CN117625580A - 黄芩素生物合成相关的β-葡萄糖醛酸苷酶基因GUS1及编码产物与应用 - Google Patents
黄芩素生物合成相关的β-葡萄糖醛酸苷酶基因GUS1及编码产物与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了黄芩素生物合成相关的β‑葡萄糖醛酸苷酶基因GUS1及编码产物与应用。本发明提供了黄芩素生物合成相关的β‑葡萄糖醛酸苷酶，为序列表中序列4所示的蛋白质。本发明所提供的黄芩β‑葡萄糖醛酸苷酶(GUS1)基因是首次从黄芩植物中克隆制备所得。黄芩β‑葡萄糖醛酸苷酶(GUS1)是黄芩黄酮合成途径的关键基因，可用于调节黄芩中黄芩素的含量。利用本发明所提供的基因可以通过基因工程技术提高黄芩药效成分黄芩素的含量，可用于其大量生成，为制备黄芩的黄酮类化合物提供了研究方向。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种黄芩素生物合成相关的β-葡萄糖醛酸苷酶基因GUS1及编码产物与应用。
背景技术
黄芩为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根，具有清热燥湿，泻火解毒，止血，安胎的功效。黄芩最早记载于《神农本草经》，最早出版于《本草纲目》。作为我国传统的大宗药材，黄芩应用广泛，黄酮类物质是其主要的活性成分。现代医学表明，黄芩具有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤细胞等多种药理活性。
黄芩素，又名黄芩苷元，是一种黄酮类物质，在临床应用中作为一些片剂、口服液、注射剂和颗粒剂等剂型的主要药用成分发挥治疗作用，具有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤细胞等多种特殊的生物活性。黄芩β-葡萄糖醛酸苷酶基因(β-glucuronidase)具有将黄芩苷催化生成黄芩素的作用，因此分离鉴定黄芩β-葡萄糖醛酸苷酶基因，为大量生物合成黄芩素奠定理论基础。
发明内容
本发明一个目的是提供一种黄芩素生物合成相关的β-葡萄糖醛酸苷酶。
本发明提供的蛋白质，为如下(a1)-(a4)任一种：
(a1)序列表中序列4所示的蛋白质；
(a2)在(a1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(a3)将(a1)-(a2)任一种经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有黄芩β-葡萄糖醛酸苷酶活性的蛋白质；
(a4)与(a1)-(a2)任一种具有98％以上同一性且具有黄芩β-葡萄糖醛酸苷酶活性的蛋白质。
编码上述蛋白质的核酸分子也是本发明保护的范围。
上述核酸分子为如下(b1)-(b3)任一种所示的DNA分子：
(b1)序列表中序列3所示的DNA分子；
(b2)与(b1)限定的核苷酸序列具有95％以上同一性，且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；
(b3)在严格条件下与(b1)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。
含有上述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物也是本发明保护的范围。
上述蛋白质在作为黄芩β-葡萄糖醛酸苷酶中的应用也是本发明保护的范围；
或上述核酸分子，或，上述表达盒、重组载体或重组微生物或所述重组微生物的诱导培养产物，在制备黄芩β-葡萄糖醛酸苷酶中的应用也是本发明保护的范围。
本发明另一个目的是提供一种制备黄芩β-葡萄糖醛酸苷酶的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：诱导培养上述重组微生物，得到黄芩β-葡萄糖醛酸苷酶。
上述蛋白质或上述核酸分子或上述表达盒、重组载体或重组微生物或所述重组微生物的诱导培养产物在制备黄芩素中的应用；
或，上述蛋白质或上述核酸分子或上述表达盒、重组载体或重组微生物所述重组微生物的诱导培养产物在催化黄芩苷合成黄芩素中的应用也是本发明保护的范围。
本发明还有一个目的是提供一种催化黄芩苷合成黄芩素的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：用上述蛋白质或上述重组微生物诱导表达产物催化黄芩苷，得到黄芩素。
上述重组微生物诱导表达产物为将上述重组微生物在IPTG诱导培养后得到的诱导培养产物。
与现有技术比较，本发明的有益效果在于：本发明所提供的黄芩β-葡萄糖醛酸苷酶基因(GUS1)是首次从黄芩植物中克隆制备所得。黄芩β-葡萄糖醛酸苷酶基因(GUS1)是黄芩黄酮合成途径的关键基因，可用于调节黄芩中黄芩素的含量。利用本发明所提供的基因可以通过基因工程技术提高黄芩药效成分黄芩素的含量，可用于其大量生成，为制备黄芩的黄酮类化合物提供了研究方向。
