CN117653630A - β-咔伯啉生物碱类化合物在制备预防和/或治疗纤维化疾病药物中的应用 - Google Patents
β-咔伯啉生物碱类化合物在制备预防和/或治疗纤维化疾病药物中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117653630A CN117653630A CN202311753272.4A CN202311753272A CN117653630A CN 117653630 A CN117653630 A CN 117653630A CN 202311753272 A CN202311753272 A CN 202311753272A CN 117653630 A CN117653630 A CN 117653630A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fibrosis
- beta
- diseases
- cells
- alkaloid compound
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 title claims abstract description 30
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims abstract description 30
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 title claims abstract description 30
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 29
- -1 beta-carboline alkaloid compound Chemical class 0.000 title claims abstract description 20
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title abstract description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 11
- 206010050207 Skin fibrosis Diseases 0.000 claims abstract description 15
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 208000005069 pulmonary fibrosis Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 230000003176 fibrotic effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims abstract description 5
- 206010023421 Kidney fibrosis Diseases 0.000 claims description 10
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 claims description 8
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 7
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 35
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 abstract description 23
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 abstract description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 23
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 abstract description 21
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 abstract description 21
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 abstract description 18
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 abstract description 18
- 201000002793 renal fibrosis Diseases 0.000 abstract description 18
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 10
- 206010019668 Hepatic fibrosis Diseases 0.000 abstract description 5
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 abstract description 5
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 abstract description 5
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 abstract description 5
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 67
- 238000000034 method Methods 0.000 description 23
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 16
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 16
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 15
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 13
