CN117659450A - 一种甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒的制备方法及其应用 - Google Patents
一种甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒的制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种甘蔗叶多酚‑玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒的制备方法及其应用，所述甘蔗叶多酚修饰的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的制备方法包括步骤：S1、制备玉米醇溶蛋白乙醇溶液；S2、制备甘蔗叶多酚水溶液；S3、等体积混合制得甘蔗叶多酚‑玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒混悬液；S4、冷冻干燥后即得甘蔗叶多酚‑玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒。本发明通过共价结合的方式将甘蔗叶多酚与玉米醇溶蛋白进行键合，提高了玉米醇溶蛋白的抗氧化能力及降低其表面疏水性，将制得的甘蔗叶多酚‑玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒作为皮克林乳液的稳定剂具有增强皮克林乳液的稳定性，降低过氧化物含量及游离脂肪酸释放量等优点，应用前景十分广阔。
Description
技术领域
本发明属于共价颗粒制备技术领域，具体涉及一种甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒的制备方法及其应用。
背景技术
玉米醇溶蛋白(Zein)是一种玉米加工中主要的副产物之一，被美国FDA认证为安全的食品载体，已广泛应用于食品和医药领域，并得到了产业化的发展。玉米醇溶蛋白独特的自组装特性及高安全性，其也常用以代替无机表面活性剂作为皮克林乳液的稳定剂。然而，玉米醇溶蛋白独特的溶解特性(只能溶于一定比例的乙醇)且在其等电点和高温条件下，玉米醇溶蛋白易于聚集，故仅使用玉米醇溶蛋白制备稳定的皮克林乳剂时，稳定性降低，从而限制进一步的应用。因此，为了解决这个问题，具有出色抗氧化能力的多酚与玉米醇溶蛋白的共价交联方法在此专利中被开发且用于制备皮克林乳液，进一步通过共价修饰改善玉米醇溶蛋白的特性并赋予玉米醇溶蛋白更强的抗氧化能力，最终提高皮克林乳液的稳定性。
甘蔗(Saccharum officinarum L.)作为一种传统作物，每年产量巨大，并且甘蔗叶中被证实富含多酚类物质。实际上，除了具有广泛的生物活性外，与单一的酚类化合物相比，甘蔗叶多酚(Sugarcane leaf polyphenols，SGLp)具有独特的色素，从而能赋予皮克林乳液独特的颜色，并且甘蔗叶多酚具有不同种类的多酚，因此具有多个芳香环，能产生更多的反应位点，与玉米醇溶蛋白能更好地共价结合。此外，目前大多数对甘蔗叶多酚的研究仅存在于成分分析、含量测定及一些简单的活性测定(如抗氧化)中，现有研究中对于甘蔗叶多酚的开发应用研究较少。
姜黄素(Curcuminoid，Cur)是一种脂溶性活性物，因其卓越的有益人体健康的功能，包括抗氧化、抗炎等活性，然而，低水溶性和易受环境影响(温度、紫外线和盐浓度)是造成其生物利用率低及储存稳定性差的主要障碍。所以关于姜黄素的递送载体的研究目前仍然是一个热门研究课题。为了解决这一问题，由于它具有更高的安全性、环境友好性和显著的生物相容性，利用固体颗粒(包括特定的蛋白质、多糖和多酚)代替表面活性剂作为乳剂稳定剂的皮克林乳剂显示出了积极的前景。
综上所述，通过将甘蔗叶多酚共价复合到玉米醇溶蛋白中，提高后者抗氧化能力，并改善疏水性，从而制备出高稳定性的共价复合纳米颗粒，继而制备出稳定性较好的水包油型皮克林乳液，最终旨在拓宽甘蔗叶多酚-蛋白复合纳米粒稳定的皮克林乳液广阔的应用前景，具有重要的意义。
发明内容
本发明旨在克服玉米醇溶蛋白上述现有的缺点及拓宽甘蔗叶多酚应用，本发明提供一种甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒的制备方法及其应用，将甘蔗叶多酚与玉米醇溶蛋白共价结合，提高了玉米醇溶蛋白的抗氧化能力及降低其表面疏水性。将本发明制备的甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白纳米粒作为皮克林乳液的稳定剂，与单一的玉米醇溶蛋白稳定的皮克林乳液相比，提高皮克林乳液的储藏稳定性，降低了储藏时过氧化物的含量及游离脂肪酸的释放。最后作为递送载体递送脂溶性活性物质姜黄素，在模拟体外消化环境中，使姜黄素达到缓释目的，并能提高姜黄素的生物利用度，在体外能提高红细胞氧化溶血抑制率。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的第一个目的是提供一种甘蔗叶多酚修饰的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
S1、精密称取玉米醇溶蛋白溶于乙醇溶液中，持续搅拌1-3h，全程避光操作，冷藏过夜，充分水合，制得质量浓度为1.0％-3.0％的玉米醇溶蛋白乙醇溶液，备用；
S2、分别精密称取5-25mg的甘蔗叶多酚溶于纯化水中，充分搅拌溶解后，全程避光，制得质量浓度为0.01-0.05％的甘蔗叶多酚水溶液，备用；
S3、使用pH调节剂NaOH调节步骤S1和S2制得的玉米醇溶蛋白乙醇溶液和甘蔗叶多酚水溶液的pH至9.0±0.02后，在搅拌条件下，将甘蔗叶多酚水溶液以细流状沿烧杯壁缓慢加入至玉米醇溶蛋白乙醇水溶液中，等体积混合，避光搅拌15～16h，旋蒸去除乙醇及部分水，制得甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒混悬液；
S4、将步骤S3得到的共价复合纳米颗粒混悬液倒入玻璃皿中，经冷冻干燥后，即得甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒。
优选的，所述甘蔗叶多酚的制备方法，包括如下步骤：
A、取适量的干燥的甘蔗叶粉末与烧杯中，按液料比为10:1mL/g加入80％乙醇；在超声功率300-400W，超声时间20-35min和超声温度40-80℃条件下提取，提取三次，合并滤液；提取液在4000-6000rpm的转速条件下离心10min；离心结束后，将提取液在旋蒸温度40-60℃和旋蒸转速率40-50rpm条件下浓缩，最终得到甘蔗叶多酚浓缩液；
