CN117647552A

CN117647552A - 一种猪血浆脂蛋白亚类测定方法与应用

Info

Publication number: CN117647552A
Application number: CN202311626663.XA
Authority: CN
Inventors: 何庆华; 王亚杰; 马冉; 魏波; 李赢; 杨宇鑫
Original assignee: Shenzhen University
Current assignee: Shenzhen University
Priority date: 2023-11-30
Filing date: 2023-11-30
Publication date: 2024-03-05

Abstract

本发明公开了一种猪血浆脂蛋白亚类测定方法与应用。以猪血浆为试验样本，通过NMR技术获取血浆¹H NMR数据，结合经UC法分离检测得到的猪血浆脂蛋白亚类数据，基于偏最小二乘回归(partial least squares regression,PLSR)原理建立116种多变量回归预测模型，建立一种猪血浆脂蛋白亚类的高通量快速测定方法。

Description

一种猪血浆脂蛋白亚类测定方法与应用

技术领域

本发明属于代谢组学技术、疾病诊断领域。具体涉及一种猪血浆脂蛋白亚类测定方法与应用。

背景技术

脂蛋白是一类由富含固醇脂、甘油三酯的疏水性内核和由蛋白质、磷脂、胆固醇等组成的外壳构成的超分子球状微粒，其主要功能是在血液中为水不溶性脂质充当载体，维持机体脂质代谢稳定。脂蛋白亚类则是根据脂蛋白微粒的物理与化学特性差异进一步细分得到的一类物质总称。根据其密度不同脂蛋白可被分为乳糜微粒(chylomicrons,CM)、极低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein,VLDL)、中密度脂蛋白(intermediate-density lipoprotein,IDL)、低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein,LDL)和高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)。现代临床医学研究在对心血管疾病(cardiovascular diseases,CVD)、代谢综合征等营养相关疾病诊断中，评判脂蛋白代谢是否正常的指标主要以血液总胆固醇含量以及高密度脂蛋白胆固醇(high-densitylipoprotein cholesterol,HDL-chol)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoproteincholesterol,LDL-chol)和载脂蛋白(apolipoprotein,Apo)等脂蛋白亚类水平作为参考。虽然广泛应用于临床实践，但预测误差较大，对CVD等的早期干预和精准治疗存在局限性。相对常规指标，脂蛋白亚类水平与机体代谢紊乱程度关系更加密切，而且，脂蛋白亚类根据不同粒径、密度和组成具有特定的功能和代谢特性，在脂质代谢异常的预防和干预中较常规指标具有更精准和直接的参考价值，这可以弥补常规检测指标的不足。因此，脂蛋白亚类的定性和定量分析对于进一步了解其在营养、健康和疾病中作用和机制至关重要。

目前，最常用的脂蛋白亚类分离检测技术是超速离心法(ultracentrifugation,UC)，将HDL分为HDL1、HDL2、HDL3和HDL4，将LDL分为LDL1、LDL2、LDL3、LDL4、LDL5和LDL6，将VLDL分为VLDL1、VLDL2、VLDL3、VLDL4、VLDL5和VLDL6。镶嵌在膜上的载脂蛋白特性差异会导致不同的脂蛋白亚类具有特定的功能，脂蛋白亚类还可根据其所含载脂蛋白(Apo)特性不同进一步细分。例如，通过Apo A1、Apo A2、Apo B、Apo C3和Apo E定义脂蛋白亚类。其中，Apo A主要存在于HDL中，而Apo B则是VLDL、IDL和LDL的主要组成成分。但是，传统UC法检测周期长达1周以上，存在耗时长和成本高企的缺点，无法作为常规检测方法用于科学研究和临床诊断，亟待建立新的快速检测技术。

UC法是脂蛋白亚类的传统标准测定方法，通过对脂蛋白组分进行物理分离而定量。William等采用UC法研究了冠状动脉硬化等脂质代谢疾病的机理研究和临床诊断。采集空腹血样，在3000g和18℃条件下离心10min，3mL血清被转移到UC管中，在18℃，176,700g条件下离心16h。取顶部1mL溶液(0.950-1.006g)即为VLDL。随后将UC管溶液加入NaCl/KBr盐溶液密度调节为1.019g/mL，体积为3mL，在18℃，213,300g条件下离心16h，取顶部1.0mL溶液(1.006-1.019g)即为IDL。随后将UC管溶液加入NaCl/KBr盐溶液密度调节为1.063g/mL，体积为3mL，在18℃，213,300g条件下离心16h，取顶部1mL溶液(1.019-1.063g)即为LDL。随后将UC管溶液加入NaCl/KBr盐溶液密度调节为1.210g/mL，体积为3mL，在18℃，238,000g条件下离心16h，取顶部1mL溶液(1.0612.210g)即为HDL。UC法需依赖其他检测技术对分离后脂蛋白亚类进行定性和定量分析，而且耗时长达1周，所需样本量较大，严重阻碍了其应用于大批量样品的检测。在长时间离心过程中，样品的自然化学平衡也会遭到破坏，高盐和超速离心可能导致一些不稳定的蛋白质的化学结构遭到破坏，而导致少量非共价键结合蛋白质的丢失。

吴新伟等基于琼脂糖及梯度聚丙烯酰胺凝胶双向电泳、免疫印迹试验和斑点扫描分析免疫印迹检测法建立了血清高密度脂蛋白亚类的检测方法，高密度脂蛋白各亚类含量重复性试验的板间变异系数为4.9％～11.1％，可以测得正常人血清高密度脂蛋白2b、2a、3a、3b和3c亚类的百分比。该免疫印迹检测法存在耗时长，操作繁琐的缺点，而且只能测得高密度脂蛋白5个亚类的百分比，无法得到定量数据。