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 12
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 11
- 208000004608 Ureteral Obstruction Diseases 0.000 description 10
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 9
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 9
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 8
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 7
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 7
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 7
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 7
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 5
- 210000000738 kidney tubule Anatomy 0.000 description 5
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 5
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000002300 anti-fibrosis Effects 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 4
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 4
- 210000004024 hepatic stellate cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 3
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 3
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 3
- 229940096422 collagen type i Drugs 0.000 description 3
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 3
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 3
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 3
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 3
- 208000009304 Acute Kidney Injury Diseases 0.000 description 2
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 101800005151 Cholecystokinin-8 Proteins 0.000 description 2
- 102400000888 Cholecystokinin-8 Human genes 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000009794 Idiopathic Pulmonary Fibrosis Diseases 0.000 description 2
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 2
- 208000033626 Renal failure acute Diseases 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 201000011040 acute kidney failure Diseases 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 230000003510 anti-fibrotic effect Effects 0.000 description 2
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 2
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 2
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 2
- 208000036971 interstitial lung disease 2 Diseases 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 2
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000820 toxicity test Toxicity 0.000 description 2
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 206010007559 Cardiac failure congestive Diseases 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000004930 Fatty Liver Diseases 0.000 description 1
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- 206010019708 Hepatic steatosis Diseases 0.000 description 1