B、将石油醚和步骤A制得的甘蔗叶多酚浓缩液按体积比为3:1mL/mL的条件下重复萃取3遍，得到甘蔗叶多酚待上样液；
C、将步骤B制得的甘蔗叶多酚待上样液经富集后，收集得到50％乙醇洗脱相，将该相依次通过旋蒸浓缩和冻干后，得到甘蔗叶多酚。
优选的，所述步骤S1中溶剂为70％的乙醇溶液，搅拌转速为950～1000rpm，冷藏温度为2-8℃。
优选的，所述步骤S3中所述pH调节剂NaOH的浓度为0.05-0.1M，所述旋蒸过程中旋蒸温度为40～43℃，旋转转速为50～60rpm，最终蛋白浓度为3.0％。
优选的，所述步骤S4中冷冻干燥温度为-50～-60℃，压力为30～50Mpa，冻干时间为20-30h。
本发明的第二个目的是提供一种根据上述制备方法制得的甘蔗叶多酚修饰的玉米醇溶蛋白纳米颗粒。
本发明的另一个目的是提供一种利用上述制备方法或甘蔗叶多酚修饰的玉米醇溶蛋白纳米颗粒制备具有营养活性物质递送功能的皮克林乳液体系的应用。
优选的，所述皮克林乳液体系的制备过程包括：
a.精密称取玉米醇溶蛋白溶于乙醇溶液中，持续搅拌1-3h，全程避光操作，冷藏过夜，充分水合，制得质量浓度为1.0％-3.0％的玉米醇溶蛋白乙醇溶液，备用；
b.分别精密称取5-25mg的甘蔗叶多酚溶于纯化水中，充分搅拌溶解后，全程避光，制得质量浓度为0.01-0.05％的甘蔗叶多酚水溶液，备用；
c.使用pH调节剂NaOH调节步骤a和步骤b制得的玉米醇溶蛋白乙醇溶液和甘蔗叶多酚水溶液的pH至9.0±0.02后，在搅拌条件下，将甘蔗叶多酚水溶液以细流状沿烧杯壁缓慢加入至玉米醇溶蛋白乙醇水溶液中，等体积混合，避光搅拌15～16h，旋蒸去除乙醇及部分水，制得甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒混悬液；
d.利用高速剪切机，将步骤c甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价复合纳米混悬液与玉米油按体积比为9:1混合，高速剪切机的转速为12000～14000rpm，剪切时长为2.0～3.0min，通过细胞破碎仪，超声功率为20-40％，超声时长4-8min，超声开关模式为2.5S开2.5S关，期间共匀质2～3次，制得均匀稳定的甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价复合颗粒稳定的水包油型皮克林乳液；
e.将营养功能成分溶于玉米油中(0.1％，w/v)，重复步骤S4，即得负载姜黄素的甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白皮克林乳液。
优选的，所述皮克林乳液体系可应用于营养功能成分缓释递送载体的制备。
优选的，所述营养功能成分包括但不限于姜黄素、多酚类、黄酮类、鱿鱼黑色素。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)与单一的玉米醇溶蛋白纳米粒相比，本发明提高了玉米醇溶蛋白的抗氧化能力，三种抗氧化能力从47.18±0.74％(DPPH)、40.28±0.20％(ABTS)、0.23±0.01(还原力)分别提高至62.13±0.17％、50.52±0.02％和0.39±0.00。其次也降低了玉米醇溶蛋白的表面疏水性(从1366.4±73.45降低至1017.05±66.51)。表明甘蔗叶多酚通过与玉米醇溶蛋白共价结合能改变后者的表面性能，进而提高后者原有的抗氧化能力。
(2)与单一的玉米醇溶蛋白纳米粒稳定的皮克林乳液相比，甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价纳米粒稳定的皮克林乳液在20天储藏前，表现出更低的粒径及较高的zeta电位，及储藏20天后表现出较高的稳定性。其次，甘蔗叶多酚的引入能赋予皮克林乳液独特的黄色，及在20天储藏中，同样表现出较高的稳定性。
(3)通过Nikon显微镜观察各乳液20天储藏前后的微观结构，与单一的玉米醇溶蛋白纳米粒稳定的皮克林乳液相比，甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价纳米粒稳定的皮克林乳液分散均匀及20天储藏后仍然能保持相对较好的分散性。
(4)通过测定各乳液20天储藏时过氧化物含量及在模拟体外消化环境中游离脂肪酸释放量，与单一的玉米醇溶蛋白纳米粒稳定的皮克林乳液相比，甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价纳米粒稳定的皮克林乳液具有较低的脂质过氧化物含量(初级过氧化物从1.57±0.01mmol/L降低至0.87±0.03mmol/L及次级过氧化物从2.37±0.10μmol/L降低至1.59±0.01μmol/L)及游离脂肪酸释放量(从20.61±0.10％降低至16.14±0.69)。最后通过安全性评价测定，结果表明甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价纳米粒稳定的皮克林乳液具有较好的安全性。综上所述，为其作为活性物质递送载体提供良好的基础条件。
(5)将所制备的甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价纳米粒用于稳定皮克林乳液所负载的姜黄素，在体外消化模拟环境中，不仅能使姜黄素达到缓释的作用还能提高它的生物利用度。在体外红细胞溶血实验中，能较好地抑制AAPH所诱导的红细胞溶血并通过溶血率实验表明其安全性良好。
(6)综上所述，利用绿色、环保、高效的反溶剂沉淀法首次成功制备出甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价纳米粒。该纳米粒在甘蔗叶多酚修饰下，既保留着玉米醇溶蛋白固有的自组装特性，也改善及提高了玉米醇溶蛋白相应的特性功能。利用其成功制备了稳定较好的皮克林乳液，从而为开发甘蔗叶多酚-蛋白质稳定的皮克林乳液应用于食品保存及医药载体的可能性。
附图说明
图1为本发明研发设计流程图；
图2为实施例3中甘蔗叶多酚水溶液调节pH值前后图；
图3为实施例3中共价纳米颗粒的扫描电子显微镜下形貌观察图；
图4为实施例3中共价纳米颗粒的荧光分析图；
图5为实施例3中共价纳米颗粒的傅里叶红外分析图；
图6为实施例3中共价纳米颗粒的X射线衍射分析图；
图7为实施例3中共价纳米颗粒的紫外可见光谱分析图；
图8为实施例3中共价纳米颗粒的SDS-PAGE图；
图9为实施例3中共价纳米颗粒的粒径、PDI及Zeta电位图；
图10为实施例3中共价纳米粒颗粒的疏水性变化图；
图11为实施例3中共价纳米颗粒的体外抗氧化图；
图12为实施例6中制备得到的皮克林乳液水包油型判断示意图；
