一些情况下，接头可以是可切割的接头，例如可自切割的接头。在一些情况下，接头可以被蛋白质例如细胞内或内源蛋白质切割。在一些情况下，接头具有选以下自组成的组的结构：式(I):XmCAACAAXn，其中X是任何核苷酸，m是1至12的整数，并且n是0至4的整数；和式(II)：Xp CCCXr，其中X是任何核苷酸，p是0至17的整数，并且r是0至13的整数。在一些情况下，接头可以包含具有ACAACAA(SEQ ID NO:23)、ATCCCTACGTACCAACAA(SEQ IDNO:67)、ACGTACCAAC AA(SEQ ID NO:68)、TCCC(SEQ ID NO:69)或ACAACAATCCC(SEQ ID NO:70)的序列。在一些实施方案中，接头可包含具有ACAACAA(SEQ ID NO:23)、ATAGTGAGTCGTATTATCCC(SEQ ID NO:72)、ATAGTGAGTCGTATTAACAACAATCCC(SEQ ID NO:73)、ATAGT GAGTCGTATTAACAACAA(SEQ ID NO:74)、ATAGTGAGTCGT ATTAATCCCTACGTACCAACAA(SEQ ID NO:75)或ATAGTGA GTCGTATTAACGTACCAACAA(SEQ ID NO：21)的序列。在一些实施方案中，接头包含具有ACAACAA(SEQ ID NO：23)的序列。在一些实施方案中，接头不包含具有TTTATCTTAGAGGCATAT CCCTACGTACCAACAA(SEQ ID NO:22)或ATAGTGAGTCGTATTAACGTACCAACAA(SEQ ID NO:21)的序列。
在一些情况下，接头的长度为约4至约50、约4至约45、或约4至约40、约4至约35、或约4至约30个核苷酸。在一些实施方案中，接头的长度为约4至约27个核苷酸。在一些实施方案中，接头的长度为约4至约18个核苷酸。例如，接头的长度为约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49或约50个核苷酸。在一些实施方案中，接头的长度可以是至多约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49或至多约50个核苷酸。在一些实施方案中，接头的长度是4个核苷酸。在一些实施方案中，接头的长度是7个核苷酸。在一些实施方案中，接头的长度是11个核苷酸。在一些实施方案中，接头的长度是12个核苷酸。在一些实施方案中，接头的长度是18个核苷酸。
在一些情况下，接头可以具有式(I)XmCAACAXn的结构，其中X是任何核苷酸；m是1-12的整数，n是0-4的整数；并且m是1且n是0。在一些情况下，接头可以包含具有CAACAA(SEQID NO:71)、TCCC(SEQ ID NO:69)或ACAACAA(SEQ ID NO:23)的序列。在一些实施方案中，接头可包含选自以下组成的组的序列：ATCCCTACGTACCAACAA(SEQ ID NO:67)、ACGTACCAACAA(SEQ ID NO:68)、TCCC(SEQ ID NO:69)、ACAACAATCCC(SEQ ID NO:70)和ACAACAA(SEQ IDNO：23)。在一些实施方案中，接头可包含具有ACAACAA(SEQ ID NO：23)的序列。在一些实施方案中，接头可包含具有ACAACAA(SEQ ID NO:23)、ATAGTGAGTCGTATTATCCC(SEQ ID NO:72)、ATAGTGAGTCGTATTAACAACAATCCC(SEQ ID NO:73)、ATAGTGAGTCGTATTAACAACAA(SEQ IDNO:74) 、ATAGTGAGTCGTATTAATCCCTACGTACCAACAA(SEQ ID NO:75)或ATAGTGAGTCGTATTAACGTACCAACAA(SEQ ID NO：21)的序列。在一些实施方案中，接头可包含选自SEQ ID NOs：23、67-75组成的组的序列。
在一些情况下，接头可以是tRNA接头。tRNA系统在生物体中是进化保守的，并利用内源性RNase P和Z来处理多顺反子构建体(Dong et al.,2016)。在一些实施方案中，tRNA接头可包含具有AACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCA CGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCA(SEQ ID NO:39)的核酸序列。在一些实施方案中，包含具有TTTATCTTAGAGGCATATCCCTACGTACCAACAA(SEQ ID NO：22)的核酸序列的接头可用于连接1-20种或更多种siRNA种类中的每一种。
在一些情况下，siRNA与其靶mRNA的特异性结合导致对靶mRNA的正常功能的干扰，从而导致由靶mRNA编码的蛋白质的表达水平、功能和/或活性的调节，例如下调。并且存在足够程度的互补性以避免在需要特异性结合的条件下siRNA与非靶核酸序列的非特异性结合，即在体内测定或治疗性处理的生理条件下，以及在体外试验的情况下进行测定的条件下。
在一些情况下，与不包含本文所述接头的相应重组RNA构建体的siRNA对靶mRNA编码的蛋白质的表达水平、功能和/或活性的下调相比，本文提供的重组RNA构建体的siRNA对靶mRNA编码的蛋白质的表达水平、功能和/或活性的下调可以得到增强。例如，与通过不包含本文所述接头的RNA构建体的siRNA下调靶mRNA编码的蛋白质的表达水平、功能和/或活性相比，来自重组RNA构建体的siRNA对由靶mRNA编码的蛋白质的表达水平、功能和/或活性的下调(所述重组RNA构建体包含本文所述的第一RNA序列、第二RNA序列和接头RNA序列)可以得到增强。例如，与来自RNA构建体的siRNA对靶mRNA编码的蛋白质的表达水平、功能和/或活性的下调相比(所述RNA构建体包含不具有选自式(I)：XmCAACAAXn(其中X是任意核苷酸，m是1至12的整数，n是0至4的整数)和式(II)：XpTCCCXr(其中X是任何核苷酸，p是0至17的整数，并且r是0至13的整数)的结构的接头)，来自重组RNA构建体的siRNA对由靶mRNA编码的蛋白质的表达水平、功能和/或活性的下调(所述重组RNA构建体包含本文所述的第一RNA序列、第二RNA序列和接头RNA序列)可以增强。例如，与包含接头的RNA构建体的siRNA对靶mRNA编码的蛋白质的表达水平、功能和/或活性的下调相比(所述接头不含包含ACAACAA(SEQ ID NO：23)的序列)，本文所述的包含第一RNA序列、第二RNA序列和接头RNA序列的重组RNA构建体的siRNA对靶mRNA编码的蛋白质的表达水平、功能和/或活性的下调可以得到增强。例如，与包含接头的RNA构建体的siRNA对靶mRNA编码的蛋白质的表达水平、功能和/或活性的下调相比(所述接头不含包含ATCCCTACGTACCAACAA(SEQ ID NO：67)的序列)，本文所述的包含第一RNA序列、第二RNA序列和接头RNA序列的重组RNA构建体的siRNA对靶mRNA编码的蛋白质的表达水平、功能和/或活性的下调可得到增强。例如，与包含接头的RNA构建体的siRNA对靶mRNA编码的蛋白质的表达水平、功能和/或活性的下调相比(所述接头不含包含ACGTACCAACAA(SEQ ID NO：68)的序列)，本文所述的包含第一RNA序列、第二RNA序列和接头RNA序列的重组RNA构建体的siRNA对靶mRNA编码的蛋白质的表达水平、功能和/或活性的下调可得到增强。例如，与包含接头的RNA构建体的siRNA对靶mRNA编码的蛋白质的表达水平、功能和/或活性的下调相比(所述接头不含包含TCCC(SEQ ID NO：69)序列)，包含第一RNA序列、第二RNA序列和接头RNA序列的重组RNA构建体的siRNA对靶mRNA编码的蛋白质的表达水平、功能和/或活性的下调可以得到增强。例如，与包含接头的RNA构建体的siRNA对靶mRNA编码的蛋白质的表达水平、功能和/或活性的下调相比(所述接头不含包含ACAACAATCCC(SEQ ID NO：70)的序列)，本文所述的包含第一RNA序列、第二RNA序列和接头RNA序列的重组RNA构建体的siRNA对靶mRNA编码的蛋白质的表达水平、功能和/或活性的下调可增强。
在一些情况下，与来自具有本文所述另一种接头的相应重组RNA构建体的siRNA对靶mRNA编码的蛋白质的表达水平、功能和/或活性的下调相比，包含本文所述接头的重组RNA构建体的siRNA对靶mRNA编码的蛋白质的表达水平、功能和/或活性的下调可以得到增强。例如，与包含本文所述另一种接头(例如B接头、C接头、D接头或E接头)的RNA构建体的siRNA对靶mRNA编码的蛋白质的表达水平、功能和/或活性的下调相比，包含本文所述第一RNA序列、第二RNA序列和A2接头RNA序列的重组RNA构建体的siRNA对靶mRNA编码的蛋白质的表达水平、功能和/或活性的下调可以得到增强。例如，与包含本文所述另一种接头(例如A2接头、C接头、D接头或E接头)的RNA构建体的siRNA对靶mRNA编码的蛋白质的表达水平、功能和/或活性的下调相比，包含本文所述第一RNA序列、第二RNA序列和B-接头RNA序列的重组RNA构建体的siRNA对靶mRNA编码的蛋白质的表达水平、功能和/或活性的下调可以得到增强。例如，与包含本文所述另一种接头(例如A2接头、B接头、D接头或E接头)的RNA构建体的siRNA对靶mRNA编码的蛋白质的表达水平、功能和/或活性的下调相比，包含本文所述第一RNA序列、第二RNA序列和C接头RNA序列的重组RNA构建体的siRNA对靶mRNA编码的蛋白质的表达水平、功能和/或活性的下调可以得到增强。例如，与包含本文所述另一种接头(例如A2接头、B接头、C接头或E接头)的RNA构建体的siRNA对靶mRNA编码的蛋白质的表达水平、功能和/或活性的下调相比，包含本文所述第一RNA序列、第二RNA序列和D接头RNA序列的重组RNA构建体的siRNA对靶mRNA编码的蛋白质的表达水平、功能和/或活性的下调可以增强。例如，与包含本文所述另一种接头(例如A2接头、B接头、C接头或D接头)的RNA构建体的siRNA对靶mRNA编码的蛋白质的表达水平、功能和/或活性的下调相比，包含本文所述第一RNA序列、第二RNA序列和E接头RNA序列的重组RNA构建体的siRNA对靶mRNA编码的蛋白质的表达水平、功能和/或活性的下调可以得到增强。在一些实施方案中，A2接头可包含具有ACAACAA(SEQ ID NO：23)的序列。在一些实施方案中，B接头可包含具有ATCCCTACGTACCAACAA(SEQID NO:67)的序列。在一些实施方案中，C接头可包含具有ACGTACCAACAA(SEQ ID NO：68)的序列。在一些实施方案中，D接头可包含具有TCCC(SEQ ID NO：69)的序列。在一些实施方案中，E接头可包含具有ACAACAATCCC(SEQ ID NO：70)的序列。
本文所用的蛋白质可以指通常包含一种或多种肽或多肽的分子。肽或多肽通常是通过肽键连接的氨基酸残基链。肽通常包含2至50个氨基酸残基。多肽通常包含超过50个氨基酸残基。蛋白质通常折叠成三维形式，这可能是蛋白质发挥其生物学功能所必需的。本文所用的蛋白质可包括蛋白质片段、蛋白质变体和融合蛋白。本文所用的功能变体可以指全长分子、其片段或其变体。例如，变体分子可包含通过插入、缺失和/或替换一个或多个氨基酸(在蛋白质序列的情况下)或一个或多个核苷酸(在核酸序列的情况下)修饰的序列。例如，变体分子可以包含或编码突变蛋白，包括但不限于功能获得或功能丧失突变体。片段可以是核酸分子如DNA或RNA或蛋白质的全长序列的较短部分。因此，片段通常包含与全长序列内的相应片段相同的序列。在一些实施方案中，序列的片段可以包含该片段所源自的全长核苷酸或氨基酸序列的至少5％至至少80％。在一些实施方案中，蛋白质可以是哺乳动物蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质可以是人蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质可以是从细胞分泌的蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质可以是细胞膜上的蛋白质。在一些实施方案中，本文提及的蛋白可以是分泌的蛋白质，并且通过细胞表面上的受体局部或全身地充当靶细胞信号转导的调节剂，通常参与免疫反应或涉及病毒感染的其他宿主蛋白质。可用于本发明的上下文中的蛋白质(包括由目的基因编码的蛋白质)的核苷酸和氨基酸序列是本领域已知的并且可在文献中获得。例如，可用于本发明的蛋白质的核苷酸和氨基酸序列，包括由目的基因编码的蛋白质，可在UniProt数据库中获得。
本文提供了包含能够结合靶mRNA以调节靶mRNA表达的siRNA的重组RNA构建体的组合物。在一些情况下，能够结合靶mRNA的siRNA下调靶mRNA的表达(例如，靶mRNA编码的蛋白质的水平)。在一些实施方案中，靶mRNA的表达被能够结合靶mRNA的siRNA抑制。如本文所述，抑制或下调靶mRNA的表达可以指但不限于干扰靶mRNA以干扰来自靶mRNA的蛋白质的翻译；因此，靶mRNA表达的抑制或下调可以指但不限于，与不存在包含能够结合靶mRNA的siRNA的重组RNA构建体时从靶mRNA表达的蛋白质水平相比，从靶mRNA表达的蛋白质水平降低。蛋白质表达水平可以通过使用本领域熟知的任何方法来测量，这些方法包括但不限于蛋白质免疫印迹、流式细胞术、ELISA、放射免疫测定(RIA)和各种蛋白质组学技术。测量或检测多肽的示例性方法是免疫测定，例如ELISA。这种类型的蛋白质定量可以基于能够捕获特定抗原的抗体和能够检测捕获的抗原的第二抗体。用于检测和/或测量多肽的示例性测定法描述于Harlow,E.and Lane,D.Antibodies:A Laboratory Manual,(1988),ColdSpring Harbor Laboratory Press。
本文提供了包含重组RNA构建体的组合物，所述重组RNA构建体包含至少一种包含能够结合靶mRNA的siRNA的核酸序列和至少一种编码目的基因的核酸序列，其中所述靶mRNA不同于由目的基因编码的mRNA。本文提供了包含重组RNA构建体的组合物，所述重组RNA构建体包含至少一种包含能够结合靶mRNA的siRNA的核酸序列和至少一种编码目的基因的核酸序列，其中所述siRNA不影响目的基因的表达。在一些情况下，siRNA不能结合目的基因编码的mRNA。在一些情况下，siRNA不抑制目的基因的表达。在某些情况下，siRNA不会下调目的基因的表达。如本文所述，抑制或下调目的基因的表达可以指但不限于干扰来自重组RNA构建体的蛋白质的翻译；因此，抑制或下调目的基因的表达可以指但不限于，与在不存在包含能够结合靶mRNA的siRNA的重组RNA构建体的情况下表达的蛋白质水平相比，蛋白质水平降低。蛋白质表达水平可以通过使用本领域熟知的任何方法来测量，这些方法包括但不限于蛋白质免疫印迹、流式细胞术、ELISA、RIA和各种蛋白质组学技术。测量或检测多肽的示例性方法是免疫测定，例如ELISA。这种类型的蛋白质定量可以基于能够捕获特定抗原的抗体和能够检测捕获的抗原的第二抗体。用于检测和/或测量多肽的示例性测定法描述于Harlow,E.and Lane,D.Antibodies:A Laboratory Manual,(1988),Cold SpringHarbor Laboratory Press。
本文提供了包含重组RNA构建体的组合物，所述重组RNA构建体包含至少一种核酸序列，所述核酸序列包含能够结合靶mRNA的siRNA。siRNA能够结合的靶mRNA的非限制性实例的列表包括基因的mRNA，所述基因包括肿瘤坏死因子α(TNF-alpha或TNF-α)、激活蛋白受体样激酶2(ALK2)、Turbo绿色荧光蛋白(Turbo GFP)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、细胞性骨髓细胞瘤病(c-Myc)、Kirsten大鼠肉瘤(KRAS)、蛋白激酶B-1(Akt1)、蛋白激酶B-2(Akt2)、蛋白激酶B-3(Akt3)或其功能变体。在一些实施方案中，Turbo GFP序列可源自海洋桡足类Pontellina plumate。本文所用的功能变体可以指全长分子、其片段或其变体。例如，变体分子可包含通过插入、缺失和/或替换一个或多个氨基酸(在蛋白质序列的情况下)或一个或多个核苷酸(在核酸序列的情况下)修饰的序列。
在一些实施方案中，本文所述的重组RNA构建体可以编码或包含一种或多种siRNA，其中所述一种或多种siRNA中的每一种能够结合不同的mRNA。例如，重组RNA构建体可以编码或包含至少3个siRNA，其中3个siRNA中的每一个能够结合不同的mRNA。在一些实施方案中，重组RNA构建体可以编码或包含至少3种siRNA，其中所述至少3种siRNA之一结合c-Myc，所述至少3种siRNA之一结合KRAS并且所述至少3种siRNA之一结合Akt1、Akt2和/或Akt3。在一些实施方案中，重组RNA构建体可以编码或包含至少3种siRNA，其中所述至少3种siRNA之一结合c-Myc，所述至少3种siRNA之一结合KRAS并且所述至少3种siRNA之一结合pan-Akt(Akt1、Akt2和Akt3)。
在一些实施方案中，TNF-α包含SEQ ID NO:32中列出的序列。在一些实施方案中，ALK2包含SEQ ID NO:33中列出的序列。在一些实施方案中，Turbo GFP包含SEQ ID NO:34中列出的序列。在一些实施方案中，VEGFA包含SEQ ID NO:115中列出的序列。在一些实施方案中，c-Myc包含SEQ ID NO:122中列出的序列。在一些实施方案中，KRAS包含SEQ ID NO:123中列出的序列。在一些实施方案中，Aktl包含SEQ ID NO:124中列出的序列。在一些实施方案中，Akt2包含SEQ ID NO:125中列出的序列。在一些实施方案中，Akt3包含SEQ ID NO:126中列出的序列。
在一些方面，siRNA包含由选自SEQ ID NO：50-57和127-132的序列编码的有义链。在一些方面，siRNA包含由选自SEQ ID NO：58-65和133-138的序列编码的反义链。在一些方面，siRNA包含由选自SEQ ID NO:50-57和127-132的序列编码的有义链，以及由选自SEQ IDNO:58-65和133-138的序列编码的相应反义链。
目的基因
本文提供了包含编码目的基因的核酸序列的一个或多个拷贝的重组RNA构建体。例如，重组RNA构建体可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个编码目的基因的核酸序列的拷贝。在一些情况下，编码目的基因的核酸序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个拷贝中的每一个均编码相同的目的基因。在一些情况下，重组RNA构建体可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个编码细胞因子的核酸序列的拷贝。
本文还提供了包含编码目的基因的核酸序列的两个或更多个拷贝的重组RNA构建体，其中两个或更多个核酸序列中的每一个可以编码不同的目的基因。在一些情况下，编码不同目的基因的两个或更多个核酸序列中的每一个可包含编码分泌蛋白的核酸序列。在一些情况下，编码不同目的基因的两个或更多个核酸序列中的每一个可包含编码细胞因子例如白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素2(IL-2)或白细胞介素12(IL-12)的核酸序列。在一些实施方案中，编码不同目的基因的两个或更多个核酸序列中的每一个可以编码不同的分泌蛋白。在一些情况下，编码不同目的基因的两种或更多种核酸中的每一种可包含编码胰岛素样生长因子1(IGF-1)的核酸序列。本文进一步提供了包含本文所述接头的重组RNA构建体。在一些实施方案中，接头可以连接编码目的基因的两个或更多个核酸序列中的每一个。在一些情况下，接头可以是不可切割的接头。在一些情况下，接头可以是可切割的接头。在一些情况下，接头可以是自剪切接头。在一些情况下，接头可以被蛋白质切割，例如细胞内蛋白质或内源蛋白质。在一些情况下，接头选自以下组成的组：式(I)：XmCAACAAXn，其中X是任何核苷酸，m是1至12的整数，并且n是0至4的整数；式(II)：XpTCCCXr，其中X是任何核苷酸，p是0至17的整数，并且r是0至13的整数。在一些情况下，接头包含具有ACAACAA(SEQ ID NO：23)的序列。在一些实施方案中，接头选自SEQ ID NO：23、67-75组成的组。
