CN117607222A - 隐球菌快速电裂解与高灵敏电化学核酸检测微平台及应用 - Google Patents

隐球菌快速电裂解与高灵敏电化学核酸检测微平台及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于真菌检测技术领域，具体涉及一种隐球菌快速电裂解与高灵敏电化学核酸检测微平台及应用。所述微平台包括一种集成微流控芯片、外接电源、进样系统和/或显像系统；所述集成微流控芯片包括电裂解区、电化学检测区和电极阵列区；所述电裂解区包括多个两两交叉排列竖直设置的对电极，以及多个横向蛇形排列的中空流道，设置在所述电极对的上方与所述电极对键合而成，其中每两个电穿孔流道相互连接处为电穿孔裂解处。所述电化学检测区由工作电极、参比电极和对电极组成，所述工作电极上修饰有rGO/AuNPs纳米材料和分子探针。

Description

隐球菌快速电裂解与高灵敏电化学核酸检测微平台及应用
技术领域
本发明属于真菌检测技术领域，具体涉及一种隐球菌快速电裂解与高灵敏电化学核酸检测微平台及应用。
背景技术
隐球菌是一种特殊的致病真菌，可感染具有免疫活性的个体并引起大规模疫情，其经常进入呼吸道并迅速传播到大脑，导致患者死亡。自1999年在加拿大首次爆发并报告以来，隐球菌迅速蔓延到美国西太平洋地区。目前，六大洲70多个国家报告了这种真菌引起的感染。大约四分之一的患者出现脑播散，如果没有及时的抗真菌治疗，死亡率接近100％，这对隐球菌的全球控制和预防提出了严峻挑战。因此快速准确地检测隐球菌对于控制隐球菌的传播至关重要目前已知隐球菌有两种亚型属于人类病原体：新型隐球菌(NEO)和罕见的格特隐球菌(GAT)，占比近100％。不同的隐球菌亚型表现出不同的致病机制，需要临床医生制定区别化的治疗方案。因此，准确识别隐球菌亚型对于辅助指导精确治疗具有重要意义。
隐球菌核酸检测的成功与否取决于其DNA的提取和扩增。然而，由于真菌具有坚韧的细胞壁和厚的多糖荚膜(占病原体体积的50％以上)，传统方法需要大量时间来裂解隐球菌以富集核酸。这些方法主要包括机械裂解、热裂解和化学裂解。此外，核酸扩增的传统方法主要是基于聚合物链式反应(PCR)，该技术需要依赖于训练有素的技术人员在专业实验室操作昂贵的仪器。因此，这些要求为在经济落后或技术落后的地方检测隐球菌感染带来了极大的障碍。文献资料《基于rGO/AuNPs复合纳米材料构建“三明治”结构电化学DNA传感器用于病毒核酸的检测》公开了一种用rGO/AuNPs纳米材料制备的电极来检测病毒核酸，该文献方法主要是在金电极表面修饰AuNPs和rGO材料，并利用DNA互补杂交反应，实现对病毒核酸的检测。然而，该文献方法没有解决样本DNA快速提取，以及将样本提取和检测同时集成到一个相对低成本装置上实现的问题。申请号为CN202011254571.X，发明名称为“一种准确检测新生隐球菌的方法”的专利，公开了一种利用实时荧光PCR扩增方法来检测DNA，以判断是否有新生隐球菌。该方法需要进行DNA提取，并且制备实时荧光PCR反应体系，操作复杂，检测成本高。
综上所述，有必要提出一种新的针对隐球菌快速准确检测的策略，以补充现有技术的不足。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于隐球菌快速电裂解与高灵敏电化学核酸检测微平台及检测方法，具体技术方案如下。
一种用于隐球菌快速电裂解与高灵敏度电化学检测的微平台，所述微平台包括一种集成微流控芯片、外接电源、进样系统和/或显像系统；所述集成微流控芯片包括电裂解区、电化学检测区和电极阵列区；
所述电裂解区由样本入口、微流道、电极对和电穿孔流道组成，所述电极对设置在所述集成微流控芯片的底部，由多个两两交叉排列的电极竖直设置，所述电穿孔流道为多个横向蛇形排列的中空流道，设置在所述电极对的上方与所述电极对键合而成，其中每两个电穿孔流道相互连接处为电穿孔裂解处，所述电穿孔裂解处与所述电极对两两交叉排列处(中间细窄位置)相对应；