- 206010019728 Hepatitis alcoholic Diseases 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000037147 Hypercalcaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000031226 Hyperlipidaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 201000001431 Hyperuricemia Diseases 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 208000000913 Kidney Calculi Diseases 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000002720 Malnutrition Diseases 0.000 description 1
- 206010029148 Nephrolithiasis Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 206010037596 Pyelonephritis Diseases 0.000 description 1
- 206010039710 Scleroderma Diseases 0.000 description 1
- 108010087230 Sincalide Proteins 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 229940022663 acetate Drugs 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 208000002353 alcoholic hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003444 anaesthetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000003367 anti-collagen effect Effects 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 239000012752 auxiliary agent Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 229940001468 citrate Drugs 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000003684 drug solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 208000010706 fatty liver disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000001434 glomerular Effects 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000000148 hypercalcaemia Effects 0.000 description 1
- 208000030915 hypercalcemia disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 210000001804 kidney proximal tubule epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 229940049920 malate Drugs 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N malic acid Chemical compound OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001071 malnutrition Effects 0.000 description 1
- 235000000824 malnutrition Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 208000015380 nutritional deficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 206010035653 pneumoconiosis Diseases 0.000 description 1
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 201000000306 sarcoidosis Diseases 0.000 description 1
- 230000037390 scarring Effects 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 1
- 231100000240 steatosis hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 208000037816 tissue injury Diseases 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 238000010023 transfer printing Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 210000000626 ureter Anatomy 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
- A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
- A61K31/437—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a five-membered ring having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. indolizine, beta-carboline
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
- A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