图13为实施例6中制备得到的皮克林乳液模量及表观粘度图；
图14为实施例6中制备得到的皮克林乳液在储藏20天前后的粒径及zeta电位图；
图15为实施例6中制备得到的皮克林乳液在储藏20天前后的色度图；
图16为实施例6中制备得到的皮克林乳液在储藏20天前后的微观图；
图17为实施例6中制备得到的皮克林乳液在储藏20天过程中过氧化物含量测定图；
图18为实施例6中制备得到的皮克林乳液在模拟体外消化过程中游离脂肪酸的释放量图；
图19为实施例6中制备得到的皮克林乳液体外安全性评价图；
图20为实例9中姜黄素的体外消化图；
图21为实例9中姜黄素的体外抑制AAPH诱导红细胞溶血图。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。
设备名称和型号：
设备名称1：ZEISS扫描电子显微镜；型号：Sigma 300；
设备名称2：马尔文粒径仪；型号：Zetasizer Nano ZS90；
设备名称3：Hitachi；型号：RF-5301PC；
设备名称4：PerkinElmer，USA；
设备名称5：IKA高速剪切分散机；型号T18；
设备名称6：细胞破碎仪；型号新芝；
设备名称7：元析紫外可见分光光度计；型号UV-5500；
设备名称8：冷冻干燥机：型号：FD-1A-50。
实施例1甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒的制备
所述甘蔗叶多酚的制备方法，包括如下步骤：
S1、取适量的干燥的甘蔗叶粉末与烧杯中，按液料比为10:1(mL/g)加入80％乙醇；在超声功率360W，超声时间25min和超声温度60℃条件下提取，提取三次，合并滤液；提取液在5000rpm的转速条件下离心10min；离心结束后，将提取液在旋蒸温度50℃和旋蒸转速率45rpm条件下浓缩，最终得到甘蔗叶多酚浓缩液；
S2、将石油醚和S1所得的甘蔗叶多酚浓缩液按体积比为3:1(mL/mL)的条件下重复萃取3遍，得到甘蔗叶多酚待上样液；
S3、将S2所得的甘蔗叶多酚待上样液经D-101大孔树脂(购自国药集团化学试剂有限公司型号D101大孔树脂，30266071)富集后，收集得到50％乙醇洗脱相，将该相依次通过旋蒸浓缩和冻干后，得到甘蔗叶多酚。
所述玉米醇溶蛋白购自上海麦克林生化科技股份有限公司厂家，CAS：9010-66-6。
本发明甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒的制备，包括如下步骤：
S1.分析天平上精密称取玉米醇溶蛋白粉末1g溶于50mL的70％乙醇溶液中，在搅拌1000rpm的条件下持续搅拌2h，搅拌全程避光，待充分搅拌结束后于4℃冰箱储藏过夜，使其充分水合，制得质量浓度为2.0％的玉米醇溶蛋白乙醇溶液，备用；
S2.精密称取5.0mg上述制备的甘蔗叶多酚溶于50mL纯化水中，制备过程全程避光，充分搅拌溶解后，制得质量浓度为0.01％的甘蔗叶多酚水溶液，备用；
S3.将经步骤S1和S2制备得到的玉米醇溶蛋白乙醇溶液和甘蔗叶多酚水溶液的pH通过0.1M NaOH调节pH至9.0±0.02后，并在1000rpm的搅拌条件下，将甘蔗叶多酚水溶液以细流状加入至玉米醇溶蛋白乙醇水溶液中，等体积混合，避光持续搅拌15h后，旋蒸(42℃，60rpm)去除乙醇及部分水，使得最终玉米醇溶蛋白浓度为3.0％，最终制得甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价纳米颗粒混悬液；
S4.将步骤S3得到的共价纳米颗粒混悬液倒入玻璃皿中，经冷冻干燥后(-42℃，46Mpa，24h)，即得甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒。
实施例2甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒的制备
本发明甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒的制备，包括如下步骤：
S1.分析天平上精密称取玉米醇溶蛋白粉末1g溶于50mL的70％乙醇溶液中，在搅拌1000rpm的条件下持续搅拌2h，搅拌全程避光，待充分搅拌结束后于4℃冰箱储藏过夜，使其充分水合，制得质量浓度为2.0％的玉米醇溶蛋白乙醇溶液，备用；
S2.精密称取15mg甘蔗叶多酚溶于50mL纯化水中，制备过程全程避光，充分搅拌溶解后，制得质量浓度为0.03％的甘蔗叶多酚水溶液，备用；
S3.将经步骤S1和S2制备得到的玉米醇溶蛋白乙醇溶液和甘蔗叶多酚水溶液的pH通过0.1M NaOH调节pH至9.0±0.02后，并在1000rpm的搅拌条件下，将甘蔗叶多酚水溶液以细流状加入至玉米醇溶蛋白乙醇水溶液中，等体积混合，避光持续搅拌16h后旋蒸(42℃，60rpm)去除乙醇及部分水，使得最终玉米醇溶蛋白浓度为3.0％，最终制得甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价纳米颗粒混悬液；
S4.将步骤S3得到的共价纳米颗粒混悬液倒入玻璃皿中，经冷冻干燥后(-42℃，46Mpa，24h)，即得甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒。
实施例3甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒的制备
本发明甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒的制备，包括如下步骤：
S1.分析天平上精密称取玉米醇溶蛋白粉末1g溶于50mL的70％乙醇溶液中，在搅拌1000rpm的条件下持续搅拌2h，搅拌全程避光，待充分搅拌结束后于4℃冰箱储藏过夜，使其充分水合，制得质量浓度为2.0％的玉米醇溶蛋白乙醇溶液，备用；
S2.精密称取25mg甘蔗叶多酚溶于50mL纯化水中，充分搅拌溶解后，制备过程全程避光，制得质量浓度为0.05％的甘蔗叶多酚水溶液，备用；
S3.将经步骤S1和S2制备得到的玉米醇溶蛋白乙醇溶液和甘蔗叶多酚水溶液的pH通过0.1M NaOH调节pH至9.0±0.02后，并在1000rpm的搅拌条件下，将甘蔗叶多酚水溶液以细流状加入至玉米醇溶蛋白乙醇水溶液中，等体积混合，避光持续搅拌16h后旋蒸(42℃，60rpm)去除乙醇及部分水，使得最终玉米醇溶蛋白浓度为3.0％，最终制得甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价纳米颗粒混悬液；