所述电裂解区和所述电化学检测区通过微流道连接；
所述电化学检测区由工作电极、参比电极和对电极组成，所述工作电极上修饰有rGO/AuNPs纳米材料和分子探针，所述分子探针为核酸序列，其一端连接有巯基与所述rGO/AuNPs纳米材料连接，另一端连接有亚甲基蓝(MB)。
所述集成微流控芯片电极均是由磁控溅射的方法溅射的铬和金，只有工作电极上面会再修饰纳米材料和分子探针。
所述微平台还包括外接电源、进样系统和/或显像系统，其中外接电源为直流高压电源；进样系统包括注射泵控制器、注射泵执行单元、注射器、移液器等，用于注入样品和控制注入样品的速度；显像系统可以是一种共聚焦显微镜，用于在电裂解前和/或电裂解后对菌体进行染色观察。所述微平台还可以包括一种检测系统。
进一步，所述电穿孔裂解处的长度为50-500μm，所述电穿孔裂解处的数量为1-36个。
进一步，所述电极对为6组；所述电穿孔裂解处的数量为6-36个。
进一步，所述工作电极上修饰的rGO/AuNPs纳米材料中rGO与AuNPs的体积比为4:1。
进一步，所述电化学检测区的工作电极的数量为1-3个(每一个工作电极上修饰有不同序列的分子探针)。
如权利要求1所述的微平台，其特征在于，所述分子探针包括SEQ ID NO.1～NO.3所示的任一序列。
一种利用电化学检测隐球菌核酸浓度的方法，应用于上述微平台，包括以下步骤：
S01：将样本通过集成微流控芯片的样本入口加入，所述样本通过集成微流控芯片微流道进入电穿孔流道；
S02：通过外接电源对所述微流控芯片施加1-15V电压，使所述样本在电穿孔流道的电穿孔裂解处被电场裂解，释放出胞内DNA；
具体来说，先用外接直流恒压电源连接电极阵列区最上面的两个电极，当样本通过电穿孔裂解区后流到电化学检测区待反应完成(最短用时15min)，接着用电化学工作站分别测试三个工作电极的信号。
S03：被电裂解后的样本通过微流道进入电化学检测区与该区域中工作电极上的分子探针序列发生互补配对，配对成功后的分子探针上连接的亚甲基蓝离开工作电极表面，从而使电流信号降低；
S04：对工作电极进行差示脉冲伏安法(DPV)测试，得到峰电流信号值。
进一步，将已知亚型的不同浓度的隐球菌样本加入到集成微流控芯片中进行检测，根据得到的不同DPV电流与所述隐球菌样本的DNA浓度对数之间的校准曲线，得到电信号与样品浓度之间的拟合方程。
进一步，将未知浓度的待测样本加入到集成微流控芯片中进行检测，根据电流值得到所述待测样本中隐球菌的核酸浓度和亚型。
进一步，所述S03中，根据电流信号降低的程度判断样本中是否含有隐球菌(电流信号降低信噪比S/B>3时判定为样本中含有隐球菌)；以及，所述S04中根据得到的电流信号值判断隐球菌的亚型。
有益技术效果
本发明提供了一种新型基于不可逆电穿孔的集成微流控芯片，可实现快速裂解菌体，提取菌体样本DNA，以及灵敏检测不同细菌/真菌亚型。总体来说，该集成芯片是将样品制备和结果量化集成在一个设备中，实现了高效准确的“样品进，结果出”的目标。
具体来说，本发明的微平台首先利用电穿孔通过模拟高电场的瞬态作用来破坏隐球菌荚膜。利用将电场强度几何放大原理，本发明进一步设计了用于高效裂解的蛇形微流道，显著提高了裂解效率。整个过程在封闭的环境中进行，避免了对周围环境和操作员的污染，减轻了人员、时间和地点的负担。由于该集成芯片提供了高灵敏度快速电化学检测、快速隐球菌裂解和核酸提取相结合的工作平台，其在资源有限的地区对隐球菌病进行快速准确的检测具有广泛的潜力。
进一步，本发明的电化学检测体系中修饰了rGO/AuNPs纳米材料，使得电极表面的比表面积增加，进一步增加了探针固定的数量，进而在与靶标杂交后产生更多的信号变化，检测结果更加灵敏。
