CN117625798A

CN117625798A - 用于肉牛基因分型检测的分子标记组合及应用

Info

Publication number: CN117625798A
Application number: CN202311345200.6A
Authority: CN
Inventors: 盖珂珂; 董林华
Original assignee: Beijing Muguo Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Muguo Technology Co ltd
Priority date: 2023-10-17
Filing date: 2023-10-17
Publication date: 2024-03-01

Abstract

本申请提供一种用于肉牛基因分型检测的分子标记组合、分子探针组合、基因芯片、试剂盒及其应用和构建肉牛基因库的方法及肉牛个体识别的方法。本申请的标记组合包括如表1所示的5000个SNP位点。根据本申请实施例的技术方案，基于5000个SNP位点，可进行多品种肉牛个体识别，适用于多个肉牛品种，解决了目前肉牛个体精准鉴定方案存在的不足，可满足生物资产贷款、牛只保险、个体溯源及精准识别的产业应用需要。

Description

用于肉牛基因分型检测的分子标记组合及应用

技术领域

本发明涉及家畜个体识别精准鉴定技术领域，具体涉及用于肉牛基因分型检测的分子标记组合及应用。

背景技术

肉牛个体价值大，肉牛养殖属于重资产投资行业。为缓解养殖户的经济压力，各金融平台也相继出台了生物资产抵押贷款政策和肉牛养殖保险业务，并逐渐已成为畜牧业的常规业务需求。

在上述业务中，常存在生物资产转移或灭失的情况。为确认申报牛只是已投保或抵押个体，产业实践中常需开展牛只个体的精准鉴定工作。但是，传统个体识别技术精确性低，微卫星等分子技术检测难度大，少量SNP(single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性)位点产品无法满足多品种的精准鉴定需要。

此外，在肉牛产品的溯源中，也需要一种能够进行个体精准溯源的方案。

发明内容

根据本申请的一方面，提供一种用于肉牛基因分型检测的分子标记组合，包括：如表1所示的5000个SNP位点。

根据本申请的另一方面，提供一种用于肉牛基因分型检测的分子探针组合，所述分子探针组合检测待测样品中如表1所示的5000个SNP位点。

根据本申请的另一方面，提供一种用于肉牛基因分型检测的基因芯片，所述基因芯片包含前述的分子探针组合。

根据本申请的另一方面，提供一种用于肉牛基因分型检测的试剂盒，包括前述的分子探针组合或基因芯片。

根据本申请的另一方面，提供根据前述的分子标记组合或根据前述的分子探针组合或根据前述的基因芯片或根据前述的试剂盒在肉牛个体识别中的应用。

根据本申请的另一方面，提供一种构建肉牛基因库的方法，所述方法基于前述的分子标记组合或前述的分子探针组合或前述的基因芯片或前述的试剂盒，所述方法包括：

采集目标肉牛群体的组织样本；

对检测合格的样本构建测序文库；

对样本进行基因组测序和位点基因分型判定；

确认个体所述5000个SNP位点的基因型。

根据一些实施例，所述基因型的格式包括：AA、TT、CC、GG、AT、AC、AG、TA、TC、TG、CA、CT、CG、GA、GT、GC、NA。

根据本申请的另一方面，提供前述的分子标记组合或前述的分子探针组合或前述的基因芯片或前述的试剂盒或前述的方法在肉牛产品溯源中的应用。

根据本申请的另一方面，提供一种肉牛个体识别的方法，包括：

采用前述的方法预先构建目标肉牛群体的肉牛基因库；

采集待确定肉牛个体的组织样本并确定所述5000个SNP位点的基因型；

将所述待确定肉牛个体的基因型与所述肉牛基因库中所有样本进行两两比对；

采用下面的遗传相似度计算公式，根据阈值判定所述待确定肉牛个体是否为所述肉牛基因库中的一个：

GS＝g_i j/G_ij×100％

其中，GS为待确定肉牛个体与对比样本之间的遗传相似度，g_i j为待确定肉牛个体与对比样本均检出且基因型一致的SNP位点数，G_ij为待确定肉牛个体与对比样本均检出的SNP位点总数。

根据一些实施例，前述方法还用于肉牛产品的溯源。

根据本申请实施例的技术方案，基于5000个SNP位点，可进行多品种肉牛个体识别，适用于多个肉牛品种，解决了目前肉牛个体精准鉴定方案存在的不足，可满足生物资产贷款、牛只保险、个体溯源及精准识别的产业应用需要。

