CN117683092A - 一种酒糟来源多靶点降压肽及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种酒糟来源多靶点降压肽及其制备方法与应用。为提高米酒槽的经济利用价值，从中开发出具有降血压功效的寡肽，本发明以米酒糟为原料，通过酶解、膜过滤、高效液相色谱逐步分离纯化得到了一种降血压肽单体，氨基酸序列为VQVVNNNGKTVFN，分子量为1433.74Da，具有纯度高，活性好，能人工合成，安全无毒的特点。经ACE抑制活性测定、ACE2酶活检测、肾素抑制活性测定等实验发现，该降压肽在体外对肾素‑血管紧张素系统(RAS)的多个关键性限速酶具有影响，可以应用于降血压领域，且有利于米酒糟的综合利用。
Description
技术领域
本发明属于米酒槽资源化利用技术领域，具体涉及一种米酒糟来源多靶点降血压肽及其制备方法与应用。
背景技术
高血压是心血管疾病的主要风险因素，还会带来各种并发症，人们需要对其引起高度重视，可以通过均衡营养的饮食和健康的生活方式来预防高血压。目前降血压机制主要为肾素-血管紧张素系统(RAS)和激肽-缓激肽系统(KKS)两种，肾素-血管紧张素系统由四个主要成分组成：肾素、血管紧张素原(AGT)、血管紧张素I转换酶(ACE)和血管紧张素受体(AGTR1和AGTR2)。肾素-血管紧张素系统在调节电解质平衡、血管收缩、血管重塑和纤维蛋白溶解中发挥重要作用。其中，肾素和ACE是该系统中两个重要的水解酶类，对其活性的抑制有利于预防高血压的形成。而由ACE2介导的ACE2-Ang(1-7)-Mas轴可水解AngⅡ，以抵消ACE-AngⅡ-AT1轴带来的升压效应，从而维持机体血压的稳定平衡。人工合成降压药物会导致不同的副作用如过敏反应，血钾水平升高，血管性神经水肿等。因此，在食源性多肽中寻求有降压功能的活性肽十分重要。食源性活性肽是一种具有促进免疫、激素调节、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂等作用，且比游离氨基酸更易消化吸收的多肽。食源性ACE抑制肽也是其中一种，具有来源广泛，无毒无害，副作用小，消化吸收好等人工合成药物所不具备的优点。
米酒糟是一种位于米酒容器底部，发酵后于储存期间或经过处理后形成的，以及过滤或离心该产品后得到的残留物。米酒糟中富含各种氨基酸、维生素和多种微量元素，营养成分丰富。现在绝大多数的酒糟是作为饲料以低价出售；造成了资源的浪费。目前已有多项研究证明从米酒糟中可分离提取出具有降血压活性的多肽，因其具有无毒副作用的优点从而成为了降血压研究领域的关注重点。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，旨在提供一种酒糟来源多靶点降压肽及其制备方法与应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供一种酒糟来源多靶点降压肽，所述酒糟来源多靶点降压肽具有如SEQID NO：1所示的氨基酸序列。
本发明还提供一种上述的酒糟来源多靶点降压肽的制备方法，包括如下步骤：
S1、将米酒糟原料酶解得到酶解液；
S2、将S1所得酶解液醇沉、离心后，取上清液加入石油醚沉淀、离心后，得到溶液A；
S3、S2所得溶液A经超滤、过滤后，用制备型高效液相色谱进行第一次分离；
S4、收集S3第一次分离后所得组分在色谱柱中进行第二次分离，收集第二次分离所得组分，即得所述酒糟来源多靶点降压肽。
优选地，步骤S1中，所述酶解采用碱性蛋白酶，pH值为9.0±0.5；所述碱性蛋白酶与米酒糟原料的质量比为1:(100±50)；所述酶解的温度为50±10℃，时间为3±1h。
优选地，步骤S2中，向酶解液中搅拌加入无水乙醇进行醇沉，所述无水乙醇在体系中的体积分数为90±5％，所述酶解液的浓度为20±5mg/mL；醇沉时间为12±4h。
优选地，步骤S2中，所述石油醚在体系中的体积分数为5～20％。
优选地，步骤S3中，所述超滤使用5000Da超滤膜，压力为0.1～0.22MPa。
优选地，步骤S3中，所述第一次分离使用的色谱柱为20mm×450mm，10μm的C18色谱柱；流动相：A泵为超纯水，B泵为乙腈；流速为10mL/min；进样量为5mL；检测波长为214nm；洗脱程序：0-50min，25-75％B；50-52min，75-90％B，52-60min，90％B；60-62min，90-25％B；62-70min，25％B。