曲冬颖等基于凝胶电泳法测定了血浆HDL亚类组成和含量，测得患者血浆大颗粒、中颗粒和小颗粒HDL的浓度及百分比。该凝胶电泳法存在耗时长，操作繁琐的缺点，而且只能测得高密度脂蛋白3个亚类的百分比，无法得到定量数据。

核磁共振波谱法(nuclear magnetic resonance,NMR)具有重现性好、快速的优点，有望在猪血浆脂蛋白亚类的测定中广泛应用。因此，在猪血浆脂蛋白亚类的定性和定量分析中，需要保持测定靶标的原貌而且力图一次性检测到尽量多的化合物，这就需要对目前存在的前处理方法进行筛选和优化，避免差异性大、操作过于繁琐和效率低的前处理方法，并通过多变量回归预测模型进而建立猪血浆脂蛋白亚类的定性和定量核磁共振分析方法。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种猪血浆脂蛋白亚类测定方法与应用。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述猪血浆脂蛋白亚类测定方法包括如下步骤：

(1)将至少400μL猪血浆样品在12000rpm、4℃条件下离心5min，取上清液转移至1.5mL离心管，按血浆：缓冲液＝1:1至1:2，优选为1:1的比例加入pH为7.0～7.4，优选为7.4，NaCl浓度为0～0.9％(优选为0)、NaH₂PO₄浓度为0.05～0.1M(优选为0.075)的缓冲液，并在12000rpm、4℃条件下再次离心5min，取600μL上清液注入5mm核磁管中，按照¹H NMR采集步骤和实验参数，使用600M超导核磁共振波谱仪采集对应的¹H NMR图谱数据；

(2)通过UC法分离血浆脂蛋白亚类，利用ELISA方法测定得到血浆脂蛋白亚类的定性和定量数据，将血浆脂蛋白亚类分类；为方便对各脂蛋白亚类的生化信息进行统计分析，通过相同的标准对谱图进行相位和基线调整，并以α-葡萄糖中1位碳的H¹质子双峰的化学位移5.22ppm和TSP单峰化学位移0.00ppm为基准，进行定标操作；

(3)利用MATLAB R2022a软件，运行sub-align代码对¹H NMR谱图进行对齐处理，弥补常规定标¹H NMR谱图血浆代谢物特征峰化学位移的偏移，增强了模型预测性能；

(4)以UC法得到的猪血浆脂蛋白亚类生化信息为预测变量Y，¹H NMR谱图数据中0.6～1.4ppm部分(其中，-CH₃和(-CH₂-)n峰群数据对该模型起主要决定作用，2620个数据点)为观测变量X，将数据导入sub-PLSR代码中，建立回归预测模型，并通过交叉验证方式评价模型的预测效果，获得优化后的与血浆脂蛋白亚类种类对应的回归预测模型；

(5)根据步骤(4)获得的优化后的回归预测模型，对待测猪血浆样品中的脂蛋白亚类进行测定。

优选地，步骤(4)所述的回归预测模型为PLSR模型。

优选地，其特征在于，步骤(2)中是将血浆脂蛋白亚类分为如下116种：

优选地，步骤(4)中所述优化后的与血浆脂蛋白亚类种类对应的回归预测模型包括：

优选地，所述步骤(5)是将待测猪血浆样品进行步骤(1)的操作，然后将¹H NMR图谱数据代入回归预测模型中，实现血浆脂蛋白亚类种类的测定。

优选地，在步骤(1)的NMR检测方法中，优选内标物TSP对血浆代谢物进行定量，从而弥补其他方案中需借助二次检测确定内标物含量的不足。

猪因其解剖学尺寸和结构、免疫学、基因组和生理学与人类更加相似，广泛应用在临床试验和科学研究中。脂蛋白亚类的异质性导致其分离检测和数据的标准化存在诸多挑战。在营养与疾病的科学研究和临床诊断中，传统UC法存在耗时长和成本高等明显缺点，迫切需要建立一种替代UC法的快速检测新技术，而NMR的高重现性、高灵敏度、原位测定等优势，可以为猪血浆脂蛋白亚类的快速测定提供一种优选方法。本发明以猪血浆为试验样本，通过NMR技术获取血浆¹H NMR数据，结合经UC法分离检测得到的猪血浆脂蛋白亚类数据，基于偏最小二乘回归(partial least squares regression,PLSR)原理建立116种多变量回归预测模型，建立一种猪血浆脂蛋白亚类的高通量快速测定方法。因此，本发明通过评估UC技术分离结果的可靠性和PLSR模型预测性能，实现猪血浆脂蛋白亚类¹H NMR检测方法的可靠性和重现性，以期为脂蛋白亚类功能的研究提供新的可利用的技术。

NMR方法测定血浆代谢物具有稳定的检测性能，且日内和日间检测误差未对血浆样品代谢差异产生显著影响。NMR技术所带来的检测稳定性可满足对代谢表型研究和临床诊断差异分析的要求，且由于缓冲液的影响，不仅平均CV值较与传统方法相比具有更稳定的优势，且可直接借助内标物(TSP)对血浆代谢物进行定量，从而弥补传统方法中需借助二次检测确定内标物含量的不足。经sub-align处理后的¹H NMR谱图具有良好的“对齐”效果，极大程度上消除化学位移差异导致PLSR性能下降的现象。基于¹H NMR的猪血浆脂蛋白亚类测定方法成功建立，将为以猪为动物模型探索脂蛋白亚类功能提供新的参考方法。