应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性的，并不能限制本申请。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示出SNP位点在染色体上的分布情况。

具体实施方式

现在将参考附图更全面地描述示例实施例。然而，示例实施例能够以多种形式实施，且不应被理解为限于在此阐述的实施例；相反，提供这些实施例使得本申请将全面和完整，并将示例实施例的构思全面地传达给本领域的技术人员。

下面参考具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《生物信息学与功能基因组学》原著第三版或者相关书籍进行，所采用的生物信息软件和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用材料来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

此外，还需要说明的是，本发明提供的位点组合及应用均是本申请的发明人经过艰苦的创造性劳动和优化工作才得以完成。

在本文前述的位点组合部分中所描述的特征和优点，同样适用于基于位点组合所形成的分子探针组合、基因芯片、试剂盒以及其应用，在此不再赘述。

需要说明的是，本发明所称的生物产品包括但不限于基于本发明提供的位点信息制成的引物、探针、基因芯片、试剂盒等。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

在描述本申请实施例之前，对本申请实施例涉及到的一些术语或概念进行解释说明。

SNP：是指单核苷酸多态性(Single Nucleot ide Polymorphism)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，所述单个核苷酸的变异包括由单个碱基的转换、颠换、插入或缺失所导致的变异。

分子标记：为一切可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质，包括但不限于基于分子杂交的分子标记，如RFLP、Mini satelliteDNA；基于PCR技术的分子标记，如RAPD、STS、SSR和SCAR；基于限制性酶切和PCR技术的DNA标记；基于DNA芯片技术的分子标记，如SNP；基于EST数据库发展的分析标记技术等。本发明提供的分子标记可以用于基因组作图、和基因定位研究、基于图谱的基因克隆、物种亲缘关系和系统分类等。

探针：是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA)，例如Taqman-MGB探针。

试剂盒：本发明所称的试剂盒为本领域常规使用的任意一种包含检测或实验所用试剂，便于操作人员能够摆脱繁重的试剂配制及优化过程的盒子。

引物：

PCR扩增：

SNP，single nucleot ide polymorphi sm，单核苷酸多态性

GBTS,Genotyping by targeted sequence,靶向测序基因分型检测

MAF,Minor allele frequency,次等位基因频率

GS,Genet ic s imilarity,遗传相似性

RFLP，Restriction Fragment Length Polymorphi sm,限制片段长度多态性

RAPD，Random ampl ified polymorphic DNA，随机扩增的多态性DNA

PCR,Polymerase Chain React ion，聚合酶链式反应

传统的肉牛个体识别鉴定方式主要通过耳标、烙印或者植入电子芯片等方式进行。使用耳标的方式其缺点是耳标经常脱落，也容易被人为修改和替换，不易追踪和记录，无法实现个体的精准识别。活体烙印标记的方式则会对动物产生较大的应激，不利于动物福利，其操作也相对繁琐，无法进行个体特征标记，也不利于最终个体识别。对于芯片植入的方式，目前存在技术尚不成熟、成本昂贵等实际问题，也无法满足高效准确的个体识别应用场景。

随着高通量测序技术的快速发展，也相继出现一些基于分子标记的个体识别方式，包括基于RFLP(Restrict ion Fragment Length Polymorphism：限制片段长度多态性)、RAPD(Random amplified polymorphic DNA：随机扩增的多态性DNA)、SSR微卫星标记和单核苷酸多态位点(SNP)等技术的方案。其中，RFLP易受酶切位点的影响，获得的片段长度稳定性相对较差，用于个体识别的技术难度较大，不利于大规模的检测和应用。RAPD技术建立于PCR技术基础上，结果易受模板DNA的质量、浓度及实验条件的影响，基因检测的准确性相对较低，也不适用于精准个体识别的应用。应用较多的微卫星标记则属于短的重复基因序列标记，其主要缺点是在品种间、个体间序列的重复数量上均存一定差异，因此，对实现准确基因分型具有一定的挑战。此外，基于微卫星标记的重复序列比对也存在较高的技术难度，不利于大规模和多品种的个体识别精准鉴定。