S4.将步骤S3得到的共价纳米颗粒混悬液倒入玻璃皿中，经冷冻干燥后(-42℃，46Mpa，24h)，即得甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒。
实施例4仅碱处理的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的制备
本发明甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒的制备，包括如下步骤：
S1.分析天平上精密称取玉米醇溶蛋白粉末1g溶于50mL的70％乙醇溶液中，在搅拌1000rpm的条件下持续搅拌2h，搅拌全程避光，待充分搅拌结束后于4℃冰箱储藏过夜，使其充分水合，制得质量浓度为2.0％的玉米醇溶蛋白乙醇溶液，备用；
S2.将经步骤S1制备得到的玉米醇溶蛋白乙醇溶液水溶液和不含甘蔗叶多酚的去离子水的pH通过0.1M NaOH调节pH至9.0±0.02后，并在1000rpm的搅拌条件下，将不含甘蔗叶多酚的去离子水以细流状加入至玉米醇溶蛋白乙醇水溶液中，等体积混合，避光持续搅拌16h后旋蒸(42℃，60rpm)去除乙醇及部分水，使得最终玉米醇溶蛋白浓度为3.0％，最终制得玉米醇溶蛋白纳米颗粒混悬液；
S3.将步骤S2得到的纳米颗粒混悬液倒入玻璃皿中，经冷冻干燥后(-42℃，46Mpa，24h)，即得玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒。
实施例5甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒稳定的皮克林乳液的制备
将实施例1-3采用不同质量浓度的甘蔗叶多酚水溶液(0.01％，0.03％和0.05％)制备的甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒分别命名为SGLpZ-1(实施例1)、SGLpZ-3
(实施例2)、SGLpZ-5(实施例3)和实施例4仅碱处理的玉米醇溶蛋白纳米颗粒(命名为：SGLpZ-0)作为对照组，分别制备采用实施例1-4纳米颗粒稳定的皮克林乳液，具体包括如下步骤：
利用高速剪切机，将经实施例1-3步骤S3的甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白复合颗粒混悬液或实施例4步骤S2制得的玉米醇溶蛋白纳米颗粒混悬液按9:1体积比与玉米油混合，于12000rpm的转速下剪切2min得到初乳液，最后通过细胞破碎仪，在超声功率为30％，超声时长5min，超声开关模式为2.5S开2.5S关的条件下，共匀质2次。最终得到匀质均匀的甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价颗粒稳定的皮克林乳液，分别命名为SPZ-1、SPZ-3、SPZ-5及SPZ-0(对照组)。
实施例6负载姜黄素的甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白皮克林乳液的制备
将姜黄素溶于玉米油中(0.1％，w/v)，采用实施例5所述制备方法进行负载姜黄素的甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白皮克林乳液的制备，将采用实施例3和4不同纳米颗粒稳定的皮克林乳液负载的姜黄素分别命名为Cur-SPZ-5和Cur-SPZ-0(对照组)。
实验一甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价纳米粒的性质检验
对实施例1-4制得的甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒进行性质检测。
1.1共价纳米颗粒制备过程中甘蔗叶多酚水溶液pH值调节效果观察实验
对甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒的制备过程中甘蔗叶多酚水溶液pH值调节效果进行检测观察，取适量实施例3步骤S3调节pH前和后的甘蔗叶多酚水溶液于10mL EP管中，进行颜色观察比对，实验结果如图2所示。
1.2共价纳米颗粒的扫描电子显微镜下形貌观察
根据国标GB/T36422-2018，将实施例1-4制得的甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒和仅碱处理的玉米醇溶蛋白纳米颗粒研磨后粘于导电胶上，通过扫描电子显微镜进行观察。实验结果如图3所示，其中，图3(A)为仅碱处理后的玉米醇溶蛋白共价纳米粒SEM结果，图3(B)为添加0.01％wt浓度甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价纳米粒SEM结果，图3(C)为添加0.03％wt浓度甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价纳米粒SEM结果，图3(D)为添加0.05％wt浓度甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价纳米粒SEM结果。
1.3共价纳米颗粒的荧光分析
将实施例1-4制得的甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价纳米粒和仅碱处理的玉米醇溶蛋白纳米颗粒分别溶于70％乙醇溶液，在室温、Ex＝280nm、Em＝290-450nm和狭缝宽度为5.0nm的条件下，使用荧光光谱仪进行荧光测定。
实验结果如图4所示，通过荧光分析结果可得，玉米蛋白的最大值为308nm，添加甘蔗叶多酚对峰值位置没有明显影响，但对峰值强度有明显的影响。每个样品的荧光强度发生的这些差异可能是酪氨酸残基参与了玉米蛋白和甘蔗叶多酚的共价反应，减少了其暴露，最终导致荧光强度的逐渐降低。同时，荧光强度的衰减作用随着甘蔗叶多酚浓度的增加而增加，这也意味着玉米醇溶蛋白和甘蔗叶多酚之间的相互共价作用正逐渐变强。
1.4共价纳米颗粒的傅里叶红外分析
根据国标GB/T 6040-2019红外光谱分析方法通则，将实施例1-4制得的甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒和仅碱处理的玉米醇溶蛋白纳米颗粒以及甘蔗叶多酚(SGLp)、玉米醇溶蛋白(Zein)在400-4000cm-1波长范围下测定傅立叶变换红外光谱。所有纳米粒子均以1:100的质量比与KBr粉末混合。
实验结果如图5所示，按照1:100质量比将各纳米颗粒冻干粉末和KBr，研磨压片。通过傅里叶红外仪器分析(图5)，与玉米醇溶蛋白相比，甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价纳米粒的酰胺I和酰胺A中也观察到了带移(从1522cm-1到1508cm-1和从3433cm-1到3356cm-1)，这进一步证实了玉米醇溶蛋白和甘蔗叶多酚之间存在相互共价作用。
1.5共价纳米颗粒的X射线衍射分析
根据中华人民共和国教育行业标准JY-T 0587-2020，将实施例1-4制得的甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒和仅碱处理的玉米醇溶蛋白纳米颗粒，以及甘蔗叶多酚(SGLp)、玉米醇溶蛋白(Zein)均匀地置于玻璃板上，利用X-射线衍射仪在常温条件下对样品进行测定，样品扫描范围为5-45°。
实验结果如图6所示，如图6所示，玉米醇溶蛋白在9°(主要来自玉米醇溶蛋白α-结构)和19.74°(主要来自玉米醇溶蛋白后期的α-螺旋堆积)处出现了峰值，这两个峰值表现宽且平坦，代表了玉米醇溶蛋白为非晶态结构。相比之下，甘蔗叶多酚只有一个位于20.92°的峰。由SGLpZ-5组可知，在添加甘蔗叶多酚后，样品的XRD结果发生了轻微的变化，包括9°处的峰强度减弱，第二个峰向更大的角度移动，这表明玉米醇溶蛋白和甘蔗叶多酚之间可能产生了新的共价结构。
1.6共价纳米颗粒的紫外可见光谱分析
根据中华人民共和国教育行业标准JY/T 0570-2020，将实施例1-4制得的甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒和仅碱处理的玉米醇溶蛋白纳米颗粒分别溶解于70％乙醇溶液，并稀释50倍，置于标准比色皿中。利用70％乙醇溶液作为空白对照进行基线调零后，在190-500nm波长范围下对样品进行紫外可见吸收光谱分析。
实验结果如图7所示，由于色氨酸和酪氨酸残基能够吸收紫外光，因此蛋白质能够产生紫外吸收光谱。根据不同的紫外吸收光谱可以确定蛋白质的构象变化。甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价纳米粒的紫外可见光谱结果如图7所示，三个样品特征吸收峰都在274nm处，这是玉米醇溶蛋白的特征吸收峰，并且该特征吸收峰与其色氨酸和酪氨酸残基有关。通过添加甘蔗叶多酚，样品最大吸收峰的强度逐渐增加。因此，一方面，结果表明玉米蛋白的构象可能发生了变化，另一方面，甘蔗叶多酚的引入可能增强了与玉米醇溶蛋白的相互作用。
1.7共价纳米颗粒的SDS-PAGE实验
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。具体操作方法如下：，取5.0mg实施例1-4制得的甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒和仅碱处理的玉米醇溶蛋白纳米颗粒，加入5×loading buffer和400μL电泳缓冲液(使5×loading buffer终浓度为1×)，于95℃中加热10min使蛋白变性得到上样样品。分别配制10％的分离胶和8％的浓缩胶，每个样品上样10μL，选择RM19001标准物为参照。条带全部跑出后，采用染色液对其染色直至观察到清晰的蓝色条带。
实验结果如图8所示，SDS-PAGE结果如图8所示，其中条带1为Marker，条带二为Zein，条带三至条带6分别为SGLpZ-0，SGLpZ-1，SGLpZ-3和SGLpZ-5。由实验结果可知，甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒和仅碱处理的玉米醇溶蛋白纳米颗粒条带大小相似，然而随着甘蔗叶多酚的加入，条带的大小发生不同程度的变化，在较大甘蔗叶多酚浓度下所制备的共价纳米粒在较大的分子量条带中也存在分布，该实验结果与粒径结果相同，表明玉米醇溶蛋白与甘蔗叶多酚发生了有效的结合，并产生了更大分子量的共价纳米粒。
1.8共价纳米颗粒的粒径、PDI及Zeta电位实验
通过马尔文粒径仪测定实施例1-4制得的甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒和仅碱处理的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的粒径、PDI及Zeta电位。具体操作方法如下：取实施例1-4制得的纳米颗粒用去离子水配制成浓度为1.0mg/mL的纳米颗粒溶液，继续用去离子水稀释50倍后，于25℃，折射率1.330的条件下进行测定。
实验结果如图9所示，各共价纳米粒粒径、PDI及Zeta电位结果如图9所示，由实验结果可知，随着甘蔗叶多酚含量的增加，样品的粒径逐渐增大(从255.5±5.2nm到318±5.9nm)，这表明结合的甘蔗叶分可能对玉米醇溶蛋白的结构具有一定的影响，从而可能影响玉米醇溶蛋白的自组装能力。此外，所有样品的PDI值均小于0.2，这意味着制备所得的共价纳米粒子的分散性是可以接受的。此外，甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价纳米粒的Zeta电位绝对值均高于30mV，表明通过甘蔗叶多酚共价偶联后的玉米醇溶蛋白纳米粒具有较好的稳定性。
1.9共价纳米粒颗粒的表面疏水性变化实验
对实施例1-4制得的甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒和仅碱处理的玉米醇溶蛋白纳米颗粒进行表面疏水性分析。具体操作方法如下：将8mM的8-苯胺基萘-1-磺酸(ANS)溶解于PBS中(10mM，pH 7.0)，用PBS稀释实施例1-4制得的纳米颗粒溶液至蛋白浓度为0.1mg/mL-0.3mg/mL。将20μL的ANS溶液加入4.0mL上述稀释样品溶液中充分混合，在激发波长390nm，发射波长400-700nm下测定荧光强度。表面疏水性利用荧光强度和样品浓度的线性回归斜率表示。
实验结果如图10所示，通过ANS方法测定各个样品的表面疏水性，结果见图10。随着甘蔗叶多酚的增加，共价纳米粒的表面疏水性明显下降(从1366.4±73.45到1017.05±66.51，P＜0.05)。
1.10共价纳米颗粒的体外抗氧化实验
对实施例1-4制得的纳米颗粒进行体外抗氧化活性实验，包括DPPH·清除率的测定、ABTS+·清除率的测定、铁原子还原能力的测定，具体测试方法如下：
a.DPPH·清除率的测定
将1.0mg/mL实施例1-4所制备的纳米颗粒分别与DPPH(0.1mmol/L)乙醇溶液在黑暗中反应30min，在517nm处测定吸光度，按计算公式(1)计算DPPH·清除能力：
其中，A0为DPPH溶液+无水乙醇的吸光度；A1为样品和DPPH溶液的吸光度；A2为样品和无水乙醇的吸光度。
b.ABTS+·清除率的测定