最后，本发明提供的微平台检测样本的时间从0分钟到45分钟不等，检测时间短。此外，该微平台检测灵敏度高，可对低目标浓度(60ng/μL)的隐球菌实现定量检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
附图标记标识汇总：
图1为本发明集成微流控芯片用于隐球菌快速裂解与电化学检测的流程示意图；
图2为本发明实施例1中的集成微流控芯片电裂解区和电化学检测区结构示意图；
图3为本发明实施例1中的集成微流控芯片电化学区和电极阵列区结构示意图；
图4为本发明其中一个实施例中电穿孔裂解验证实验图(a为显微镜图像比较裂解前后隐球菌的结构，b为不同浓度隐球菌样品在不同电压条件下通过电穿孔裂解区的qPCR结果，c为不同浓度的样品在注射泵的不同流速下通过电穿孔裂解区的qPCR结果)；
图5为本发明其中一个实施例中电化学检测系统功能验证实验图(a为rGO/AuNPs修饰的电化学平台在靶标添加前后的CV响应，以及裸电极在0.1M PBS溶液(pH＝7.4)中的CV响应，b为rGO/AuNPs修饰的电化学平台在靶标添加前后的DPV响应，以及裸电极在0.1MPBS溶液(pH＝7.4)中的DPV响应)；
图6为电化学检测性能测试实验图(a-c分别为CRY、NEO和GAT在pH 7.4PBS溶液中孵育45分钟后，电化学装置对不同浓度目标检测的DPV性能测试，d-e分别为DPV电流与新生隐球菌和格特隐球菌的DNA浓度对数之间的校准曲线，f-h为计算浓度为10ng/mL的样品在不同孵育时间下的电流变化：0分钟(对照)、15分钟、30分钟和45分钟)；
图7为其他方法与本检测方法对比实验图(a为芯片平台上隐球菌的裂解和检测结果，b为使用传统样品裂解方法的qPCR检测结果)；
图8为rGO/AuNPs/探针修饰工作电极的稳定性测试。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本文中“和/或”包括任何和所有一个或多个列出的相关项的组合。
本文中“多个”意指两个或两个以上，即其包含两个、三个、四个、五个等。
需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括该要素的过程、方法、物品或者装置中还存在另外的相同要素。
如在本说明书中使用的，术语“大约”，典型地表示为所述值的+/-5％，更典型的是所述值的+/-4％，更典型的是所述值的+/-3％，更典型的是所述值的+/-2％，甚至更典型的是所述值的+/-1％，甚至更典型的是所述值的+/-0.5％。
在本说明书中，某些实施方式可能以一种处于某个范围的格式公开。应该理解，这种“处于某个范围”的描述仅仅是为了方便和简洁，且不应该被解释为对所公开范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的独立数字值。例如，范围的描述应该被看作已经具体地公开了子范围如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及此范围内的单独数字，例如1，2，3，4，5和6。无论该范围的广度如何，均适用以上规则。
实施例1
本实例提供一种集成微流控芯片的结构示例，见图2、图3。
集成微流控芯片100包括电裂解区110、电化学检测区120和电极阵列区130。
集成微流控芯片100分为两层，底层是玻璃片，并在玻璃片上磁控溅射铬和金；上层的流道是由PDMS倒模制作；两者通过打氧键合得到完整芯片。
所述电裂解区由样本入口111、微流道112、电极对113和电穿孔流道114组成，所述电极对113设置在所述集成微流控芯片100的底部，由6组两两交叉排列的电极竖直设置而成，所述电穿孔流道114为多个横向蛇形排列的中空流道，设置在所述电极对113的上方与所述电极对键合而成，其中每两个电穿孔流道相互连接处为电穿孔裂解处115，一共设置有36个电穿孔裂解处115，其与所述电极对113两两交叉排列处中间细窄位置相对应。