- A61K31/5377—1,4-Oxazines, e.g. morpholine not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. timolol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Dermatology (AREA)
Abstract
本发明公开了β‑咔伯啉生物碱类化合物在制备预防和/或治疗纤维化疾病药物中的应用，涉及医药技术领域。具体公开了β‑咔伯啉生物碱类化合物在制备预防和/或治疗纤维化疾病药物中的应用，所述的β‑咔伯啉生物碱类化合物为TB‑68d及其衍生物，其中为TB‑68d及其衍生物在制备预防和/或治疗纤维化疾病药物中作为唯一活性成分。本发明提供了β‑咔伯啉生物碱类化合物TB‑68d及其衍生物在TGF‑β1诱导细胞形成纤维化模型中，TB‑68d及其衍生物可以抑制纤连蛋白、I型胶原蛋白、α‑平滑肌动蛋白三个目的蛋白的表达，具有抗肺、肝、肾、皮肤纤维化活性，提示其能够在制备预防和/或治疗肺、肝、肾、皮肤纤维化药物的新用途，为治疗器官纤维化疾病提供了新思路。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及β-咔伯啉生物碱类化合物在制备预防和/或治疗纤维化疾病药物中的应用。
背景技术
慢性肾脏疾病(Chronic kidney disease,CKD)是一种由体内和体外多种因素引起的常见慢性疾病。慢性肾病(CKD)引发细胞和细胞外基质反应的复杂程序，这在短期内可能有有益的影响，然而当激活时间过长时，会导致肾脏结构受损，细胞功能障碍、实质瘢痕进而最终发展成肾衰竭。
肾脏纤维化(Renal Fibrosis,RF)，是各种进行性肾脏病(CKD)的病理标志和共同通路，也是肾功能不全的主要决定因素和可靠的愈后指标，其主要表现为组织硬化、肾小管球萎缩等。但本质上，肾纤维化的形成是各种肾组织损伤愈合失败的过程。纤维化在肺、肝、皮等其它组织器官也均可发生，但其机制是近乎相同的。纤维化的形成主要由以下个部分组成：1、损伤后炎症反应和炎症细胞的浸润；2、成纤维细胞增殖；3、胞外基质(Extracellular matrix ECM)沉积。每个病理过程之间相互促进导致纤维化的进展，最终导致器官组织的损坏和功能的丧失。然而，迄今为止，仍然缺乏专门针对肾纤维化本身的有效治疗方法。目前提出的通过对多个靶点的抑制或过表达来逆转或抑制纤维化进展的治疗方法，然而转化为临床环境时，这些治疗剂都面临诸如安全性或效率不足等障碍，继而很难应用于临床。因此，目前还没有可以有效治疗器官纤维化的药物。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供β-咔伯啉生物碱类化合物在制备预防和/或治疗器官及组织纤维化疾病药物中的应用，为制备治疗器官及组织纤维化疾病的药物提供新思路。
为了解决上述问题，本发明提出以下技术方案：
本发明提供β-咔伯啉生物碱类化合物在制备预防和/或治疗纤维化疾病药物中的应用，所述的β-咔伯啉生物碱类化合物为TB-68d及其衍生物，结构式如下：
其中，对于衍生物中R1、R2基团的选择如下：
进一步地，所述纤维化疾病包括肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化和皮肤纤维化等纤维化疾病或由纤维化诱发的疾病。
需要说明的是，本发明提供的β-咔伯啉生物碱类化合物的药物新用途，TB-68d及其衍生物均为文献已有报道的化合物，其制备方法也是本领域技术人员所熟知的。例如，专利CN 115872991 A中给出了TB-68d及其衍生物的具体制备方法。
具体地，本发明所述的肺纤维化疾病是药物性肺纤维化，特发性肺纤维化(IPF)，结节病、尘肺、过敏性肺炎和放射线等诱发的肺纤维化，其他病因未明的肺纤维化，以及由肺纤维化诱发的疾病。
所述的肝纤维化是病毒性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性疾病、脂肪肝、营养不良、慢性充血性心力衰竭和药物等不同原因引起的肝脏纤维化，其他病因未明的肝脏纤维化，以及由肝纤维化诱发的疾病。
所述的肾纤维化是高血压、肾小球肾炎、系统性红斑狼疮、硬皮病、肾移植排斥、肾盂肾炎、肾结石、高血脂、糖尿病、高尿酸尿症、高钙尿症等原因引起的肾脏纤维化，其他病因未明的肾脏纤维化，以及由肾纤维化诱发的疾病。
所述的皮肤纤维化是药物性纤维化，特发性皮肤纤维化、遗传等诱发的皮肤纤维化，其他病因未明的皮肤纤维化，以及由皮肤纤维化诱发的疾病。
其他方面，本发明提供一种预防和/或治疗器官及组织纤维化疾病的药物组合物，所述药物组合物包括所述的β-咔伯啉生物碱类化合物，所述的β-咔伯啉生物碱类化合物为唯一活性成份。
以本发明所述TB-68d及其衍生物制备的抗肺、肝、肾、皮肤纤维化药物中，其药物活性成分可以是所述的TB-68d及其衍生物，也可以是其药学上可接受的盐。
具体地，本发明提供的如上所述的化合物的药学上可接受的盐可以为：钠盐、钾盐、铵盐、氨基酸盐、乳酸盐、盐酸盐、磷酸盐、醋酸盐、苹果酸盐、枸椽酸盐或天冬氨酸盐等，本发明不对药物盐做具体限定。
进一步地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或辅剂。
在本发明中，可将本发明的TB-68d及其衍生物作为活性成分配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的载体介质；配制好的药物可以通过常规途径进行给药，包括但并不限口服、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
当本发明的药物组合物的剂型为用于口服施用的药物时，其含有安全有效量的本发明的TB-68d及其衍生物以及药学上可接受的载体和/或辅剂，口服施用的药物可制成片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、乳剂、糖浆剂、软膏剂、栓剂等常用剂型；本发明中，不对载体和/或辅剂做具体限定。
本发明的药物组合物还可以被制成注射剂，可以在无菌操作环境下与注射用水、生理盐水、葡萄糖水制成注射剂，上述注射剂可通过常规方法进行制备。
与现有技术相比，本发明所能达到的技术效果包括：