SNP标记属于第三代分子标记，与上述分子标记相比，具有多态性稳定、基因组上分布多、容易被检测等特点，可作为用于肉牛个体识别精准鉴定的优选分子标记。最初的SNP检测产品受限于基因检测技术，其检测成本相对较高，因此仅有少数检测试剂盒可用于单一品种的个体识别。由于现有产品的SNP位点数量较少，其准确性也易受系统性误差影响，其基因频率也易受到育种的影响失去多态性。考虑到肉牛母牛的生产寿命可长达十余年，组建基因库和个体识别是一项长期、持续性的工作，此类产品均不适于大规模、多品种、长期性的基因库构建和个体识别应用场景。

为此，本发明挑选出5000个SNP位点，利用靶向测序基因分析技术(GBTS)设计开发出适用于多品种、长期组建肉牛基因库和个体识别的液相芯片，可为产业实际提供有效的技术手段，具有较大的应用价值。

下面结合附图对本申请的示例实施例进行说明。

实施例1：SNP位点组合的获得

(1)肉牛个体的选择

本申请的样本共来自于6个品种的286份个体，共计310个样本，其中有来自相同个体采样的38个盲测样本。6个品种分别是安格斯牛、安格斯杂交牛、海福特牛、利林赞牛、利木赞杂交牛、西门塔尔牛。

(2)样本的采集和基因组DNA的提取

采集肉牛个体的组织样本，样本类型包括但不限于血液、耳组织、牛毛或毛囊样本。采用磁珠法提取组织样本的DNA。

(3)SNP位点集合的选取

对上述组织样本通过高通量测序平台进行全基因组测序。所得原始测序数据比对到肉牛参考基因组版本ARS-UCD1.2进行SNP变异检测。根据对SNP分型数据进行分析，按照次级等位基因频率大于0.3、缺失率小于0.05、杂合率小于0.15的参数、基因组同源序列片段数小于5个、目标位点上下游GC碱基比例在20-80％之间的原则，挑选出5000个SNP位点集合。

本发明中的SNP位点在染色体上的分布情况如图1所示，位点信息见表3。表3中以下划线连接的两个数字分别是基因组染色体号与SNP位点在基因组上的物理位置，参考基因组版本为ARS-UCD1.2。根据本申请的方案基于靶向测序基因分析技术开发，该技术不限制检测位点的突变类型，因此不提供突变位点碱基类型。

实施例2：将SNP位点组合用于制备探针组合

利用GBTS(靶向测序基因分型)技术设计液相探针，例如TaqMan探针。

实施例3：将SNP位点组合用于制备基因芯片

本申请的SNP基因芯片可采用常规方法将实施例2获得的探针固定在聚合物基片上，例如尼龙膜、硝酸纤维膜、塑料、硅胶晶片、微型磁珠等，或将探针固定在玻璃基底或硅基底上，或在玻璃等硬质表面上直接合成实施例2获得的探针。本申请的SNP基因芯片的使用方法与常规方法相同。需要说明的是，本领域技术人员可以采用任一一种方式制备本申请的SNP基因芯片，或者也可以委托生物公司制备，但是基于本申请提供的SNP位点组合制备的SNP基因芯片均属于本发明的保护范围。

根据本申请的芯片可利用高通量测序技术对样本DNA进行基因分型检测，以获取各样本固定SNP分子标记的基因型信息，并构建肉牛个体识别基因库。

实施例4：试剂盒

本申请的SNP检测试剂盒包括基于实施例1获得的SNP位点组合获得的探针或基因芯片。根据使用类型的不同，还可包括相应的检测试剂，例如当基于实施例1获得的SNP位点组合获得Taqman探针时，还包括荧光定量PCR反应常规使用的缓冲液、连接酶等。

实施例5：肉牛个体识别

1、基因位点的获取。

1)样本DNA及测序文库构建

采集目标肉牛群体的组织样本，样本类型包括血液、耳组织或毛囊样本。采用磁珠法提取组织样本的DNA,使用Qubit检测进行DNA测量，对检测合格的样本构建测序文库。此后，可利用本发明中的检测产品对个体识别基因位点进行基因分型检测。

2)基因分型检测

使用高通量测序仪对样本进行基因组测序，获得测序数据后按以下步骤进行数据处理，主要包括以下内容：

①使用BWA软件进行基因组序列比对。

②使用GATK软件进行位点基因分型判定。

③去除indels之类的小片段结构变异。

④未检出的位点使用NA标记。

⑤最终确认个体5000个标记的基因型，基因型的格式包括：AA、TT、CC、GG、AT、AC、AG、TA、TC、TG、CA、CT、CG、GA、GT、GC、NA。

2、个体基因相似度分析

在基因对比时，待测样本与基因库中所有样本进行两两比较，采用遗传相似度计算公式(见公式1)获取各对样本间的遗传相似性分值，再根据阈值(例如95％)判断待测样本是否与基因库个体存在基因重复。