接头的其他实例包括但不限于柔性接头、2A肽接头(或2A自切割肽)例如T2A、P2A、E2A或F2A以及tRNA接头等。tRNA系统在生物体中进化上是保守的，并利用内源性RNase P和Z来处理多顺反子构建体(Dong et al.,2016)。在一些实施方案中，tRNA接头可包含具有AACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCA CGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCA(SEQ ID NO:39)的核酸序列。
本文提供了重组RNA构建体，其包含编码目的基因的RNA，用于调节目的基因的表达。例如，可以调节由目的基因的mRNA编码的蛋白质的表达。例如，通过在重组RNA构建体中表达由目的基因的mRNA编码的蛋白质来上调目的基因的表达。例如，通过增加重组RNA构建体中目的基因的mRNA编码的蛋白质水平来上调目的基因的表达。蛋白质表达水平可以通过使用本领域熟知的任何方法来测量，这些方法包括但不限于蛋白质免疫印迹、流式细胞术、ELISA、RIA和各种蛋白质组学技术。测量或检测多肽的示例性方法是免疫测定，例如ELISA。这种类型的蛋白质定量可以基于能够捕获特定抗原的抗体和能够检测捕获的抗原的第二抗体。用于检测和/或测量多肽的示例性测定法描述于Harlow,E.and Lane,D.Antibodies:A Laboratory Manual,(1988),Cold Spring Harbor Laboratory Press。
本文提供了包含编码目的基因的RNA的重组RNA构建体，其中目的基因编码目的蛋白质。在一些情况下，目的蛋白质是治疗性蛋白质。在一些情况下，目的蛋白质是人类来源的，即，是人类蛋白质。在一些情况下，目的基因编码分泌蛋白质。在一些实施方案中，目的基因编码胰岛素样生长因子1(IGF-1)。在一些实施方案中，目的蛋白质是IGF-1。在一些情况下，目的基因编码细胞因子。在一些实施方案中，细胞因子包括白细胞介素。在一些实施方案中，目的蛋白质是白细胞介素4(IL-4)或其功能变体。在一些实施方案中，目的蛋白质是白细胞介素2(IL-2)或其功能变体。在一些实施方案中，目的蛋白质是白细胞介素12(IL-12)或其功能变体。
在一些情况下，包含编码目的基因的核酸序列的重组RNA构建体可以包含编码人胰岛素样生长因子1(IGF-1)的核酸序列。在一些情况下，本文所用的IGF-1可以指人IGF-1的天然序列(Uniprot数据库：P05019和Genbank数据库中：NM_001111285.3)、片段或其功能变体。在一个实施方案中，重组RNA构建体可以是包含编码IGF-1的核酸序列的裸RNA。在该实施方案中，重组RNA构建体可以包含编码成熟人IGF-1的核酸序列。编码人IGF-1的天然DNA序列可以是密码子优化的。人IGF-1的天然序列包含具有21个氨基酸(核苷酸1-63)的信号肽、具有27个氨基酸(核苷酸64-144)的前肽、具有70个氨基酸(核苷酸145-354)的成熟人IGF-1，和具有77个氨基酸(核苷酸355-585)的E-肽。在一些实施方案中，重组RNA构建体可以包含编码IGF-1前肽(也称为前结构域)的核酸序列、编码IGF-1成熟蛋白或IGF-1的E-肽(也称为E-结构域)(即具有羧基末端延伸的IGF-1)的核酸序列。在一些实施方案中，重组RNA构建体不包含编码IGF-1的E-肽的核酸序列。在一些实施方案中，重组RNA构建体可以包含编码IGF-1前肽的核酸序列、编码IGF-1成熟蛋白质的核酸序列和编码脑源性神经营养因子(BDNF)的信号肽的核酸序列。在一些实施方案中，IGF-1是人IGF-1。
在一些实施方案中，重组RNA构建体可以包含编码具有27个氨基酸的IGF-1(优选人IGF-1)的前肽的核酸序列，和编码具有70个氨基酸的成熟IGF-1(优选成熟人IGF-1)的核酸序列，并且优选地不包含编码IGF-1的E-肽的核苷酸序列，并且优选地不包含编码人IGF-1的E-肽的核酸序列。在一些实施方案中，重组RNA构建体可以包含编码具有27个氨基酸的IGF-1(优选人IGF-1)的前肽的核酸序列，编码具有70个氨基酸的成熟IGF-1(优选成熟人IGF-1)的核酸序列，和编码脑源性神经营养因子(BDNF)的信号肽的核酸序列。在一些实施方案中，重组RNA构建体不包含编码IGF-1的E-肽的核酸序列，更优选地不包含编码人IGF-1的E-肽的核酸序列。
在一些实施方案中，本文提供的重组RNA构建体可包含编码具有27个氨基酸的人IGF-1前肽的核酸序列和编码具有70个氨基酸的成熟人IGF-1的核酸序列，并且优选不包含编码人IGF-1的E-肽的核酸序列，其中编码具有27个氨基酸的人IGF-1前肽的核酸序列，编码具有70个氨基酸氨基酸的成熟人IGF-1的核酸序列，和编码E-肽的核酸序列在Uniprot数据库中被称为UniProtKB-P05019。在一些实施方案中，本文所述的IGF-1可具有包含SEQ IDNO:29或SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
在一些情况下，本文提供的重组RNA构建体可包含编码IGF-1的mRNA。在一些实施方案中，编码IGF-1的mRNA可以指包含编码具有27个氨基酸的人IGF-1前肽的核苷酸序列和/或编码具有70个氨基酸的成熟人IGF-1的核苷酸序列的mRNA。编码人IGF-1前肽的核苷酸序列和编码成熟人IGF-1的核苷酸序列可以是密码子优化的。在一些情况下，本文提供的重组RNA构建体可包含1个拷贝的IGF-1mRNA。在一些情况下，本文提供的重组RNA构建体可包含2个或更多个拷贝的IGF-1mRNA。
在一些情况下，本文所用的白细胞介素4(IL-4)或IL-4可以指人IL-4的天然序列(Uniprot数据库：P05112并且在Genbank数据库中：NM_000589.4)、片段或其功能变体。编码人IL-4的天然DNA序列可以是密码子优化的。人IL-4的天然序列包含具有24个氨基酸(核苷酸1-72)的信号肽和具有153个氨基酸(核苷酸73-459)的成熟人IL-4。在一些实施方案中，信号肽是未修饰的IL-4信号肽。在一些实施方案中，信号肽是通过插入、缺失和/或替换至少一个氨基酸修饰的IL-4信号肽。在一些实施方案中，本文使用的白细胞介素4(IL-4)或IL-4可以指成熟的人IL-4。在一些实施方案中，成熟蛋白质可以指在表达和分泌该蛋白质的细胞中的内质网中合成并通过高尔基体分泌的蛋白质。在一些实施方案中，成熟的IL-4可以指在表达和分泌IL-4的细胞中的内质网中合成并通过高尔基体分泌的IL-4蛋白。在一些实施方案中，成熟人IL-4可以指在表达和分泌人IL-4的人细胞中的内质网中合成并通过高尔基体分泌的IL-4蛋白，并且通常包含由SEQ ID NO:26所示核苷酸编码的氨基酸。在一些实施方案中，本文所述的IL-4可具有包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
编码IL-4的mRNA可以指包含编码人IL-4(具有153个氨基酸)前肽的核苷酸序列或编码成熟人IL-4(具有129个氨基酸)的核苷酸序列的mRNA。编码人IL-4前肽的核苷酸序列和编码成熟人IL-4的核苷酸序列可以是密码子优化的。在一些情况下，本文提供的重组RNA构建体可包含1个拷贝的IL-4mRNA。在一些情况下，本文提供的重组RNA构建体可包含2个或更多个拷贝的IL-4mRNA。
在一些情况下，本文使用的白细胞介素2(IL-2)或IL-2可以指人IL-2的天然序列(Uniprot数据库：P60568或Q0GK43以及在Genbank数据库中：NM_000586.3)、片段或其功能变体。编码人IL-2的天然DNA序列可以是密码子优化的。人IL-2的天然序列可以由具有20个氨基酸(核苷酸1-60)的信号肽和具有133个氨基酸(核苷酸61-459)的成熟人IL-2组成。在一些实施方案中，信号肽是未修饰的IL-2信号肽。在一些实施方案中，信号肽是通过插入、缺失和/或替换至少一个氨基酸而修饰的IL-2信号肽。在一些实施方案中，IL-2的信号肽可包含含有SEQ ID NO:112的序列。在一些实施方案中，本文所用的白细胞介素2(IL-2)或IL-2可指成熟人IL-2。在一些实施方案中，成熟蛋白质可以指在表达和分泌该蛋白质的细胞中的内质网中合成并通过高尔基体分泌的蛋白质。在一些实施方案中，成熟的IL-2可以指在表达和分泌IL-2的细胞中的内质网中合成并通过高尔基体分泌的IL-2蛋白。在一些实施方案中，成熟人IL-2可以指在表达和分泌人IL-2的人细胞中的内质网中合成并通过高尔基体分泌的IL-2蛋白，并且通常含有由如SEQ ID NO:111所示的核苷酸编码的氨基酸。在一些实施方案中，本文所述的IL-2片段可以是至少部分有功能的，即，与野生型或全长IL-2相比，可以以相似或更低的水平发挥IL-2活性。在一些实施方案中，本文所述的IL-2片段可以是完全有功能的，即，与野生型或全长IL-2相比，可以以相同水平发挥IL-2活性。在一些实施方案中，IL-2变体、IL-2突变蛋白或IL-2突变体可包含通过插入、缺失和/或替换至少一个氨基酸而修饰的IL-2氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-2变体、IL-2突变蛋白或IL-2突变体可以是至少部分有功能的，即，与野生型IL-2相比可以以相似或更低的水平发挥IL-2活性。在一些实施方案中，IL-2变体、IL-2突变蛋白或IL-2突变体可以是完全有功能的，即，可以以与野生型IL-2相比相同的水平发挥IL-2活性。在一些实施方案中，IL-2变体、IL-2突变蛋白或IL-2突变体与野生型IL-2相比可以表现出更高水平的IL-2活性。在一些实施方案中，本文所述的IL-2可具有包含SEQ ID NO:109或110的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-2可包含IL-2片段、IL-2变体、IL-2突变蛋白，或IL-2突变体。
编码IL-2的mRNA可以指包含编码人IL-2(具有153个氨基酸)前肽的核苷酸序列的mRNA，或编码成熟人IL-2(具有133个氨基酸)的核苷酸序列的mRNA。编码人IL-2前肽的核苷酸序列和编码成熟人IL-2的核苷酸序列可以是密码子优化的。在一些情况下，本文提供的重组RNA构建体可包含1个拷贝的IL-2mRNA。在一些情况下，本文提供的重组RNA构建体可包含2个或更多个拷贝的IL-2mRNA。
在一些情况下，本文使用的白细胞介素12(IL-12)或IL-12可以指人IL-12α的天然序列(Uniprot数据库：P29459并且在Genbank数据库中：NM_000882.3)、人IL-12β的天然序列(Uniprot数据库：P29460和Genbank数据库中：NM_002187.2)、其片段或其功能变体。编码人IL-12的天然DNA序列可以是密码子优化的。人IL-12α的天然序列可以由具有22个氨基酸的信号肽和具有197个氨基酸的成熟人IL-12组成，如SEQ ID NO:116中所示。在一些实施方案中，信号肽是未修饰的IL-12α信号肽。在一些实施方案中，信号肽是通过插入、缺失和/或替换至少一个氨基酸而修饰的IL-12α信号肽。人IL-12β的天然序列可以由具有22个氨基酸的信号肽和具有306个氨基酸的成熟人IL-12组成，如SEQ ID NO:119中所示。在一些实施方案中，信号肽是未修饰的IL-12β信号肽。在一些实施方案中，信号肽是通过插入、缺失和/或替换至少一个氨基酸而修饰的IL-12β信号肽。
在一些实施方案中，本文使用的白介素12(IL-12)或IL-12可以指成熟的人IL-12α。在一些实施方案中，本文使用的白介素12(IL-12)或IL-12可以指成熟的人IL-12β。在一些实施方案中，成熟蛋白质可以指在表达和分泌该蛋白质的细胞中的内质网中合成并通过高尔基体分泌的蛋白质。在一些实施方案中，成熟的IL-12可以指在表达和分泌IL-12的细胞中的内质网中合成并经由高尔基体分泌的IL-12α蛋白。在一些实施方案中，成熟的IL-12可以指在表达和分泌IL-12的细胞中的内质网中合成并经由高尔基体分泌的IL-12β蛋白。在一些实施方案中，成熟人IL-12可以指在表达和分泌人IL-12的人细胞中的内质网中合成并通过高尔基体分泌的IL-12α蛋白，并且通常含有由SEQ ID NO:118所示核苷酸编码的氨基酸。在一些实施方案中，成熟人IL-12可以指在表达和分泌人IL-12的人细胞中的内质网中合成并通过高尔基体分泌的IL-12β蛋白通常含有SEQ ID NO：121所示的核苷酸编码的氨基酸。
在一些实施方案中，IL-12α可包含IL-12α片段、IL-12α变体、IL-12α突变蛋白或IL-12α突变体。在一些实施方案中，本文所述的IL-12α片段可以是至少部分有功能的，即，与野生型或全长IL-12α相比，可以以相似或更低的水平发挥IL-12α活性。在一些实施方案中，本文所述的IL-12α片段可以是完全有功能的，即，与野生型或全长IL-12α相比可以以相同水平发挥IL-12α活性。在一些实施方案中，IL-12α变体、IL-12α突变蛋白或IL-12α突变体可包含通过插入、缺失和/或替换至少一个氨基酸而修饰的IL-12α氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-12α变异体、IL-12α突变体或IL-12α突变体可以是至少部分具有功能的，即，与野生型IL-12α相比，可以以相似或更低的水平发挥IL-12α活性。在一些实施方案中，IL-12α变体、IL-12α突变蛋白或IL-12α突变体可以是完全有功能的，即，与野生型IL-12α相比，可以以相同水平发挥IL-12α活性。在一些实施方案中，IL-12α变体、IL-12α突变蛋白或IL-12α突变体与野生型IL-12α相比可以表现出更高水平的IL-12α活性。
在一些实施方案中，IL-12β可包含IL-12β片段、IL-12β变体、IL-12β突变蛋白或IL-12β突变体。在一些实施方案中，本文所述的IL-12β片段可以是至少部分有功能的，即，与野生型或全长IL-12β相比，可以以相似或更低的水平发挥IL-12β活性。在一些实施方案中，本文所述的IL-12β片段可以是完全有功能的，即，与野生型或全长IL-12β相比可以以相同水平发挥IL-12β活性。在一些实施方案中，IL-12β变体、IL-12β突变蛋白或IL-12β突变体可包含通过插入、缺失和/或替换至少一个氨基酸而修饰的IL-12β氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-12β变体、IL-12β突变蛋白或IL-12β突变体可以是至少部分有功能的，即，与野生型IL-12β相比，可以以相似或更低的水平发挥IL-12β活性。在一些实施方案中，IL-12β变体、IL-12β突变蛋白或IL-12β突变体可以是完全有功能的，即，与野生型IL-12β变体相比，可以以相同水平发挥IL-12β活性。在一些实施方案中，IL-12β变体、IL-12β突变蛋白或IL-12β突变体与野生型IL-12β相比可以表现出更高水平的IL-12β活性。
编码IL-12的mRNA可以指包含编码人IL-12α(具有219个氨基酸)前肽的的核苷酸序列或编码成熟人IL-12α(具有197个氨基酸)的核苷酸序列的mRNA。编码人IL-12α前肽的核苷酸序列和编码成熟人IL-12的核苷酸序列可以是密码子优化的。编码IL-12的mRNA可以指包含编码的人IL-12β(具有328个氨基酸)前肽的核苷酸序列或编码成熟人IL-12β(具有306个氨基酸)的核苷酸序列的mRNA。编码人IL-12β前肽的核苷酸序列和编码成熟人IL-12的核苷酸序列可以是密码子优化的。在一些情况下，本文提供的重组RNA构建体可包含1个拷贝的IL-12mRNA。在一些情况下，本文提供的重组RNA构建体可包含2个或更多个拷贝的IL-12mRNA。
靶基序
本文提供了包含重组RNA构建体的组合物，所述重组RNA构建体包含靶基序。本文所用的靶基序或靶向基序可以指新合成的多肽或蛋白质中存在的任何短肽，其目的地为除了细胞质或胞质溶胶的细胞膜、细胞外区室或细胞内区室的任何部分。在一些实施方案中，肽可以指一系列彼此连接的氨基酸残基，通常通过相邻氨基酸残基的α-氨基和羧基之间的肽键连接。细胞内区室包括但不限于细胞内细胞器，例如细胞核、核仁、核内体、蛋白酶体、核糖体、染色质、核膜、核孔、外泌体、黑素体、高尔基体、过氧化物酶体、内质网(ER)、溶酶体、中心体、微管、线粒体、叶绿体、微丝、中间丝或质膜。在一些实施方案中，信号肽可称为信号序列、靶向信号、定位信号、定位序列、转运肽、前导序列或前导肽。在一些实施方案中，靶基序可操作地连接至编码目的基因的核酸序列。在一些实施方案中，术语“可操作地连接”可以指两个或更多个核酸序列之间的功能关系，例如转录调节或信号序列与转录序列的功能关系。例如，如果靶基序或编码靶基序的核酸表达为前蛋白，所述前蛋白参与将由编码序列编码的多肽靶向细胞膜、细胞内或细胞外区室，则其与编码序列可操作地连接。例如，如果信号肽或编码信号肽的核酸表达为参与由编码序列编码的多肽的分泌的前蛋白，则其与编码序列可操作地连接。例如，如果启动子刺激或调节编码序列的转录，则该启动子是可操作连接的。靶基序的非限制性实例包括信号肽、核定位信号(NLS)、核仁定位信号(NoLS)、溶酶体靶向信号、线粒体靶向信号、过氧化物酶体靶向信号、微管尖端定位信号(MtLS)、内体靶向信号、叶绿体靶向信号、高尔基体靶向信号、内质网(ER)靶向信号、蛋白酶体靶向信号、膜靶向信号、跨膜靶向信号、中心体定位信号(CLS)或将蛋白质靶向细胞膜、细胞外区室或细胞内区室的特定部分的任何其他信号。
信号肽是存在于新合成蛋白质N末端的短肽，该蛋白质将进入分泌途径。本发明的信号肽可以是10-40个氨基酸长。信号肽可以位于目的蛋白质的N-末端或位于目的蛋白质的前蛋白形式的N-末端。信号肽可以是真核来源的。在一些实施方案中，信号肽可以是哺乳动物蛋白。在一些实施方案中，信号肽可以是人蛋白质。在一些情况下，信号肽可以是同源信号肽(即，来自相同蛋白质)或异源信号肽(即，来自不同蛋白质或合成信号肽)。在一些情况下，信号肽可以是蛋白质的天然存在的信号肽或修饰的信号肽。
本文提供了包含重组RNA构建体的组合物，所述重组RNA构建体包含靶基序，其中所述靶基序可以选自以下组成的组：(a)与由目的基因编码的蛋白质异源的靶基序；(b)与目的基因编码的蛋白质异源的靶基序，其中与目的基因编码的蛋白质异源的靶基序通过至少一个氨基酸的插入、缺失和/或替换而被修饰；(c)与目的基因编码的蛋白质同源的靶基序；(d)与目的基因编码的蛋白质同源的靶基序，其中与目的基因编码的蛋白质同源的靶基序通过至少一个氨基酸的插入、缺失和/或替换而被修饰；(e)天然存在的氨基酸序列，其本质上不具有靶基序的功能，其中所述天然存在的氨基酸序列任选地通过至少一个氨基酸的插入、缺失和/或替换而被修饰。
本文提供了包含重组RNA构建体的组合物，所述重组RNA构建体包含靶基序，其中所述靶基序是信号肽。在一些实施方案中，信号肽选自以下组成的组：(a)与目的基因编码的蛋白质异源的信号肽；(b)与目的基因编码的蛋白质异源的信号肽，其中与目的基因编码的蛋白质异源的信号肽通过至少一个氨基酸的插入、缺失和/或替换而被修饰，条件是该蛋白质不是氧化还原酶；(c)与目的基因编码的蛋白质同源的信号肽；(d)与目的基因编码的蛋白质同源的信号肽，其中与目的基因编码的蛋白质同源的信号肽通过至少一个氨基酸的插入、缺失和/或替换而被修饰；(e)天然存在的氨基酸序列，其本质上不具有信号肽的功能，其中所述天然存在的氨基酸序列任选地通过至少一个氨基酸的插入、缺失和/或替换来修饰。在一些情况下，信号肽N末端的氨基酸1-9具有高于2的平均疏水性得分。
在一些情况下，如本文所用，与由目的基因编码的蛋白质异源的靶基序或与由目的基因编码的蛋白质异源的信号肽可以指与蛋白质的天然存在的靶基序或信号肽不同的天然存在的靶基序或信号肽。例如，靶基序或信号肽不是源自目的基因。通常，与给定蛋白质异源的靶基序或信号肽是来自与给定蛋白质不相关的另一蛋白质的靶基序或信号肽。例如，与给定蛋白质异源的靶基序或信号肽具有与给定蛋白质的靶基序或信号肽的氨基酸序列相差超过50％、60％、70％、80％、90％或超过95％的氨基酸序列。尽管异源序列可以源自相同的生物体，但它们自然地(本质上)并不出现在相同的核酸分子中，例如在相同的mRNA中。与蛋白质异源的靶基序或信号肽以及与靶基序或信号肽异源的蛋白质可以具有相同或不同的来源。在一些实施方案中，它们具有真核来源。在一些实施方案中，它们属于相同的真核生物。在一些实施方案中，它们是哺乳动物来源的。在一些实施方案中，它们属于相同的哺乳动物生物体。在一些实施方案中，它们是人类来源的。例如，RNA构建体可以包含编码人IL-4基因的核酸序列和另一种人蛋白质的信号肽。在一些实施方案中，RNA构建体可以包含与蛋白质异源的信号肽，其中信号肽和蛋白质具有相同来源，即人类来源。