本发明提供了β-咔伯啉生物碱类化合物TB-68d及其衍生物在TGF-β1诱导细胞形成纤维化模型中，TB-68d及可以抑制纤连蛋白、I型胶原蛋白、α-平滑肌动蛋白三个目的蛋白的表达，具有抗肾纤维化活性，其中衍生物YTB-8，在体外实验中发现其对肝、肺、皮肤成纤维细胞也具有较好的抗纤维化活性，提示其能够在制备预防和/或治疗器官及组织纤维化疾病药物的新用途，为治疗纤维化疾病提供了新思路。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为TB-68d对NRK-52E细胞的毒性测试结果以及细胞蛋白Western Blot方法验证活性结果。其中，(A)为细胞毒性测试结果，与单独对照组相比*p＜0.05，**p＜0.01。数据代表三个实验的平均±SEM值；(B)为细胞蛋白Western Blot方法活性结果，结果显示了TB-68d对TGF-β1诱导的NRK-52E细胞纤维化的剂量依赖性抑制作用。
图2为TB-68d的衍生物对NRK-52E细胞的毒性测试结果。
图3为细胞蛋白Western Blot方法检测TB-68d的衍生物抗纤维化活性结果。
图4为YTB-7、YTB-8不同浓度的体外抗肾纤维化活性对比结果
图5为衍生物YTB-8的体内抗肾纤维化活性验证结果。其中(A)为YTB-8减轻单侧输尿管梗阻(UUO)模型小鼠的肾间质纤维化(比例尺＝20μM，每组n＝5只小鼠)。UUO手术后，小鼠每天腹膜内注射载体或YTB-8(每天12.5mg/kg或25mg/kg)，并在第8天实施安乐死。苏木精和伊红(H&E)的代表性显微照片和Masson染色结果证明；(B)为梗阻肾脏模型中，不同剂量的YTB-8对纤连蛋白、I型胶原和α-平滑肌动蛋白mRNA表达的实时PCR分析。(C)为梗阻肾脏模型中，不同剂量的YTB-8对纤连蛋白、I型胶原和α-平滑肌动蛋白表达的免疫组织化学图像和定量(比例尺＝20μM)。条形图表示染色分析的量化。(D)为蛋白质印迹上的代表性条带(两例)显示梗阻肾脏中纤连蛋白、I型胶原和α-平滑肌动蛋白的表达。条形图表示免疫印迹灰度分析的定量，通过ImageJ和GraphPad Prism进行定量分析。数据代表三个实验的平均值±SEM；*表示与单独使用UUO相比；#表示与单独对照组比较。NS无统计学意义。
图6为不同浓度的衍生物YTB-8在肺、肝、皮肤成纤维细胞中抗纤维化活性检测结果。
图7为TB-68d及其衍生物的结构图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，以下将描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
应当理解，当在本说明书和所附权利要求书中使用时，术语“包括”和“包含”指示所描述特征、整体、步骤、操作、元素和/或组件的存在，但并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素、组件和/或其集合的存在或添加。
参考图7，本发明实施例提供β-咔伯啉生物碱类化合物在制备预防和/或治疗纤维化药物中的应用，所述的β-咔伯啉生物碱类化合物为TB-68d及其衍生物，结构式如下：
本发明所述纤维化疾病包括肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化和皮肤纤维化等纤维化疾病或由纤维化诱发的疾病。
为了便于识别TB-68d衍生物，现根据不同的取代基团对各衍生物进行命名，见下表1。
表1 TB-68d衍生物的命名
TB-68d及其衍生物的制备方法和鉴定具体见专利CN 115872991 A的记载，本发明对TB-68d及其衍生物的制备和鉴定不再赘述。
在获得TB-68d及其衍生物后，对其进行体外活性筛选实验及体内实验以验证其具有抗肺、肝、肾、皮肤纤维化活性。具体实验方法及结果介绍如下：
1.体外活性筛选实验
1.1细胞培养
为保证细胞培养的无菌条件，实验须在超净工作台中进行，所有细胞实验所用的器材须经高温灭菌，并烘干水分后方可使用。体外活性筛选的细胞选用正常大鼠肾近端小管上皮细胞(NRK-52E)，人真皮成纤维细胞(HDF),人肺成纤维细胞(HPF)，人肝星状细胞(HSC)，培养于5％ CO2、37℃和足够湿度的细胞培养箱中，使用含有10％胎牛血清(FBS)，1％双抗(P/S)的高糖DMEM培养基培养。实验中选用状态良好，密度70％-80％的处于对数生长期的细胞。
1.2细胞复苏
将液氮罐或-80℃冰箱中冻存的细胞取出，迅速放入到37℃的水浴锅解冻，防止冰晶对细胞造成损伤，待完全融化后，将细胞转移至15mL离心管中，加入3mL的完全培养基，室温条件下1000rpm转速离心3min。使用滤泵吸去上清，加入3-4mL的完全培养基，枪头吹打混匀，随后将细胞转移至100mm细胞培养皿中，将培养基补充至6-7mL，轻微摇晃，使细胞均匀分布至皿底，放入细胞培养箱内培养。每日观察细胞状态包括形态、汇合度、贴壁状况以及培养基颜色，根据情况决定是否需要换液。
1.3细胞传代
待细胞汇合度达到70％-80％且状态良好，即可进行传代。取一皿细胞，使用滤泵吸去旧培养基，沿培养皿的侧壁缓慢加入2mL高温灭菌后的PBS，清洗遗留的培养基，随后弃掉。向皿中加入1mL胰酶，轻微摇晃，使细胞与胰酶充分接触，放入培养箱中消化2min，待细胞形态变圆，并有少许漂浮时，加入3mL完全培养基终止消化，用移液枪缓慢吹打皿底，使底部细胞完全脱落，将悬液吸至15mL离心管中，1000rpm转速离心3min，弃去上清，加入完全培养基重悬，转移至新的培养皿中，放至培养箱中培养。
1.4细胞冻存
细胞冻存前需保证细胞冻存盒恢复至室温，随后按照1.3细胞传代的操作，将细胞转移到15mL离心管中，1000rpm离心3min后弃去上清，将配制好的细胞冻存液加入离心管中，使用枪头吹打混匀，将细胞悬液分装至洁净的细胞冻存管中，再将冻存管放入冻存盒中，再将冻存盒放至-80℃冰箱程序降温，24小时后转移到样品盒中放入液氮罐中保存备用。
1.5CCK8法测定细胞活力
按照1.3细胞传代的方法，将细胞消化并使用完全培养基重悬后，取20μL细胞悬液，加至细胞计数板的小室中，再将计数板插入细胞计数仪中，得到细胞密度。将处于对数生长期的细胞按照以1×104个/孔的密度，计算需要的细胞悬液体积，按照每孔100μL体积配制稀释液，用排枪将细胞接种于96孔板上，每组设置3-5个复孔。放入细胞培养箱培养24小时，待细胞贴壁汇合度达到70％-80％后，更换不含血清和双抗的DMEM高糖培养基饥饿处理4个小时以使细胞同步化。随后更换成4％血清的DMEM培养基并加入不浓度的药物，对照组加入对应体积的DMSO，加入后立即混匀，防止局部浓度过高造成细胞死亡，放至培养箱培养48小时。48小时后，弃去原有培养液，每孔加入90μL空白培养基以及10μL的CCK-8工作液，放入细胞培养箱孵育1小时，使用多功能成像酶标仪测定各孔在波长450nm光密度(Opticaldensity，OD)值，进行三次独立重复实验后计算细胞活力。
计算公式为：细胞活力(％)＝(OD实验组-OD空白)/(OD对照组-OD空白)x100％，使用GraphPad Prism 7.0统计软件对OD值进行统计分析。