优选地，步骤S4中，收集第一次分离时50-52min，75-90％B中得到的组分进行第二次分离，所述第二次分离使用的色谱柱为260mm×4.6mm，5μm的ECOSIL C18色谱柱；流动相：A泵为超纯水，B泵为乙腈；流速为1mL/min；进样量为20μL；检测波长为214nm；洗脱程序：0-30min，10-35％B；30-50min，35-90％B；50-60min，90％B。
本发明还提供一种上述的酒糟来源多靶点降压肽在食品、药品、保健品领域中的应用。
优选地，所述酒糟来源多靶点降压肽在食品、药品、保健品中的添加量为1±0.5mmol/L。
本发明具有以下有益效果：
本发明以米酒糟为原料，通过使用多种分离纯化的手段得到一种降血压寡肽，该寡肽氨基酸序列为VQVVNNNGKTVFN，分子量为1433.74Da，具有纯度高，活性好，能人工合成，安全无毒的特点。ACE抑制活性测定的结果表明，该降压肽在体外对ACE具有显著的抑制作用，对ACE2具有剂量依赖性的正向调节作用，对肾素具有显著抑制作用，可以应用于降血压领域，且有利于米酒糟的综合利用。
附图说明
图1为分别用碱性蛋白酶和中性蛋白酶对米酒糟处理后的酶解液的ACE抑制率；
图2为分别用不同浓度石油醚对酶解液处理后的ACE抑制率；
图3为制备液相分离纯化峰图及各组分对ACE的抑制率；
图4为液相色谱分析中三个组分的ACE抑制活性；
图5为序列VQVVNNNGKTVFN的二级结构图；
图6为序列VQVVNNNGKTVFN在蛋白CAA29152.1中的位置；
图7为不同浓度单体M1和市售降压肽对ACE2酶活的影响；
图8为单体M1和市售降压肽对肾素的抑制率。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
如无特殊说明，均为可从商业途径得到的试剂和材料。
下述实施例所用米酒糟原料均来自阳西美味鲜食品有限公司。
AL104万分之一电子天平，购自梅特勒-托利多仪器有限公司。
TDL-5离心机，购自上海安亭仪器有限公司。
R204B3旋转蒸发仪，购自上海申科技有限公司。
Thermo Modulyo冷冻干燥机，购自赛默飞世尔有限公司。
KQ500-B超声波清洗器，购自昆山市超声仪器有限公司。
VM-300S涡旋混合器，购自群安实验仪器有限公司。
VersaMax光栅型酶标仪，购自Melecular Devices。
HT-400B电热恒温培养箱，购自上海赫田科学仪器有限公司。
LC-10ATvp plus分析型高效液相，购自日本岛津公司。
LTQ-Orbitrap-Velos Pro高分辨质谱，购自赛默飞世尔有限公司。
MSC300超滤杯，购自上海摩速科学器材有限公司。
实施例1酒糟来源多靶点降压肽的分离纯化
S1.采用碱性蛋白酶进行水解，先将2000g酒糟和10L水混合，水解条件为：碱性蛋白酶：pH＝9.0，酶与酒糟溶液的质量比为1:100，温度50℃，时间3h。水解结束后把酶解液升温至90℃保温10min灭酶，在4000r/min离心15-20min，收集上清液，记为酶解液。将所得酶解液与未酶解原料配成1mg/mL的溶液进行ACE抑制活性测定。如图1所示。
S2.将冻干后的酶解液固体配成20mg/mL，搅拌加入无水乙醇配成终浓度为90％(体积分数)乙醇溶液，醇沉12h，在4000rpm，15min下离心。向上清液中搅拌加入上清液体积15％的石油醚，待静置沉淀、离心后取上清液，记为溶液A。测定溶液A的ACE抑制率，结果如图2所示。
S3.将超滤杯放在水浴中，超滤全称在常温下进行，安装好5000Da超滤膜后密闭，调整氮气压力为0.2Mpa。将溶液A除去有机溶剂后加入100mL到超滤杯中，并从超滤杯下方出料口收集5000Da透过液组分。
S4.将S3得到的组分过0.45μm滤膜后，借助制备型高效液相色谱进行分离。制备条件：①色谱柱：20mm×450mm，C18填料(10μm,Macherey Nagel,France)；②流动相：A泵为超纯水，B泵为乙腈；③流速：10mL/min；④进样量：5mL；⑤检测波长：214nm。⑥洗脱程序：0-50min，25-75％B；50-52min，75-90％B，52-60min，90％B；60-62min，90-25％B；62-70min，25％B。分别收集分离后的D1、D2、D3、D4、D5组分，冻干后配成1mg/mL的溶液测定其ACE抑制率，结果如图3所示。收集ACE抑制率最高的D2组分进行组分再进一步分离纯化。