将等体积的7mmol/L ABTS和2.45mmol/L过硫酸钾溶液在室温下黑暗中混合，4℃环境下，静置12-16h，获得ABTS+·溶液(7mmol/L)，用无水乙醇稀释ABTS溶液制备ABTS工作液，使其在734nm处吸光度为0.70±0.02。将1.0mg/mL实施例1-4所制备的纳米颗粒分别加入等体积ABTS工作液中，充分混合，反应10min后，于734nm处测定吸光度，按公式(2)计算ABTS+·清除活性：
A0为ABTS溶液+无水乙醇的吸光度；A1为样品和ABTS溶液的吸光度；A2为样品和无水乙醇的吸光度。
c.铁原子还原能力的测定
分别取1mL 10mg/mL实施例1-4所制备的纳米颗粒，加入2.5mL(0.2mol/L、pH6.6)磷酸盐缓冲液，2.5mL的10mg/mL铁氰化钾，混匀后于50℃水浴20min，冷却后加入2.5mL的100mg/mL三氯乙酸，3000r/min离心10min。移取2.5mL上清液，加入2.5mL蒸馏水及0.5mL的1mg/mL FeCl3，静置10min，于700nm处测定吸光度，按公式(3)计算还原能力。
还原能力＝Ai-A0 (3)
式中：Ai为样品溶液吸光度；A0空白样品吸光度。
实验结果如图11所示，通过三种基本的体外抗氧化能力测定方法(DPPH自由基清除实验、ABTS自由基清除实验及还原力测定实验)用以评估甘蔗叶多酚修饰后抗氧化能力的变化，结果见图11。结果显示，随着甘蔗叶多酚浓度的增加，纳米粒子的抗氧化能力得到增强。三个抗氧化能力值分别提高至62.14±0.17％(DPPH)、50.52±0.02％(ABTS)和0.39±0.04(还原力)，P<0.05)。这可能是由于甘蔗叶多酚与玉米醇溶共价结合后所导致的结果。
实验二甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒稳定的皮克林乳液的性质检验
对本发明实施例5制备的甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒稳定的皮克林乳液进行检测。
2.1皮克林乳液水包油型直观判断
通过分散法对实施例5所得的皮克林乳液进行类型判断。具体操作方法如下：将实施例5制备的甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒稳定的皮克林乳液分别滴加于去离子水和玉米油中，若乳液分散在去离子水中则判断为水包油型，反之则为油包水型。
实验结果如图12所示，其中，图12中左边瓶装为去离子水，右边瓶装为玉米油，由实验结果可知，本发明实施例5制得的甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒稳定的皮克林乳液的乳液类型为水包油型。
2.2皮克林乳液模量及表观粘度检测实验
克林乳液进行流变学研究，具体操作方法如下：将实施例5制备的甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒稳定的皮克林乳液均匀地平铺于加热板上，于25℃条件下测定0.1-100s-1剪切速率范围内样品的粘弹性变化，同时在1Pa压下，测定1-10Hz范围内样品的储能模量(G’)与损耗模量(G”)的变化。
实验结果如图13所示，各个样品的皮克林乳液流变测量结果如图13所示，随着剪切频率增加，G'(储能)和G"(损耗模量)均呈缓慢增加趋势，且G'高于G"。以往的研究表明，皮克林乳液的G'值越高，该皮克林乳液在受到外力作用时变形的可能性就越小，最终表现出高度的物理稳定性。此外，表观粘度随着剪切速率的增加而降低，但两者之间没有明显的线性关系。这些特征表明甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白稳定的皮克林乳液呈现非牛顿流体的趋势。
2.3皮克林乳液在储藏20天前后的粒径及zeta电位检测实验
过马尔文粒度仪分别测定新鲜制备时与储藏20天后皮克林乳液的粒径与Zeta电位。具体操作方法如下：将实施例5制备的甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒稳定的皮克林乳液用去离子水稀释50倍后置于测定的比色皿中，设置测试温度25℃，水和玉米油的折射率分别为1.330和1.470条件下测定。
实验结果如图14所示，各皮克林乳液储藏20天前后粒径、Zeta电位变化如图14所示。经过20天的储藏时间，不同皮克林乳液的粒径发生了不同程度的变化。其中，仅碱处理的玉米醇溶蛋白纳米粒(对照组)的影响最大，其平均粒径从230.4±2.85nm增大至452.5±11.78nm。然而，通过甘蔗叶多酚与玉米醇溶蛋白共价结合后的粒径增大较少(230.9±13.57nm到264.2±10.22nm)。此外，Zeta电位结果表明，添加较高浓度的甘蔗叶多酚所制备的皮克林乳液在20天储藏时间中稳定性较好。
2.4皮克林乳液在储藏20天前后的色度检测实验
通过色度仪分别测定新鲜制备时与储藏20天后皮克林乳液的色度。具体操作方法如下：将实施例5制备的甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒稳定的皮克林乳液均匀平铺于色度仪中，测试其L*、a*和b*值。
实验结果如图15所示，通过色度仪测定各皮克林乳液20天储藏前后的色度变化。L*、a*和b*值分别代表皮克林乳液的亮度、红色深度和黄色深度。图15显示，随着甘蔗叶多酚浓度增加，a*和b*值逐渐增加。多酚氧化成醌类化合物后，溶液的黄色加深，测定结果与实施例1-3共价纳米颗粒pH值调节效果观察实验结果(图2)相符。储存20天后L*、a*和b*值没有发生显著变化，这表明随着时间的延长，各皮克林乳液颜色的稳定性从而表明各皮克林乳液具有较好的稳定性。
2.5皮克林乳液在储藏20天前后的微观检测实验
通过Nikon显微镜分别测定新鲜制备时与储藏20天后皮克林乳液的微观结构。具体操作方法如下：取适量实施例5制备的甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒稳定的皮克林乳液滴加于载波片上，盖上玻片后通过Nikon显微镜观察乳液的微观结构。
实验结果如图16所示，图16为实施例5中制备得到的皮克林乳液在储藏20天前后的微观结构图。结果显示，仅由玉米醇溶蛋白所制备的皮克林乳液在储存20天后出现液滴聚集现象。相反，甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白所制备的皮克林乳液该现象得到改善，这表明甘蔗叶多酚的加入能提高皮克林乳液的稳定性，最终减少液滴聚集。
2.6皮克林乳液在储藏20天过程中过氧化物含量测定