1.6蛋白印迹(Western blot)抗纤维化活性检测
蛋白质免疫印迹(Western Blot)是以抗体-抗原相互作用为基础，采用聚丙烯酰胺蛋白凝胶电泳，将不同蛋白依据分子量分离，再将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上，然后选择合适的抗体对其进行检测。本发明中，肾纤维化模型选用TGF-β1/Smad通路诱导的模型，通过检测纤连蛋白(Fibronectin)、I型胶原蛋白(Collagen I)、α-平滑肌动蛋白(α-Smooth Muscle Actin,α-SMA)，来评价药物抗纤维化的活性。具体方法如下：
(1)蛋白提取
按照1.3细胞传代的方法，将细胞消化并使用完全培养基重悬后，计算细胞密度。将处于对数生长期的细胞按照每孔2×105个的细胞数量接种于六孔板中，放至细胞培养箱培养24小时。待细胞贴壁，汇合度达到70％-80％后，更换不含血清的DMEM高糖培养基饥饿处理6小时以使细胞同步化。更换新的培养基并加入不浓度的药物，模型组和空白组加入对应体积的DMSO，以GW788388(20mM)做为阳性对照，加入后立即混匀，防止局部药物浓度过高，放置培养箱孵育1小时，随后加入TGF-β1(10ng/mL)诱导细胞，空白组除外。孵育48小时后，弃去培养上清，向孔中缓慢加入1mL PBS缓冲液，洗涤1次。向每孔加入100μL蛋白裂解液，置于冰上，将细胞破碎提取蛋白，转移到1.5mL离心管中，4℃12000rpm离心10min，吸取上清液，使用BCA法测定浓度，加入5X Loading buffer后100℃高温变性10min，于-20℃保存备用。
(2)SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶配制，上样
将制胶设备准备好后，参考说明书的试剂配比，配制8％的分离胶，待分离胶凝固后，配制浓缩胶，并根据样品数量及上样体积选择合适的梳子。待胶完全凝固后，组装好电泳系统，拔出梳子，将蛋白样品和蛋白Marker按序加入孔道中，蛋白样品要求每个孔道蛋白量不少于30μg。
(3)电泳
连接电泳装置的两极，先用90V恒压条件电泳，待样品的Marker分散开即蛋白电泳过浓缩胶后，切换电压至120-130V电压不宜过高，防止样品条带出现异常。待溴酚蓝标记条带电泳至底部，停止电泳。
(4)蛋白转印(转膜)
湿转：提前将PVDF膜浸至甲醇中活化，取出预冷的1X湿转液，倾倒至转膜盘中，将活化好的PVDF膜浸入转膜液中平衡，再按照“黑色电极板-转印滤纸-聚丙烯酰胺凝胶-PVDF膜-转印滤纸-红色电极板”的顺序，每层之间不要混入气泡，放至转膜夹中，250mA恒定电流，转印2小时。
半干转：提前将PVDF膜浸至无水乙醇中活化，将1X半干转液倒至托盘中，活化后的PVDF膜浸入转膜液中平衡，再按照“负极-转印滤纸-聚丙烯酰胺凝胶-PVDF膜-转印滤纸-正极”每层之间不要混入泡，弃去转膜夹中多余的转膜液，放至转膜仪中，25V，1.3A的条件，转印25分钟。
(5)封闭、抗体孵育
转印结束后，将膜浸入5％脱脂奶粉，放至水平摇床室温封闭1个小时。封闭结束后，使用TBST清洗掉封闭液，依据目的蛋白的分子量(anti-alpha-SMA antibody，42kDa，anti-Collagen I antibody，130kDa；anti-Fibronactin antibody，250kDa；anti-GAPDHantibody，37kDa)，将对应条带放至抗体工作液中，水平摇床4℃过夜孵育一抗。
第二天回收一抗，并用TBST洗去膜上非特异结合的抗体，加入对应抗体的属源的二抗工作液，水平摇床室温孵育1个小时。
(6)显影
二抗孵育结束后，使用TBST洗去膜上非特异结合的二抗，根据显影液的说明书配制显影液，将膜在显影液中浸泡1分钟后，置于Bio-Red Chemidoctm MP上进行拍照。
1.7 Tb-68d及其衍生物对细胞活力的影响
方法与加药步骤参考上述内容。在细胞接种到孔板中24小时后，将TB-68d及其衍生物按照40μM,20μM,10μM,5μM,2.5μM的浓度梯度加入到对应的孔中，每个浓度设置三个复孔，对照组加入相应体积的DMSO，培养箱中孵育48小时后按照前述方法，加入CCK8工作液后测定OD值。重复进行三次平行实验，使用GraphPad Prism 7.0软件进行柱状分析。
1.8Tb-68d及其衍生物抗肾纤维化活性检测
方法参考上述内容，取对数生长的细胞，经消化、计数改变细胞的密度为每孔1X105个接种至12孔板中，在接种24小时后，经同步化处理更换4％血清的培养基，将Tb-68d及其衍生物以指定浓度加入对应的孔中，空白组，模型组加入相应体积的DMSO，GW788388(20mM)组做为阳性对照。孵育48小时后，裂解细胞提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度，WesternBlot方法检测纤连蛋白(Fibronectin)、I型胶原蛋白(Collagen I)、α-平滑肌动蛋白(α-Smooth Muscle Actin,α-SMA)三种目的蛋白。重复进行三次平行实验，评估衍生物的活性。
2.体内实验
2.1动物模型
使用单侧输尿管梗阻(Unilateral ureteral occlusion,UUO)方法制作急性肾损伤小鼠模型。
(1)动物分组：
将6-8周小鼠随机分为空白组10只；模型组10只；低剂量组(12.5mg/kg)10只；高剂量组(25mg/kg)10只。
(2)动物造模：
将小鼠麻醉后，无菌手术暴露左侧肾脏，除假手术组外，其余组分小鼠结扎左侧肾脏输尿管，缝合。待小鼠麻醉效果消失，正常饲养。
(3)给药：
称取衍生物YTB-8粉末，加入前述的动物注射药物溶剂，超声使其完全溶解，在UUO造模第二天后，所有实验小鼠进行腹腔注射给药，空白组和模型组给予相同剂量的溶剂，连续给药7天，给药期间观察小鼠状态并记录体重变化。(4)取材：
第7天给药结束后第二天，小鼠断髓处死，取左侧肾组织。将肾组织均分为3等份，中间部分置于4％多聚甲醛或组织固定液中室温固定，用于病理切片染色，其余部分置于-80℃保存备用。
2.2病理切片染色
取材后置于4％多聚甲醛或组织固定液中室温固定的肾组织，交由武汉赛维尔生物科技有限公司对组织进行H&E和Masson染色。
2.3衍生物YTB-8体内有效性验证
体内有效性的验证，通过Western Blot方法检测肾组织中纤连蛋白(Fibronectin)、I型胶原蛋白(Collagen I)、α-平滑肌动蛋白(α-Smooth Muscle Actin,α-SMA)，来评价衍生物YTB-8对于UUO模型小鼠的体内有效性。