S5.将S4得到的D2组分再用ECOSIL C18(260mm×4.6mm，5μm)色谱柱进行二次分离。分离条件：①流动相：A泵为超纯水，B泵为乙腈；②流速：1mL/min；③进样量：20μL；④检测波长为214nm，在0-30min，10-35％B；30-50min，35-90％B；50-60min，90％B。程序下进行梯度洗脱。分别收集分离后的M1、M2、M3组分，冻干后配成1mg/mL的溶液测定其ACE抑制率，结果如图4所示。将ACE抑制活性最高的M1组分进行收集。
S6.为进一步明确M1组分的单体结构，使用HPLC对S5得到的M1组分的峰尖进行收集，使用UPLC-LTQ-Orbitrap-Velos Pro质谱分析仪，再通过Proteome Discoverer质谱软件进行解析鉴定，搜库结果鉴定出M1的分子量为1433.74Da，氨基酸的序列为Val-Gln-Val-Val-Asn-Asn-Asn-Gly-Lys-Thr-Val-Phe-Asn(VQVVNNNGKTVFN)，该ACE抑制肽序列也是属于首次发现，结果如图5、图6所示。
S7.评价S6得到的寡肽M1对ACE2酶的影响，并与市售降压肽进行对比。在黑色酶标板中，将10μL不同浓度(0.1、0.5、1mmol/L)的样品和10μL ACE2酶液依次加入到77.5μL50mmol/L Tris-HCl(pH 7.0，含0.3mol/L NaCl，10μmol/L ZnCl2)中并混匀，立即加入2.5μL底物MCA-APK(终浓度10μmol/L)。对照组以超纯水代替样品，空白组以超纯水代替样品及ACE2酶液。在酶标仪中37℃下避光反应30min后，立即在激发波长320nm，发射波长405nm下测定反应所释放产物的荧光强度，以7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)标准溶液的标曲，对反应产物进行定量。相对酶活力(％)的计算公式如下式：
ACE2相对酶活力(％)＝[(Ap-Ab)/(Ac-Ab)]×100％
式中：Ap—实验组的吸光值；Ac—对照组的吸光值；Ab—空白组的吸光值。
ACE2在高血压系统中起着负向调节的作用，可平衡由ACE引起的血管收缩效应，故在降血压肽的筛选中，多肽对ACE2的活性影响也是一项重要的指标。实验探究了市售降压肽和单体M1两种样品在不同浓度下对ACE2活性的影响，图7结果显示，降压肽单体对ACE2的活性具有剂量依赖性，浓度越高，对ACE2的酶活的正向调节作用越明显，当浓度达到1mmol/L时，对ACE2的酶活产生促进作用。而市售降压肽一款日本乳酸菌多肽则对ACE2的影响不显著。
S8.评价S6得到的寡肽M1对肾素的影响，并与市售降压肽进行对比。根据肾素试剂盒，以96孔酶标板为反应容器。将缓冲液和肾素酶在低温温度下1:10稀释后备用。空白组加入20μL底物，150μL缓冲液，10μL纯水，10μL缓冲液；空白对照组加入20μL底物，150μL缓冲液，10μL纯水；样品组加入20μL底物，150μL缓冲液，10μL样品溶液。然后向空白对照组和样品组的每个孔中加入10μL肾素酶使反应启动。在微孔板混合器上混匀，置于37℃反应30min。以激发波长340nm，发射波长528nm检测其荧光强度。肾素抑制率的计算公式如下：
S1＝[1-(F1-F)/(F2-F)]*100％
S1——肾素抑制率，％；F——空白反应液的荧光强度；F1——样品反应液的荧光强度；F2——空白对照反应液的荧光强度。
单体M1和市售降压肽对肾素的抑制活性如图8所示。其中肾素抑制实验中的体系浓度为0.50mg/mL。可以看出，与市售降压肽相比，单体M1的肾素抑制率较高，为84.21％。
S9.ACE抑制活性测定方法
分别向空白组、对照组和样品组加入10μL ACE溶液(0.25U/mL)，样品组加入10μLACEI，空白组和对照组加入10μL缓冲液，在37℃下放置5min后所有组别均加入30μL HHL溶液(6.5mmol/mL，HHL溶于pH8.3的0.1mol/L硼酸缓冲液，含0.3mol/L NaCl)，在37℃下反应1h后，对照组和样品组分别加入80μL1.0mol/L HCl中止反应。
液相色谱条件：①色谱柱：ECOSIL C18(260mm×4.6mm，5μm)；②流动相：乙腈:超纯水＝25:75(含0.1％(v/v)TFA)；③流速：1mL/min；④检测波长：228nm；⑤柱温：30℃；⑥进样量：20μL。
结果计算：
原理：HHL在ACE的催化下快速地分解并产生马尿酸(Hip)和二肽(His-Leu，HL)，马尿酸在228nm处有最大吸收。当加入ACEI样品时，ACE酶活受到抑制，马尿酸生成量减少，所以可通过高效液相色谱测定马尿酸的生成量来评估ACEI对ACE活性的抑制率。
计算公式为：