本发明所述的方法是一种可靠、稳定、高通量的猪血浆脂蛋白亚类¹H NMR快速检测方法，以期为营养和疾病的机制研究和临床诊断方法提供一种新的测定技术，不仅优化了猪血浆的¹H NMR检测方法，而且建立了猪血浆的¹H NMR脂蛋白亚类检测方法。第一，确定了最优血浆样品NMR前处理方案和可靠的¹H NMR实验操作程序为：血浆与缓冲液比例为1：1，缓冲液为0.075M NaH₂PO₄缓冲液(pH＝7.4)。第二，通过UC法分离猪血浆脂蛋白亚类组分和采用ELISA试剂盒测定获得了116种脂蛋白亚类的定性和定量数据。第三，建立猪血浆的¹H NMR脂蛋白亚类检测方法如下：采用NMR测定血浆一维氢谱后，选择化学位移在0.6～1.4ppm范围内的¹H NMR谱图数据2620个数据点，经过sub-align进行谱峰对齐处理后，内标物(TSP)对血浆代谢物进行定量，然后，基于UC法测定的116种血浆脂蛋白亚类的定性和定量数据，建立了基于¹H NMR谱图的116个血浆脂蛋白亚类PLSR预测模型。并通过交叉验证方式评价模型的预测效果，剔除各脂蛋白亚类信息异常值，筛选脂蛋白亚类生化信息预测误差较大的少数样品，并从训练模型中去除，然后重新计算PLSR校准模型进行预测。该方法可直接借助内标物(TSP)对血浆代谢物进行定量，从而弥补传统方法中需借助二次检测确定内标物含量的不足，并极大程度上消除化学位移差异导致PLSR性能下降的现象。实现了包括NMR一维氢谱检测和脂蛋白亚类计算等步骤，在10min内提供116种脂蛋白亚类的定性和定量数据。因此，该方法不仅提高了脂蛋白亚类检测方法的准确性和稳定性，而且实现了血浆脂蛋白亚类的高通量快速检测。

附图说明

图1；实施的工作流程概述，以评估基于¹H NMR的猪血浆代谢物检测的日间和日间分析变异性；

图2：日内检测PCA和OPLS-DA分析图(方案一：A和B；方案二：C和D)；

图3：日内检测分析中OPLS-DA模型的置换检验图(A)、均方根误差图(B)和VIP图(C)(方案一)；

图4：日内检测分析中OPLS-DA模型的置换检验图(A)、均方根误差图(B)和VIP图(C)(方案二)；

图5：日内检测血浆小分子代谢物变异系数图(方案一：A、C、E、G和I代表样品1-5；方案二：B、D、F、H和J代表样品1-5)；

图6：日间检测PCA(A)、OPLS-DA(B)、OPLS-DA模型置换检验(C)、均方根误差(D)和VIP分析图(E)(方案一)；

图7：日间日内检测PCA(A)、OPLS-DA(B)、OPLS-DA模型置换检验(C)、均方根误差(D)和VIP分析图(E)(方案二)；

图8：日间检测分析中OPLS-DA模型交叉验证CV得分图(方案一：A；方案二：B)；

图9：日间检测血浆小分子代谢物变异系数图(方案一：A；方案二：B)；

图10：脂蛋白亚类密度分布；

图11：脂蛋白游离胆固醇、总胆固醇、载脂蛋白B、磷脂、甘油三酯和载脂蛋白A1浓度分布；

图12：脂蛋白亚类载脂蛋白A1和载脂蛋白B浓度分布；

图13：脂蛋白亚类总胆固醇、游离胆固醇、甘油三酯和磷脂浓度分布；

头14：¹H NMR谱图小分子代谢物信息(1：异亮氨酸；2：亮氨酸；3：缬氨酸；4：赖氨酸；5：丙氨酸；6：精氨酸；7：蛋氨酸；8：谷氨酸；9：谷氨酰胺；10：脯氨酸；11：苏氨酸；12：甘氨酸；13：酪氨酸；14：甲基组氨酸；15：苯丙氨酸；16：肌酸；17：肌酐；18：乳酸盐；19：柠檬酸盐；20：丙酮酸盐；21：丁二酸盐；22：延胡索酸盐；23：β-葡萄糖；24：α-葡萄糖；25：醋酸盐；26：甲酸盐；27：三甲胺；28：氧化三甲胺；29：尿素；30：肌醇；31：胆碱；32：甘油磷酰胆碱；33：糖蛋白；34：白蛋白)；

图15：¹H NMR谱图对齐示意图；

图16：¹H NMR谱图sub-align对齐示意图；

图17：TPA1、TPAB、TPCH、TPFC、TPPL和TPTG的PLSR模型交叉验证结果；

图18：血浆甘油三酯PLSR模型X变量回归系数和权重分析；

图19：对照组(■)和感染组(●)猪血浆脂蛋白亚类的相关系数图；

图20：宁乡猪(●)血浆脂蛋白亚类的浓度分布图。

具体实施方式

1、脂蛋白亚类定量模型的建立流程如下：

血浆样品(至少400μL)在12000rpm、4℃条件下离心5min，取上清液350μL转移至离心管(1.5mL)。分别加入350μL，pH＝7.4，浓度为0.075M的NaH₂PO₄缓冲液，并在12000rpm、4℃条件下再次离心5min，取600μL上清液注入5mm核磁管中。冷藏，待检测用。通过UC法分离血浆脂蛋白亚类，利用ELISA方法测定得到血浆脂蛋白亚类的定性和定量数据，将血浆脂蛋白亚类分为116种。为方便对各脂蛋白亚类的生化信息进行统计分析。通过相同的标准对谱图进行相位和基线调整。并以α-葡萄糖中1位碳的H¹质子双峰的化学位移(5.22ppm)和TSP单峰化学位移(0.00ppm)为基准，进行定标操作。利用MATLAB R2022a软件，运行sub-align代码对¹H NMR谱图进行对齐处理。以UC法得到的猪血浆脂蛋白亚类信息为预测变量Y，¹H NMR谱图数据中0.6～1.4ppm部分为观测变量X。将数据导入sub-PLSR代码中，建立PLSR模型，并通过交叉验证方式评价模型的预测效果。剔除各脂蛋白亚类信息异常值(导致在不同的PLSR模型中使用不同数量的样品)。通过10倍交叉验证和10次蒙特卡罗重复，将1～20个潜在变量模型拟合到训练样本(70％)，选择了最佳的数量。为每个PLSR模型选择具有最小均方根误差(root mean square error for cross-validation,RMSEcv)的最优潜在变量数量，用于后续预测。筛选脂蛋白亚类生化信息预测误差较大的少数样品，定义为“X-Y关系”异常值，并从训练模型中去除，然后重新计算PLSR校准模型。

2实验方法

2.1样品

前腔静脉采血收集60日龄杜×长×大猪血液样品50mL，室温放置，肝素钠抗凝10min内，4000rpm离心5min离心分离血浆，液氮速冻后保存于负80℃冰箱，待检。

2.2实验设备

600M超导核磁共振波谱仪(AVANCE III 600MHz)，德国Bruker BioSpin公司；电子天平(NBL 214i)，中国德姆衡器(武汉)有限公司；高速冷冻离心机(UNIVERSAL 320R)德国HERMLE Labortachnik GmbH公司；超纯水系统(Milli-Q Advantage)，中国赛默飞世尔(上海)仪器有限公司；10μL、50μL、1000μL微量移液器，中国赛默飞世尔(上海)仪器有限公司；酶标仪(Multiskan FC)，中国赛默飞世尔(上海)仪器有限公司；恒温鼓风干燥箱/培养箱(DHG-9140A)，中国上海精宏实验设备有限公司；贝克曼超速离心机(Optima L-100xp)，美国Beckman Coulter公司。

2.3血浆的核磁共振检测

按照课题组以发表文章的¹H NMR谱采集步骤和实验参数，使用600M超导核磁共振波谱仪采集对应血浆样品的一维¹H NOESY谱。

2.4核磁检测日内和日间差异评估

血浆样品在相同环境下根据以下2种预处理方案进行预处理。

方案1：血浆样品(至少300μL)在12000rpm、4℃条件下离心5min，取上清液200μL转移至离心管(1.5mL)。分别加入400μL血浆缓冲液buffer1(0.9％NaCl:50％D₂O)，并在12000rpm、4℃条件下再次离心5min，取600μL上清液注入5mm核磁管中。冷藏，待检测用。

方案2：血浆样品(至少400μL)在12000rpm、4℃条件下离心5min，取上清液350μL转移至离心管(1.5mL)。分别加入350μL血浆缓冲液buffer2(pH＝7.4，浓度为0.0075M的NaH₂PO₄)，并在12000rpm、4℃条件下再次离心5min，取600μL上清液注入5mm核磁管中。冷藏，待检测用。

按照2.3所述步骤对猪血浆进行NMR测定。¹H NMR光谱的相位和基线校正通过TopSpin 4.1.4软件的自动化程序实现，并手动进行检查。为了确保在相同条件下将每个样品的血浆代谢物整合并定量到¹H NMR谱中，采用α-葡萄糖中H¹质子双峰(5.22ppm)和TSP单峰(0.00ppm)的化学位移对¹H NMR谱进行校准。随后，将¹H NMR数据导入MATLAB R2022a软件，对各血浆代谢物的特征峰进行整合。此外，在评估不同血浆预处理方案对检测变异性影响的实验中，为了确保代谢物定量的参考标准相同，使用CheKineTM血糖含量测定试剂盒(微体积法)准确测定每个样品的血浆葡萄糖浓度。最终，以血浆葡萄糖和TSP为内标对照物，通过比较特征血浆代谢物光谱的峰积分面积的大小来确定相对浓度。

选取的血浆样品按照上述相应的预处理方案和扫描参数，每天检测5次，连续检测5天。使用SIMCA 14.1软件(Umetrics,Sweden)，利用主成分分析法(PCA)和偏最小二乘判别分析模型(OPLS-DA)，比较日内和日间检测变异性对代谢差异的影响。实施的工作流程具体如下图1所示。

2.4.1日内检测变异性分析

以34种猪血浆小分子代谢物的定量浓度值为X变量，对50个样本(不同前处理方案×5个样品×5次检测)做5个主成分的PCA分析。该模型可代表了方案1和方案2中76.9％和82.8％的数据信息，如图2A和图2C所示，在检测变异性影响下(同一聚类数据点离散程度)，5个样本能够明显的相互区分。且两种猪血浆样品前处理方案均显示相似的结果，说明日内检测变异性未对猪血浆样品代谢差异分析产生大的影响。

为了进一步验证日内检测变异性对猪血浆代谢差异分析的影响，进行OPLS-DA分析。如图2B和图2D所示，在OPLS-DA二维散点得分图中，根据代谢差异，5个样品被明显的分离。相对于样品代谢差异，再次说明日内检测变异引起的组间变化(同一聚类数据点离散程度)可忽略不计。本研究中，方案一中OPLS-DA模型的R²X、R²Y和Q²值分别为76.4％、99.8％和99.6％，方案二中OPLS-DA模型的R²X、R²Y和Q²值分别为82.8％、99.7％和99.5％，结果表明该OPLS-DA对X变量和Y变量具有很好的解释能力和预测能力，即日内检测变异对样本代谢差异分析的干扰未影响OPLS-DA模型的性能。但OPLS-DA模型是否过度拟合需通过置换检验进行评估，其中R²和Q²低于原始值且Q²回归线截距小于0，则表示该模型未过度拟合。如图3A和图4A所示，在对OPLS-DA分别进行200次置换检验的结果中，R²和Q²的至均小于原始值且Q²回归线截距小于0，说明该模型是可靠的。根据RMSEcv分析结果，如图3B和图4B所示，RMSEcv均小于0.05，同样表明日内检测变异未对OPLS-DA模型产生较大影响。

通过猪血浆小分子代谢物定量数据评价样本间代谢差异，检测方法的变异性则是不可忽视的误差来源。对于样本本身差异较小的样品，检测误差甚至会影响最终分析结果。如图5所示，连续5次通过NMR方法定量检测的猪血浆34种小分子代谢物的日内检测CV值均小于5％。研究结果表明日内不同时间利用NMR技术检测猪血浆代谢物信息是可靠的，对样本血浆代谢差异的影响可忽略不计。对于不同前处理方案得到的检测结果，受检测样本溶液环境的影响其CV值存在一定的差异。如表1和表2所示，经方案二处理的血浆样品，通过NMR检测定量的血浆小分子代谢物的整体CV值略小于方案一。

表1方案一中每个样品的血浆代谢物日内检测的变异系数(CV)

表2方案二中每个样品的血浆代谢物日内检测的变异系数(CV)

2.4.2日间检测变异性分析

以34种猪血浆小分子代谢物浓度的定量值为X变量，对50个样本(不同前处理方案×5个样品×5天检测)做5个主成分的PCA分析。该模型可解释方案一和方案二中75.9和80.9％的原始数据，如图6A和图7A所示，在检测变异性影响情况下，5个样本均能够明显的相互区分。且不同前处理方案，PCA分析均显示相似的结果，说明日间检测变异性未对猪血浆样品代谢差异分析产生明显影响。

为了进一步验证日间检测变异性对猪血浆代谢差异分析的影响，做OPLS-DA分析。如图6B和图7B所示，在OPLS-DA二维散点得分图中，根据代谢差异，5个样品被明显的分离，再次说明日间检测变异未对样品代谢差异产生明显影响。方案一中OPLS-DA模型的R²X、R²Y和Q²值分别为74.1％、99.9％和99.8％，方案二中OPLS-DA模型的R²X、R²Y和Q²值分别为80.9％、99.3％和99.1％，结果表明日间检测变异同样未对OPLS-DA准确性造成干扰。如图6C和图7C所示，对OPLS-DA模型分别进行200次置换检验的结果中，R²和Q²的值均小于原始值且Q2回归线截距小于0，说明该模型是可靠的。根据RMSEcv分析结果，如图6D和图7D，发现RMSEcv均小于0.05，即表明日间检测变异未对OPLS-DA模型产生明显影响。

此外，交叉验证中日间不同检测数据和样品分组的稳定性分析结果(图8)显示日间检测对OPLS-DA模型的影响一致，但因前处理不同，存在一定的差异。进一步通过VIP值对34种猪血浆小分子代谢物日间检测变异性进行评价，结果发现即使具有主要贡献的小分子代谢物也未呈现明显检测误差(图7E)。但充当关键变量的小分子代谢物日间检测定量是否可靠，仍需进一步通过变异系数进行详细的评价。

如图9所示，日间检测CV值均小于5％。研究结果表明在样本允许存放时间范围内，利用NMR技术检测猪血浆代谢物信息是可靠的，对样本血浆代谢差异的影响可忽略不计。同理，对不同血浆样品前处理方案得到的日间血浆小分子代谢物检测定量的CV值进行对比分析。结果如表3所示，经方案二处理的血浆样品，通过NMR分析定量的血浆小分子代谢物整体CV值略小于方案一。

表3方案一和方案二各样品血浆代谢物日间检测总变异系数(CV)

2.4.3结果

通过对基于NMR检测猪血浆小分子代谢物的日内和日间变异性分析，发现NMR方法测定血浆代谢物具有稳定的检测性能，且日内和日间检测误差未对血浆样品代谢差异产生显著影响。即在样本保存时间和方式合理的情况下，借助NMR方法测定血浆代谢物是可靠的。此外，不同样品前处理条件下，小分子代谢物的定量检测变异系数计算结果均可控制在5％左右。相比类似的研究(CV<15％)，本方法的CV值评价呈现良好的结果。

因此，综合以上数据，优选本发明核磁共振检测方法如下：

将猪血浆样品(至少400μL)在12000rpm、4℃条件下离心5min，取上清液350μL转移至离心管(1.5mL)。分别加入350μL血浆缓冲液(血浆与缓冲液比例为1：1，缓冲液为pH＝7.4的0.0075M NaH₂PO₄溶液)，并在12000rpm、4℃条件下再次离心5min，取600μL上清液注入5mm核磁管中。冷藏，待检测用。按照已确定的¹H NMR采集步骤和实验参数，使用600M超导核磁共振波谱仪采集对应的¹H NMR波谱数据。

2.5 UC法分离检测血浆脂蛋白亚类信息评价

经UC法分离得到的脂蛋白亚类，通过测定平均密度评估各组分密度分布情况。如图10A所示，VLDL、IDL、LDL和HDL组分密度均在相对应范围内。UC法分离脂蛋白亚类过程中，样品固有属性差异和密度调节实验误差导致各组分呈现一定的密度离散趋势，其中以VLDL和LDL最为明显。对于脂蛋白亚类，各组分均呈现明显的密度梯度。如图10B、图10C和图10D所示，脂蛋白亚类组群密度范围跨度越大，相应的梯度区分越明显。

对分离后的脂蛋白亚类游离胆固醇、总胆固醇、载脂蛋白B、磷脂、甘油三酯和载脂蛋白A1的生化信息定量检测结果如图11所示，游离胆固醇、总胆固醇和甘油三脂在IDL、LDL和HDL中的浓度均略高于在VLDL的浓度，即血浆中胆固醇和甘油三脂的分布重要集中于IDL、LDL和HDL中。该结果表示，在机体脂质代谢过程中VLDL、IDL、LDL和HDL之间的转换处于活跃状态，而经肝脏合成分泌至血液的VLDL易被迅速分解，并作为合成密度更大的脂蛋白的原料。图11B、图11D和图11E所示，对于HDL，H1TC、H1TG和H1PL浓度要高于其他相对应的HDL亚类。图11C中，载脂蛋白B的浓度分布证实载脂蛋白B主要分布于LDL，而IDAB浓度较高则归因于在脂蛋白转换过程中IDL作为LDL的前体物质存在。图11D中，由于HDL密度大的特点，作为充当脂蛋白外壳的磷脂分子含量明显高于其它脂蛋白组分。图11F中，载脂蛋白A1作为HDL的特有蛋白质，其HDA1浓度与血浆总在载脂蛋白A1接近且略高于TPA1。

对于脂蛋白亚类的的生化信息评估如图12和图13所示。图12A和图12B所示，对VLDL和LDL中载脂蛋白B的含量评估发现，VLDL中载脂蛋白B主要集中于VLDL5和VLDL6中，LDL中载脂蛋白B主要集中于LDL3-6。图13A、图13D、图13G和图13J所示，对于VLDL亚类，除磷脂外，VLDL5和VLDL6中总胆固醇、游离胆固醇和甘油三酯的浓度较高。图13B中，L1FC和L2FC浓度较高可能是导致LDFC浓度高于其他脂蛋白亚类(图11A)的原因。图13K中，L3PL、L4PL、L5PL和L6PL浓度较高可能是导致LDPL浓度高于VLPL(图11D)的原因。因此，在血浆脂蛋白亚类测定方法中，优选将血浆脂蛋白亚类分为116种。

2.6 NMR实验参数的优化

2.6.1温度的优化

温度作为确保血浆样本能够前提条件，需在310k的条件下精确运行，从而能够有效避免血浆中大分子蛋白、脂质和脂蛋白分子聚合体及其与小分子代谢物的结合特性随温度变化而发生显著的变化。因此，在样品运行前，需使用99.8％的氘化甲醇(MeOD)标准样品进行温度的校准。首先，在仪器中放入MeOD核磁管，在一定的时间内使其温度达到平衡。此后，操作探头自动调谐和选择MeOD进行锁场。使用脉冲长度为1μs的标准90°质子参数集进行2次扫描实验。经过自动或者手动匀场操作后，当核磁信号采集过程中没有任何谱峰加宽时，由于H-D的自旋耦合，应使得在3.33ppm的甲醇峰(来自CD₂H-)对称且具有明显的1:2:3:2:1的多重性。通过仪器制造商提供的校准曲线进行参考对照，测量两个甲醇峰之间的距离宽度(CH₃和OH共振：3.0Hz)，计算出真实探针温度。最后根据样品所需条件，调整探头的目标温度，重复此过程，直到样品的实际计算温度为310±0.05K。

因此，本方法优选的实际测定温度为310±0.05K。

2.6.2水峰的优化

水峰的强度通常超过溶质信号的几千倍，使许多NMR实验无法进行，从而得不到需要的一维和二维图谱，难以完成谱峰指定和进一步的构象研究，所以需要进行水峰的优化。首先，需检查¹H NMR采集序列的水抑制功能的性能，将仪器中放入2mM的蔗糖标准样品(含0.5mM TSP,2mM NaN₃,90％H₂O：10％ D₂O)，再利用饱和、长弛豫延迟和1次扫描的一维核磁共振实验对中心频率O1进行优化。在获得全周期(8次扫描)实验和相对较长的延迟(～10s)后，对水峰的抑制性能进行评估(其理想状态为信噪比必须高于300、分辨率优于15％且水峰不大于40/80Hz)。随后，使用自动化程序机型计算，得出样品的最佳90°脉冲长度。采集样品(含0.5mM TSP)¹H NMR谱图，并对TSP信号进行相位调整，改变其脉冲频率值，以确保其余频谱(包括残余水峰值)可以相位化。将检查TSP峰半峰宽是否小于0.8Hz作为评价磁场均匀性的参考标准，进行脉冲频率的优化。将记录的90°脉冲长度与饱和频率和功率(25Hz场对应的饱和功率)以及其他采集参数读取至今的实验文件中数据，并确保以最佳的水饱和度，TSP峰半峰宽应小于0.8Hz的条件，用8倍的扫描次数重新采集¹H NMR谱图。最后使用24.1K点和suppcal命令对光谱进行再处理，估计水抑制的效率。此阶段若频谱的分辨率和信噪比未达到实验要求，则有必要进行重新校准。

2.6.3实验质量的优化

为了监测磁场均匀性和质量的一致性，需使用α-葡萄糖的H¹质子等小代谢物的信号并结合TSP信号。其中，除了温度差异引起的共振位移，残余水峰值应不影响4.6-4.8ppm范围以外的基线，再对实验质量进行优化。确保温度平衡为310±0.05K的前提下，读取蔗糖标准品¹H NMR谱图采集过程中设置的实验参数。以标准的过饱和度序列作为标准修改脉冲序列，将瞬变次数改为1，并去除虚扫描和线展宽。经过调谐和锁场的操作后，血浆样品的buffer溶剂将锁定样品。遵循蔗糖标准样品步骤所描述的过饱和度频率和功率设置一致的方法，计算90°脉冲长度。记录并更新优化的实验参数。在采集程序或自动化程序中导入实验参数，获得¹H NMR数据后进行傅里叶变换、相位、基线调整和定标等处理。TSP峰信号由于血浆样品的特性，内标物(TSP)受内源性蛋白质等大分子结合的影响，易被拓宽。

因此，本方法中优选内标物TSP对血浆代谢物进行定量，从而弥补其他方案中需借助二次检测确定内标物含量的不足。

2.7在上述最优化方法下的到内容物核磁谱图结果

代谢物¹H NMR谱图特征峰识别参照图14。从猪血浆样本核磁谱图中指认大约34种代谢物。

2.8 ¹H NMR谱图处理

以α-葡萄糖中H¹质子双峰的化学位移(5.22ppm)和TSP单峰化学位移(0.00ppm)为基准对¹H NMR谱图进行定标操作后，各代谢物¹H NMR谱峰均处在同一范围内，如图15A。PLSR模型的建立需依靠¹H NMR谱图原始数据为X变量，各样品所对应谱峰的化学位移在水平位置上存在的微量偏差均会对建模结果造成显著影响。如图15B所示，仅通过常规定标操作未能达到“对齐”要求。¹H NMR谱图血浆代谢物特征峰化学位移的偏移，不利于PLSR模型对各观测变量X回归系数和权重的准确判断，从而影响模型的预测准确性。

sub-align代码将¹H NMR谱图分割为若干区间，并以平均值为谱图对齐参考，¹HNMR谱图对齐结果如图16所示，0.6～1.4ppm范围内谱图对齐效果较好(图16A)，化学位移异常谱图被矫正(图16B)。sub-align处理仅微调¹H NMR谱图水平方向的化学位移，不改变垂直方向代表血浆代谢物含量的峰强度，故对血浆代谢物的后续积分定量无影响。具体操作如下：在MATLAB工作区中分别根据核磁谱图信息输入ppm，ppm_mean，data以及subject。运行sub-align文件夹中的sub-aligndemo，点击运行。在工作区得到第一次对齐结果Alignedplasma。随后选择Alignedplasma第43862列至46481列，并在复制在新工作区中的data中。并根据实际样品数量补充工作区的subjects和indexes的列向量长度。运行sub-aligndemo，随后将工作区的AlignedWineData数据导出。

因此，本方法中优选使用sub-align代码对¹H NMR谱图0.6～1.4ppm区间(2620个数据点)进行对齐处理，弥补常规定标¹H NMR谱图血浆代谢物特征峰化学位移的偏移，增强了模型预测性能。sub-align处理仅微调¹H NMR谱图水平方向的化学位移，不改变垂直方向代表血浆代谢物含量的峰强度，对血浆代谢物的后续积分定量无影响。

2.9 PLSR模型的建立和评价

2.9.1 PLSR模型的建立

以UC法得到的猪血浆脂蛋白亚类信息为预测变量Y，选取代表脂蛋白及其亚类各基团末端-CH₃和脂肪酰基长链(-CH₂-)_n的¹H NMR谱图数据(0.6-1.4ppm)作为观测变量X，将数据导入Unscrambler10.4软件中，建立PLSR模型，并通过交叉验证方式评价模型的预测效果。模型结果如图17所示，以血浆总胆固醇PLSR模型(TPTG)为例，测定值与模型预测值拟合效果良好(R²＝0.9378)。预测值的线性曲线斜率与测定值相近，分别为0.9707和0.9755。

因此，本方法中优选偏最小二乘回归(PLSR)模型，并优选交叉验证方式通过建模数据对PLSR模型进行验证，确保精确度。

2.9.2 PLSR模型的分析

如图18A，对TPTG模型重要变量回归系数分析，结果表明谱图区间在0.6～1.4ppm范围内的2620个数据点均对模型有不同程度的贡献，其中-CH₃和(-CH₂-)n峰群数据对该模型起主要决定作用。图18B中，观测变量X的权重分析也得到相似的结果，说明-CH₃和(-CH₂-)_n的¹H NMR数据与血浆甘油三酯的含量具有紧密的联系，借助PLSR模型可准确的对其进行预测。

PLSR模型潜在变量数量对模型性能具有巨大影响。由于脂蛋白及其亚类的化学复杂性，使其具有代表性的NMR信号的数量及其分辨率存在差异。并且，样品各脂蛋白及其亚类生化信息的变化趋势并不一致。0.6～1.4ppm范围内脂蛋白亚类和非脂蛋白亚类光谱信号的重叠均可产生不同数量的潜在变量，这将导致各脂蛋白亚类所对应的PLSR模型性能不尽相同。剔除各脂蛋白亚类信息异常值(导致在不同的PLSR模型中使用不同数量的样品)。通过10倍交叉验证和10次蒙特卡洛重复，将1～20个潜在变量模型拟合到训练样本(70％)，选择了最佳的数量。本研究中，对PLSR模型的验证未采用新的数据集，而是通过建模数据进行交叉验证，因此精确度相对较高。此外，脂蛋白颗粒浓度在血液中具有共变性，且生物学使得打破这种共变非常困难。即脂蛋白亚类在血液中的代谢彼此相关，这将导致脂蛋白亚类PLSR预测模型依赖于与高度共变脂蛋白颗粒相关的信息，具体表现为同一脂蛋白亚类不同生化信息具有不同的PLSR模型预测性能。而模型序列样品的差异性将显著减弱共变性引起的模型缺陷。UC法导致部分脂蛋白颗粒变性或降解，也是相应PLSR模型预测性能较低的潜在因素。例如，L4TG(R²＝0.3683)、L6PL(R²＝0.4919)、H2CH(R²＝0.3783)、H1FC(R²＝0.4792)、H5FC(R²＝0.3523)、H1TG(R²＝0.4539)、H1PL(R²＝0.4239)、H2A1(R²＝0.2456)和H6A1(R²＝0.4811)。为每个PLSR模型选择具有最小RMSECV的最优潜在变量数量，用于后续预测。筛选脂蛋白亚类生化信息预测误差较大的少数样品，定义为“X-Y关系”异常值，并从训练模型中去除，然后重新计算PLSR校准模型。本方法中优选建立116个PLSR模型用于116种猪血浆脂蛋白亚类的测定。

2.10血浆脂蛋白亚类表型用于链球菌急性感染猪的诊断研究

2.10.1动物实验

将21日龄的健康易感猪(杜×长×大)(猪链球菌PCR方法检测核酸为阴性，猪链球菌ELISA抗体检测试剂盒检测抗体为阴性)10头随机分成2组，每组5头。处理分别为生理盐水组和猪链球菌感染组，在实验第1天饮水接触攻毒，对照组以相同剂量和方法给予生理盐水。攻毒后第7天，感染组所有猪只均出现明显症状，前腔静脉采血，室温放置，肝素钠抗凝10min内，4000rpm离心5min离心分离得到血浆，干冰冻存待测。

2.10.2血浆脂蛋白亚类表型分析

采用本发明方法对猪血浆脂蛋白亚类表型进行分析，共检测到116种脂蛋白亚类，对照组猪和感染组猪血浆IDL、LDL和VLDL浓度无显著差异(P>0.05)，而感染组猪血浆HDL显著低于对照组猪(P<0.05)，其中有8种HDL亚类显著高于对照组猪(P<0.05)(图19)。这些结果不仅可以为疾病感染机制研究提供数据，而且可以为疾病诊断提供潜在生物标志物。

2.11不同品种猪血浆脂蛋白亚类表型研究

2.11.1动物实验

随机选取120日龄健康宁乡猪10头，前腔静脉采血，肝素钠抗凝10min内，4000rpm离心5min离心分离得到血浆，干冰冻存待测。

2.11.2血浆白亚类表型分析

采用NMR方法对宁乡猪血浆脂蛋白亚类表型的表征分析，共检测到116种脂蛋白亚类，其中甘油三酯亚类、磷脂亚类、载脂蛋白、胆固醇、游离胆固醇、胆固醇酯各约20种，不同的脂蛋白亚类的存在不同浓度范围和分布，差异较大(如图20所示)。这些结果可以为不同品系猪的代谢表型研究提供数据，为育种提供早期表型测定和预测方法，具有广阔的应用前景。

Claims

1.一种猪血浆脂蛋白亚类测定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)将至少400μL猪血浆样品在12000rpm、4℃条件下离心5min，取上清液转移至1.5mL离心管，按血浆：缓冲液＝1:1至1:2的比例加入pH为7.0～7.4，NaCl浓度为0～0.9％、NaH₂PO₄浓度为0.05～0.1M的缓冲液，并在12000rpm、4℃条件下再次离心5min，取600μL上清液注入5mm核磁管中，按照¹H NMR采集步骤和实验参数，使用600M超导核磁共振波谱仪采集对应的¹H NMR图谱数据；

(3)利用MATLAB R2022a软件，运行sub-align代码对¹H NMR谱图进行对齐处理；

(4)以UC法得到的猪血浆脂蛋白亚类生化信息为预测变量Y，¹H NMR谱图数据中0.6～1.4ppm部分为观测变量X，将数据导入sub-PLSR代码中，建立回归预测模型，并通过交叉验证方式评价模型的预测效果，获得优化后的与血浆脂蛋白亚类种类对应的回归预测模型；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述的回归预测模型为PLSR模型。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中是将血浆脂蛋白亚类分为如下116种：

4.如权利要要求3所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述优化后的与血浆脂蛋白亚类种类对应的回归预测模型包括：

5.如权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)是将待测猪血浆样品进行步骤(1)的操作，然后将¹H NMR图谱数据代入回归预测模型中，实现血浆脂蛋白亚类种类的测定。

6.一种猪血浆脂蛋白亚类测定的前处理方法，其特征在于，所述前处理方法是将至少400μL猪血浆样品在12000rpm、4℃条件下离心5min，取上清液转移至1.5mL离心管，按血浆：缓冲液＝1:1至1:2的比例加入pH为7.0～7.4，NaCl浓度为0～0.9％、NaH₂PO₄浓度为0.05～0.1M的缓冲液，并在12000rpm、4℃条件下再次离心5min，取600μL上清液注入5mm核磁管中，冷藏，待检测用。

7.如权利要求6所述的前处理方法，其特征在于，所述前处理方法是将至少400μL猪血浆样品在12000rpm、4℃条件下离心5min，取上清液350μL转移至1.5mL离心管，加入350μLpH＝7.4、NaH₂PO₄浓度为0.075M的缓冲液，并在12000rpm、4℃条件下再次离心5min，取600μL上清液注入5mm核磁管中，冷藏，待检测用。

8.一种猪血浆脂蛋白亚类测定回归模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(4)以UC法得到的猪血浆脂蛋白亚类生化信息为预测变量Y，¹H NMR谱图数据中0.6～1.4ppm部分为观测变量X，将数据导入sub-PLSR代码中，建立回归预测模型，并通过交叉验证方式评价模型的预测效果，获得优化后的与血浆脂蛋白亚类种类对应的回归预测模型；所述的回归预测模型为PLSR模型。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(2)中是将血浆脂蛋白亚类分为如下116种：

10.如权利要要求3所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述优化后的与血浆脂蛋白亚类种类对应的回归预测模型包括：