(1)组织蛋白提取组织蛋白的提取全程需在低温条件下操作。取上述保存于-80℃的肾组织，切取部分组织至于洁净的1.5mL离心管中，加入100μL蛋白裂解液，2枚研磨钢珠，置于研磨仪低温研磨1min，随后将研磨后的组织匀浆，4℃12000rpm离心10min，吸取上清液，使用BCA法测定并均一化浓度，加入5X Loading buffer后100℃高温变性10min，于-20℃保存备用。
(2)SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶配制，蛋白上样，电泳，蛋白转印(转膜)，封闭，抗体孵育，显影的方法与步骤参考上述内容。
3.实验结果
3.1衍生物YTB-8体外具有较强的抗肾纤维化活性
在得到Tb-68d及12个Tb-68d的衍生物后，首先通过CCK8法检测各化合物对于NRK-52E细胞活性的影响，结果见图1-图4。其中，由图1-2可以看出，对照组细胞生长状态良好，在40μM的浓度条件，衍生物YTB-3、YTB-4、YTB-5、YTB-6、YTB-7对细胞产生较大毒性，并且镜下观察细胞出现变圆，漂浮等现象；20μM浓度下，仅产生轻微毒性，细胞状态正常，因此后续使用20μM的浓度检测衍生物的抗肾纤维化活性。
将NRK-52细胞接种到12孔板中，加入终浓度20μM的化合物后，使用TGF-β1诱导细胞形成纤维化模型，孵育48小时，提取细胞蛋白Western Blot方法验证活性，重复进行三次平行实验，结果如图2-图4。与空白组对比模型组的纤连蛋白(Fibronectin)、I型胶原蛋白(Collagen I)、α-平滑肌动蛋白(α-Smooth Muscle Actin,α-SMA)三个目的蛋白表达均上调，说明模型构建成功；与模型组对比衍生物YTB-3、YTB-4、YTB-5、YTB-6、YTB-7在20μM浓度条件具有抗肾纤维化的活性，可以抑制纤连蛋白(Fibronectin)、I型胶原蛋白(CollagenI)、α-平滑肌动蛋白(α-Smooth Muscle Actin,α-SMA)三个目的蛋白的表达，其中YTB-7、YTB-8对于纤连蛋白(Fibronectin)、I型胶原蛋白(Collagen I)的抑制效果最为明显，具有剂量依赖性。
3.2衍生物YTB-8可以显著抗小鼠急性肾脏纤维化
根据前述实验，在确定衍生物YTB-7、YTB-8在体外具有较强的抗肾纤维化活性之后，我们通过UUO急性肾损伤模型小鼠，对衍生物YTB-8在体内的活性进行验证。
在UUO造模第二天后，所有实验小鼠进行腹腔注射给药，连续给药7天，取材进行形态学和蛋白水平的检测，结果如图5所示。通过组织切片的形态学检测可以发现图5(A)，空白组小鼠肾脏结构正常，肾小管排列整齐、紧密，肾小管基底膜光滑，间质区未见炎性细胞浸润，胶原纤维主要位于肾小球及肾小管基底膜，间质区无着色。与空白组相比UUO小鼠肾脏大部分肾小管及肾小球坏死，残存肾小管扩张或萎缩，间质可见炎性细胞浸润，基底膜细胞被大量破坏，胶原纤维大量沉积。使用衍生物YTB-8治疗UUO小鼠7天后，UUO小鼠肾间质炎性细胞减少，纤维化程度减轻，部分肾小管形态恢复正常，肾间质胶原纤维沉积减少，肾小管萎缩区域减少，高剂量组相较于低剂量组治疗效果更为明显。另外通过mRNA及蛋白水平检测结果如图5(B-D)，与UUO模型组相比，衍生物YTB-8治疗组可以明显抑制纤连蛋白(Fibronectin)、I型胶原蛋白(Collagen I)、α-平滑肌动蛋白(α-Smooth Muscle Actin,α-SMA)三个目的蛋白的表达，表现出了较高的活性，并且具有明显的剂量依赖性。
综合体外和体内的活性验证，我们决定选择衍生物YTB-8进行接下来的机制研究。
3.33衍生物YTB-8在体外肺、肝、皮肤成纤维细胞中具有较强的抗纤维化活性
根据前述实验，在确定衍生物YTB-8无论在体外还是体内都具有较强的抗肾纤维化活性之后，我们对衍生物YTB-8在体外抗肺、肝、皮肤纤维化活性进行验证。
按照上述实验方法将人真皮成纤维细胞(HDF),人肺成纤维细胞(HPF)，人肝星状细胞(HSC)按密度为每孔1×105个细胞接种到12孔板中，加入不同浓度的化合物YTB-8后，使用TGF-β1诱导细胞形成纤维化模型，孵育48小后，提取细胞蛋白Western Blot方法验证活性，重复进行三次平行实验，结果如图6。与空白组对比模型组的纤连蛋白(Fibronectin)、I型胶原蛋白(Collagen I)、α-平滑肌动蛋白(α-Smooth Muscle Actin,α-SMA)三个目的蛋白表达均上调，说明模型构建成功；与模型组对比衍生物YTB-8可以显著抑制纤连蛋白(Fibronectin)、I型胶原蛋白(Collagen I)、α-平滑肌动蛋白(α-SmoothMuscle Actin,α-SMA)三个目的蛋白的表达，并且具有剂量依赖性。
以上实验及结果证明了衍生物YTB-8具有良好的抗纤维化活性，具有制备治疗肾纤维化、肝纤维化、肺纤维化、皮肤纤维化等疾病的药物的潜力。
在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详细描述的部分，可以参见其他实施例的相关描述。
以上所述，为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。
Claims (5)
1.β-咔伯啉生物碱类化合物在制备预防和/或治疗纤维化疾病药物中的应用，所述的β-咔伯啉生物碱类化合物为TB-68d及其衍生物，结构式如下：
其中，对于衍生物中R1、R2基团的选择如下：
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述纤维化疾病包括肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化和皮肤纤维化疾病或由纤维化诱发的疾病。
3.一种预防和/或治疗纤维化疾病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括所述的β-咔伯啉生物碱类化合物，所述的β-咔伯啉生物碱类化合物为唯一活性成份。
4.如权利要求3所述的所述药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或辅剂。