在一些情况下，如本文所使用的与目的基因编码的蛋白质同源的靶基序或与目的基因编码的蛋白质同源的信号肽可以指蛋白质的天然存在的靶基序或信号肽。与蛋白质同源的靶基序或信号肽是天然存在的由蛋白质的基因编码的靶基序或信号肽。与蛋白质同源的靶基序或信号肽通常是真核起源的。在一些实施方案中，与蛋白质同源的靶基序或信号肽是哺乳动物来源的。在一些实施方案中，与蛋白质同源的靶基序或信号肽是人类来源的。
在一些情况下，如本文所述的天然存在的本质上不具有靶基序功能的氨基酸序列或天然存在的本质上不具有信号肽功能的氨基酸序列可以指天然存在且与自然出现的任何靶基序或信号肽的氨基酸序列不相同氨基酸序列。天然存在的本质上不具有靶基序或信号肽功能的天然存在的氨基酸序列可以是10-50个氨基酸长。在一些实施方案中，本质上不具有靶基序或信号肽的功能的天然存在的氨基酸序列是真核来源的并且与真核来源的任何靶基序或信号肽不相同。在一些实施方案中，本质上不具有靶基序或信号肽功能的天然存在的氨基酸序列是哺乳动物来源的并且与哺乳动物来源的任何靶基序或信号肽不相同。在一些实施方案中，天然存在的本质上不具有靶基序或信号肽的功能的天然存在的氨基酸序列是人类来源的并且与自然界中存在的人类来源的任何靶基序或信号肽不同。天然存在的本质上不具有靶基序或信号肽功能的氨基酸序列通常是蛋白质编码序列的氨基酸序列。本文使用的术语“天然存在的”、“天然的”和“本质上”具有等同的含义。
在一些情况下，如本文所用的信号肽的N-末端的氨基酸1-9可以指信号肽的氨基酸序列的N-末端的前九个氨基酸。类似地，本文所用的信号肽的N-末端的氨基酸1-7可以指信号肽的氨基酸序列的N-末端的前7个氨基酸并且信号肽的N-末端的氨基酸1-5可以指信号肽的氨基酸序列的N-末端的前5个氨基酸。
在一些情况下，通过插入、缺失和/或替换至少一个氨基酸而修饰的氨基酸序列可以指在氨基酸序列内包括至少一个氨基酸的氨基酸替换、插入和/或缺失的氨基酸序列。例如，如本文所用，与由目的基因编码的蛋白质异源的靶基序通过插入、缺失和/或替换至少一个氨基酸进行修饰，或者与由目的基因编码的与蛋白质异源的信号肽通过插入、缺失和/或替换至少一个氨基酸进行修饰，可以指与蛋白质异源的天然存在的靶基序或信号肽的氨基酸序列，其天然存在的氨基酸序列中包括至少一个氨基酸的替换、插入和/或缺失。例如，与由目的基因编码的蛋白质同源的靶基序通过插入、缺失和/或替换至少一个氨基酸而被修饰，或者与由目的基因编码的蛋白质同源的信号肽通过插入、缺失和/或替换至少一个氨基酸而被修饰，如本文所用，可以指与蛋白质同源的天然存在的靶基序或信号肽，其天然存在的氨基酸序列中包括其中至少一个氨基酸的氨基酸替换、插入和/或缺失。在一些实施方案中，天然存在的氨基酸序列可以通过至少一个氨基酸的插入、缺失和/或替换来修饰，并且天然存在的氨基酸序列可以包括至少一个氨基酸的氨基酸替换、插入和/或缺失在其天然存在的氨基酸序列中。氨基酸替换或替代可以指氨基酸或多肽序列中特定位置处的氨基酸被另一氨基酸替换。例如，R34K替换是指其中34位的精氨酸(Arg或R)被赖氨酸(Lys或K)替换的多肽。对于前面的示例，34K表示第34位的氨基酸被赖氨酸(Lys或K)替换。在一些实施方案中，多个替换通常由斜杠分隔。例如，R34K/L38V是指包含替换R34K和L38V的变体。氨基酸插入可以指在氨基酸或多肽序列中的特定位置处添加氨基酸。例如，插入物-34表示在位置34处的插入。氨基酸缺失或删除可以指在氨基酸或多肽序列中特定位置处的氨基酸的去除。例如，R34-表示第34位精氨酸(Arg或R)的缺失。
在一些情况下，缺失的氨基酸是疏水性得分低于-0.8、-0.7、-0.6、-0.5、-0.4、-0.3、-0.2、-0.1、0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8或低于1.9的氨基酸。在一些情况下，替换氨基酸是疏水评分高于被替换氨基酸的疏水评分的氨基酸。例如，替代氨基酸是疏水性得分为2.8及更高、或3.8及更高的氨基酸。在一些情况下，插入的氨基酸是疏水得分为2.8及更高或3.8及更高的氨基酸。
在一些情况下，本文所述的氨基酸序列可包含1至15个氨基酸插入、缺失和/或替换。在一些实施方案中，本文所述的氨基酸序列可包含1至7个氨基酸插入、缺失和/或替换。在一些情况下，本文描述的氨基酸序列可以不包含氨基酸插入、缺失和/或替换。在一些情况下，本文所述的氨基酸序列可在靶基序或信号肽的氨基酸序列的N-末端的氨基酸1-30内包含1至15个氨基酸插入、缺失和/或替换。在一些实施方案中，本文所述的氨基酸序列可以在靶基序或信号肽的氨基酸序列的N-末端的氨基酸1-30内包含1至9个氨基酸插入、缺失和/或替换。在一些情况下，本文所述的氨基酸序列可在靶基序或信号肽的氨基酸序列的N-末端的氨基酸1-20内包含1至15个氨基酸插入、缺失和/或替换。在一些实施方案中，本文所述的氨基酸序列可以在靶基序或信号肽的氨基酸序列的N-末端的氨基酸1-20内包含1至9个氨基酸插入、缺失和/或替换。在一些情况下，本文描述的氨基酸序列的至少一个氨基酸可以任选地通过缺失和/或替换进行修饰。
在一些情况下，与未修饰的信号肽相比，修饰的信号肽的氨基酸序列的N-末端的前9个氨基酸的平均疏水性得分增加1.0单位或以上。在一些情况下，疏水分数或疏水性评分可以与本文的亲水性评分同义使用，并且可以指根据Kyte-Doolittle等级(Kyte J.,Doolittle R.F.；J.Mol.Biol.157:105-132(1982))计算的氨基酸的疏水性程度。根据Kyte-Doolittle等级的氨基酸疏水分数如下：
表A.氨基酸疏水分数
氨基酸 一字母代码 疏水分数
异亮氨酸 I 4.5
缬氨酸 V 4.2
亮氨酸 L 3.8
苯丙氨酸 F 2.8
半胱氨酸 C 2.5
蛋氨酸 M 1.9
丙氨酸 A 1.8
甘氨酸 G -0.4
苏氨酸 T -0.7
丝氨酸 S -0.8
色氨酸 W -0.9
酪氨酸 Y -1.3
脯氨酸 P -1.6
组氨酸 H -3.2
谷氨酸 E -3.5
谷氨酰胺 Q -3.5
天冬氨酸 D -3.5
天冬酰胺 N -3.5
赖氨酸 K -3.9
精氨酸 R -4.5
在一些情况下，氨基酸序列的平均疏水性得分可通过将根据氨基酸序列的每个氨基酸的Kyte-Doolittle量表的疏水性得分除以氨基酸的数目相加来计算。例如，信号肽的氨基酸序列的N末端的氨基酸1-9的平均疏水性得分可以通过将9个氨基酸中的每一个的疏水性得分相加然后除以9来计算。
根据Zimmerman Polarity指数(Zimmerman J.M.,Eliezer N.,Simha R.；J.Theor.Biol.21:170-201(1968))计算极性。在一些实施方案中，氨基酸序列的平均极性可通过将根据氨基酸序列的每个氨基酸的Zimmerman极性指数计算的极性值相加然后除以氨基酸的数目来计算。例如，信号肽的氨基酸序列的N-末端的氨基酸1-9的平均极性可以通过将N-末端的氨基酸1-9的九个氨基酸中的每一个的平均极性相加然后除以九来计算。根据Zimmerman极性指数，氨基酸的极性如下：
表B.氨基酸极性
氨基酸 一字母代码 极性
异亮氨酸 I 0.13
缬氨酸 V 0.13
亮氨酸 L 0.13
苯丙氨酸 F 0.35
半胱氨酸 C 1.48
蛋氨酸 M 1.43
丙氨酸 A 0
甘氨酸 G 0
苏氨酸 T 1.66
丝氨酸 S 1.67
色氨酸 W 2.1
酪氨酸 Y 1.61
脯氨酸 P 1.58
组氨酸 H 51.6
谷氨酸 E 49.9
谷氨酰胺 Q 3.53
天冬氨酸 D 49.7
天冬酰胺 N 3.38
赖氨酸 K 49.5
精氨酸 R 52
在一些情况下，天然存在的胰岛素样生长因子1(IGF-1)信号肽可以通过一种或多种替换、缺失和/或插入进行修饰，其中天然存在的IGF-1信号肽是指IGF-1氨基酸序列(在Uniprot数据库中为P05019并且在Genbank数据库中为NM_001111285.3)的氨基酸1-20。在一些情况下，IGF-1信号肽的氨基酸序列可以通过选自G2L、K3-、S5L、T9L、Q10L和C15-组成的组的一个或多个替换、缺失和/或插入进行修饰。在一些实施方案中，野生型(WT)IGF-1信号肽氨基酸序列包含含有SEQ ID NO:46的序列。在一些情况下，修饰的IGF-1信号肽具有包含由SEQ ID NO:42所示的DNA序列编码的SEQ ID NO:41的序列的氨基酸序列。在一些情况下，修饰的IGF-1信号肽具有包含由SEQ ID NO：49所示DNA序列编码的包含SEQ ID NO：48的序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:41
Met-Leu-Ile-Leu-Leu-Leu-Pro-Leu-Leu-Leu-Phe-Lys-Cys-Phe-Cys-Asp-Phe-Leu-Lys
SEQ ID NO:42
ATGCTGATTCTGCTGCTGCCCCTGCTGCTGTTCAAGTGCTTCTGCGACTTCCTGAAA
SEQ ID NO:48
MTILFLTMVISYFGCMKA
SEQ ID NO:49
ATGACCATCCTGTTTCTGACAATGGTCATCAGCTACTTCGGCTGCATGAAGGCC
在一些情况下，IGF-1的前肽可以被修饰。在一些实施方案中，天然存在的IGF-1前肽的氨基酸序列，其在本质上不具有信号肽的功能(Uniprot数据库中为P05019)，通过缺失前肽N末端中22-31侧翼的十个氨基酸残基(VKMHTMSSSH(SEQ ID NO：45)而被修饰，并且优选地具有由如SEQ ID NO：44所示的DNA序列编码的如SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO:43
Met-Leu-Phe-Tyr-Leu-Ala-Leu-Cys-Leu-Leu-Thr-Phe-Thr-Ser-Ser-Ala-Thr-Ala
SEQ ID NO:44
ATGCTGTTCTATCTGGCCCTGTGCCTGCTGACCTTTACCAGCTCTGCTACCGCC
在一些情况下，包含编码IGF-1前肽的核酸序列和编码成熟IGF-1的核酸序列但不包含编码IGF-1E肽的核酸序列的mRNA可以指包含编码具有27个氨基酸的人IGF-1前肽的核苷酸序列和编码具有70个氨基酸的成熟人IGF-1的核苷酸序列但不包含编码人IGF-1E肽的核苷酸序列，即不包含编码Ea-、Eb-或Ec-结构域的核苷酸序列的mRNA。编码具有27个氨基酸的人IGF-1前肽的核苷酸序列和编码具有70个氨基酸的成熟人IGF-1的核苷酸序列可以是密码子优化的。
在一些情况下，天然存在的白细胞介素4(IL-4)信号肽可以通过一个或多个替换、缺失和/或插入进行修饰，其中天然存在的IL-4信号肽是指IL-4氨基酸序列(在Uniprot数据库中为P05112，在Genbank数据库中为NM_000589.4)的氨基酸1-24。在一些情况下，IL-4信号肽的氨基酸序列可通过一或多个氨基酸残基的一或多个替换、缺失和/或插入来修饰。
在一些情况下，天然存在的白细胞介素2(IL-2)信号肽可通过一或多个替换、缺失和/或插入进行修饰，其中天然存在的IL-2信号肽是指IL-2氨基酸序列(在Uniprot数据库中为P60568或Q0GK43，在Genbank数据库中为NM_000586.3)的氨基酸1-20。在一些情况下，IL-2信号肽的氨基酸序列可以通过选自Y2L、R3K、R3-、M4L、Q5L、S8L、S8A、-13A、L14T、L16A、V17-和V17A组成的组的一个或多个替换、缺失和/或插入进行修饰。在一些情况下，野生型(WT)IL-2信号肽由包含SEQ ID NO:113的DNA序列编码。在一些情况下，修饰的IL-2信号肽具有包含SEQ ID NO:112的序列的氨基酸序列。在一些情况下，修饰的IL-2信号肽由包含SEQ ID NO:114的DNA序列编码(Y2L/R3-/M4L/Q5L/S8A/-A13/L14T/L16A和V17A)。
在一些情况下，天然存在的白细胞介素12(IL-12)信号肽可通过一或多个替换、缺失和/或插入进行修饰，其中天然存在的IL-12信号肽是指IL-12氨基酸序列(在Genbank数据库中为NM_000882.4或在Genbank数据库中为NM_002187.2)的氨基酸1-22。在一些情况下，IL-12信号肽的氨基酸序列可通过一或多个氨基酸残基的一或多个替换、缺失和/或插入来修饰。
表达载体和RNA构建体的产生
本文提供了包含编码本文所述重组RNA构建体的重组多核酸构建体的组合物。本文提供了包含编码重组RNA构建体的重组多核酸构建体的组合物，所述重组RNA构建体编码包含第一RNA序列、第二RNA序列和接头RNA序列的重组RNA构建体，其中所述接头RNA序列连接所述第一RNA序列和所述第二RNA序列。在一些情况下，接头具有独立地选自以下组成的组的结构：式(I):XmCAACAAXn，其中X是任何核苷酸，m是1至12的整数，并且n是0至4的整数；和式(II)：XpTCCCXr，其中X是任何核苷酸，p是0至17的整数，并且r是0至13的整数。在一些情况下，接头可以包含含有ACAACAA(SEQ ID NO：23)的序列。在一些情况下，第一RNA序列或第二RNA序列可以编码目的基因。在一些实施方案中，第一RNA序列或第二RNA序列可以是编码目的基因的mRNA。在一些情况下，第一RNA序列或第二RNA序列可包含调节靶RNA表达的一个或多个遗传元件。在一些实施方案中，第一RNA序列或第二RNA序列可包含各自能够结合靶RNA的一个或多个siRNA。例如，编码目的基因的mRNA可以是IL-4、IL-2、IL-12或IGF-1的mRNA。例如，靶RNA可以是TNF-αmRNA、ALK2mRNA、Turbo GFP mRNA、VEGFA mRNA、c-Myc mRNA、KRAS mRNA、Akt1 mRNA、Akt2 mRNA或Akt3 mRNA。
在相关方面，编码重组RNA构建体的重组多核酸构建体可以编码1、2、3、4、5或更多个siRNA种类。在相关方面，编码重组RNA构建体的重组多核酸构建体可以编码针对靶mRNA的1种siRNA。在相关方面，编码重组RNA构建体的重组多核酸构建体可以编码3个siRNA，每个siRNA针对靶mRNA。在相关方面，每种siRNA种类可包含相同序列、不同序列或其组合。例如，编码重组RNA构建体的重组多核酸构建体可以编码3个siRNA，每个siRNA针对靶mRNA的相同区域或序列。例如，编码重组RNA构建体的重组多核酸构建体可以编码3个siRNA，每个siRNA针对靶mRNA的不同区域或序列。在一些方面，编码重组RNA构建体的重组多核酸构建体可以编码3种siRNA，其中3种siRNA中的每一种针对不同的靶mRNA。在一些实施方案中，靶mRNA可以是TNF-α、ALK2、Turbo GFP mRNA、VEGFA mRNA、c-Myc mRNA、KRAS mRNA、Akt1mRNA、Akt2 mRNA或Akt3 mRNA。在相关方面，重组多核酸构建体可以包含选自SEQ ID NOs：10-18和93-100组成的组的序列。
本文所述的多核酸构建体可以通过本领域已知的任何方法获得，例如通过化学合成DNA链、通过PCR或通过Gibson组装方法。通过化学合成或者PCR方法或Gibson组装方法的组合构建多核酸构建体的优点是可以优化密码子以确保融合蛋白在宿主细胞中高水平表达。密码子优化可以指通过用在该宿主细胞的基因中更频繁或最频繁使用的密码子替换至少一个密码子(例如，多于1、2、3、4、5、10、15、20、25、50个或更多密码子)来修饰用于在目的宿主细胞中表达的核酸序列同时保持天然氨基酸序列的过程。密码子使用表很容易获得，例如，在“密码子使用数据库”中，并且这些表可以通过多种方式进行调整。用于密码子优化特定序列以便在特定宿主细胞中表达的计算机算法也是可用的，例如Gene(Aptagen,PA)和/>(ThermoFischer,MA)。一旦获得多核苷酸，就可以将其整合到合适的载体中。本文使用的载体可以指用于体内或体外摄取、增殖、表达或传输核酸的天然存在的或合成产生的构建体，例如质粒、微环、噬菌粒、粘粒、人工染色体/微型染色体、噬菌体、病毒如杆状病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、噬菌体。用于构建载体的方法是本领域技术人员众所周知的并且描述于各种出版物中。具体地，用于构建合适载体的技术，包括功能和调节组分例如启动子、增强子、终止和聚腺苷酸化信号、选择标记、复制起点和剪接信号的描述，是本领域技术人员已知的。多种载体是本领域众所周知的，并且一些载体可从诸如安捷伦技术，圣塔克拉拉，加利福尼亚州；Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚州；普洛麦格(Promega)，麦迪逊，威斯康星州；赛默飞世尔科技；或Invivogen，圣迭戈，加利福尼亚州等公司商购获得；用于体外转录的载体的非限制性实例包括pT7CFE1-CHis、pMX(例如pMA-T、pMA-RQ、pMC、pMK、pMS、pMZ)、pEVL、pSP73、pSP72、pSP64和pGEM(例如/>-4Z、/>-5Zf(+)、/>-11Zf(+)、/>-9Zf(-)、/>-3Zf(+/-)、/>-7Zf(+/-))。在一些情况下，重组多核酸构建体可以是DNA。
如本文所述的多核酸构建体可以是圆形的或线性的。例如，环状多核酸构建体可包括载体系统，例如pMX、pMA-T、pMA-RQ或pT7CFE1-CHis。例如，线性多核酸构建体可以包括线性载体例如pEVL或线性化载体。在一些情况下，重组多核酸构建体还可包含启动子。在一些情况下，启动子可以存在于编码第一RNA序列和第二RNA序列的序列的上游或5'侧。启动子的非限制性实例可包括T3、T7、SP6、P60、Syn5和KP34。在一些情况下，本文提供的重组多核酸构建体可包含T7启动子，该T7启动子包含具有TAATACGACTCACTATA(SEQ ID NO：20)的序列。在一些情况下，重组多核酸构建体还包含编码Kozak序列的序列。Kozak序列可以指充当蛋白质翻译起始位点的核酸序列基序。Kozak序列在文献中详细描述，例如Kozak,M.,Gene 299(1-2):1-34，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，重组多核酸构建体包含编码Kozak序列的序列，所述Kozak序列包含具有GCCACC(SEQ ID NO：19)的序列。在一些情况下，本文描述的重组多核酸构建体可以是密码子优化的。
本文提供了包含编码本文所述RNA构建体的重组多核酸构建体的组合物，所述重组多核酸构建体包含编码能够结合靶RNA的siRNA的一种或多种核酸序列和编码目的基因的一种或多种核酸序列，其中所述能够结合靶RNA的siRNA不是由目的基因编码的内含子序列的一部分。在某些情况下，目的基因无需RNA剪接即可表达。在一些情况下，能够结合靶RNA的siRNA不由目的基因的内含子序列编码或组成。在一些情况下，能够结合靶RNA的siRNA结合靶mRNA的外显子。在一些情况下，能够结合靶RNA的siRNA特异性结合一种靶RNA。在一些情况下，重组多核酸构建体可包含核酸序列，所述核酸序列包含选自SEQ ID NO：10-18和101-108组成的组的序列。
本文提供了产生本文所述的RNA构建体组合物的方法。例如，重组RNA构建体可以通过体外转录从多核酸构建体产生，所述多核酸构建体包含RNA聚合酶的启动子、至少一种编码目的基因的核酸序列、至少一种编码能够结合靶mRNA的siRNA的核酸序列和编码聚腺苷酸尾的核酸序列。体外转录反应还可包含RNA聚合酶、三磷酸核苷酸(NTP)的混合物和/或加帽酶。使用体外转录产生RNA以及分离和纯化转录的RNA的细节是本领域众所周知的并且可以在例如Beckert&Masquida((2011)Synthesis of RNA by In vitroTranscription.RNA.Methods in Molecular Biology(Methods and Protocols),vol703.Humana Press)中找到。体外转录试剂盒的非限制性列表包括MEGAscriptTMT3转录试剂盒、MEGAscript T7试剂盒、MEGAscriptTMSP6转录试剂盒、MAXIscriptTMT3转录试剂盒、MAXIscriptTMT7转录试剂盒、MAXIscriptTMSP6转录试剂盒、MAXIscriptTMT7/T3转录试剂盒、MAXIscriptTMSP6/T7转录试剂盒、mMESSAGE mMACHINETMT3转录试剂盒、mMESSAGEmMACHINETMT7转录试剂盒、mMESSAGE mMACHINETMSP6转录试剂盒、MEGAshortscriptTMT7转录试剂盒、HiScribeTMT7高产量RNA合成试剂盒、HiScribeTMT7体外转录试剂盒、AmpliScribeTMT7-FlashTM转录试剂盒、AmpliScribeTMT7高产量转录试剂盒、AmpliScribeTMT7-FlashTM生物素-RNA转录试剂盒、T7转录试剂盒、HighYield T7 RNA合成试剂盒、T7转录试剂盒等。