其中，GS为待测样本与对比样本之间的遗传相似度，g_ij为待测样本与对比样本均检出且基因型一致的SNP位点数(去除NA和变异)，G_ij为待测样本与对比样本均检出的SNP位点总数。

实施例6：检出率测试

利用本申请实施例的芯片在安格斯牛、安格斯杂交牛、海福特牛、利木赞、利木赞杂交牛以及西门塔尔群体中做测试。其中，310份测试样品的检出率为100％，平均SNP位点检出率为99.916％,各品种的杂合度为47.623％，芯片在上述品种中均具有较好的基因分型表现，产品通用性强，各品种的具体统计数据见表1。

表1 SNP在主要肉牛品种中的表现

品种	样本量	多态性位点数	SNP检出率	杂合率	样本检出率
						安格斯	6	5000	99.815％	48.203％	100％
安格斯杂交牛	4	5000	99.830％	50.180％	100％
						海福特	59	5000	99.927％	42.542％	100％
利木赞	32	5000	99.838％	50.190％	100％
						利木赞杂交牛	10	5000	99.882％	51.353％	100％
西门塔尔	199	5000	99.932％	48.460％	100％
						合计	310	5000	99.916％	47.623％	100％

实施例7：个体识别测试

为测试本发明方案对个体识别的实际应用效果，在310份测试样品中，随机安排38个重复样品进行盲测。通过对310份测试样品进行GS分析，结果中准确鉴定出38对重复样品。经过核对品种与盲测样本单独的备注信息表明，通过本申请的基因型的遗传相似度分析，鉴定到的重复样品与实际结果完全吻合。验证结果(参见表2)证明，本发明中的SNP位点集合适用于多个肉牛品种及杂交群体，且检测与分析方案能够实现准确的个体身份鉴定。本申请的方案和基因产品将为肉牛个体精准识别提供高效率、低成本和长期稳定的技术支撑。

表2测试样本遗传相似度结果示例

注：表格中X代表杂交牛

表3 SNP位点信息

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Claims

1.一种用于肉牛基因分型检测的分子标记组合，其特征在于，包括：如表1所示的5000个SNP位点。

2.一种用于肉牛基因分型检测的分子探针组合，其特征在于，所述分子探针组合检测待测样品中如表1所示的5000个SNP位点。

3.一种用于肉牛基因分型检测的基因芯片，其特征在于，所述基因芯片包含根据权利要求2所述的分子探针组合。

4.一种用于肉牛基因分型检测的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求2所述的分子探针组合或如权利要求3所述的基因芯片。

5.根据权利要求1所述的分子标记组合或根据权利要求2所述的分子探针组合或根据权利要求3所述的基因芯片或根据权利要求4所述的试剂盒在肉牛个体识别中的应用。

6.一种构建肉牛基因库的方法，其特征在于，所述方法基于根据权利要求1所述的分子标记组合或根据权利要求2所述的分子探针组合或根据权利要求3所述的基因芯片或根据权利要求4所述的试剂盒，所述方法包括：

采集目标肉牛群体的组织样本；

对检测合格的样本构建测序文库；

对样本进行基因组测序和位点基因分型判定；

确认个体所述5000个SNP位点的基因型。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述基因型的格式包括：AA、TT、CC、GG、AT、AC、AG、TA、TC、TG、CA、CT、CG、GA、GT、GC、NA。

8.根据权利要求1所述的分子标记组合或根据权利要求2所述的分子探针组合或根据权利要求3所述的基因芯片或根据权利要求4所述的试剂盒或根据权利要求6或7所述的方法在肉牛产品溯源中的应用。

9.一种肉牛个体识别的方法，其特征在于，包括：

采用根据权利要求6或7所述的方法预先构建目标肉牛群体的肉牛基因库；

GS＝g_ij/G_ij×100％

其中，GS为待确定肉牛个体与对比样本之间的遗传相似度，g_ij为待确定肉牛个体与对比样本均检出且基因型一致的SNP位点数，G_ij为待确定肉牛个体与对比样本均检出的SNP位点总数。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法还用于肉牛产品的溯源。