储藏20天对皮克林乳液进行氧化稳定性分析，具体测定指标为初级氧化产物及次级氧化产物。乳液中初级氧化产物测定的具体操作方法如下：将0.3mL样品与1.5mL萃取溶剂I(异辛烷:异丙醇＝3:1，v/v)混合，持续振荡1min，混合物以2000g离心5min，收集200μL有机相并加入2.8mL萃取溶剂II(甲醇:丁醇＝2:1，v/v)、15μL3.94M硫氰酸铵和50μL三价铁离子溶液(由0.132M BaCl2、0.144M FeSO4以1:1的体积比混合制备而成)避光反应20min。最后，利用紫外分光光度计在510nm处测量混合溶液的吸光度，根据过氧化氢异丙苯标准曲线计算脂质氢过氧化物(LH)含量。次级氧化产物测定的具体操作方法按照GB/T5009.181-2016。
实验结果如图17所示，脂质氧化会导致含油相氧化，从而影响皮克林乳剂的质量，缩短其储存时间，进一步影响皮克林乳剂在食品及医药领域中的应用。在20天的储藏过程中，四种皮克林乳液的LH和MDA值均有所增加，这表明皮克林乳液出现氧化现象。如图17所示，对照组的LH和MDA的最终值分别为1.57±0.01mmol/L和2.37±0.10μmol/L，而甘蔗叶多酚加入后则至0.87±0.03mmol/L和1.59±0.01μmol/L，这与实施例1-3共价纳米颗粒的体外抗氧化实验结果(图11)一致，即随着甘蔗叶多酚浓度的增加，抗氧化能力更强，从而提高了皮克林乳液的氧化稳定性。
2.7皮克林乳液在模拟体外消化过程中游离脂肪酸的释放量检测实验
模拟体外模拟消化环境，对实施例5所制备得到的皮克林乳液进行游离脂肪酸释放率(FFA)测定。具体操作方法如下：取20mL实施例5所制备得到的皮克林乳液样品中加入20mL模拟胃液(SGF，由0.85gNaCl和0.7mL HCl在100mL去离子水中组成，用1M HCl调节pH值为2.0)混合均匀后，将胃蛋白酶(3.2mg/mL)加入混合物中。并再次将混合物的pH值调至2.0(1M HCl)。在100rpm和37℃条件下搅拌2小时以模拟胃消化。将胃模拟样本的pH用0.1MNaOH调节至7.0。然后，用等体积的模拟肠液(SIF，含有8.0mg/mL胆盐、10mM CaCl2，120mMNaCl和1.0mg/mL胰酶)混合。并再次将混合物的pH值用0.1M NaOH调节至7.0。在100rpm和37℃条件下搅拌2小时以模拟小肠消化。与此同时，通过pH值恒定法根据NaOH(0.1M NaOH)的体积计算FFA的含量。
实验结果如图18所示，在脂肪酶的作用下，皮克林乳液中的油滴会水解为甘油三酯，甘油三酯能进一步水解生成游离脂肪酸(FFA)。在此过程中，溶液的pH值下降，因此可利用pH-stat法计算FFA的释放速率，后者也是评价皮克林乳液消化情况的重要指标。如图18所示，在消化的前20分钟，各皮克林乳液的FFA释放速度很快，在20分钟后呈稳定趋势。其主要原因是三酰甘油的快速水解导致溶液pH值快速下降，20分钟后三酰甘油基本水解完全，溶液pH值趋于稳定。随着甘蔗叶浓度的增加，FFA释放量减少，消化结束时，对照组及高浓度甘蔗叶多酚组的FFA释放量分别为20.61±0.10％和16.14±0.69％。
2.8皮克林乳液体外安全性评价
克林乳液进行体外安全性评价。具体操作方法如下：红细胞悬浮液的预处理：从一只大鼠心脏中抽取10毫升血液至EDTA抗凝血管中离心10分钟，离心转速为2000转/分以去除上层纤维蛋白。下层红细胞用生理盐水反复洗涤三次。然后，取出2.0mL红细胞原液至100mL棕色容量瓶中，用无菌生理盐水配制成2％(v/v)的红细胞悬液。取实施例5中采用实施例1-4所制备得到纳米颗粒稳定的皮克林乳液样品，采用无菌生理盐水进行稀释，分别配制浓度为2.0、4.0、6.0、8.0和10mg/mL的皮克林乳液样品，将2.5mL红细胞悬液与不同浓度(2.0、4.0、6.0、8.0和10mg/mL)的实施例5所制备得到的皮克林乳液样品等量混合，轻轻摇动，然后置于37℃水浴中孵育1小时。然后将上清液在2000rpm转速下离心10min，然后在541nm波长处测量其吸光度。取相同体积的蒸馏水和生理盐水样品溶液分别用作阳性对照和阴性对照。溶血率的计算公式如下：
其中Ai是样品吸光度。Aj为阴性对照吸光度。Ao是阳性对照吸光度。实验结果如图19所示，皮克林乳液被用于食品包装，以改善食品的气味和口感，延长食品的保质期，这无疑涉及体内安全性评估。溶血实验被用来评估皮克林乳液的安全性。溶血实验是量化药物疗效、评估细胞活力、食品应用和药物安全性的重要指标。从图19可以看出，在高皮克林乳剂用量下，各乳液的溶血率均小于5％，这表明所制备的皮克林乳液具有良好的安全性。
实验三本发明甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒稳定的皮克林乳液用于姜黄素递送的应用研究
3.1姜黄素的体外消化实验
a.体外消化环境设计
将30mL新鲜的Cur-SZP-0和Cur-SZP-5加入相同体积的模拟胃液(SGF，由0.85gNaCl、0.7mL HCl和3.2mg/mL胃蛋白酶在100mL去离子水中组成，pH＝2)。然后，再次将系统的pH值调至2.0，并在100rpm和37℃下搅拌2小时，以模拟胃消化。模拟消化反应结束后，将体系的pH值调至7.0，并加入60mL模拟肠液(SIF，含8.0mg/mL胆盐、10mM CaCl2、120mM NaCl和1.0mg/mL胰酶，pH＝7.0)。体系的pH值再次调整为7.0。在100rpm和37℃下搅拌2小时，以模拟肠道消化。
b.粒径及Zeta电位测定
粒径及Zeta电位的测定参照实验一。
c.体外消化显微结构观察
体外消化显微结构观察参照实验二。
d.姜黄素在体外消化过程中的累积释放量
每30分钟收集1.0mL Cur-SZP-0/Cur-SZP-5，放入冰浴中冷却2分钟，然后以6000rpm离心15分钟。将1.0mL Cur-loaded-SZP与4.0mL无水乙醇混合，涡旋30秒，记录萃取体积。根据姜黄素标准曲线在419纳米波长(溶于无水乙醇，Y＝0.1578X-0.0119，R2＝0.9998)下的曲线，计算萃取乳液中的姜黄素含量，进而通过下式计算姜黄素在体外消化过程中的累积释放量。
其中，Mt为SZP姜黄素的累积释放量，M0为SZP中的姜黄素含量。
e.姜黄素的生物利用度计算
通过离心(10000转/分，25℃，20分钟)和0.45μm滤膜收集中间胶束相，并记录胶束相体积，通常认为胶束相是人体肠道细胞可吸收的部分。根据上述步骤d中的说明计算胶束相中Cur的含量，最终计算出Cur的生物利用率如下：
其中，Wa代表胶束相中的Cur含量，Wb代表Cur-SZP-0/5中的Cur含量。
实验结果如图20所示，
3.2姜黄素的体外抑制AAPH诱导红细胞溶血实验
a.红细胞溶血测定