体外转录反应还可包含转录缓冲系统、三磷酸核苷酸(NTP)和RNase抑制剂。在一些实施方案中，转录缓冲系统可包含二硫苏糖醇(DTT)和镁离子。NTP可以是天然存在的或非天然存在的(修饰的)NTP。非天然存在的(修饰的)NTP的非限制性实例包括N1-甲基假尿苷、假尿苷、N1-乙基假尿苷、N1-甲氧基甲基假尿苷、N1-丙基假尿苷、2-硫尿苷、4-硫尿苷、5-甲氧基尿苷、5-甲基尿苷、5-羧甲基酯尿苷、5-甲酰尿苷、5-羧基尿苷、5-羟基尿苷、5-溴尿苷、5-碘尿苷、5,6-二氢尿苷、6-氮杂尿苷、噻吩尿苷(thienouridine)、3-甲基尿苷、1-羧甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、5-甲基胞苷、5-甲氧基胞苷、5-羟甲基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-羧基胞苷、5-羟基胞苷、5-碘胞苷、5-溴胞苷、2-硫代胞苷、5-氮杂胞苷、假异胞苷、3-甲基胞苷、N4-乙酰基胞苷、5-甲酰基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、1-甲基-假异胞苷、4-甲氧基-假异胞苷和4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、N1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷,N6-甲基-2-氨基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲硫基腺嘌呤和2-甲氧基-腺嘌呤。DNA依赖性RNA聚合酶的非限制性实例包括T3、T7、SP6、P60、Syn5和KP34 RNA聚合酶。在一些实施方案中，RNA聚合酶选自T3 RNA聚合酶、T7 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶、P60 RNA聚合酶、Syn5 RNA聚合酶和KP34RNA聚合酶组成的组。
如本文所述，转录的RNA可以从体外转录反应混合物中分离和纯化。例如，可以使用柱纯化来分离和纯化转录的RNA。从体外转录反应混合物中分离和纯化转录的RNA的细节是本领域众所周知的，并且可以使用任何市售试剂盒。RNA纯化试剂盒的非限制性列表包括MEGAclear试剂盒、RNA Cleanup试剂盒、/>RNA纯化试剂盒、RNA Clean-up等。
治疗应用
本文提供了可用于治疗疾病或病症的组合物。在一些方面，组合物以足以治疗或预防疾病或病症的量存在或施用。在一些方面，本文提供了治疗疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用本文所述的组合物或药物组合物。在一些方面，本文提供了本文描述的组合物或药物组合物，其用于在有需要的受试者中治疗疾病或病症的方法中使用。在一些方面，本文提供本文所述的组合物或药物组合物在制造用于治疗有需要的受试者的疾病或病症的药物中的用途。在一些实施方案中，疾病或病症包括皮肤疾病或病症。在一些实施方案中，皮肤疾病或病症包括炎性皮肤病。在一些实施方案中，炎性皮肤病包括牛皮癣。在一些实施方案中，疾病或病症包括肌肉疾病或病症。在一些实施方案中，肌肉疾病或病症包括骨骼肌病症。在一些实施方案中，骨骼肌病症包括进行性骨化性纤维发育不良(FOP)。在一些实施方案中，疾病或病症包括癌症。在一些实施方案中，癌症包括胶质母细胞瘤、人舌鳞状细胞癌、人肺癌或人单核细胞白血病。本文提供重组多核酸或RNA构建体组合物，其包含第一RNA序列、第二RNA序列和接头RNA序列，其中接头RNA序列连接第一RNA序列和第二RNA序列。在一些情况下，第一RNA序列或第二RNA序列可以编码目的基因。在一些实施方案中，目的基因可包含IL-4、IL-2、IL-12或IGF-1。在一些情况下，第一RNA序列或第二RNA序列可包含可降低与本文所述的疾病或病症相关的基因的表达的遗传元件。在一些实施方案中，可以降低与疾病或病症相关的基因的表达的遗传元件可以包括靶向TNF-αmRNA或功能变体的siRNA。在一些实施方案中，可降低与疾病或病症相关的基因的表达的遗传元件可包含靶向ALK2 mRNA或功能变体的siRNA。在一些实施方案中，可以降低与疾病或病症相关的基因的表达的遗传元件可以包括靶向VEGFA mRNA或功能变体的siRNA。在一些实施方案中，可以降低与疾病或病症相关的基因的表达的遗传元件可以包括靶向c-Myc mRNA或功能变体的siRNA。在一些实施方案中，可以降低与疾病或病症相关的基因的表达的遗传元件可以包括靶向KRAS mRNA或功能变体的siRNA。在一些实施方案中，可降低与疾病或病症相关的基因的表达的遗传元件可包含靶向Akt1 mRNA或功能变体的siRNA。在一些实施方案中，可以减少与疾病或病症相关的基因的表达的遗传元件可以包括靶向Akt2 mRNA或功能变体的siRNA。在一些实施方案中，可以减少与疾病或病症相关的基因的表达的遗传元件可以包括靶向Akt3mRNA或功能变体的siRNA。
本文还提供了包含本文所述的任何重组RNA构建体组合物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。药物组合物可以指包含治疗有效量的活性药物成分以及一种或多种药学上可接受的赋形剂的混合物或溶液，其施用给有需要的受试者。术语“药学上可接受的”表示可用于制备药物组合物的材料的属性，其通常是安全的、无毒的，并且在生物学上或其他方面都不是不期望的，并且对于兽医以及人类药物用途来说是可接受的。术语“药学上可接受的”可以指诸如载体或稀释剂的材料，其不会消除化合物的生物活性或性质，并且相对无毒，即，该材料可以施用于个体而不引起不希望的生物效应或以有害的方式与其中含有该材料的组合物的任何组分相互作用。药学上可接受的赋形剂可以指药物组合物中不具有治疗活性并且对施用的受试者无毒的任何药学上可接受的成分，例如用于配制药品的崩解剂、粘合剂、填充剂、溶剂、缓冲剂、张力剂、稳定剂、抗氧化剂、表面活性剂、载体、稀释剂、赋形剂、防腐剂或润滑剂。药物组合物可促进化合物向生物体的施用，并且可使用一种或多种药学上可接受的非活性成分以常规方式配制，所述非活性成分将促进活性化合物加工成可药用的制剂。合适的制剂取决于所选择的施用途径，并且药物组合物的概述可以在例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Nineteenth Ed(Easton,Pa.:MackPublishing Company,1995)；Hoover,John E.,Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania 1975；Liberman,H.A.and Lachman,L.,Eds.,Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Decker,New York,N.Y.,1980；和Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Seventh Ed.(LippincottWilliams&Wilkins1999)中找到，通过引用并入本文。在一些实施方案中，药物组合物可以通过将活性物质(例如，本文描述的重组多核酸或RNA构建体)溶解在水溶液中来配制用于注射到疾病组织或疾病细胞中。在一些实施方案中，药物组合物可以通过将活性物质(例如，本文所述的重组多核酸或RNA构建体)溶解在水溶液中来配制用于直接注射到疾病组织或疾病细胞中。
本文还提供了治疗有需要的受试者中的疾病或病症的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的多核酸构建体或重组RNA构建体组合物或药物组合物。本文所用的术语“有效量”或“治疗有效量”是指所施用的药剂或化合物的足量，其将在一定程度上缓解所治疗的疾病或病症的一种或多种症状；例如，疾病的一种或多种体征、症状或病因的减少和/或缓解，或生物系统的任何其他所需的改变。例如，用于治疗用途的“有效量”可以是使得一种或多种疾病症状的临床显著减少的药剂的量。在个别情况下，可以使用诸如剂量递增研究等技术来确定适当的“有效”量。
本文所用的术语“治疗”包括缓解、减轻或改善疾病或病症的至少一种症状，预防另外的症状，抑制疾病或病症，例如阻止疾病或病症的发展、缓解疾病或病症、使疾病或病症消退、缓解由疾病或病症引起的病症、或预防性和/或治疗性地停止疾病或病症的症状。在一些实施方案中，治疗疾病或病症包括减小疾病组织或疾病细胞的尺寸。在一些实施方案中，治疗受试者的疾病或病症包括增加受试者的存活。在一些实施方案中，治疗疾病或病症包括降低或改善疾病的严重性、延迟疾病的发作、抑制疾病的进展、减少受试者的住院或住院时间、改善受试者的生活质量、减少与疾病相关的症状的数量、减少或改善与疾病相关的症状的严重性、减少与疾病相关的症状的持续时间、预防与疾病相关的症状的复发、抑制疾病症状的发作或其发展，或抑制与疾病相关的症状的进展。在一些实施方案中，治疗癌症包括减小肿瘤的尺寸或增加患有癌症的患者的存活率。
在一些情况下，受试者可以包括哺乳动物。哺乳动物的例子包括但不限于哺乳动物纲的任何成员：人类、非人类灵长类动物如黑猩猩、以及其他猿类和猴类；农场动物，例如牛、马、绵羊、山羊、猪；家畜，例如兔子、狗和猫；实验动物包括啮齿动物，例如大鼠、小鼠和豚鼠等。在一些情况下，哺乳动物是人类。在一些情况下，受试者可以是动物。在一些情况下，动物可以包括人类和非人类动物。在一个实施方案中，非人类动物可以是哺乳动物，例如啮齿动物，例如大鼠或小鼠。在另一个实施方案中，非人类动物可以是小鼠。在一些情况下，受试者是哺乳动物。在一些情况下，受试者是人类。在一些情况下，受试者是成人、儿童或婴儿。在一些情况下，受试者是伴侣动物。在一些情况下，受试者是猫科动物、犬科动物或啮齿动物。在一些情况下，受试者是狗或猫。
在一些方面，本文提供了治疗受试者的疾病或病症的方法，包括向受试者施用本文所述的重组RNA构建体组合物或药物组合物，其包含编码目的基因的mRNA和能够结合靶mRNA的siRNA。在一些实施方案中，靶mRNA包含TNF-α、ALK2、VEGFA、c-Myc、KRAS、Akt1、Akt2、Akt3 mRNA或其功能变体。在一些实施方案中，编码目的基因的mRNA编码IGF-1或其功能变体。在一些实施方案中，编码目的基因的mRNA编码细胞因子。在一些实施方案中，细胞因子是IL-4或其功能变体。在一些实施方案中，细胞因子是IL-2或其功能变体。在一些实施方案中，编码目的基因的mRNA编码细胞因子。在一些实施方案中，细胞因子是IL-12或其功能变体。
在一些方面，本文提供了治疗受试者的疾病或病症的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的重组RNA组合物或药物组合物，其包含编码IL-4的mRNA和能够结合至TNF-αmRNA的siRNA。在一些方面，本文提供了治疗受试者中的疾病或病症的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的重组RNA构建体组合物或药物组合物，其包含编码IGF-1的mRNA和能够结合至ALK2 mRNA的siRNA。在一些方面，本文提供了治疗受试者的疾病或病症的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的重组RNA构建体组合物或药物组合物，其包含编码IL-2的mRNA和能够结合至VEGFA mRNA的siRNA。在一些方面，本文提供了治疗受试者的疾病或病症的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的重组RNA构建体组合物或药物组合物，其包含编码IL-12的mRNA和能够结合c-Myc、KRAS、Akt1、Akt2和/或Akt2 mRNA的siRNA。在一些方面，本文提供了治疗受试者的疾病或病症的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的重组RNA构建体组合物或药物组合物，其包含编码IL-12的mRNA和能够结合c-Myc、KRAS、Akt1、Akt2和Akt2mRNA的siRNA。在一些实施方案中，疾病或病症包括皮肤疾病或病症、肌肉疾病或病症、或癌症。在一些实施方案中，疾病或病症包括皮肤疾病或病症，或肌肉疾病或病症。在一些实施方案中，皮肤疾病或病症包括炎性皮肤病。在一些实施方案中，炎性皮肤病包括牛皮癣。在一些实施方案中，肌肉疾病或病症包括骨骼肌病症。在一些实施方案中，骨骼肌病症包括进行性骨化性纤维发育不良(FOP)。在一些实施方案中，疾病或病症包括癌症。在一些实施方案中，癌症包括胶质母细胞瘤、人舌鳞状细胞癌、人肺癌或人单核细胞白血病。
在一些方面，向有需要的受试者施用的组合物或药物组合物包含重组多核酸构建体或RNA构建体，所述重组多核酸构建体或RNA构建体包含：(i)IL-4mRNA；和(ii)至少一种能够结合TNF-αmRNA的siRNA。在相关方面，重组多核酸构建体或RNA构建体可编码或包含至少1、2、3、4、5、6或更多个siRNA。在相关方面，重组多核酸构建体或RNA构建体可以编码或包含针对TNF-αmRNA的1个siRNA。在相关方面，重组多核酸构建体或RNA构建体可以编码或包含3个siRNA，每个siRNA针对TNF-αmRNA。在相关方面，所述至少3种siRNA中的每一种可以是相同的、不同的或其组合。在相关方面，重组RNA构建体可包含如下所示的序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:76或SEQ ID NO:77(Cpd.1或Cpd.2)。在相关方面，重组多核酸构建体可包含如下所示的序列：SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11(Cpd.1或Cpd.2)。
在一些方面，向有需要的受试者施用的组合物或药物组合物包含重组多核酸构建体或RNA构建体，所述重组多核酸构建体或RNA构建体包含：(i)IGF-1mRNA；和(ii)至少一种能够结合ALK2 mRNA的siRNA。在相关方面，重组多核酸构建体或RNA构建体可编码或包含至少1、2、3、4、5、6或更多个siRNA。在相关方面，重组多核酸构建体或RNA构建体可以编码或包含针对ALK2 mRNA的1个siRNA。在相关方面，重组多核酸构建体或RNA构建体可以编码或包含3个siRNA，每个siRNA针对ALK2mRNA。在相关方面，所述至少3种siRNA中的每一种可以是相同的、不同的或其组合。在相关方面，重组RNA构建体可包含如下所示的序列：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:78或SEQ ID NO:79(Cpd.3或Cpd.4)。在相关方面，重组多核酸构建体可包含如下所示的序列SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13(Cpd.3或Cpd.4)。
在一些方面，向有需要的受试者施用的组合物或药物组合物包含重组多核酸构建体或RNA构建体，所述重组多核酸构建体或RNA构建体包含：(i)IGF-1mRNA；和(ii)至少一种能够结合Turbo GFP mRNA的siRNA。在相关方面，重组多核酸构建体或RNA构建体可编码或包含至少1、2、3、4、5、6或更多个siRNA。在相关方面，重组多核酸构建体或RNA构建体可以编码或包含针对Turbo GFP mRNA的1个siRNA。在相关方面，重组多核酸构建体或RNA构建体可以编码或包含3个siRNA，每个siRNA针对Turbo GFP mRNA。在相关方面，所述至少3种siRNA中的每一种可以是相同的、不同的或其组合。在相关方面，重组RNA构建体可包含如下所示的序列：SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:84(Cpd.5-Cpd.9)。在相关方面，重组多核酸构建体可包含如下所示的序列SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18(Cpd.5-CPD.9)。
在一些方面，向有需要的受试者施用的组合物或药物组合物包含重组多核酸构建体或RNA构建体，所述重组多核酸构建体或RNA构建体包含：(i)IL-2mRNA；和(ii)至少一种能够结合VEGFA mRNA的siRNA。在相关方面，重组多核酸构建体或RNA构建体可编码或包含至少1、2、3、4、5、6或更多个siRNA。在相关方面，重组多核酸构建体或RNA构建体可以编码或包含1个针对VEGFA mRNA的siRNA。在相关方面，重组多核酸构建体或RNA构建体可以编码或包含3个siRNA，每个siRNA针对VEGFA mRNA。在相关方面，所述至少3种siRNA中的每一种可以是相同的、不同的或其组合。在相关方面，重组RNA构建体可包含如下所示的序列：SEQ IDNO:85,SEQ ID NO:86,SEQ ID NO:87,SEQ ID NO:88,SEQ ID NO:89,SEQ ID NO:90,SEQ IDNO:101,SEQ ID NO:102,SEQ ID NO:103,SEQ ID NO:104,SEQ ID NO:105,or SEQ ID NO:106(Cpd.10,Cpd.11,Cpd.12,Cpd.13,Cpd.14或Cpd.15)。在相关方面，重组多核酸构建体可包含如下所示的序列：SEQ ID NO:93,SEQ ID NO:94,SEQ ID NO:95,SEQ ID NO:96,SEQ IDNO:97,或SEQ ID NO:98(Cpd.10,Cpd.11,Cpd.12,Cpd.13,Cpd.14或Cpd.15)。
在一些方面，向有需要的受试者施用的组合物或药物组合物包含重组多核酸构建体或RNA构建体，所述重组多核酸构建体或RNA构建体包含：(i)IL-12mRNA；和(ii)至少一种能够结合c-Myc、KRAS、Akt1、Akt2和/或Akt3 mRNA的siRNA。在相关方面，重组多核酸构建体或RNA构建体可以编码或包含至少1、2、3、4、5、6或更多个siRNA。在相关方面，重组多核酸构建体或RNA构建体可编码或包含针对c-Myc、KRAS、Akt1、Akt2和/或Akt3 mRNA的1个siRNA。在相关方面，重组多核酸构建体或RNA构建体可以编码或包含3个siRNA，每个siRNA针对c-Myc、KRAS、Akt1、Akt2和/或Akt3 mRNA。在相关方面，所述至少3种siRNA中的每一种可以是相同的、不同的或其组合。在相关方面，重组多核酸或RNA构建体可以编码或包含至少3个siRNA，每个siRNA针对选自c-Myc、KRAS、Akt1、Akt2和Akt3 mRNA中的一种mRNA。在相关方面，重组多核酸或RNA构建体可以编码或包含至少3个siRNA，每个siRNA针对选自c-Myc、KRAS、pan-Akt(即，结合Akt1、Akt2和Akt3)mRNA中的一种mRNA。在相关方面，重组RNA构建体可包含如下所示的序列：SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:107或SEQ ID NO:108(Cpd.16或Cpd.17)。在相关方面，重组多核酸构建体可包含如下所示的序列：SEQ ID NO：100或SEQ ID NO：101(Cpd.16或Cpd.17)。
本文所述的重组RNA构建体组合物可以作为联合疗法施用。两种或更多种治疗剂或疗法的联合疗法可以使用通过不同作用机制发挥作用的药剂和疗法。使用具有不同作用机制的药物或疗法的联合疗法可以产生加和效应或协同效应。组合疗法可以允许每种药剂的剂量低于单一疗法中使用的剂量，从而减少毒副作用和/或增加药剂的治疗指数。联合疗法可以降低耐药疾病细胞产生的可能性。在一些情况下，组合疗法包含影响免疫应答(例如，增强或激活应答)的治疗剂或疗法和影响(例如，抑制或杀死)疾病细胞的治疗剂。在一些情况下，联合疗法可包括(i)本文所述的重组RNA组合物或药物组合物；和(ii)本领域已知的用于本文描述的疾病的一种或多种另外的疗法。在一些实施方案中，本文描述的重组RNA组合物或药物组合物可以在施用联合疗法的一种或多种附加疗法之前、同时和/或之后施用给患有疾病或病症的受试者。在一些实施方案中，一种或多种另外的疗法可以包括1、2、3或更多种附加的治疗剂或疗法。
本文描述的组合物和药物组合物可以使用本领域已知的任何合适的方法施用于受试者。用于本发明的合适的制剂和递送方法通常是本领域众所周知的。例如，本文描述的组合物可以多种方式施用于受试者，包括肠胃外、静脉内、皮内、肌内、结肠、直肠或腹膜内。在一些实施方案中，本文所述的组合物通过受试者的腹膜内注射、肌内注射、皮下注射或静脉内注射来施用。在一些实施方案中，本文描述的组合物可以肠胃外、静脉内、肌内或口服施用。在一些实施方案中，本文描述的组合物可以通过注射到疾病组织或细胞中来施用。在一些实施方案中，本文描述的组合物可以作为用于注射到疾病组织或细胞中的水溶液施用。
本文描述的任何组合物和药物组合物可以与使用说明书一起提供。指导手册可包括对技术人员或主治医师如何根据本发明治疗(或预防)本文所述的疾病或病症(例如癌症)的指导。在一些实施方案中，使用说明书可以分别包括关于本文描述的递送/施用模式和递送/施用方案的指导(例如，递送/施用途径、剂量方案、递送/施用时间、递送/施用频率等)。在一些实施方案中，使用说明书可以包括如何施用或注射本发明的组合物和/或如何准备本发明的组合物用于施用或注射的说明。原则上，本文其他地方分别关于递送/施用模式和递送/施用方案所描述的内容可以作为各自的说明被包含在说明书中。
组合物和药物组合物可以用于基因治疗。在某些实施方案中，包含本文所述的重组多核酸或RNA构建体的组合物可以在基因治疗载体中递送至细胞。基因治疗载体和基因递送方法是本领域众所周知的。这些方法的非限制性实例包括病毒载体递送系统，包括DNA和RNA病毒，其在递送至细胞后具有游离的或整合基因组；非病毒载体递送系统，包括DNA质粒、裸核酸和与递送载体复合的核酸、转座子系统(用于递送并整合到宿主基因组中；Moriarity,et al.(2013)Nucleic Acids Res41(8),e92,Aronovich,et al.,(2011)Hum.Mol.Genet.20(R1),R14-R20)、逆转录病毒介导的DNA转移(例如，莫洛尼小鼠白血病病毒、脾坏死病毒、逆转录病毒例如劳斯肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、长臂猿白血病病毒、人类免疫缺陷病毒，腺病毒、骨髓增殖性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒；参见例如Kayet al.(1993)Science 262,117-119,Anderson(1992)Science 256,808-813)，以及DNA病毒介导的DNA转移，包括腺病毒，疱疹病毒、细小病毒和腺相关病毒(例如，Ali et al.(1994)Gene Therapy 1,367-384)。病毒载体还包括但不限于腺相关病毒、腺病毒性病毒、慢病毒、逆转录病毒和单纯疱疹病毒载体。能够整合到宿主基因组中的载体包括但不限于逆转录病毒或慢病毒。
在一些实施方案中，包含本文所述的重组多核酸或RNA构建体的组合物可通过直接DNA转移递送至细胞(Wolff et al.(1990)Science 247,1465-1468)。在对细胞膜进行轻度机械破坏，暂时使细胞透化后，可以将重组多核酸或RNA构建体递送至细胞。这种对膜的温和机械破坏可以通过轻柔地迫使细胞穿过小孔来实现(Sharei et al.PLOS ONE(2015)10(4),e0118803)。在另一个实施方案中，包含本文所述的重组多核酸或RNA构建体的组合物可以通过脂质体介导的DNA转移递送至细胞(例如，Gao&Huang(1991)Biochem.Ciophys.Res.Comm.179,280-285,Crystal(1995)Nature Med.1,15-17,Caplenet al.(1995)Nature Med.3,39-46)。脂质体可以涵盖通过生成封闭的脂质双层或聚集体而形成的各种单层和多层脂质载体。重组多核酸或RNA构建体可以封装在脂质体的水性内部，散布在脂质体的脂质双层内，通过与脂质体和寡核苷酸两者缔合的连接分子附着至脂质体，包埋在脂质体中，或与脂质体复合。
基因表达的调节
本文提供了在细胞中从单个RNA转录物表达siRNA和mRNA的方法，包括将包含本文所述的任何重组多核酸或RNA构建体的组合物引入细胞中。本文进一步提供了调节细胞中两种或更多种基因的表达的方法，包括将包含编码或包含第一RNA序列、第二RNA序列和接头RNA序列的重组多核酸或RNA构建体的组合物引入细胞中，其中接头RNA连接第一RNA序列和第二RNA序列，其中第一RNA序列编码目的基因；其中第二RNA序列编码能够结合靶信使RNA(mRNA)的小干扰RNA(siRNA)，并且其中靶mRNA不同于由目的基因编码的mRNA，从而调节来自单个RNA转录物的靶mRNA以及目的基因的表达。在一些情况下，如本文所用，多核酸、基因、DNA或RNA的表达可以指多核酸、基因、DNA或RNA的转录和/或翻译。在一些情况下，如本文所用，调节、增加、上调、减少或下调多核酸、基因(例如目的基因)、DNA或RNA(例如靶mRNA)的表达可以指通过影响多核酸、基因(例如目的基因)、DNA或RNA(例如靶RNA)的转录和/或翻译来调节、增加、上调、减少、下调由多核酸、基因(例如目的基因)、DNA或RNA(例如靶RNA)表达的蛋白质水平。在一些情况下，抑制多核酸、基因(如目的基因)、DNA或RNA(如靶mRNA)的表达可指影响多核酸、基因(如目的基因)、DNA或RNA(如靶mRNA)的转录和/或翻译，使得由多核酸、基因(如目的基因)、DNA或RNA(如靶mRNA)编码的蛋白质的水平降低或消除。
例如，本文提供了调节细胞中两种或更多种基因的表达的方法，包括将包含编码或包含第一RNA序列、第二RNA序列和接头RNA序列的重组多核酸或RNA构建体的组合物引入细胞中，其中接头RNA序列连接第一RNA序列和第二RNA序列，其中第一RNA序列编码IL-4，并且其中第二RNA序列编码能够结合TNF-αmRNA的小干扰RNA(siRNA)。从而调节单个RNA转录物中TNF-αmRNA和IL-4的表达。
例如，本文提供了调节细胞中两种或更多种基因表达的方法，包括将包含编码或包含第一RNA序列、第二RNA序列和接头RNA序列的重组多核酸或RNA构建体的组合物引入细胞中，其中接头RNA序列连接第一RNA序列和第二RNA序列，其中第一RNA序列编码IGF-1，并且其中第二RNA序列编码能够结合ALK2 mRNA的小干扰RNA(siRNA)，从而调节单个RNA转录物中ALK2 mRNA和IGF-1的表达。
例如，本文提供了调节细胞中两种或更多种基因表达的方法，包括将包含编码或包含第一RNA序列、第二RNA序列和接头RNA序列的重组多核酸或RNA构建体的组合物引入细胞中，其中接头RNA序列连接第一RNA序列和第二RNA序列，其中第一RNA序列编码IGF-1，并且其中第二RNA序列编码能够结合Turbo GFP mRNA的小干扰RNA(siRNA)，从而调节来自单个RNA转录物的Turbo GFP mRNA和IGF-1的表达。
例如，本文提供了调节细胞中两种或更多种基因表达的方法，包括将包含编码或包含第一RNA序列、第二RNA序列和接头RNA序列的重组多核酸或RNA构建体的组合物引入细胞中，其中接头RNA序列连接第一RNA序列和第二RNA序列，其中第一RNA序列编码IL-2，并且其中第二RNA序列编码能够结合VEGFA mRNA的小干扰RNA(siRNA)，从而调节单个RNA转录物中VEGFA mRNA和IL-2的表达。
例如，本文提供了调节细胞中两种或更多种基因表达的方法，包括将包含编码或包含第一RNA序列、第二RNA序列和接头RNA序列的重组多核酸或RNA构建体的组合物引入细胞中，其中接头RNA序列连接第一RNA序列和第二RNA序列，其中第一RNA序列编码IL-12，并且其中第二RNA序列编码能够结合c-Myc、KRAS、Akt1、Akt2和/或Akt3 mRNA的小干扰RNA(siRNA)。从而调节单个RNA转录物中VEGFA mRNA和IL-12的表达。在一些实施方案中，第二RNA序列可以编码一种或多种小干扰RNA(siRNA)，每种能够结合c-Myc、KRAS、Akt1、Akt2和/或Akt3 mRNA，从而调节来自单个RNA转录物的VEGFA mRNA和IL-12的表达。在一些实施方案中，第二RNA序列可编码一种或多种小干扰RNA(siRNA)，其中所述一种或多种siRNA中的每一种可结合选自c-Myc、KRAS、Akt1、Akt2和Akt3 mRNA的一种mRNA。在一些实施方案中，第二RNA序列可编码一种或多种小干扰RNA(siRNA)，其中所述一种或多种siRNA中的每一种可结合选自以下的一种mRNA：c-Myc、KRAS、pan-Akt(即，结合Akt1、Akt2和Akt3)mRNA。
本文提供了调节细胞中两种或更多种基因表达的方法，包括将包含重组多核酸或RNA构建体的组合物引入细胞中，所述重组多核酸或RNA构建体包含第一RNA序列、第二RNA序列和接头RNA序列，其中所述接头RNA序列连接第一RNA序列和第二RNA序列，其中第一RNA编码IL-4，并且其中第二RNA编码能够结合TNF-αmRNA的小干扰RNA(siRNA)；其中，IL-4和TNF-α的表达同时受到调节，即同时上调IL-4的表达和下调TNF-α的表达。在相关方面，重组多核酸或RNA构建体可以编码或包含至少1、2、3、4、5、6或更多个siRNA。在相关方面，重组多核酸或RNA构建体可以编码或包含3个siRNA，每个siRNA针对TNF-αmRNA的相同区域。在相关方面，重组多核酸或RNA构建体可以编码或包含3个siRNA，每个siRNA针对TNF-αmRNA的不同区域。在相关方面，所述至少3种siRNA中的每一种可以针对相同的、不同的或其组合。在相关方面，重组RNA构建体可包含具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:76或SEQ IDNO:77(Cpd.1或Cpd.2)的序列。在相关方面，重组多核酸构建体可包含具有SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11(Cpd.1或Cpd.2)的序列。
本文还提供了调节细胞中两种或更多种基因表达的方法，包括将包含重组多核酸或RNA构建体的组合物引入细胞中，所述重组多核酸或RNA构建体包含第一RNA序列、第二RNA序列和接头RNA序列，其中所述接头RNA序列连接第一RNA序列和第二RNA序列，其中第一RNA编码IGF-1，并且其中第二RNA编码能够结合ALK2 mRNA的小干扰RNA(siRNA)；其中IGF-1和ALK2的表达同时受到调节，即同时上调IGF-1的表达和下调ALK2的表达。在相关方面，重组多核酸或RNA构建体可以编码或包含至少1、2、3、4、5、6或更多个siRNA。在相关方面，重组多核酸或RNA构建体可以编码或包含3个siRNA，每个siRNA针对ALK2 mRNA的相同区域。在相关方面，重组多核酸或RNA构建体可以编码或包含3个siRNA，每个siRNA针对ALK2mRNA的不同区域。在相关方面，所述至少3种siRNA中的每一种可以针对相同的、不同的或其组合。在相关方面，重组RNA构建体可包含具有SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:78或SEQ IDNO:79(Cpd.3或Cpd.4)的序列。在相关方面，重组多核酸构建体可包含具有SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13(Cpd.3或Cpd.4)的序列。
本文还提供了调节细胞中两种或更多种基因的表达的方法，包括将包含重组多核酸或RNA构建体的组合物引入细胞中，所述重组多核酸或RNA构建体包含第一RNA序列、第二RNA序列和接头RNA序列，其中所述接头RNA序列连接第一RNA序列和第二RNA序列，其中第一RNA编码IGF-1，并且其中第二RNA编码能够结合Turbo GFP mRNA的小干扰RNA(siRNA)；其中，IGF-1和Turbo GFP的表达同时受到调节，即同时上调IGF-1的表达和下调Turbo GFP的表达。在相关方面，重组多核酸或RNA构建体可以编码或包含至少1、2、3、4、5、6或更多个siRNA。在相关方面，重组多核酸或RNA构建体可以编码或包含3个siRNA，每个siRNA针对Turbo GFP mRNA的相同区域。在相关方面，重组多核酸或RNA构建体可以编码或包含3个siRNA，每个siRNA针对Turbo GFP mRNA的不同区域。在相关方面，所述至少3种siRNA中的每一种可以针对相同的、不同的或其组合。在相关方面，重组RNA构建体可包含选自以下组成的组的序列：SEQ ID NO：5-9和80-84(Cpd.5-Cpd.9)。在相关方面，重组多核酸构建体可包含选自以下组成的组的序列：SEQ ID NO：14-18(Cpd.5-Cpd.9)。
本文还提供了调节细胞中两种或更多种基因表达的方法，包括将包含重组多核酸或RNA构建体的组合物引入细胞中，所述重组多核酸或RNA构建体包含第一RNA序列、第二RNA序列和接头RNA序列，其中所述接头RNA序列连接第一RNA序列和第二RNA序列，其中第一RNA编码IL-2，并且其中第二RNA编码能够结合VEGFA mRNA的小干扰RNA(siRNA)；其中，IL-2和VEGFA的表达同时受到调节，即同时上调IL-2的表达和下调VEGFA的表达。在相关方面，重组多核酸或RNA构建体可以编码或包含至少1、2、3、4、5、6或更多个siRNA。在相关方面，重组多核酸或RNA构建体可以编码或包含3个siRNA，每个siRNA针对VEGFA mRNA的相同区域。在相关方面，重组多核酸或RNA构建体可以编码或包含3个siRNA，每个siRNA针对VEGFA mRNA的不同区域。在相关方面，所述至少3种siRNA中的每一种可以针对相同的、不同的或其组合。在相关方面，重组RNA构建体可包含具有SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID N0:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105或SEQ ID NO:106(Cpd.10、Cpd.11、Cpd.12、Cpd.13、Cpd.14或Cpd.15)的序列。在相关方面，重组多核酸构建体可包含具有SEQ ID NO:93、SEQID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97或SEQ ID NO:98。(Cpd.10、Cpd.11、Cpd.12、Cpd.13、Cpd.14或Cpd.15)的序列。
本文还提供了调节细胞中两种或更多种基因的表达的方法，包括将包含重组多核酸或RNA构建体的组合物引入细胞中，所述重组多核酸或RNA构建体包含第一RNA序列、第二RNA序列和接头RNA序列，其中所述接头RNA序列连接第一RNA序列和第二RNA序列，其中第一RNA编码IL-12，并且其中第二RNA编码能够结合c-Myc、KRAS、Aktl、Akt2和/或Akt3 mRNA的小干扰RNA(siRNA)；其中IL-12和c-Myc、KRAS、Aktl、Akt2和/或Akt3的表达同时受到调节，即同时上调IL-12的表达和下调c-Myc、KRAS、Aktl、Akt2和/或Akt3的表达。在一些实施方案中，同时上调IL-12的表达和下调c-Myc、KRAS、Akt1、Akt2和Akt3的表达。在相关方面，重组多核酸或RNA构建体可以编码或包含至少1、2、3、4、5、6或更多个siRNA。在相关方面，重组多核酸或RNA构建体可以编码或包含3个siRNA，每个siRNA针对c-Myc、KRAS、Akt1、Akt2和/或Akt3 mRNA的相同区域。在相关方面，重组多核酸或RNA构建体可以编码或包含3个siRNA，每个siRNA针对c-Myc、KRAS、Akt1、Akt2和/或Akt3mRNA的不同区域。在相关方面，所述至少3种siRNA中的每一种可以针对相同的、不同的或其组合。在相关方面，重组多核酸或RNA构建体可以编码或包含至少3个siRNA，每个siRNA针对选自c-Myc、KRAS、Akt1、Akt2和Akt3 mRNA的一种mRNA。在相关方面，重组多核酸或RNA构建体可以编码或包含至少3个siRNA，每个siRNA针对选自c-Myc、KRAS、pan-Akt(即，结合Akt1、Akt2和Akt3)mRNA的一种mRNA。在相关方面，重组RNA构建体可包含具有SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:107或SEQ ID NO:108(Cpd.16或Cpd.17)的序列。在相关方面，重组多核酸构建体可包含具有SEQ ID NO:100或SEQ ID NO:101(Cpd.16或Cpd.17)的序列。
本文提供了上调和下调细胞中两种或更多种基因表达的方法，包括将包含编码或包含第一RNA序列、第二RNA序列和接头RNA序列的重组多核酸或RNA构建体的组合物引入细胞中，其中接头RNA序列连接第一RNA序列和第二RNA序列，其中第一RNA编码目的基因(例如，IL-4、IL-2、IL-12或IGF-1)，并且其中第二RNA编码能够结合靶mRNA(例如TNF-α、ALK2、Turbo GFP、VEGFA、c-Myc、KRAS、Akt1、Akt2或Akt3)的小干扰RNA(siRNA)；其中靶mRNA与目的基因编码的mRNA不同，并且其中靶mRNA的表达被下调并且目的基因的表达同时被上调。在一些实施方案中，靶mRNA的表达被能够结合靶mRNA的siRNA下调。在一些实施方案中，通过表达目的基因编码的mRNA或蛋白质来上调目的基因的表达。
说明性实施方案
在一些方面，本文提供了包含重组RNA构建体的组合物，所述重组RNA构建体包含第一RNA序列、第二RNA序列和接头RNA序列，其中：(i)第一RNA序列是第一小干扰RNA(siRNA)顺序；(ii)第二RNA序列是第二siRNA序列或编码目的基因(GOI)的第一信使RNA(mRNA)序列；和(iii)连接第一RNA序列和第二RNA序列的接头RNA序列，其中接头RNA序列具有选自下组成的组的结构：式(I)：XmCAACAAXn，其中X是任何核苷酸，m为1至12的整数，n为0至4的整数；式(II)：XpTCCCXr，其中X是任意核苷酸，p是0至17的整数，r是0至13的整数。
在一些方面，本文提供了包含重组RNA构建体的组合物，所述重组RNA构建体包含第一RNA序列、第二RNA序列和接头RNA序列，其中：(i)第一RNA序列是第一小干扰RNA(siRNA)顺序；(ii)第二RNA序列是第二siRNA序列或编码目的基因(GOI)的第一信使RNA(mRNA)序列；和(iii)连接第一RNA序列和第二RNA序列的接头RNA序列，其中接头RNA序列包含ACAACAA或由ACAACAA组成。
在一些方面，本文提供了包含重组RNA构建体的组合物，所述重组RNA构建体包含第一RNA序列、第二RNA序列和接头RNA序列，其中：(i)第一RNA序列是第一小干扰(siRNA)序列；(ii)第二RNA序列是第二siRNA序列或编码目的基因(GOI)的第一信使(mRNA)序列；和(iii)连接第一RNA序列和第二RNA序列的接头RNA序列，其中(a)接头RNA序列不是或/>或(b)接头RNA序列不形成根据RNAfold WebServer的二级结构。
在一些实施方案中，第二RNA序列是第二siRNA序列。在一些实施方案中，接头RNA序列包含ACAACAA、或/>或由其组成。在一些实施方案中，重组RNA构建体还包含编码GOI的第一mRNA序列。在一些实施方案中，第二RNA序列是编码GOI的第一mRNA序列。
在一些实施方案中，接头RNA序列包含ACAACAA、 或由其组成。
在一些实施方案中，重组RNA构建体还包含编码GOI的第二mRNA序列。在一些实施方案中，重组RNA构建体还包含第二siRNA序列。在一些实施方案中，重组RNA构建体包含第三siRNA序列。在一些实施方案中，重组RNA构建体还包含四个、五个或更多个siRNA序列。在一些实施方案中，每个siRNA序列结合靶RNA并调节靶RNA的表达。
在一些实施方案中，每个siRNA序列能够结合：(a)不同的靶RNA；(b)同一靶RNA的不同区域；(c)相同靶RNA的相同区域；或(d)其任何组合。在一些实施方案中，(c)的siRNA序列是相同的。在一些实施方案中，重组RNA构建体包含三个、四个、五个或更多个mRNA序列，每个序列编码GOI。在一些实施方案中，每个mRNA序列编码相同的GOI。在一些实施方案中，每个mRNA序列编码不同的GOI。