5.如权利要求3所述的所述药物组合物，其特征在于，所述纤维化疾病包括肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化和皮肤纤维化疾病或由纤维化诱发的疾病。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311753272.4A CN117653630A (zh) | 2023-12-18 | 2023-12-18 | β-咔伯啉生物碱类化合物在制备预防和/或治疗纤维化疾病药物中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311753272.4A CN117653630A (zh) | 2023-12-18 | 2023-12-18 | β-咔伯啉生物碱类化合物在制备预防和/或治疗纤维化疾病药物中的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117653630A true CN117653630A (zh) | 2024-03-08 |
Family
ID=90066080
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311753272.4A Pending CN117653630A (zh) | 2023-12-18 | 2023-12-18 | β-咔伯啉生物碱类化合物在制备预防和/或治疗纤维化疾病药物中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117653630A (zh) |
-
2023
- 2023-12-18 CN CN202311753272.4A patent/CN117653630A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| De Palma et al. | Deficient nitric oxide signalling impairs skeletal muscle growth and performance: involvement of mitochondrial dysregulation | |
| US11433039B2 (en) | Composition and method for muscle repair and regeneration | |
| Jang et al. | Skeletal muscle stem cells: effects of aging and metabolism on muscle regenerative function | |
| US5976523A (en) | Method for healing compromised tissues using pyrimidine derivatives | |
| CN106478776A (zh) | 抗纤维化肽及其在用于治疗以纤维化为特征的疾病和病症的方法中的用途 | |
| Sharp et al. | Notexin-induced muscle injury in the dog | |
| CN117653630A (zh) | β-咔伯啉生物碱类化合物在制备预防和/或治疗纤维化疾病药物中的应用 | |
| US20210379104A1 (en) | Pharmaceutical composition comprising isolated mitochondria for preventing or treating tendinopathy | |
| Chou et al. | Human placenta-derived mesenchymal stem cells attenuate established hyperoxia-induced lung injury in newborn rats | |
| CN113194926A (zh) | 用于预防或治疗肝病的包括含有间充质干细胞的生物植入物的药物组合物 | |
| CN114632153A (zh) | Hedgehog信号通路抑制剂在制备治疗异位骨化产品中的用途 | |
| Calderazzo et al. | Neural recovery after cortical injury: Effects of MSC derived extracellular vesicles on motor circuit remodeling in rhesus monkeys | |
| Kondoh et al. | Combined strategy using myoblasts and hepatocyte growth factor in dilated cardiomyopathic hamsters | |
| US20200011855A1 (en) | COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING LIVER FIBROSIS OR CIRRHOSIS, COMPRISING EXPRESSION OR ACTIVITY ENHANCER OF TIF1y AS ACTIVE INGREDIENT | |
| KR101217066B1 (ko) | 벤조산 유도체를 포함하는, 간경변의 예방 또는 치료용 조성물 | |
| US20220257717A1 (en) | Methods of Treatment Using Encapsulated Cells | |
| CN114209840A (zh) | 一种mif抑制剂在制备治疗骨关节炎的药物中的应用 | |
| KR20240105439A (ko) | 건-골 계면의 복구를 위한 방법 및 조성물 | |
| CN117347640A (zh) | AGEs-RAGE信号在调控半月板钙化中的作用及其作用机制的研究方法和应用 | |
| CN117085137A (zh) | Il-11抑制剂及其在抗瘢痕治疗中的应用 | |
| Salamah et al. | Assessment of the potential therapeutic effects of Mesenchymal Stem Cells in an experimental model of Cardiorenal Syndrome | |
| CN118557735A (zh) | Nrp1抑制剂在制备抗血管钙化药物中的应用 | |
| CN117883578A (zh) | Snx3抑制剂在制备防治肝纤维化药物中的应用 | |
| CN118356417A (zh) | 香紫苏醇在制备抑制小胶质细胞介导的炎症药物中的应用 | |
| CN116003528A (zh) | 靶向竞争性抑制CCL20结合整合素α5β1的多肽和/或其衍生物及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |