CN117635425A - 基于二分加速参数估计算法的结构光照明显微成像方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于二分法加速参数估计算法的结构光照明显微成像方法，用于快速、长时程、活细胞超分辨观测。本发明利用二分查找的搜索特性降低了传统互相关参数估计算法的迭代冗余，同时保证了参数估计的准确性和抗噪性。能够在低信噪比情况下快速、精确地计算出亚像素精度的波矢量和初相位，进而实现对活细胞精细结构的高质量动态超分辨成像。由于具有高精度、鲁棒的抗噪性和较低的计算复杂度，本发明成为进行快速、长时程、无伪影活细胞超分辨成像的一种有前途的方法。
Description
技术领域
本发明属于超分辨荧光显微成像技术领域，具体为基于二分加速参数估计算法的结构光照明显微成像方法。
背景技术
光学显微镜在生命科学中扮演着不可或缺的角色，但其分辨率受限于物镜的数值孔径(NA)和发射光波长，通常只能观测到分子尺度结构或细胞器的图像。然而，随着对细胞器精细结构和相互作用研究需求的不断增长，各种荧光超分辨成像技术应运而生，打破了阿贝衍射极限，将光学显微镜的空间分辨率提升至纳米级别，极大地推动了生命科学和生物医学领域的发展[Lichtman J W,ConchelloJA.Fluorescence microscopy[J].Naturemethods,2005,2(12):910-919.]。这些技术主要包括受激发射耗尽显微镜(stimulatedemission depletion，STED)、随机光学重建显微镜(stochastic optical reconstructionmicroscopy，STORM)、光活化定位显微镜(photoactivated localization microscopy，PALM)和结构光照明显微技术(structured illumination microscopy，SIM)。在这些技术中，SIM技术由于其宽视场、快速成像速度和低激发光功率密度等独特优势，非常适用于长时间活细胞和结构动态行为的观察[Kner P,Chhun B B,Griffis E R,et al.Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination[J].Nature methods,2009,6(5):339-342.]。
在SIM重建过程中，求解和分离样品的光谱并将其移回正确位置是非常关键的步骤。这个过程高度依赖照明参数(照明频率矢量、角度、相位和调制深度)，即使重建参数与正确参数稍有误差，也会导致重建图像中出现明显的伪影，如重影和条纹[Schaefer L H,Schuster D,Schaffer J.Structured illumination microscopy:artefact analysisand reduction utilizing aparameter optimization approach[J].Journalofmicroscopy,2004,216(2):165-174.]。为了解决这个问题，已经提出了几种照明参数估算算法，例如峰值相位(phase-of-peak，POP)、非迭代自相关重建(non-iterativeautocorrelation reconstruction，ACR)、图像重组变换(image recombinationtransform，IRT)和二维互相关(cross-correlation，COR)。尽管前三种算法可以以非迭代的方式快速计算照明参数，但在低信噪比(signal-to-noise，SNR)或调制深度较弱的情况下的精确度和鲁棒性表现不佳。相比之下，二维迭代互相关(COR)算法作为目前应用最广泛的照明参数估算算法之一，通过迭代遍历搜索亚像素级别的波矢量坐标，即使在复杂的实验环境下也能保持较高的精确度和鲁棒性[Müller M,V,Hennig S,etal.Open-source image reconstruction of super-resolution structuredillumination microscopy data in ImageJ[J].Nature communications,2016,7(1):10980.]。
传统的SIM技术面临一些技术挑战，其中关键的挑战之一是成像速度和效率。传统SIM算法需要进行大量的互相关计算，导致图像重建速度较慢，因此有必要对其进行改进和加速。
发明内容
本发明旨在提供一种基于二分加速参数估计算法的结构光照明显微成像方法，以实现对活细胞中纳米尺度的亚细胞结构特征、运动状态、相互作用及蛋白质功能的快速、长时程、灵活、便捷、低光损伤观测。
实现本发明目的的技术方案为：一种基于二分加速参数估计算法的结构光照明显微成像方法，具体步骤为：
步骤1：采集用于结构光照明超分辨所需的样品原始照明图像；
步骤2：分离样品原始图像的三个频谱信息，包括0级和±1级频谱信息；
步骤3：使用分离的频谱信息定位整像素精度的1级频谱峰值坐标；
步骤4：在0级频谱与1级频谱的公共区域进行互相关值计算；
步骤5：使用二分查找法搜索出互相关值最大的亚像素精度照明向量；
步骤6：通过亚像素精度照明向量估计照明参数；
步骤7：利用获取的照明参数将步骤2中初步分离的样品0级和±1级频谱信息进行分离与重组，通过维纳反卷积重构出实时的超分辨图像。
优选地，采集用于结构光照明超分辨所需的样品原始照明图像的具体方法为：
通过结构光照明成像系统采集样品在三个不同照明方向上的三步相移正弦照明图像。
优选地，任一方向上的三步相移正弦照明图像具体为：
其中，D表示被采集的照明图像，r表示空间坐标，是卷积运算，S是样本信息，H是光学显微系统的点扩散函数(PSF)，md表示第d个方向结构光的调制度，pd表示第d个方向结构光的频率，/>表示第d个方向结构光的第n个相移，/>表示第d个方向结构光的初相位，d＝1,2,3，n＝1,2,3。
优选地，分离样品原始图像的三个频谱信息的具体方法为：
步骤2.1：对步骤1中获取的照明图像进行傅里叶变换，变换后的频谱图像被表示为：
式中，k表示频率坐标，表示样本的傅里叶变换，下标0和±1表示频谱的不同级谱，/>代表光学传递函数，/>表示照明图像D的频谱图，/>分别表示无光学传递函数与照明参数成分的样品S的0级频谱、+1级频谱和-1级频谱，i代表虚数符号，e为自然底数；
步骤2.2：对步骤2.1获得的频谱图像进行线性组合并初步分离出样品的0级和±1级频谱信息：
令C0，C1，C-1分别为初步分离的样品0级和±1级频谱信息。
优选地，步骤3使用分离的频谱信息定位整像素精度的1级频谱峰值坐标，具体为：
kint＝arg max C1
其中，kint表示为+1级频谱中最大值的整像素坐标，C1为+1级频谱信息。
优选地，步骤4在0级频谱与1级频谱的公共区域进行互相关值计算的具体方法为：
在上述公式中，Cor表示为互相关运算，*表示共轭，ks表示次级谱频移坐标，和/>分别表示为0级频谱和1级频谱的公共区域。
优选地，步骤5按照二分查找法搜索出互相关值最大的亚像素精度照明向量的具体方法为：
步骤5.1：以步骤3中定位的整像素坐标为中心，取x方向初始步长的亚像素精度区间，对区间两端坐标进行互相关值计算；保留较大互相关值的一端到中心的区间；
步骤5.2：以步骤5.1得到的区间中点为中心，取y方向初始步长的亚像素精度区间，对区间两端坐标进行互相关值计算；保留较大互相关值的一端到中心的区间，作为下一次y方向迭代计算的区间；
步骤5.3：以步骤5.1和步骤5.2计算的区间作为初始计算区间重复进行步骤5.1和步骤5.2的计算，经过指定次数的x和y方向交替迭代计算后，对最终的区间取中心坐标作为最终确定的亚像素精度照明向量。
优选地，步骤6通过亚像素精度照明向量估计照明参数的具体步骤为：
通过复数线性回归获得初始相位和调制深度：
其中，angle是返回复数相位的函数，和/>分别表示为0级共轭频谱、±1级频谱，md表示第d个方向结构光的调制度，/>表示第d个方向结构光的初相位，d＝1,2,3，n＝1,2,3。
优选地，通过维纳反卷积重构出的实时的超分辨图像具体为：
其中，表示傅里叶逆变换，*表示共轭，/>代表光学传递函数，ω为维纳常数，pd,n表示第d个方向结构光第n个的频率，d＝1,2,3，n＝1,2,3。
本发明与现有技术相比，其显著优点为：本发明在复杂且低信噪比的实验环境中，能够快速而精准地估计照明参数，以及快速、长时程、高保真度的动态超分辨成像；本发明提供了一种灵活、便捷、低光损伤的观测手段，为研究活细胞中纳米尺度的亚细胞结构特征、运动状态、相互作用及蛋白质功能提供了有效工具。
下面结合附图对本发明作进一步详细描述。
附图说明
图1为本发明的流程图。
图2为利用本发明和传统方法在不同信噪比下对牛肺动脉内皮(BPAE)细胞的实验结果。(a)宽场图像和通过本发明获取的超分辨图像。原始图像通过40X0.6NA物镜获取。(b)图(a)中白色方框区域在不同噪声水平下经过不同参数估计算法重建的图像。(c)不同参数估计算法在不同噪声水平下对图(b)蓝色线段的强度对比曲线图(归一化至最大值)。
图3为利用本发明在不同时间点对COS-7细胞线粒体的超分辨重建结果。其中线粒体通过MitoTrackerTM Green FM标记。(a)宽场图像和本发明获得的超分辨图像。原始图像通过原始图像通过60X 1.42NA物镜获取。(b)-(c)图(a)中白色方框和黄色方框在不同时间点下放大的超分辨重建图像(两个第一帧放大的图像皆为宽视场图像)。
具体实施方式
本发明提出了一种基于结构光照明显微的二分加速参数估计方法，用于长时间观察下的快速超分辨活细胞显微观察。该算法利用了二分查找的搜索特性，以降低计算量的同时保证了参数估计的准确性和抗噪性。在高信噪比情况下，该算法能够快速、精确地计算出亚像素精度的波矢量和初相位。而在低信噪比情况下，该算法能够有效地抑制噪声干扰，并保持较高的准确性。该算法具有高精度、鲁棒的抗噪性和较低的计算复杂度，因此在进行快速、长时程、无伪影活细胞超分辨成像方面具有很大的潜力。此外，在复杂且信噪比较低的实验环境中，该算法还能够快速计算估计照明参数，并实现对活细胞精细结构的快速、高质量动态超分辨成像。该发明方法的流程图如图1所示，具体步骤如下：
步骤1：通过结构光照明成像(structured illumination microscopy，SIM)系统采集样品在三个不同照明方向上的三步相移正弦照明图像，其中某个照明图像被表示为：
其中，D表示被采集的照明图像，r表示空间坐标，是卷积运算，S是样本信息，H是光学显微系统的点扩散函数(PSF)，md表示第d个方向结构光的调制度，pd表示第d个方向结构光的频率，/>表示第d个方向结构光的第n个相移，/>表示第d个方向结构光的初相位，d＝1,2,3，n＝1,2,3。
步骤2：由步骤1中的照明图像初步分离样品的0级和±1级频谱信息。具体步骤为：
步骤2.1：对步骤1中获取的照明图像进行傅里叶变换，变换后的频谱图像被表示为：
在上述公式中，k表示频率坐标，表示样本的傅里叶变换，下标0和±1表示频谱的不同级谱，/>代表光学传递函数(OTF)。/>表示照明图像D的频谱图，/> 分别表示无光学传递函数与照明参数成分的样品S的0级频谱、+1级频谱和-1级频谱，i代表虚数符号，e为自然底数。
步骤2.2：对步骤2.1获得的频谱图像进行线性组合并初步分离出样品的0级和±1级频谱信息：
令C0，C1，C-1分别为初步分离的样品0级和±1级频谱信息。
步骤3：通过分离的频谱信息定位整像素精度的+1级频谱峰值坐标，具体为：
kint＝arg max C1
其中，kint表示为+1级频谱中最大值的整像素坐标。
步骤4：通过0级频谱与+1级频谱的公共区域进行互相关值计算的具体方法为：
在上述公式中，Cor表示为互相关运算，*表示共轭，ks表示次级谱频移坐标，和/>分别表示为0级频谱和1级频谱的公共区域。
步骤5：按照二分查找法搜索出互相关值最大的亚像素精度照明向量的具体方法为：
步骤5.1：以步骤3中定位的整像素坐标为中心，取x方向初始步长的亚像素精度区间，对区间两端坐标进行互相关值计算；保留较大互相关值的一端到中心的区间，作为下一次x方向迭代计算的区间；
步骤5.2：以步骤5.1得到的区间中点为中心，取y方向初始步长的亚像素精度区间，对区间两端坐标进行互相关值计算；保留较大互相关值的一端到中心的区间，作为下一次y方向迭代计算的区间；
步骤5.3：以步骤5.1和步骤5.2计算的区间作为初始计算区间再次进行步骤5.1和步骤5.2的计算，经过指定次数的x和y方向交替迭代计算后，对最终的区间取中心坐标作为最终确定的亚像素精度照明向量。