在一些实施方案中，siRNA序列之间的接头RNA序列的长度为约4至约27个核苷酸。在一些实施方案中，siRNA序列之间的接头RNA序列的长度为约4至约18个核苷酸。在一些实施方案中，m是1并且n是0。在一些实施方案中，siRNA序列之间的接头RNA序列是ACAACAATCCC。在一些实施方案中，接头RNA序列是ACAACAA。在一些实施方案中，接头RNA序列包含选自SEQ ID NO:23和67-75组成的组的序列。在一些实施方案中，接头RNA序列包含根据SEQ ID NO:23的序列或由其组成。在一些实施方案中，接头RNA序列包含根据SEQ IDNO:67的序列或由其组成。在一些实施方案中，接头RNA序列包含根据SEQ ID NO:68的序列或由其组成。在一些实施方案中，接头RNA序列包含根据SEQ ID NO:69的序列或由其组成。在一些实施方案中，接头RNA序列包含根据SEQ ID NO：70的序列或由其组成。
在一些实施方案中，与以下相比：(i)使用包含根据SEQ ID NO：68的接头RNA序列的重组RNA构建体的siRNA靶向的靶RNA的表达，(ii)使用包含根据SEQ ID NO：69的接头RNA序列的重组RNA构建体的siRNA靶向的靶RNA的表达，(iii)使用包含根据SEQ ID NO：70的接头RNA序列的重组RNA构建体的siRNA靶向的靶RNA的表达，和/或(iv)使用包含根据SEQ IDNO：23的接头RNA序列的重组RNA构建体的siRNA靶向的靶RNA的表达，使用包含根据SEQ IDNO：67的接头RNA序列的重组RNA构建体的siRNA靶向的靶RNA的表达更低。
在一些实施方案中，与以下相比：(i)使用包含根据SEQ ID NO：67的接头RNA序列的重组RNA构建体的编码GOI的第一mRNA序列的表达，(ii)使用包含根据SEQ ID NO：68的接头RNA序列的重组RNA构建体的编码GOI的第一mRNA序列的表达，(iii)使用包含根据SEQ IDNO：69的接头RNA序列的重组RNA构建体的编码GOI的第一mRNA序列的表达，和/或(iv)使用包含根据SEQ ID NO：23的接头RNA序列的重组RNA构建体的编码GOI的第一mRNA序列的表达，使用包含根据SEQ ID NO：70的接头RNA序列的重组RNA构建体的编码GOI的第一mRNA序列的表达更高。
在一些实施方案中，与以下相比：(i)使用包含根据SEQ ID NO：68的接头RNA序列的重组RNA构建体的siRNA靶向的靶RNA的表达，(ii)使用包含根据SEQ ID NO：69的接头RNA序列的重组RNA构建体的siRNA靶向的靶RNA的表达，和/或(iii)使用包含根据SEQ ID NO：70的接头RNA序列的重组RNA构建体的siRNA靶向的靶RNA的表达，使用包含根据SEQ ID NO：23的接头RNA序列的重组RNA构建体的siRNA靶向的靶RNA的表达更低。
在一些实施方案中，与以下相比：(i)使用包含根据SEQ ID NO：69的接头RNA序列的重组RNA构建体的siRNA靶向的靶RNA的表达，和/或(ii)使用包含根据SEQ ID NO：70的接头RNA序列的重组RNA构建体的siRNA靶向的靶RNA的表达，使用包含根据SEQ ID NO：23的接头RNA序列的重组RNA构建体的siRNA靶向的靶RNA的表达更低。
在一些实施方案中，与以下相比：(i)使用包含根据SEQ ID NO：67的接头RNA序列的重组RNA构建体的编码GOI的第一mRNA序列的表达，(ii)使用包含根据SEQ ID NO：68的接头RNA序列的重组RNA构建体的编码GOI的第一mRNA序列的表达，和/或(iii)使用包含根据SEQ ID NO：69的接头RNA序列的重组RNA构建体的编码GOI的第一mRNA序列的表达，使用包含根据SEQ ID NO：23的接头RNA序列的重组RNA构建体的编码GOI的第一mRNA序列的表达更高。
在一些实施方案中，基于编码GOI的第一mRNA序列的所需表达水平和/或siRNA靶向的靶RNA的所需表达水平或siRNA靶向的靶RNA编码的蛋白质的所需表达水平选择接头RNA序列。
在一些实施方案中，GOI的表达受到调节。在一些实施方案中，通过表达由GOI编码的蛋白质来上调GOI的表达。在一些实施方案中，靶RNA的表达受到调节。在一些实施方案中，能够结合靶RNA的siRNA序列下调靶RNA的表达。在一些实施方案中，能够结合靶RNA的siRNA序列不抑制GOI的表达。
在一些实施方案中，siRNA序列之间的RNA接头序列不形成根据RNAfoldWebServer的二级结构。在一些实施方案中，siRNA序列形成根据RNAfold WebServer的二级结构。在一些实施方案中，siRNA序列包含发夹结构或环结构。在一些实施方案中，siRNA序列包含一种或多种短或小发夹RNA(shRNA)。
在一些实施方案中，重组RNA构建体被切割。在一些实施方案中，重组RNA构建体被细胞内蛋白质切割。在一些实施方案中，重组RNA构建体被内源蛋白质切割。在一些实施方案中，重组RNA构建体被内源DICER切割。
在一些实施方案中，与不包含具有选自式(I)和式(II)的结构的接头的RNA构建体的切割相比，重组RNA构建体的切割得到增强。在一些实施方案中，与不包含具有ACAACAA的序列的接头的RNA构建体的切割相比，重组RNA构建体的切割得到增强。在一些实施方案中，与包含形成二级结构的接头的RNA构建体的切割相比，重组RNA构建体的切割得到增强。
在一些实施方案中，与来自不包含具有选自式(I)和式(II)的结构的接头的RNA构建体的目的基因的表达相比，目的基因的表达得到增强。在一些实施方案中，与来自不包含具有ACAACAA的序列的接头的RNA构建体的目的基因的表达相比，目的基因的表达得到增强。
在一些实施方案中，GOI包含白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素12(IL-12)、或胰岛素样生长因子1(IGF1)。在一些实施方案中，靶RNA是非编码RNA。在一些实施方案中，靶RNA是信使RNA(mRNA)。在一些实施方案中，靶RNA是编码选自以下组成的组的蛋白质的mRNA：肿瘤坏死因子α(TNF-α)、激活素受体样激酶2(ALK2)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、细胞性骨髓细胞瘤病(c-Myc)、Kirsten大鼠肉瘤(KRAS)、蛋白激酶B-1(Akt1)、Akt2和Akt3。
在一些实施方案中，能够结合靶RNA的siRNA序列结合靶RNA的外显子。在一些实施方案中，能够结合靶RNA的siRNA序列特异性结合一种靶RNA。在一些实施方案中，能够结合靶RNA的siRNA序列不由目的基因的内含子序列编码或组成。在一些实施方案中，GOI在没有RNA剪接的情况下表达。
在一些实施方案中，第一RNA序列存在于第二RNA序列的下游或3'侧。在一些实施方案中，RNA构建体包含第二RNA序列下游或3'侧的内部核糖体进入位点(IRES)。在一些实施方案中，RNA构建体包含紧邻第一RNA序列上游或5'侧的内部核糖体进入位点(IRES)。在一些实施方案中，第一RNA序列存在于第二RNA序列的上游或5'。在一些实施方案中，RNA构建体包含位于第一RNA序列上游或5'侧的内部核糖体进入位点(IRES)。
在一些实施方案中，RNA构建体还包含聚腺苷酸尾、5'帽或Kozak序列。在一些实施方案中，第一RNA序列和第二RNA序列都是重组的。在一些实施方案中，siRNA包含选自SEQID NO：50-57和127-132组成的组的有义链序列。
在一些方面，本文提供了用于调节细胞中两种或更多种基因的表达的组合物。在一些方面，本文提供了药物组合物，其包含治疗有效量的本文所述的任意一种组合物和药学上可接受的赋形剂。在一些方面，本文提供了包含本文所述的任何一种组合物的细胞。在一些方面，本文提供了包含编码本文所述的任何一种组合物的重组多核酸构建体的载体。
在一些方面，本文提供了从细胞中的单个RNA转录物产生siRNA和mRNA的方法，包括将本文所述的任何一种组合物或本文所述的载体引入细胞中。在一些方面，本文提供了调节蛋白质表达的方法，其包括将本文所述的任何一种组合物或本文所述的任何一种载体引入细胞中，其中由靶RNA编码的蛋白质的表达降低。在一些方面，本文提供了调节蛋白质表达的方法，其包括将本文所述的任何一种组合物或本文所述的任何一种载体引入细胞中，其中由目的基因(GOI)编码的蛋白质的表达增加了。在一些方面，本文提供了调节蛋白质表达的方法，其包括将本文所述的任何一种组合物或本文所述的任何一种载体引入细胞中，其中由靶RNA编码的蛋白质的表达降低，并且其中由目的基因(GOI)编码的蛋白质的表达增加。
在一些方面，本文提供了治疗疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用本文所述的任何一种组合物或本文所述的任何一种药物组合物。
在一些实施方案中，疾病或病症包括皮肤疾病或病症或肌肉疾病或病症。在一些实施方案中，皮肤疾病或病症包括炎性皮肤病。在一些实施方案中，炎性皮肤病包括牛皮癣。在一些实施方案中，肌肉疾病或病症包括骨骼肌病症。在一些实施方案中，骨骼肌病症包括进行性骨化性纤维发育不良(FOP)。在一些实施方案中，疾病或病症包括癌症。在一些实施方案中，癌症包括胶质母细胞瘤、人舌鳞状细胞癌、人肺癌或人单核细胞白血病。在一些实施方案中，受试者是人类。
在一些方面，本文提供了包含重组RNA构建体的组合物，所述重组RNA构建体包含第一RNA序列、第一接头RNA序列、第二RNA序列和第二接头RNA序列，其中：(i)第一RNA序列是编码白细胞介素4(IL-4)的信使RNA(mRNA)；(ii)第二RNA序列包含两个或更多个能够结合肿瘤坏死因子α(TNF-α)mRNA的小干扰RNA(siRNA)；(iii)第一接头RNA序列存在于第一RNA序列和第二RNA序列之间；和(iv)第二接头RNA序列连接两个或更多个siRNA中的每一个并且包含根据SEQ ID NO:23的序列。
在一些方面，本文提供了包含重组RNA构建体的组合物，所述重组RNA构建体包含第一RNA序列、第一接头RNA序列、第二RNA序列和第二接头RNA序列，其中：(i)第一RNA序列是编码胰岛素样生长因子1(IGF1)的信使RNA(mRNA)；(ii)第二RNA序列包含两个或更多个能够结合激活素受体样激酶2(ALK2)mRNA的小干扰RNA(siRNA)；(iii)第一接头RNA序列存在于第一RNA序列和第二RNA序列之间；和(iv)第二接头RNA序列连接两个或更多个siRNA中的每一个并且包含根据SEQ ID NO:23的序列。
在一些方面，本文提供了包含重组RNA构建体的组合物，所述重组RNA构建体包含第一RNA序列、第一接头RNA序列、第二RNA序列和第二接头RNA序列，其中：(i)第一RNA序列是编码白细胞介素2(IL-2)的信使RNA(mRNA)；(ii)第二RNA序列包含两个或更多个能够结合血管内皮生长因子A(VEGFA)mRNA的小干扰RNA(siRNA)；(iii)第一接头RNA序列存在于第一RNA序列和第二RNA序列之间；和(iv)第二接头RNA序列连接两个或更多个siRNA中的每一个并且包含选自SEQ ID NO:23和67-70组成的组的序列。
在一些方面，本文提供了包含重组RNA构建体的组合物，所述重组RNA构建体包含第一RNA序列、第一接头RNA序列、第二RNA序列和第二接头RNA序列，其中：(i)第一RNA序列是编码白细胞介素12(IL-12)的信使RNA(mRNA)；(ii)第二RNA序列包含两个或更多个能够结合细胞性骨髓细胞瘤病(c-Myc)、Kirsten大鼠肉瘤(KRAS)、蛋白激酶B-1(Akt1)、Akt2和/或Akt3的mRNA的小干扰RNA(siRNA)；(iii)第一接头RNA序列存在于第一RNA序列和第二RNA序列之间；和(iv)第二接头RNA序列连接两个或更多个siRNA中的每一个并且包含根据SEQID NO:23的序列。
在一些方面，本文提供了包含重组多核酸构建体的组合物，所述重组多核酸构建体包含选自SEQ ID NO：1-18和76-108组成的组的核酸序列。
实施例
提供这些实施例仅用于说明目的，而不是限制本文所提供的权利要求的范围。
实施例1：结构设计、序列和合成
构建体设计
设计构建体以从体外转录产生的单一转录物同时表达siRNA和目的基因(表1；SEQID NO：1-9和76-84)。IL-4和IGF-1编码序列源自智人并且对于IL-4(hIL4:NP_000580.1；SEQ ID NO:26和27)在所得氨基酸序列中没有引入变化。为了增加mRNA诱导的IGF-1(NP_000609.1)从转染细胞中的分泌，在mRNA构建体中，用BDNF(NP_733931.1；SEQ ID NO:30和31)信号肽(BDNF-pro-IGF-1)交换内源IGF-1前结构域(信号肽；SEQ ID NO：28和29)。并且，构建体含有编码成熟人IGF-1的完整编码序列的序列，所述成熟人IGF-1具有70个氨基酸(SEQ ID NO：30和31)。构建体中未添加C端E结构域。TNF-α(NM_000594.3；SEQ ID NO：32)和ALK2(NM_001105.4；SEQ ID NO：33)的siRNA靶序列源自智人并且没有对序列引入变化。Turbo GFP序列源自海洋桡足类Pontellina plumate(SEQ ID NO:34)。
多核酸构建体可以包含Kozak序列(5'GCCACC3'；SEQ ID NO：19)。另外，多核酸构建体可包含目的基因序列上游的T7启动子序列(5'TAATACGACTCACTATA 3'；SEQ ID NO:20)，用于RNA聚合酶结合和单个转录物中的目的基因和siRNA的成功体外转录。可以使用替代的启动子，例如SP6、T3、P60、Syn5和KP34。使用设计成在T7启动子、目的基因和siRNA序列侧翼的引物，通过PCR产生转录模板以产生mRNA。反向引物包含一段胸苷(T)碱基(120)，以将120bp长度的聚腺苷酸尾添加到mRNA中。一些多核苷酸或RNA构建体被工程化以包括Cheng,et al.(2018)J.Mater.Chem.B.,6,4638-4644中描述的siRNA设计，并且还包括siRNA序列上游的一个或多个目的基因，其中接头连接不同的RNA片段(目的基因mRNA与siRNA(SEQ ID NO：21)，或siRNA与siRNA(SEQ ID NO：22))，下文中称为A1接头。在一些构建体中，新的接头序列被设计来连接不同的RNA片段(例如，连接编码目的基因的mRNA和siRNA以及连接siRNA和siRNA)，下文称为A2接头(SEQ ID NO:23)。重组构建体可以编码或包含多于一种靶向相同或不同靶mRNA的siRNA序列。同样，构建体可以包含两个或更多个目的基因的核酸序列。
构建体合成
表1所示的构建体(化合物ID号Cpd.1-Cpd.17)由德国GeneArt(赛默飞世尔科技)在pMA-RQ质粒骨架载体中合成，或由中国GeneWiz在pUC-GW-Kan骨架载体中合成，其在开放阅读框中包含使用GeneOptimizer算法进行密码子优化的T7 RNA聚合酶启动子。表1显示了，对于每种化合物(Cpd.)，通过siRNA与相应mRNA(siRNA靶标)结合而下调的蛋白质、化合物中的siRNA位置、化合物中siRNA的数量、目的基因和各自的适应症。每个构建体的序列显示在表2和表6中，并且注释如下表所示(SEQ ID NO：1-9、85-92、76-84和85-92)。每个构建体的质粒骨架序列显示在表3中并且化合物序列以粗体和下划线显示(SEQ ID NO：10-18；93-100)。
表1.化合物总结
TNF-α：肿瘤坏死因子-α、IL-4：白细胞介素4、ALK2：激活素受体样激酶2、FOP：进行性骨化性纤维发育不良、IGF-1：胰岛素样生长因子-1、Turbo GFP：涡轮绿荧光蛋白质(源自桡足类Pontellina plumate)，NA：不适用。VEGFA：血管内皮生长因子A，c-Myc：细胞性骨髓细胞增多症，KRAS：Kirsten大鼠肉瘤，Akt：蛋白激酶B，pan-Akt：Akt1、Akt2和Akt3。
表2.化合物序列
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加粗＝有义siRNA链
加粗且斜体＝siRNA反义链
下划线＝信号肽
斜体＝Kozak序列
表3.化合物的质粒载体序列
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加粗且下划线＝化合物序列
实施例2：RNA构建体的体外转录和数据分析
使用编码Cpd.1-Cpd.17的pMA-RQ/pUC-GW-Kan载体进行基于PCR的体外转录，以产生RNA构建体。使用表4中的正向和反向引物(SEQ ID NO：24和25)通过PCR产生转录模板。在模板中编码聚腺苷酸尾，产生120bp聚腺苷酸尾。考虑到siRNA侧翼区域的重复序列，根据需要进行优化以实现特异性扩增。优化包括：1)减少载体的质粒DNA的量，2)改变DNA聚合酶(Q5热启动聚合酶，New England Biolabs)，3)对于每个PCR循环减少变性时间(30秒至10秒)和延伸时间(45秒/kb至10秒/kb)，4)对于每个PCR循环增加退火(10秒至30秒)，和5)对于每个PCR循环增加最终延伸时间(最多15分钟)。此外，为了避免非特异性引物结合，在冰上制备含有解冻试剂的PCR反应混合物，PCR循环次数减少到25次。
对于体外转录，在37℃使用T7 RNA聚合酶(MEGAscript试剂盒，赛默飞世尔科技)2小时。合成的RNA用100％ N1-甲基假-UTP化学修饰，并在5'末端用抗-反向CAP类似物(ARCA；[m2 7，3'-OG(5')ppp(5')G])共转录加帽(Jena生物科学)。为了产生未修饰的RNA以测量免疫原性，使用规范dUTP代替N1-甲基假-UTP。体外转录后，RNA构建体用MEGAclear试剂盒(赛默飞世尔科技)柱纯化，并用Nanophotometer-N60(Implen)定量。
表4.用于模板产生的引物
使用体外转录，将Cpd.1-Cpd.17生成为RNA构建体(200-500μg)并在下文指定的各种体外模型中测试IL-4、IGF1、IL-2和IL-12表达及IL-4、IGF1、IL-2和IL-12过表达与TNF-α、ALK2、Turbo-GFP、VEGFA、c-Myc、KRAS、Akt1、Akt2和Akt3下调同步的组合效应。
如下进行构建体分子量的测定。通过测定每个序列中存在的每个碱基(A、C、G、T或N1-UTP)的总数，并将该数乘以相应的分子量(例如A:347.2g/mol；C:323.2g/mol；G:363.2g/mol；N1-UTP:338.2g/mol)，由每个序列测定每种构建体的分子量。通过每种碱基获得的所有重量之和确定分子量，ARCA分子量为817.4g/mol。每种构建体的分子量用于计算每个孔中用于转染的RNA的量至纳摩尔(nM)浓度。
使用GraphPad Prism 8(圣地亚哥，美国)分析数据。为了估计蛋白质水平，使用ELISA检测标准品或样品，从标准品或样品的平均吸光度中减去空白的平均吸光度值。根据制造商的方案，使用四参数非线性回归产生标准曲线并绘制。为了测定每个样品中的蛋白质浓度，从标准曲线内插不同蛋白质的浓度。通过乘以稀释因子计算样品的最终蛋白质浓度。统计学分析是通过使用Student's t检验或单向ANOVA，然后使用Dunnet's多重比较检验来进行的。
实施例3：THP-1细胞的体外转染和THP-1细胞中内源TNF-α表达模型
THP-1细胞的体外转染
人单核细胞白血病细胞系THP-1(西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich))，目录号88081201)维持在生长培养基(添加10％ FBS和2mM谷氨酰胺的RPMI 1640)中。转染前72小时，将细胞以30,000THP-1细胞/孔接种在96孔细胞培养板中，并用50nM在生长培养基中稀释的佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)(西格玛奥德里奇，目录号P8139)活化。使用Lipofectamine 2000(赛默飞世尔科技)用特异性RNA构建体(600ng/孔)和乱序siRNA(600ng/孔；西格玛，目录号SIC002)转染细胞。从每个孔中取出100μl DMEM，并用50μlOpti-MEM(赛默飞世尔科技)和50μl RNA和Lipofectamine 2000在Opti-MEM中的复合物代替。5小时后，用添加了50nM PMA的新鲜生长培养基替换培养基，并在37℃下，在含5％ CO2的潮湿气氛中培养平板24小时。
THP-1细胞中内源TNF-α表达模型