可以理解的是，可根据芯片的大小和待测样本的数量设置更多组的电极对和相对应的电穿孔裂解处。
可以理解的是，根据实际需要设计样本出口的位置，可以在电化学检测区120的底部，也可以在芯片的背面。
所述电化学检测区120由工作电极121(本实施例中包括第1工作电极、第2工作电极和第3工作电极)、参比电极122和对电极组成123，所述工作电极121上修饰有rGO/AuNPs纳米材料和分子探针。所述分子探针为核酸序列，其一端连接有巯基与所述rGO/AuNPs纳米材料连接，另一端连接有亚甲基蓝。所述分子探针的序列如下表所示。
表1分子探针
其中，CRY代表隐球菌(总体型别)；NEO代表新型隐球菌；GAT代表格特隐球菌。
实施例2
一种用于隐球菌快速电裂解与高灵敏度电化学检测的微平台验证
所述微平台包括：
1)集成微流控芯片(电化学检测分区)
2)外接电源：直流高压电源
3)进样系统：注射泵控制器、注射泵执行单元、注射器、移液器等
4)显像系统：共聚焦显微镜
5)检测系统：电化学工作站
6)样品回收设备：离心管
1.整体方法步骤：
1)用印度墨水染色隐球菌，将肺泡灌洗液漩涡振荡充分混匀,取50μl标本与墨汁按2∶1比例混匀，滴置于离心管。将样品用移液枪加载到集成芯片中，在直流电场中对其进行电裂解。当电场强度足够高时，细胞在狭窄的截面上发生裂解。用共聚焦显微镜观察隐球菌在通道中的表达情况。
2)将10μL隐球菌样品以不同的流速通过入口注入电穿孔裂解区。同时，使用恒压源向样品施加电压以进行电穿孔裂解，并在出口处收集获得的裂解细胞溶液。如图4a所示，在施加电压的作用下，使用共聚焦显微镜观察到隐球菌的荚膜破裂。说明本发那么的集成芯片能够对隐球菌荚膜进行高效裂解。
2.隐球菌微流控芯片裂解最佳条件优化
1)将10μL隐球菌样品以不同的流速(30μL/min、45μL/min、60μL/min、75μL/min和90μL/min)通过样品入口注入集成芯片。同时，使用直流恒压源向样品施加不同的电压(1V-15V)以进行电穿孔裂解，并在出口处收集获得的裂解细胞溶液。每次实验前用洗涤缓冲液洗涤，可去除任何残留污染物。
2)将收集的溶液离心1分钟(10000rpm)。将获得的上清液与10μL TB GreenPremix DimerEraser(2×)、0.6μL PCR正向引物(100μM)、0.6μL PCR反向引物(100μM)和0.4μL ROX参考染料(50×)在6.4μL无菌水中混合。使用实时定量PCR仪器检测溶液中的荧光信号。如图4b、4c所示，核酸的最高释放以及Ct值的变化发生在9V左右。说明在最佳电压下，在约45μL/min的流速下实现了最好的电穿孔裂解效果。
实施例3
1.设计工作电极
1)设计分子探针。所述分子探针的核酸序列如实施例表1所示，其中，在核酸分子的一端连接上巯基(-SH)，在其另一端连接上亚甲基蓝(MB)分子。
2)rGO/AuNPs纳米材料(还原氧化石墨烯/金纳米颗粒)的制作与修饰。首先，将2mgrGO与2mL超纯水混合并超声处理20分钟以获得相对稳定的rGO溶液。然后，将固定比例的AuNPs添加到溶液中，并剧烈搅拌24小时，以制备rGO/AuNPs纳米材料。随后，将10μL的纳米复合材料沉积在电化学装置的工作电极表面上，直到液体完全蒸发。然后，将10μL的三种不同的DNA探针滴到各自的工作电极表面上，并在室温下孵育60分钟。探针通过Au-S键固定在电极上。最后，加入10μL的1mM 6-巯基己醇(6-MCH)溶液以阻断剩余的非特异性结合位点。