步骤6：通过步骤5精确定位的照明向量精确估计照明参数的具体步骤为：
当通过二分加速参数估计算法得到较为准确的照明向量后，可以通过复数线性回归获得初始相位和调制深度：
其中，angle是返回复数相位的函数，和/>分别表示为0级共轭频谱、±1级频谱，md表示第d个方向结构光的调制度，/>表示第d个方向结构光的初相位，d＝1,2,3，n＝1,2,3。
步骤7：利用在步骤6中获取的照明参数将步骤2中初步分离的样品0级和±1级频谱信息进行精确分离与重组，对另外两个照明方向执行同样的操作，通过维纳反卷积重构出实时的超分辨图像，具体为：
其中，表示傅里叶逆变换，*表示共轭，/>代表光学传递函数，ω为维纳常数(通常由经验确定)，pd,n表示第d个方向结构光第n个的频率，d＝1,2,3，n＝1,2,3。
本发明有望促进新的生物现象的发现，为细胞生物学、癌症研究、发育生物学和神经科学等领域提供了新的可能性。
实施例
为了验证本发明所述方法在准确性和抗噪性方面的优势，进行了一系列仿真实验，以探究不同信噪比情况下的性能。使用了高分辨率(1024×1024像素)的牛肺动脉内皮(BPAE)细胞图像作为模板，并生成了模拟40×0.6NA显微镜采集的低分辨率图像。为了模拟真实场景中的噪声情况，有意地添加了不同强度的高斯噪声。分别采用了本发明所述方法和传统COR算法进行超分辨图像重建。图2.a展示了宽视场图像和本发明所述方法的超分辨重建图像。在图2.b1-b3中，展示了在不同噪声水平(5dBW、10dBW和15dBW)下的重建图像，并将其与传统COR算法的结果进行对比。从视觉上观察，本发明所述方法和传统COR算法在重建图像的表现上高度相似。为了进一步评估重建图像的质量，在图2.c中对比了图2.b中蓝色线段区域的荧光强度。结果显示，在高信噪比情况下[图2.c1]，本发明所述方法与传统COR算法在对比度表现上几乎一致。而在低信噪比情况下[图2.c3]，本发明所述方法的对比度表现略微优于传统COR算法。仿真实验结果表明，利用本发明所述方法进行超分辨图像重建在准确性和抗噪性方面与传统COR算法相当甚至略有优势。这进一步验证了本发明所述方法的有效性和可行性，为显微镜图像重建领域提供了一种新的改进方法。
最近的研究表明，线粒体动态管化(MDT)对线粒体网络的形成起着重要作用，并对维持线粒体功能(如线粒体DNA完整性和细胞凋亡等)至关重要。提前采集了由MitoTrackerTM Green FM标记的活COS-7细胞的线粒体动态图像数据集，并使用本发明所述方法对其进行处理，生成了超分辨动态数据集，如图3.a所示。在图3.b中，右侧的线粒体试图通过伸出小管来连接相对方向的线粒体小管，但未成功。而对面的线粒体小管直接伸出足够长的小管与右侧的线粒体连接。这种观察提示线粒体小管融合的动态过程可能受到方向性和空间配置的影响。此外，在图3.c中，可以看到当附近没有其他线粒体小管时，线粒体小管会向周围探索和移动。这种探索行为可能与线粒体的动态重组和适应环境的能力有关。通过这些观察，展示了通过本发明所述方法生成的超分辨动态数据集能够揭示线粒体动态过程中的细微细节和行为。
Claims (9)
1.一种基于二分加速参数估计算法的结构光照明显微成像方法，其特征在于，具体步骤为：
步骤1：采集用于结构光照明超分辨所需的样品原始照明图像；
步骤2：分离样品原始图像的三个频谱信息，包括0级和±1级频谱信息；
步骤3：使用分离的频谱信息定位整像素精度的1级频谱峰值坐标；
步骤4：在0级频谱与1级频谱的公共区域进行互相关值计算；
步骤5：使用二分查找法搜索出互相关值最大的亚像素精度照明向量；
步骤6：通过亚像素精度照明向量估计照明参数；
步骤7：利用获取的照明参数将步骤2中初步分离的样品0级和±1级频谱信息进行分离与重组，通过维纳反卷积重构出实时的超分辨图像。
2.根据权利要求1所述的基于二分加速参数估计算法的结构光照明显微成像方法，其特征在于，采集用于结构光照明超分辨所需的样品原始照明图像的具体方法为：
通过结构光照明成像系统采集样品在三个不同照明方向上的三步相移正弦照明图像。