为了在THP-1细胞中内源分泌TNF-α，用终浓度为10μg/mL的大肠杆菌衍生的脂多糖(LPS-L4391；西格玛奥德里奇)和终浓度为1μg/mL的R848(TLR7/8激动剂；Invivogen)刺激THP-1细胞，并培养90分钟。诱导产生的TNF-α对应于在银屑病中观察到的生理状况。刺激后，取出50μl培养基，用含有在Opti-MEM中与Lipofectamine 2000复合的特异性RNA构建体(Cpd.1和Cpd.2)的转染复合物替换，并在37℃下在含有5％ CO2的潮湿气氛中培养24小时。转染后，收集细胞培养上清液，通过ELISA定量TNF-α(下调靶基因)和IL-4(过表达目的基因)。未转染但经刺激的样品中的TNF-α水平用作对照，并设定为100％，计算TNF-α的敲低百分率。
结果
在用10μg/mL LPS和1μg/mL R848刺激以诱导内源TNF-α分泌的THP-1细胞中，评估Cpd.1(包含3x siRNA，其靶向3'TNF-α和具有A1接头的IL-4编码序列)和Cpd.2(包含3xsiRNA，其靶向3'TNF-α和具有A2接头的IL-4编码序列)下调TNF-α的效果。建立的THP-1模型模拟银屑病的生理免疫状况。如图2A所示，Cpd.1和Cpd.2下调THP-1细胞中内源TNF-α的表达(＞80％)(P＜0.001)。测定相同细胞培养上清的IL-4表达，确认IL-4表达没有受到损害(图2B)。注意到Cpd.2表达的IL-4水平比Cpd.1表达的IL-4水平高2.5倍，如图2B所示(P＜0.01)。
实施例4：HEK-293细胞体外转染和HEK-293细胞中的TNF-α过表达模型
HEK-293细胞的体外转染
人胚肾细胞293(HEK-293；ATCC CRL-1573)维持在补充了10％(v/v)胎牛血清(FBS)和青霉素-链霉素-两性霉B混合物(882087，Biozym Scientific)的Dulbecco氏改良Eagle氏培养基(DMEM，柏楉(Biochrom))中。在转染前，将细胞以20,000个细胞/孔接种在96孔培养板中，并在37℃下在含有5％ CO2的潮湿气氛中培养24小时。细胞在含有10％ FBS但不含抗生素的DMEM生长培养基中生长，以在转染前达到＜60％的汇合。然后，按照制造商的说明书，用不同浓度(600-1500ng)的特异性RNA构建体(TNF-αmRNA、Cpd.1或Cpd.2)转染HEK-293细胞，其中RNA与Lipofectamine的比例为1:1w/v。取出100μl DMEM，并用50μlOpti-MEM和50μl RNA和Lipofectamine 2000在Opti-MEM(赛默飞世尔科技)中的复合物替换。5小时后，用新鲜培养基替换培养基，并将平板在37℃下在含有5％ CO2的潮湿气氛中培养24小时。
HEK-293细胞中TNF-α过表达模型
为了评价在HEK-293细胞中Cpd.1和Cpd.2的TNF-αRNA干扰(RNAi)和IL-4表达的同时作用，使用TNF-αmRNA转染(600ng/孔)建立TNF-α过表达模型。为了评价含有靶向TNF-α的siRNA的Cpd.1和Cpd.2下调TNF-α和同时表达IL-4的能力，用Cpd.1和Cpd.2(900ng/孔)和TNF-αmRNA(600ng/孔)共转染细胞。转染后，将细胞在37℃下在含有5％ CO2的潮湿气氛中培养24小时，然后通过ELISA在相同的细胞培养物上清液中定量TNF-α(下调的靶基因)和IL-4(过表达的目的基因)。将未转染样品中的TNF-α水平用作对照，并设定为100％，计算TNF-α的敲低百分率。
结果
分别检测包含靶向TNF-α的siRNA和IL-4蛋白编码序列(具有A1接头或A2接头)的Cpd.1和Cpd.2，在具有外源递送的TNF-αmRNA(600ng/孔)的HEK-293细胞(900ng/孔)中同时检测TNF-α下调和IL-4表达。如图3A所示，与未处理对照相比，Cpd.1和Cpd.2都下调TNF-α水平高达80％(P＜0.01)。此外，如图3B所示(P＜0.05)，Cpd.2的IL-4表达水平比Cpd.1的IL-4表达水平高1.6倍。
实施例5：A549细胞体外转染及A549细胞内源ALK2表达模型
A549细胞的体外转染
A549细胞是典型的来源于人肺癌的肺泡II型(ATII)细胞。由于A549细胞以中等水平表达内源性ALK2 RNA转录物(进行性骨化纤维发育不良的治疗靶标，FOP)，因此将A549细胞用于研究Cpd.3和Cpd.4在与测量IGF-1表达同步的降解ALK2 mRNA中的效果。将A549细胞(西格玛奥德里奇，布斯克，瑞士，目录号6012804)维持在补充了10％ FBS(赛默飞世尔科技，巴塞尔，瑞士；目录号10500-064)的Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基-高葡萄糖(DMEM，西格玛奥德里奇，布斯克，瑞士，目录号D0822)。为了评价Cpd.3和Cpd.4活性，在转染前24小时，将A549细胞以10,000个细胞/孔的密度接种在常规生长培养基中。此后，按照生产商的说明，使用Lipofectamine 2000(www.invitrogen.com)，用递增浓度的Cpd.3和Cpd.4(0.65、1.33、2.7、5.4和10.8nM)转染细胞。除去100μl DMEM，并向每孔加入50μl Opti-MEM(www.thermofisher.com)，随后加入50μl RNA和Lipofectamine 2000在Opti-MEM中的复合物。培养5小时后，用新鲜的生长培养基替换培养基，并将平板在37℃下在含有5％ CO2的潮湿气氛中培养24小时，然后通过ELISA对IGF-1进行定量，并使用靶向人ALK2 mRNA的引物(正向引物：5'-GACGTGGAGTATGGCACTATCG-3'和反向引物：5'-CACTCCAACAGTGTAATCTGGCG-3'；SEQ ID NO：35和36分别)的qPCR，使用SYBR 1-step Cell to CT试剂盒(赛默飞世尔科技，巴塞尔，瑞士；目录号A25599)对ALK2 mRNA进行相对定量。人18S rRNA用作参考对照(正向引物：5'-ACCCGTTGAACCCCATTCGTGA-3'和反向引物：5'-GCCTCACTAAACCATCCAATCGG-3'；SEQ ID NO：37和38)。
结果
剂量反应结果显示，Cpd.4中A2接头对IGF-1表达的作用显著高于A549细胞中Cpd.3中A1接头的作用(图4A；P＜0.001)。在相同的细胞培养裂解物中，通过相对定量评估Cpd.3和Cpd.4对剩余ALK-2表达的RNA干扰。如图4B所示，Cpd.3和Cpd.4同等地下调内源ALK2RNA转录物表达高达75％。
在以1.33nM/孔12次重复的A549细胞分析中，Cpd.4处理的细胞显示IGF-1表达和分泌比Cpd.3处理的细胞高1.5倍(图4D，P＜0.001)。为了证实A2接头在另一种细胞类型的IGF-1表达中的作用，如实施例4所述在HEK293细胞中进行相同的实验(1.33nM/孔，12次重复)，结果显示从用Cpd.4处理的细胞中的IGF-1表达和分泌水平比Cpd.3处理的细胞高1.8倍(图4C，P＜0.05)。
实施例6：SCC-4细胞的体外转染以及在Turbo GFP过表达模型中SCC-4细胞中IGF1分泌和Turbo GFP下调的组合效应
SCC-4细胞的体外转染
将人舌鳞癌(SCC-4；西格玛，目录号89062002CRL-1573)细胞维持在添加HAM F12(1:1)+2mM谷氨酰胺+10％胎牛血清(FBS)+0.4μg/ml氢化可的松的Dulbecco氏改良的Eagle氏高葡萄糖培养基(DMEM，西格玛奥德里奇)中。在转染前，将细胞以15,000个细胞/孔接种在96孔培养板中，并在37℃下在含有5％ CO2的潮湿气氛中培养24小时。细胞在DMEM/HAMF-12生长培养基中生长，以在转染前达到＜70％的汇合。然后，按照生产商的说明书，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)，用Turbo GFP mRNA(0.3μg)和特异性RNA构建体(Cpd.5至Cpd.9，30nM/孔)共转染SCC-4细胞，以建立Turbo GFP过表达模型，所述构建体包含IGF-1蛋白编码RNA序列和针对Turbo GFP的1x或2x siRNA。通用的乱序siRNA(西格玛，目录号SIC002)用作对照(30nM/孔)。RNA与Lipofectamine的比例为1:1w/v。取出100μl DMEM，并用50μl Opti-MEM和50μl RNA和Lipofectamine 2000在Opti-MEM(赛默飞世尔科技)中的复合物替换。5小时后，用不含FBS的新鲜生长培养基替换培养基，并将平板在37℃下在含有5％CO2的潮湿气氛中培养24小时。未转染样品中的Turbo GFP阳性细胞用作对照，并设定为0％，计算Turbo GFP敲低的百分数。
结果
在SCC-4细胞中评价接头A1(Cpd.5、Cpd.7和Cpd.8)和A2(Cpd.6和Cpd.9)对IGF-1表达的影响。数据证明，与它们的A1接头对应物相比，含A2接头的Cpd.6和Cpd.9显示IGF1水平增加1.8倍至2.2倍(图5A；P＜0.001)。就与A2接头相比A1接头降低的IGF-1水平而言，siRNA数目(1x或2x siRNA)和siRNA序列差异(Cpd7具有重复两次的相同的siRNA序列，而Cpd8具有两种不同的siRNA序列)没有显示差异。所有测试的构建体均导致完全的TurboGFP下调(98-99％；图5B)。图5C显示了对照、sc.siRNA、Cpd.5和Cpd.6的代表性显微镜图像，其中Turbo GFP表达以灰度表示。
实施例7：在A549细胞中针对IL-2表达和内源性VEGFA下调对具有不同接头的化合物(Cpd.10至Cpd.15)进行比较分析
A549细胞的体外转染
如上所述培养和转染A549细胞。生长培养基不含FBS以避免实验中FBS-衍生的VEGFA效应。使用A549细胞，因为这些细胞在体外内源性表达VEGFA，高达50-100ng/mL。为了评价不同接头(A1、A2、B-E)对VEGFA RNA干扰(RNAi)和IL-2表达的同时的影响，用递增浓度(1、3、10和30nM)Cpd.10-Cpd.15转染A549细胞。然后将细胞在37℃在含有5％ CO2的潮湿气氛中培养24小时，随后通过使用特异性ELISAs对存在于相同细胞培养上清液中的VEGFA(赛默飞世尔目录号KHG0112)和IL-2(赛默飞世尔目录号887025)进行定量。将来自未转染细胞的VEGFA水平设定为100％，并将VEGFA水平的下调相对于未转染样品(基础水平)归一化。
结果
评估了接头A1(Cpd.10)、A2(Cpd.11)、B(Cpd.12)、C(Cpd.13)、D(Cpd.14)和E(Cpd.15)对A549细胞IL-2表达的影响。数据表明，与用其它接头转染的细胞相比，用含A2接头的Cpd.11和含E接头的Cpd.15转染的细胞显示IL-2水平增加(高1.5倍至2.5倍)(图6A和6C)。为了评价接头对内源性VEGFA表达的抑制作用，在A549细胞中进行了剂量应答研究。用具有不同接头的化合物(10nM和30nM浓度)转染的细胞表现出完全的VEGFA下调(98-99％)(图6B和6C)。然而，含B接头的Cpd12在3nM浓度时显示更高的65％ VEGFA下调效力，而Cpd10(A1；50％)、Cpd11(A2；40％)、Cpd13(C；39％)、Cpd14(D；46％)和Cpd15(E；31％)显示降低的VEGFA下调效力。在1nM浓度时，与具有其它接头的化合物相比，注意到Cpd.12(含有B接头)显示改善的VEGFA下调(30％)的类似趋势。然而，在3nM浓度下，Cpd.12的IL-2表达比Cpd.11和Cpd.15的IL-2表达低约9倍(图6A)。
实施例8：SCC-4细胞中IL-2表达和内源性VEGFA下调的具有不同接头(Cpd.10至Cpd.15)的化合物的比较分析
SCC-4细胞的体外转染
如上所述培养SCC-4细胞并转染。生长培养基不含FBS以避免实验中FBS-衍生的VEGFA。使用SCC-4细胞，因为这些细胞在体外内源性表达VEGFA，高达800ng/mL。为了评价不同接头(A1、A2、B-E)对VEGFA RNA干扰(RNAi)和IL-2表达的同时的影响，用递增浓度(1、3、10和30nM)Cpd.10-Cpd.15转染SCC-4细胞。然后将细胞在37℃在含有5％ CO2的潮湿气氛中培养24小时，随后通过使用特异性ELISAs对存在于相同细胞培养上清液中的VEGFA(赛默飞世尔目录号KHG0112)和IL-2(赛默飞世尔目录号887025)进行定量。将来自未转染细胞的VEGFA水平设定为100％，并将VEGFA水平的下调相对于未转染样品(基础水平)归一化化。
结果
在SCC-4细胞中评估接头A1(Cpd.10)、A2(Cpd.11)、B(Cpd.12)、C(Cpd.13)、D(Cpd.14)和E(Cpd.15)对IL-2表达的影响。与A549细胞相似，用含A2接头的Cpd11和含E接头的Cpd15转染的细胞与用其它接头转染的细胞相比，显示出IL-2水平增加(高1.2倍至2.5倍)(图7A和7C)。在3nM浓度下，与含有A2接头的Cpd.11(14915pg/mL vs.30361pg/mL)和含有E接头的Cpd.15(14915pg/mL vs.34127pg/mL)相比，含有B接头的Cpd.12导致IL-2水平降低。在SCC-4细胞中评估内源性VEGFA表达抑制，揭示了含有B-接头的Cpd.12在10nM浓度时显示出72％的较高效力的VEGFA下调，而Cpd.10(A1；52％)、Cpd.11(A2；40％)、Cpd.13(C；47％)、Cpd.14(D；38％)和Cpd.15(E；34％)显示出较低的VEGFA下调效力。所有具有不同接头的化合物在30nM浓度时都表现出相同水平的VEGFA下调(80-90％)(图7B)。
实施例9：体外转染原代HSMM细胞和评估来自具有不同接头的化合物的IGF-1表达
HSMM细胞的体外转染
成人骨骼肌成肌细胞(HSMM，CC-2580，龙沙，瑞士)是从正常健康供体的上臂或腿部肌肉中分离的原代骨骼肌细胞。HSMM细胞是进行性骨化性纤维发育不良(FOP)疾病的疾病相关细胞类型。除了精选(curated)的细胞系外，还在原代细胞中评估了A1和A2接头对蛋白质表达的影响。HSMM细胞维持在骨骼生长培养基(SkGM)中，其含有骨骼肌-2基础培养基(SkBM，CC-3246，龙沙，瑞士)，补充有骨骼肌-2SingleQuots试剂盒(SkGM-Kit，CC-3244，龙沙，瑞士)。加入分化培养基(生长培养基+2％热激活马血清；26050-070，生命技术(LifeTechnologies)，瑞士)使原代成肌细胞分化为多核肌管，其与FOP相关。为了评价Cpd.3和Cpd.4的活性，在转染前24小时，将HSMM细胞以10,000个细胞/孔接种在96孔细胞培养板中。细胞在SkGM生长培养基(GM)或分化培养基(DM)中生长。此后，按照生产商的说明，使用Lipofectamine 2000，用递增浓度的Cpd.3和Cpd.4(0.1、0.3、1、3、10和30nM)转染细胞。除去100μl SkGM，向每个孔中加入50μl Opti-MEM(www.thermofisher.com)，随后加入50μl在Opti-MEM中的RNA和Lipofectamine 2000的复合物。培养5小时后，用新鲜的生长培养基替换培养基，并将平板在37℃和含有5％ CO2的潮湿气氛中培养24小时，然后通过ELISA在细胞培养上清液(Mediagnost，德国；目录号E20)中定量IGF-1。
结果
剂量反应结果显示，在HSMM生长培养基中培养的HSMM细胞中，Cpd4中A2接头对IGF-1表达的作用显著高于Cpd3中A1接头的作用(图8A；P＜0.001；10nM的Cmax为57ng/mLvs.23ng/mL。在分化培养基中培养的HSMM细胞中检测A2-接头超过A1-接头对分化的HSMM中IGF-1表达的作用，结果显示，在10nM浓度，用含有A2-接头的Cpd.4处理的细胞的IGF-1表达和分泌水平比用含有A1-接头的Cpd.3处理的细胞的IGF-1表达和分泌水平高2倍(图8B，P＜0.001)。
实施例10：在体外胶质母细胞瘤癌症模型A172细胞中，A1和A2接头对多种siRNA靶标的细胞因子表达和RNA干扰的时程效应
A172细胞的体外转染
人胶质母细胞瘤细胞系(A172；ECACC，目录号88062428)来源于取自53岁男性的胶质母细胞瘤。A172细胞维持在补充有10％ FBS和2mM谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中。在转染前，将细胞以20,000个细胞/孔接种在96孔培养板中，并在37℃下在含有5％ CO2的潮湿气氛中培养24小时。细胞在RPMI生长培养基中生长，以在转染前达到＜70％的汇合。然后，根据生产商说明书，按照RNA与Lipofectamine的比例为1:1w/v，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)，用浓度为10nM的Cpd16(A1接头；IL-12mRNA+1x c-Myc siRNA+1x KRASsiRNA+1x pan-Akt siRNA)和Cpd17(A2接头；IL-12mRNA+1x c-Myc siRNA+1x KRAS siRNA+1x pan-Akt siRNA)转染A172细胞。取出100μl RPMI，并用90μl Opti-MEM(赛默飞世尔科技，瑞士，目录号31985-070)和10μl Opti-MEM中的RNA和Lipofectamine 2000复合物替换。6小时后，用新鲜生长培养基替换培养基，并将平板在37℃下在含有5％ CO2的潮湿气氛中培养24小时。对于时间过程评估，如图9A所示从0-24小时收集样品。进行ELISA以定量细胞培养上清液中存在的人IL-12p70(赛默飞世尔目录号88-7126)水平。还处理各细胞裂解物，以针对未转染样品，通过RT-qPCR的相对定量，测量siRNA靶基因(c-Myc、KRAS、Akt1、Akt2和Akt3)的RNA丰度，其中RT-qPCR使用Cell-to-CTTM 1-Step Power SYBR Green试剂盒(赛默飞世尔目录号A25599)和引物(引物序列细节列于表5)。人18s rRNA用作参照对照，在GraphPad Prism v.9.2中进行单相衰变分析，以计算转染后靶基因的siRNA的半衰期。
表5.qPCR测定中使用的引物
结果
通过用10nM的Cpd.16或Cpd.17转染A172细胞，针对A172细胞中的IL-12表达和同时下调的靶基因，评价具有靶向c-Myc的1xsiRNA、靶向KRAS的1x siRNA和靶向pan-Akt(Akt1、Akt2和Akt3)的1x siRNA的包含IL-12mRNA的Cpd.16(A1接头)和Cpd.17(A2接头)的时程效应。数据证明，如图9A所示，在所有测试时间点，用Cpd.17(A2接头)转染的细胞比用Cpd.16(A1接头)转染的细胞表达更高水平的IL-12蛋白(1.4-4倍)。在相同的细胞裂解物中，还评价Cpd.16和Cpd.17对c-Myc、KRAS和pan-Akt(Akt 1、Akt2和Akt3)RNA转录物的RNA干扰。如图9C-9D所示，Cpd.16和Cpd.17在24小时时间点均下调内源性Akt-1、Akt-2、Akt-3和KRAS＞95％。单相分析表明，具有A1接头的Cpd.16比A2接头快一小时或两小时实现靶基因的RNA干扰(t1/2:1.7-2.3h vs.2.2-3.4h)，但与具有A2接头的Cpd.17相比，表达的IL-12水平降低。12小时后观察到Cpd.16和Cpd.17靶向的c-Myc的RNA干扰，持续减少内源性c-MycmRNA至最多24小时(27％vs.21％)。设计pan-Akt siRNA以靶向所有三种Akt基因(Akt1、Akt2和Akt3)是成功的，并经实验验证，证明了设计靶向具有相似序列的多个基因的特异性siRNA的可行性。
实施例11：在检测STAT4激活的HEK-BlueTMhIL-12报道基因检测中对衍生自具有A1和A2接头的化合物的IL-12进行功能分析
HEK-BlueTMhIL-12报道基因检测
在HEK-BlueTMhIL-12报道细胞(Invivogen，目录号：hkb-il12)中测试了衍生自具有A1接头的Cpd.16和衍生自具有A2接头的Cpd.17的IL-12的功能活性，所述报道细胞设计用于通过监测STAT-4途径的活化来研究人IL-12受体的活化。这些细胞来源于人胚肾HEK293细胞系，并被工程化以表达人IL-12Rβ1和IL-2Rβ2基因，以及人JAK2和STAT4基因，以实现完全功能性的IL-12信号级联。另外，引入STAT4诱导型SEAP报道基因。在IL-12活化后接着STAT4，产生的SEAP可以用HEK-BlueTM检测细胞培养基在细胞培养上清液中实时测定。HEK-BlueTMhIL-12细胞的刺激通过重组人IL-12(rhIL-12)或来源于已用Cpd.16或Cpd.17(0.3μg/孔)转染的HEK293细胞的细胞培养上清液的IL-12实现，下文详述。
HEK-BlueTMhIL-2细胞维持在补充有10％(v/v)胎牛血清(FBS)的Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM，西格玛奥德里奇)中。将抗生素HEK-BlueTMselection(用培养基1:250稀释)加入培养基中以选择含有IL-12Rβ1、IL-2Rβ2、STAT4和SEAP转基因质粒的细胞。在刺激前，将细胞以40,000个细胞/孔接种在96孔培养板中，并在37℃下在含有5％CO2的潮湿气氛中培养24小时。细胞在含有10％FBS的DMEM生长培养基中生长，以在刺激前达到＜80％的汇合。收集来自HEK293细胞培养上清液的明确浓度(0.001-300ng)的IL-12，稀释于20μl培养基中，并加入HEK-BlueTMhIL-12细胞的培养基中，以测量IL-12受体募集，随后STAT4途径激活。平行测试了rhIL-12或来源于Cpd.16和Cpd.17的IL-12(0.001-300ng)。培养2小时后，使用QUANTI-BlueTM(20μl细胞培养上清液+180μl QUANTI-BlueTM溶液)并在SpectraMaxi3多模式读板机(Molecular Device)中在620nm处读取光密度(O.D.)来评估SEAP活性。未转染的样品用作背景对照，并从测试样品中获得的O.D.值中扣除。
结果
用rhIL-12或来源于已用Cpd.16(A1接头)或Cpd.17(A2接头)转染的HEK293细胞的细胞培养上清液的IL-12刺激HEK-BlueTMhIL-12细胞是有功能的，因为所有三种测试化合物以相似的剂量依赖方式诱导SEAP产生。没有观察到对IL-12功能性的接头依赖性影响(图9B)。总之，衍生自Cpd.16和Cpd.17的IL-12是有功能的，并可诱导IL-12信号级联，类似于rhIL-2。
这里描述的实施例和实施方案仅用于说明性目的，并且本领域技术人员所建议的各种修改或改变将被包括在本申请的精神和范围内以及所附权利要求的范围内。
表6.所列序列的表格
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Claims (90)

1.一种包含重组RNA构建体的组合物，所述重组RNA构建体包含第一RNA序列、第二RNA序列和接头RNA序列，其中：
(i)第一RNA序列是第一小干扰RNA(siRNA)序列；
(ii)第二RNA序列是第二siRNA序列或编码目的基因(GOI)的第一信使RNA(mRNA)序列；和
(iii)接头RNA序列连接第一RNA序列和第二RNA序列，其中所述接头RNA序列具有选自以下组成的组的结构：
式(I)：XmCAACAAXn，
其中X是任何核苷酸，m是1至12的整数，n是0至4的整数；和
式(II)：XpTCCCXr，
其中X是任何核苷酸，p是0至17的整数，r是0至13的整数。
2.一种包含重组RNA构建体的组合物，所述重组RNA构建体包含第一RNA序列、第二RNA序列和接头RNA序列，其中：
(i)第一RNA序列是第一小干扰RNA(siRNA)序列；
(ii)第二RNA序列是第二siRNA序列或编码目的基因(GOI)的第一信使RNA(mRNA)序列；和
(iii)接头RNA序列连接第一RNA序列和第二RNA序列，其中接头RNA序列包含ACAACAA或由其组成。
3.一种包含重组RNA构建体的组合物，所述重组RNA构建体包含第一RNA序列、第二RNA序列和接头RNA序列，其中：
(i)第一RNA序列是第一小干扰(siRNA)序列；
(ii)第二RNA序列是第二siRNA序列或编码目的基因(GOI)的第一信使(mRNA)序列；和
(iii)接头RNA序列连接第一RNA序列和第二RNA序列，其中：
(a)接头RNA序列不是TTTATCTTAGAGGCATATCCCTACGTACCAACAA或ATAGTGAGTCGTATTAACGTACCAACAA；或
(b)接头RNA序列不形成根据RNAfold WebServer的二级结构。
4.权利要求1-3中任一项的组合物，其中所述第二RNA序列是第二siRNA序列。
5.权利要求4的组合物，其中所述接头RNA序列包含ACAACAA、ATCCCTACGTACCAACAA、ACGTACCAACAA、TCCC或ACAACAATCCC，或由其组成。
6.权利要求4的组合物，其中所述重组RNA构建体还包含编码GOI的第一mRNA序列。
7.权利要求1-3中任一项的组合物，其中所述第二RNA序列是编码GOI的第一mRNA序列。
8.权利要求7的组合物，其中所述接头RNA序列包含ACAACAA、ATAGTGAGTCGTATTATCCC、ATAGTGAGTCGTATTAACAACAATCCC、ATAGTGAGTCGTATTAACAACAA、ATAGTGAGTCGTATTAATCCCTACGTACCAACAA或ATAGTGAGTCGTATTAACGTACCAACAA，或由其组成。
9.权利要求6-8中任一项的组合物，其中所述重组RNA构建体还包含编码GOI的第二mRNA序列。
10.权利要求7-9中任一项的组合物，其中所述重组RNA构建体还包含第二siRNA序列。
11.权利要求4-6或10中任一项的组合物，其中所述重组RNA构建体包含第三siRNA序列。
12.权利要求11的组合物，其中所述重组RNA构建体还包含四个、五个或更多个siRNA序列。
13.权利要求12的组合物，其中所述siRNA序列中的每一种都结合靶RNA并调节所述靶RNA的表达。
14.权利要求13的组合物，其中每个siRNA序列能够结合：
(a)不同的靶RNA；
(b)相同靶RNA的不同区域；
(c)相同靶RNA的相同区域；或
(d)其任何组合。
15.权利要求14的组合物，其中(c)的siRNA序列是相同的。
16.权利要求9-15中任一项的组合物，其中所述重组RNA构建体包含三个、四个、五个或更多个mRNA序列，其中每个编码GOI。
17.权利要求16的组合物，其中所述mRNA序列中的每一个编码相同的GOI。
18.权利要求16的组合物，其中所述mRNA序列中的每一个编码不同的GOI。
19.前述权利要求中任一项的组合物，其中siRNA序列之间的接头RNA序列的长度为约4至约27个核苷酸。
20.前述权利要求中任一项的组合物，其中siRNA序列之间的接头RNA序列的长度为约4至约18个核苷酸。
21.前述权利要求中任一项的组合物，其中m是1且n是0。
22.权利要求2的组合物，其中siRNA序列之间的接头RNA序列是ACAACAATCCC。
23.权利要求2的组合物，其中所述接头RNA序列是ACAACAA。
24.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述接头RNA序列包含选自SEQ ID NOs:23和67-75的序列。
25.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述接头RNA序列包含根据SEQ ID NO：23的序列或由其组成。
26.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述接头RNA序列包含根据SEQ ID NO：67的序列或由其组成。
27.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述接头RNA序列包含根据SEQ ID NO：68的序列或由其组成。
28.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述接头RNA序列包含根据SEQ ID NO：69的序列或由其组成。
29.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述接头RNA序列包含根据SEQ ID NO：70的序列或由其组成。
30.权利要求24-29中任一项的组合物，其中与以下相比：(i)使用包含根据SEQ ID NO：68的接头RNA序列的重组RNA构建体的siRNA靶向的靶RNA的表达，(ii)使用包含根据SEQ IDNO：69的接头RNA序列的重组RNA构建体的siRNA靶向的靶RNA的表达，(iii)使用包含根据SEQ ID NO：70的接头RNA序列的重组RNA构建体的siRNA靶向的靶RNA的表达，和/或(iv)使用包含根据SEQ ID NO：23的接头RNA序列的重组RNA构建体的siRNA靶向的靶RNA的表达，使用包含根据SEQ ID NO：67的接头RNA序列的重组RNA构建体的siRNA靶向的靶RNA的表达更低。
31.权利要求24-30中任一项的组合物，其中与以下相比：(i)使用包含根据SEQ ID NO：67的接头RNA序列的重组RNA构建体的编码GOI的第一mRNA序列的表达，(ii)使用包含根据SEQ ID NO：68的接头RNA序列的重组RNA构建体的编码GOI的第一mRNA序列的表达，(iii)使用包含根据SEQ ID NO：69的接头RNA序列的重组RNA构建体的编码GOI的第一mRNA序列的表达，和/或(iv)使用包含根据SEQ ID NO：23的接头RNA序列的重组RNA构建体的编码GOI的第一mRNA序列的表达，使用包含根据SEQ ID NO：70的接头RNA序列的重组RNA构建体的编码GOI的第一mRNA序列的表达更高。
32.权利要求24-31中任一项的组合物，其中与以下相比：(i)使用包含根据SEQ ID NO：69的接头RNA序列的重组RNA构建体的siRNA靶向的靶RNA的表达，和/或(ii)使用包含根据SEQ ID NO：70的接头RNA序列的重组RNA构建体的siRNA靶向的靶RNA的表达，使用包含根据SEQ ID NO：23的接头RNA序列的重组RNA构建体的siRNA靶向的靶RNA的表达更低。
33.权利要求24-32中任一项的组合物，其中与以下相比：(i)使用包含根据SEQ ID NO：67的接头RNA序列的重组RNA构建体的编码GOI的第一mRNA序列的表达，(ii)使用包含根据SEQ ID NO：68的接头RNA序列的重组RNA构建体的编码GOI的第一mRNA序列的表达，和/或(iii)使用包含根据SEQ ID NO：69的接头RNA序列的重组RNA构建体的编码GOI的第一mRNA序列的表达，使用包含根据SEQ ID NO：23的接头RNA序列的重组RNA构建体的编码GOI的第一mRNA序列的表达更高。
34.前述权利要求中任一项的组合物，其中基于编码GOI的第一mRNA序列的期望表达水平和/或siRNA靶向的靶RNA的期望表达水平或siRNA靶向的靶RNA编码的蛋白质的期望表达水平来选择接头RNA序列。
35.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述GOI的表达受到调节。
36.权利要求35的组合物，其中所述GOI的表达通过GOI编码的蛋白质的表达来上调。
37.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述靶RNA的表达受到调节。
38.权利要求37的组合物，其中所述靶RNA的表达被能够结合靶RNA的siRNA序列下调。
39.前述权利要求中任一项的组合物，其中能够结合靶RNA的siRNA序列不抑制GOI的表达。
40.前述权利要求中任一项的组合物，其中siRNA序列之间的RNA接头序列不形成根据RNAlfold WebServer的二级结构。
41.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述siRNA序列形成根据RNAlfoldWebServer的二级结构。
42.权利要求41的组合物，其中所述siRNA序列包含发夹结构或环结构。
43.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述siRNA序列包含一种或多种短或小发夹RNA(shRNAs)。
44.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述重组RNA构建体被切割。
45.权利要求44的组合物，其中所述重组RNA构建体被胞内蛋白质切割。
46.权利要求44或45的组合物，其中所述重组RNA构建体被内源性蛋白质切割。
47.权利要求44-46中任一项的组合物，其中所述重组RNA构建体被内源性DICER切割。
48.权利要求44-47中任一项的组合物，其中与不包含具有选自式(I)和式(II)的结构的接头的RNA构建体的切割相比，所述重组RNA构建体的切割得到增强。
49.权利要求44-47中任一项的组合物，其中与不包含接头的RNA构建体的切割相比，所述重组RNA构建体的切割得到增强，所述接头包含含有ACAACAACAACACAA的序列。
50.权利要求44-47中任一项的组合物，其中与包含形成二级结构的接头的RNA构建体的切割相比，所述重组RNA构建体的切割得到增强。
51.前述权利要求中任一项的组合物，其中与来自不包含接头的RNA构建体的目的基因的表达相比，所述目的基因的表达得到增强，所述接头具有选自式(I)和式(II)的结构。
52.前述权利要求中任一项的组合物，其中与来自不包含接头的RNA构建体的目的基因的表达相比，所述目的基因的表达得到增强，所述接头包含含有ACAACAA的序列。
53.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述GOI包含白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素12(IL-12)或胰岛素样生长因子1(IGF1)。
54.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述靶RNA是非编码RNA。
55.权利要求1-53中任一项的组合物，其中所述靶RNA是信使RNA(mRNA)。
56.权利要求1-53中任一项的组合物，其中所述靶RNA是编码选自以下蛋白质的mRNA：肿瘤坏死因子α(TNF-α)、激活素受体样激酶2(ALK2)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、细胞性骨髓细胞瘤病(c-Myc)、Kirsten大鼠肉瘤(KRAS)、蛋白激酶B-1(Akt1)、Akt2和Akt3。
57.前述权利要求中任一项的组合物，其中能够结合靶RNA的siRNA序列结合靶RNA的外显子。
58.前述权利要求中任一项的组合物，其中能够结合靶RNA的siRNA序列特异性结合一种靶RNA。
59.前述权利要求中任一项的组合物，其中能够结合靶RNA的siRNA序列不是由目的基因的内含子序列编码或由其组成。
60.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述GOI在无RNA剪接的情况下表达。
61.前述权利要求中任一项的组合物，其中第一RNA序列存在于第二RNA序列的下游或3'侧。
62.权利要求61的组合物，其中所述RNA构建体包含在第二RNA序列下游或3'侧的内部核糖体进入位点(IRES)。
63.权利要求61或62的组合物，其中所述RNA构建体包含紧邻第一RNA序列上游或5'侧的内部核糖体进入位点(IRES)。
64.权利要求1-60中任一项的组合物，其中所述第一RNA序列存在于第二RNA序列的上游或5'侧。
65.权利要求64的组合物，其中所述RNA构建体包含在第一RNA序列上游或5'侧的内部核糖体进入位点(IRES)。
66.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述RNA构建体还包含聚腺苷酸尾、5'帽或Kozak序列。
67.前述权利要求中任一项的组合物，其中第一RNA序列和第二RNA序列均为重组的。
68.前述权利要求任一项的组合物，其中所述siRNA包含有义链序列，所述有义链序列选自SEQ ID NO：50-57和127-132组成的组。
69.前述权利要求中任一项的组合物，其用于调节细胞中两种或更多种基因的表达。
70.一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求1-68中任一项的组合物和药学上可接受的赋形剂。
71.一种细胞，其包含权利要求1-68中任一项的组合物。
72.一种载体，其包含编码权利要求1-68中任一项的组合物的重组多核酸构建体。
73.一种在细胞中从单RNA转录物产生siRNA和mRNA的方法，其包括将权利要求1-68中任一项的组合物或权利要求72的载体引入细胞中。
74.一种调节蛋白质表达的方法，其包括将权利要求1-68中任一项的组合物或权利要求72的载体引入细胞中，其中由靶RNA编码的蛋白质的表达降低。
75.一种调节蛋白质表达的方法，其包括将权利要求1-68中任一项的组合物或权利要求72的载体引入细胞中，其中由目的基因(GOI)编码的蛋白质的表达增加。
76.一种调节蛋白质表达的方法，其包括将权利要求1-68中任一项的组合物或权利要求72的载体引入细胞中，其中由靶RNA编码的蛋白质的表达降低，并且其中由目的基因(GOI)编码的蛋白质的表达增加。
77.一种治疗疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用权利要求1-68中任一项的组合物或权利要求70的药物组合物。
78.权利要求77的方法，其中所述疾病或病症包括皮肤疾病或病症或肌肉疾病或病症。
79.权利要求78的方法，其中所述皮肤疾病或病症包括炎性皮肤病。
80.权利要求79的方法，其中所述炎性皮肤病包括牛皮癣。
81.权利要求78的方法，其中所述肌肉疾病或病症包括骨骼肌病。
82.权利要求81的方法，其中所述骨骼肌病包括进行性骨化性纤维发育不良(FOP)。
83.权利要求77的方法，其中所述疾病或病症包括癌症。
84.权利要求83的方法，其中所述癌症包括胶质母细胞瘤、人舌鳞状细胞癌、人肺癌或人单核细胞白血病。
85.权利要求77-84中任一项的方法，其中受试者是人。
86.一种包含重组RNA构建体的组合物，所述重组RNA构建体包含第一RNA序列、第一接头RNA序列、第二RNA序列和第二接头RNA序列，其中：
(i)第一RNA序列是编码白介素4(IL-4)的信使RNA(mRNA)；
(ii)第二RNA序列包含两种或多种小干扰RNA(siRNA)，所述小干扰RNA能够结合肿瘤坏死因子α(TNF-α)的mRNA；
(iii)第一接头RNA序列存在于第一RNA序列和第二RNA序列之间；和
(iv)第二接头RNA序列连接两种或多种siRNA的每一种，并包含根据SEQ ID NO：23的序列。
87.一种包含重组RNA构建体的组合物，所述重组RNA构建体包含第一RNA序列、第一接头RNA序列、第二RNA序列和第二接头RNA序列，其中：
(i)第一RNA序列是编码胰岛素样生长因子1(IGF1)的信使RNA(mRNA)；
(ii)第二RNA序列包含两种或多种小干扰RNA(siRNA)，所述小干扰RNA能够结合激活素受体样激酶2(ALK2)的mRNA；
(iii)第一接头RNA序列存在于第一RNA序列和第二RNA序列之间；和
(iv)第二接头RNA序列连接两种或多种siRNA的每一种，并包含根据SEQ ID NO：23的序列。
88.一种包含重组RNA构建体的组合物，所述重组RNA构建体包含第一RNA序列、第一接头RNA序列、第二RNA序列和第二接头RNA序列，其中：
(i)第一RNA序列是编码白细胞介素2(IL-2)的信使RNA(mRNA)；
(ii)第二RNA序列包含两种或多种小干扰RNA(siRNA)，所述小干扰RNA能够结合血管内皮生长因子A(VEGFA)的mRNA；
(iii)第一接头RNA序列存在于第一RNA序列和第二RNA序列之间；和
(iv)第二接头RNA序列连接两种或多种siRNA中的每一种，并包含选自SEQ ID NO：23和67-70的序列。
89.一种包含重组RNA构建体的组合物，所述重组RNA构建体包含第一RNA序列、第一接头RNA序列、第二RNA序列和第二接头RNA序列，其中：
(i)第一RNA序列是编码白细胞介素12(IL-12)的信使RNA(mRNA)；
(ii)第二RNA序列包含两种或多种小干扰RNA(siRNA)，所述小干扰RNA能够结合细胞性骨髓细胞瘤病(c-Myc)、Kirsten大鼠肉瘤(KRAS)、蛋白激酶B-1(Akt1)、Akt2和/或Akt3的mRNA；
(iii)第一接头RNA序列存在于第一RNA序列和第二RNA序列之间；和
(iv)第二接头RNA序列连接两种或多种siRNA的每一种，并包含根据SEQ ID NO：23的序列。
90.一种包含重组多核酸构建体的组合物，所述重组多核酸构建体包含选自SEQ IDNO：1-18和76-108的核酸序列。
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