红细胞溶血的测定中小鼠腹主动脉血液由广东药科大学实验动物中心提供。首先，将血样在2000rpm、4℃条件下离心10分钟，然后用生理盐水洗涤3次，澄清上清液，制备红细胞。最后，用生理盐水稀释得到红细胞悬浮液(20％)。溶血抑制试验的步骤如下：0.2mL红细胞悬液(实验前37℃孵育10分钟)中加入0.2mL不同浓度的样品溶液或生理盐水和0.4mL200mM AAPH溶液，轻轻摇匀后，在37℃下培养3小时，然后加入3.2mL生理盐水，轻轻振荡，在4℃下离心(1200g，10分钟)，最后在540nm处测定吸光度，记为A。完全溶血组(0.2毫升20％红细胞悬液+3.8毫升蒸馏水)也被设置为试验组，即B组：溶血抑制率通过下式计算：
b.红细胞的扫描电镜
样品先用2.5％戊二醛在4℃固定过夜，然后用30、50、70、90和100％乙醇脱水。干燥后喷金，用扫描电镜观察。
c.最大姜黄素浓度样品的溶血率测定
具体的操作方法如实验二中2.8所述，计算公式如下：
其中，Ai为样本吸光度(样本+红细胞悬液)，Aj为阴性对照吸光度(生理盐水+红细胞悬液)。Ao为阳性对照吸光度(蒸馏水+红细胞悬液)。
3.3实验结论
实验结果如图21所示，通过甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价纳米粒稳定的皮克林乳液递送姜黄素，不仅能达到缓释的作用，与单一的油相姜黄素对比，也提高了姜黄素的生物利用度。在体外抑制AAPH诱导的红细胞氧化溶血中也能产生明显的抑制作用并在溶血实验中表现出良好的安全性。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (10)
1.一种甘蔗叶多酚修饰的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、精密称取玉米醇溶蛋白溶于乙醇溶液中，持续搅拌1-3h，全程避光操作，冷藏过夜，充分水合，制得质量浓度为1.0％-3.0％的玉米醇溶蛋白乙醇溶液，备用；
S2、分别精密称取5-25mg的甘蔗叶多酚溶于纯化水中，充分搅拌溶解后，全程避光，制得质量浓度为0.01-0.05％的甘蔗叶多酚水溶液，备用；
S3、使用pH调节剂NaOH调节步骤S1和S2制得的玉米醇溶蛋白乙醇溶液和甘蔗叶多酚水溶液的pH至9.0±0.02后，在搅拌条件下，将甘蔗叶多酚水溶液以细流状沿烧杯壁缓慢加入至玉米醇溶蛋白乙醇水溶液中，等体积混合，避光搅拌15～16h，旋蒸去除乙醇及部分水，制得甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒混悬液；
S4、将步骤S3得到的共价复合纳米颗粒混悬液倒入玻璃皿中，经冷冻干燥后，即得甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述甘蔗叶多酚的制备方法，包括如下步骤：
A、取适量的干燥的甘蔗叶粉末与烧杯中，按液料比为10:1mL/g加入80％乙醇；在超声功率300-400W，超声时间20-35min和超声温度40-80℃条件下提取，提取三次，合并滤液；提取液在4000-6000rpm的转速条件下离心10min；离心结束后，将提取液在旋蒸温度40-60℃和旋蒸转速率40-50rpm条件下浓缩，最终得到甘蔗叶多酚浓缩液；
B、将石油醚和步骤A制得的甘蔗叶多酚浓缩液按体积比为3:1mL/mL的条件下重复萃取3遍，得到甘蔗叶多酚待上样液；
C、将步骤B制得的甘蔗叶多酚待上样液经富集后，收集得到50％乙醇洗脱相，将该相依次通过旋蒸浓缩和冻干后，得到甘蔗叶多酚。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中溶剂为70％的乙醇溶液，搅拌转速为950～1000rpm，冷藏温度为2-8℃。
4.据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中所述pH调节剂NaOH的浓度为0.05-0.1M，所述旋蒸过程中旋蒸温度为40～43℃，旋转转速为50～60rpm，最终蛋白浓度为3.0％。
5.据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中冷冻干燥温度为-50～-60℃，压力为30～50Mpa，冻干时间为20-30h。
6.一种根据权利要求1-5任一项所述制备方法制得的甘蔗叶多酚修饰的玉米醇溶蛋白纳米颗粒。
7.一种利用权利要求1-5任一项所述制备方法或权利要求6所述甘蔗叶多酚修饰的玉米醇溶蛋白纳米颗粒制备具有营养活性物质递送功能的皮克林乳液体系的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述皮克林乳液体系的制备过程包括：
a.精密称取玉米醇溶蛋白溶于乙醇溶液中，持续搅拌1-3h，全程避光操作，冷藏过夜，充分水合，制得质量浓度为1.0％-3.0％的玉米醇溶蛋白乙醇溶液，备用；
b.分别精密称取5-25mg的甘蔗叶多酚溶于纯化水中，充分搅拌溶解后，全程避光，制得质量浓度为0.01-0.05％的甘蔗叶多酚水溶液，备用；
c.使用pH调节剂NaOH调节步骤a和步骤b制得的玉米醇溶蛋白乙醇溶液和甘蔗叶多酚水溶液的pH至9.0±0.02后，在搅拌条件下，将甘蔗叶多酚水溶液以细流状沿烧杯壁缓慢加入至玉米醇溶蛋白乙醇水溶液中，等体积混合，避光搅拌15～16h，旋蒸去除乙醇及部分水，制得甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价复合纳米颗粒混悬液；
d.利用高速剪切机，将步骤c甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价复合纳米混悬液与玉米油按体积比为9:1混合，高速剪切机的转速为12000～14000rpm，剪切时长为2.0～3.0min，通过细胞破碎仪，超声功率为20-40％，超声时长4-8min，超声开关模式为2.5S开2.5S关，期间共匀质2～3次，制得均匀稳定的甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白共价复合颗粒稳定的水包油型皮克林乳液；
e.将营养功能成分溶于玉米油中(0.1％，w/v)，重复步骤S4，即得负载姜黄素的甘蔗叶多酚-玉米醇溶蛋白皮克林乳液。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述皮克林乳液体系可应用于营养功能成分缓释递送载体的制备。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述营养功能成分包括但不限于姜黄素、多酚类、黄酮类、鱿鱼黑色素。
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