式中：R：ACEI样品对ACE的抑制率(％)；
A：对照组中马尿酸的峰面积；
B：添加ACEI组中马尿酸的峰面积；
A0：空白管中马尿酸的峰面积。
对比例1
采用中性蛋白酶进行水解，其余操作步骤与实施例1步骤S1一致。所得中性蛋白酶酶解液配成1mg/mL进行ACE抑制活性测定，结果如图1所示。
对比例2
将实施例1步骤S1所得酶解液冻干成固体后加水溶解配成20mg/mL，搅拌加入无水乙醇配成终浓度为90％乙醇溶液，醇沉12h，在4000rpm，15min下离心。向上清液中搅拌加入上清液体积5％的石油醚，待静置沉淀、离心后取部分上清液，测定其ACE抑制，结果率如图2所示。
对比例3
将实施例1步骤S1所得酶解液冻干成固体后加水溶解配成20mg/mL，搅拌加入无水乙醇配成终浓度为90％乙醇溶液，醇沉12h，在4000rpm，15min下离心。向上清液中搅拌加入上清液体积10％的石油醚，待静置沉淀、离心后取部分上清液，测定其ACE抑制，结果如图2所示。
对比例4
将实施例1步骤S1所得酶解液冻干成固体后加水溶解配成20mg/mL，搅拌加入无水乙醇配成终浓度为90％乙醇溶液，醇沉12h，在4000rpm，15min下离心。向上清液中搅拌加入上清液体积20％的石油醚，待静置沉淀、离心后取部分上清液，测定其ACE抑制，结果如图2所示。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种酒糟来源多靶点降压肽，其特征在于，所述酒糟来源多靶点降压肽具有如SEQID NO：1所示的氨基酸序列。
2.一种权利要求1所述的酒糟来源多靶点降压肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将米酒糟原料酶解得到酶解液；
S2、将S1所得酶解液醇沉、离心后，取上清液加入石油醚沉淀、离心后，得到溶液A；
S3、S2所得溶液A经超滤、过滤后，用制备型高效液相色谱进行第一次分离；
S4、收集S3第一次分离后所得组分在色谱柱中进行第二次分离，收集第二次分离所得组分，即得所述酒糟来源多靶点降压肽。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述酶解采用碱性蛋白酶，pH值为9.0±0.5；所述碱性蛋白酶与米酒糟原料的质量比为1:(100±50)；所述酶解的温度为50±10℃，时间为3±1h。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，向酶解液中搅拌加入无水乙醇进行醇沉，所述无水乙醇在体系中的体积分数为90±5％，所述酶解液的浓度为20±5mg/mL；醇沉时间为12±4h。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述石油醚在体系中的体积分数为5～20％。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述超滤使用5000Da超滤膜，压力为0.1～0.22MPa。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述第一次分离使用的色谱柱为20mm×450mm，10μm的C18色谱柱；流动相：A泵为超纯水，B泵为乙腈；流速为10mL/min；进样量为5mL；检测波长为214nm；洗脱程序：0-50min，25-75％B；50-52min，75-90％B，52-60min，90％B；60-62min，90-25％B；62-70min，25％B。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤S4中，收集第一次分离时50-52min，75-90％B中得到的组分进行第二次分离，所述第二次分离使用的色谱柱为260mm×4.6mm，5μm的ECOSIL C18色谱柱；流动相：A泵为超纯水，B泵为乙腈；流速为1mL/min；进样量为20μL；检测波长为214nm；洗脱程序：0-30min，10-35％B；30-50min，35-90％B；50-60min，90％B。
9.一种权利要求1所述的酒糟来源多靶点降压肽在食品、药品、保健品领域中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，所述酒糟来源多靶点降压肽在食品、药品、保健品中的添加量为1±0.5mmol/L。
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