3.根据权利要求2所述的基于二分加速参数估计算法的结构光照明显微成像方法，其特征在于，任一方向上的三步相移正弦照明图像具体为：
其中，D表示被采集的照明图像，r表示空间坐标，是卷积运算，S是样本信息，H是光学显微系统的点扩散函数(PSF)，md表示第d个方向结构光的调制度，pd表示第d个方向结构光的频率，/>表示第d个方向结构光的第n个相移，/>表示第d个方向结构光的初相位，d＝1,2,3，n＝1,2,3。
4.根据权利要求1所述的基于二分加速参数估计算法的结构光照明显微成像方法，其特征在于，分离样品原始图像的三个频谱信息的具体方法为：
步骤2.1：对步骤1中获取的照明图像进行傅里叶变换，变换后的频谱图像被表示为：
式中，k表示频率坐标，表示样本的傅里叶变换，下标0和±1表示频谱的不同级谱，/>代表光学传递函数，/>表示照明图像D的频谱图，/>分别表示无光学传递函数与照明参数成分的样品S的0级频谱、+1级频谱和-1级频谱，i代表虚数符号，e为自然底数；
步骤2.2：对步骤2.1获得的频谱图像进行线性组合并初步分离出样品的0级和±1级频谱信息：
令C0，C1，C-1分别为初步分离的样品0级和±1级频谱信息。
5.根据权利要求1所述的基于二分加速参数估计算法的结构光照明显微成像方法，其特征在于，步骤3使用分离的频谱信息定位整像素精度的1级频谱峰值坐标，具体为：
kint＝argmaxC1
其中，kint表示为+1级频谱中最大值的整像素坐标，C1为+1级频谱信息。
6.根据权利要求1所述的基于二分加速参数估计算法的结构光照明显微成像方法，其特征在于，步骤4在0级频谱与1级频谱的公共区域进行互相关值计算的具体方法为：
在上述公式中，Cor表示为互相关运算，*表示共轭，ks表示次级谱频移坐标，和分别表示为0级频谱和1级频谱的公共区域。
7.根据权利要求1所述的基于二分加速参数估计算法的结构光照明显微成像方法，其特征在于，步骤5按照二分查找法搜索出互相关值最大的亚像素精度照明向量的具体方法为：
步骤5.1：以步骤3中定位的整像素坐标为中心，取x方向初始步长的亚像素精度区间，对区间两端坐标进行互相关值计算；保留较大互相关值的一端到中心的区间；
步骤5.2：以步骤5.1得到的区间中点为中心，取y方向初始步长的亚像素精度区间，对区间两端坐标进行互相关值计算；保留较大互相关值的一端到中心的区间，作为下一次y方向迭代计算的区间；
步骤5.3：以步骤5.1和步骤5.2计算的区间作为初始计算区间重复进行步骤5.1和步骤5.2的计算，经过指定次数的x和y方向交替迭代计算后，对最终的区间取中心坐标作为最终确定的亚像素精度照明向量。
8.根据权利要求1所述的基于二分加速参数估计算法的结构光照明显微成像方法，其特征在于，步骤6通过亚像素精度照明向量估计照明参数的具体步骤为：
通过复数线性回归获得初始相位和调制深度：
其中，angle是返回复数相位的函数，和/>分别表示为0级共轭频谱、±1级频谱，md表示第d个方向结构光的调制度，/>表示第d个方向结构光的初相位，d＝1,2,3，n＝1,2,3。
9.根据权利要求1所述的基于二分加速参数估计算法的结构光照明显微成像方法，其特征在于，通过维纳反卷积重构出的实时的超分辨图像具体为：
其中，表示傅里叶逆变换，*表示共轭，/>代表光学传递函数，ω为维纳常数，pd,n表示第d个方向结构光第n个的频率，d＝1,2,3，n＝1,2,3。/>
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| CN202311364466.5A Pending CN117635425A (zh) | 2023-10-20 | 2023-10-20 | 基于二分加速参数估计算法的结构光照明显微成像方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117635425A (zh) |
-
2023
- 2023-10-20 CN CN202311364466.5A patent/CN117635425A/zh active Pending
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