附图说明
图1为黄芩β-葡萄糖醛酸苷酶基因GUS1的琼脂糖凝胶电泳图。
图2为GUS1蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果(原核表达)。
图3为GUS1蛋白催化黄芩苷产物的色谱图(原核表达，峰1黄芩苷，峰2黄芩素)。
图4为GUS1蛋白催化黄芩苷产物的质谱图(原核表达)。
图5为GUS1蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果(真核表达)。
图6为GUS1蛋白催化黄芩苷产物的色谱图(真核表达，峰1黄芩苷，峰2黄芩素)。
图7为GUS1蛋白催化黄芩苷产物的质谱图(真核表达)。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下通过优选实施例并结合附图具体说明本发明的各个方面和特征，本领域的技术人员应该理解，这些实施例只是用于说明，而不是限制本发明的范围。在不背离权利要求书范围的条件下，本领域的技术人员可以对本发明的各个方面进行各种修改和改进，这些修改和改进也属于本发明的保护范围。例如，将实施例中所实用表达载体和宿主菌替换为本领域中常用的其它表达载体和宿主菌，是本领域的普通技术人员所能够理解并实现的。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
克隆试剂盒Zero Cloning Kit、载体试剂盒/>E1Expression Kit、Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell、限制性内切酶、BL21(DE3)Chemically Competent Cell购自北京全式金生物技术有限公司；核酸染料GoledenView购于北京博迈德有限公司；切胶回收试剂盒Gel Extraction Kit购于美国Omega Bio-Tek公司；2×Phanta Flash Master Mix(Dye Plus)购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司；PBS(0.076M,PH＝7.4)购自北京兰博利德生物技术有限公司；其他试剂均为进口或国产分析纯试剂。如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、黄芩β-葡萄糖醛酸苷酶基因GUS1的克隆
根据黄芩转录组数据注释筛选得到基因全长序列片段，以黄芩cDNA为模板，设计特异性引物GUS1-F、GUS1-R，进行PCR扩增。
GUS1F:ATGGGTTTTCTGCTTTGGCAAAAGG(序列1)
GUS1R:TCAGGTTTCTTGACATGCAGGGAAC(序列2)
扩增体系如下：2×Phanta Flash Master Mix(Dye Plus)15μL，引物F和R各1μL，模板1μL，其余用无菌双蒸水补足30μL。反应条件：98℃预变性30s，98℃变性10s，58℃退火5s，72℃延伸9s，35个循环后72℃延伸1min，4℃保存。
将PCR产物连接Zero Cloning vector,得到pEASY-GUS1载体；再将该载体转化trans T1感受态细胞，测序PCR产物的序列。
该PCR产物具有的基因的核苷酸序列为序列表中序列3，该基因命名为GUS1,该基因编码的蛋白命名为GUS1，该蛋白的氨基酸序列为序列表中序列4。
实施例2、黄芩β-葡萄糖醛酸苷酶的功能
一、利用原核表达载体表征黄芩β-葡萄糖醛酸苷酶基因GUS1的功能
1、原核表达载体构建
以实施例1制备的pEASY-GUS1载体为模板，使用GUS1F、GUS1R引物进行PCR扩增。使用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，并对其进行切胶回收。将切胶回收后的目的片段与表达载体E1(北京全式金生物技术股份有限公司，CE111-01)在25℃连接30min，得到重组质粒E1-GUS1。
重组质粒E1-GUS1为将序列3所示的GUS1基因与E1进行平末端连接，得到的载体。
将重组质粒E1-GUS1转化至大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞中，挑取单克隆进行测序，阳性克隆菌液扩大培养提取质粒E1-GUS1。
用重组质粒E1-GUS1转化BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性菌株(GUS1-F、GUS1-R扩增得到1614bp的为阳性)，命名为BL21(DE3)/E1-GUS1。
将空载体E1转化至BL21(DE3)感受态细胞中，得到对照重组菌BL21(DE3)/E1。
提取上述菌株BL21(DE3)/E1-GUS1和BL21(DE3)/E1的质粒，使用通用引物T7、T7T扩增，凝胶电泳结果如图1所示，M：marker；1：BL21(DE3)/E1；2-4：BL21(DE3)/E1-GUS1，可以看出，得到目标载体。
2、GUS1蛋白的诱导表达
取阳性菌株BL21(DE3)/E1-GUS1的种子液按照1:100的比例加到150mL含Amp抗性的LB培养液中，37℃，200rpm振荡培养至A600＝0.6～0.8，加入终浓度为0.2mM IPTG于16℃低温诱导过夜，以同样条件处理对照重组菌BL21(DE3)/E1作为空白对照。
取各个菌液离心去上清以获得菌体，加6mL PBS重悬，于超声破碎仪中超声破碎40min，冰上操作,避免产生气泡。超声破碎裂解液于4℃离心15min后获得上清，分别记作目标蛋白GUS1溶液(阳性菌株BL21(DE3)/E1-GUS1的上清液)和BL21(DE3)/E1上清液，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果如图2所示，M为Protein Ruler Marker l，1为对照重组菌BL21(DE3)/E1上清；2为BL21(DE3)/E1-GUS1上清；可以看出，在分子量约为62kDa处，BL21(DE3)/E1-GUS1出现一条明显的特异蛋白质表达条带，证明得到目标蛋白GUS1，目标蛋白大小与理论值一致。
3、原核表达体外酶功能验证
GUS1组：以黄芩苷(上海源叶生物科技有限公司，B20570)为反应底物进行体外酶功能验证，反应体系为：20μL底物(1mM),10μL上述2得到的目标蛋白GUS1溶液,70μL PBS混匀，水浴35℃，1h。再直接加入1倍体积甲醇终止反应，得到反应产物。
空白对照样品组：以等量PBS溶液替换GUS1组中的底物，得到反应产物。
混合对照品组：使用甲醇配制的1mM黄芩苷对照品溶液与使用甲醇配制的1mM黄芩素对照品溶液等体积混合制成混合对照品溶液。
黄芩β-葡萄糖醛酸苷酶降解黄芩苷得到黄芩素。
高效液相检测反应产物，分析条件为：流动相为乙腈(A)-0.1％甲酸水溶液(B)。采用梯度洗脱，条件如下：0.01～4min，10％～20％A；4～12min，20％～22％A；12～22min，22％～24％A；22～49min，24％～28％A；49～52min，28％～35％A；52～60min，35％～45％A；60～64min，45％～55％A；64～70分钟，55％～10％A；70～85min,10％A.体积流速为0.8mL/min；检测波长为274nm；进样量为10μL；柱温为30℃。黄芩素对照品购自上海源叶生物科技有限公司，产品号：B20571。
黄芩素对照品的保留时间为58.3min。
上述各组的结果如图3所示，目标蛋白GUS1溶液反应后得到的产物中在保留时间为58.3min存在特征峰，而空白对照样品中没有检测到相应的特征峰，表明目标蛋白GUS1为黄芩β-葡萄糖醛酸苷酶，能够催化黄芩苷得到黄芩素。
将GUS1组的反应产物使用UPLC-LTQ/Orbitrap MS进行定性检测。分析条件为：Waters ACQUITY UPLC T3色谱柱(2.1mm×100mm，1.7um，Waters，USA)，流动相0.1％甲酸-水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0min，99％A；2min，99％A；4min，83％A；14min，81％A；15min，5％A；17min，5％A)，流速0.30mL/min，柱温40℃，进样量1uL。
结果如图4所示，上图为一级质谱图；下图为二级质谱图；样品存在黄芩素特征峰(一级离子[m+H]+：m/z 271.06，二级碎片离子:m/z 252.98[M+H-H2O]+，m/z 224.99[M+H-CO-H2O]+，m/z 168.93[M+H-C8H6]+)，经MS分析定性为黄芩素，因此可以进一步认定GUS1具有催化黄芩苷合成黄芩素的活性。
二、真核表达载体表征黄芩β-葡萄糖醛酸苷酶基因GUS1的功能
1、真核表达载体构建
设计特异性引物P-GUS1F(序列5)和P-GUS1R(序列6)，以实施例1制备的pEASY-GUS1载体为模板进行PCR扩增，得到扩增产物用EcoRI、NotI酶切后，与经过同样酶切的载体pPIC9K(优宝生物(VT1344))连接，构建重组酵母表达载体pPIC9K-GUS1。
重组质粒pPIC9K-GUS1为将序列3所示的GUS1基因替换pPIC9K的EcoRI和NotI酶切位点间的片段，得到的载体。
Sal I单酶切线性化重组质粒pPIC9K-GUS1后转入电转化的毕赤酵母GS115感受态细胞中，经过His+转化子、遗传霉素G418和Mut+型重组子筛选含黄芩GUS1的毕赤酵母GS115工程菌后，测序筛选阳性结果，阳性菌命名为GS115/pPIC9K-GUS1。
将空载体pPIC9K转入毕赤酵母GS115中，得到对照菌GS115/pPIC9K。
2、真核表达载体的诱导表达
将阳性菌GS115/pPIC9K-GUS1于30℃，180r/min的摇床中按1:100的比例接种于10mL YPD液体培养基培养24h；然后按1:100的比例接种于150mL BGMY培养基中，于30℃，180r/min的摇床中培养24h；接着按1:100的比例接种于150mLBMMY培养基中，于30℃，180r/min的摇床中培养24h后加入1％(体积百分含量)的甲醇进行诱导，于30℃，180r/min的摇床中诱导培养7天，每24h称重补充甲醇，收集菌液。
取菌液离心去上清以获得菌体，加6mL PBS重悬，于超声破碎仪中超声破碎40min，冰上操作,避免产生气泡。超声破碎裂解液于4℃离心15min后获得GUS1的上清液(记作目标蛋白GUS1溶液)，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。以对照菌GS115/pPIC9K作为对照，得到对照菌GS115/pPIC9K上清液。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果如图5所示，其中M为Protein Ruler Marker l，1为对照菌GS115/pPIC9K上清液；2为阳性菌GS115/pPIC9K-GUS1的GUS1的上清液。在分子量约为62kDa处，出现一条明显的特异蛋白质表达条带，证明得到目标蛋白GUS1，目标蛋白大小与理论值一致。
3、真核表达体外酶功能验证
与上述一的3的方法相同，不同是替换为上述2制备的真核表达的目标蛋白GUS1溶液。
高效液相检测结果如图6所示，黄芩素标准品的保留时间为58.3min，目标蛋白GUS1溶液反应后得到的产物中在保留时间为58.3min存在特征峰，表明目标蛋白GUS1为黄芩β-葡萄糖醛酸苷酶，能够催化黄芩苷得到黄芩素。
UPLC-LTQ/Orbitrap MS检测结果如图7所示，上图为一级质谱图；下图为二级质谱图；样品存在黄芩素特征峰(一级离子[m+H]+：m/z 271.06，二级碎片离子:m/z252.93[M+H-H2O]+，m/z 224.91[M+H-CO-H2O]+，m/z 168.90[M+H-C8H6]+)，而空白对照样品中没有检测到相应的特征峰，经MS分析定性为黄芩素，因此可以进一步认定GUS1具有催化黄芩苷合成黄芩素的活性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，对本发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效，但都将落入本发明的保护范围内。
Claims (8)
1.蛋白质，为如下(a1)-(a4)任一种：
(a1)序列表中序列4所示的蛋白质；
(a2)在(a1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(a3)将(a1)-(a2)任一种经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有黄芩β-葡萄糖醛酸苷酶活性的蛋白质；
(a4)与(a1)-(a2)任一种具有98％以上同一性且具有黄芩β-葡萄糖醛酸苷酶活性的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。
3.如权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下(b1)-(b3)任一种所示的DNA分子：
(b1)序列表中序列3所示的DNA分子；
(b2)与(b1)限定的核苷酸序列具有95％以上同一性，且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；
(b3)在严格条件下与(b1)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。
5.权利要求1所述蛋白质在作为黄芩β-葡萄糖醛酸苷酶中的应用；
或权利要求2或3所述核酸分子，或，权利要求4所述表达盒、重组载体或重组微生物或所述重组微生物的诱导培养产物，在制备黄芩β-葡萄糖醛酸苷酶中的应用。
6.一种制备黄芩β-葡萄糖醛酸苷酶的方法，包括如下步骤：诱导培养权利要求5所述重组微生物，得到黄芩β-葡萄糖醛酸苷酶。
7.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述核酸分子或权利要求4所述表达盒、重组载体或重组微生物或所述重组微生物的诱导培养产物在制备黄芩素中的应用；
或，权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述核酸分子或权利要求4所述表达盒、重组载体或重组微生物或所述重组微生物的诱导培养产物在催化黄芩苷合成黄芩素中的应用。
8.一种催化黄芩苷合成黄芩素的方法，包括如下步骤：用权利要求1所述蛋白质或所述重组微生物的诱导培养产物催化黄芩苷，得到黄芩素。
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