3)循环伏安法(CV)和微分脉冲伏安法(DPV)的验证。在CHI 660I电化学工作站上进行电化学表征。使用循环伏安法(CV)和微分脉冲伏安法(DPV)表征电化学检测平台在0.1M PBS溶液(pH7.4)中的电信号变化。CV的扫描速率在-0.5V至0V的范围内为100mV/s。DPV的电压范围为-0.5V到-0.1V，阶跃电位为5mV，调制时间为0.025秒，间隔时间为0.5秒。
图5a、b结果显示，用循环伏安法(CV)和微分脉冲伏安法(DPV)研究了工作电极的改性性能。修改后，CV响应显示出明显的可逆氧化还原波，DPV响应显示出高达21μa的峰值电流。图5中设置有裸露电极，表示未进行修饰的电信号。加入有靶标数据比较，可以看出修饰过纳米材料和探针后的工作电极初始信号升高(裸露电极和探针修饰比较)，也可以看出与靶标结合后信号有所降低，芯片性能得以验证(仅探针修饰和探针修饰后与靶标结合比较)。
图6结果显示，本发明芯片装置能够定量检测液体DNA浓度范围为200pg/mL(10^2CFU/mL)至200ng/mL(10^5CFU/mL)的新生隐球菌和格特隐球菌。通过计算DPV电流与新生隐球菌和格特隐球菌的DNA浓度对数之间的校准曲线，得到了检测信号与样品浓度之间关系的拟合方程：Y＝-4.288*X+13.33和Y＝-4.544*X+14.06。考虑到空白对照的检测限降低了0.97±1.7％，新生隐球菌和格特隐球菌的DNA的LOD分别计算为60pg/mL和100pg/mL，信噪比(S/B)为3。此外，在不同的反应时间进行了测试，每个检测目标的反应时间从0分钟到45分钟不等。当孵育时间超过15分钟时，能够检测到电信号(S/B>3)，45分钟时可以达到最高灵敏度。说明本发明装置的检测时间短。
实施例4
实际样本检测
首先，制备了两组样品，每组由四个样品组成，包括新生隐球菌、格特隐球菌、两种类型均有和两种类型均没有。使用本发明的芯片对一组样品进行了裂解和检测，并获得了相应的电化学检测数据。另一组样品使用传统的实验室方法进行裂解，裂解时间从30分钟到几个小时，然后对裂解物进行qPCR实验，得到△Ct值。
图7结果表明，本发明的检测平台在更短的时间和更简单的过程中产生了与传统方法相同的结果，灵敏度为100％。
本实施例涉及的相关序列如表2所示。
表2
No. 名称 序列(5’到3’)
4 CRY靶标 ACCACCACGCTCAGCTCATCTA
5 NEO靶标 TACTTCTTCCCCATCCAAGGAA
6 GAT靶标 AATGAAATCCCCAACAACACGT
7 CRY-引物-F GTCCTCATCGACCGAATGAAG
8 CRY-引物-R GCAGTCGCCCTGGTGTAG
9 NEO-引物-F GCTTACCTCATCTACTCCATCGG
10 NEO-引物-R TGATCGGTCAAATTCGGCTTG
11 GAT-引物-F CTCCCCTGTTGATGCCAAGT
12 GAT-引物-R CTTTGTTTGACCATGGGGCG
其中，靶标代表样本核酸中能与探针序列碱基互补配对的部分。
CRY代表NEO和GAT的总和。
如图7a所示的电信号变化值，样本1在三种探针均有信号变化，代表检测的是CRY；样本2在NEO和CRY处有信号变化，代表检测的是NEO；样本3在GAT和CRY处有信号变化，代表检测的是GAT；样本4均无信号变化，代表检测的样本不包含隐球菌。图7b是用其他方法裂解后进行PCR实验的Ct变化，用于验证图7a的结果。
本发明提供的微平台系统可在1个小时内实现隐球菌的分型检测，可对低目标浓度(60ng/μL)实现高度灵敏的定量。计算方法为：最高电流值(21μA左右)减去误差的三倍，该数值是能算作检测有效信号的最高电流值，考虑到空白对照的检测限降低了0.97±1.7％(由图8的重复性实验数据得到)，NEO和GAT的DNA的检测限分别计算为60pg/mL和100pg/mL，信噪比(S/B)为3。
实施例5
提供一种集成微流控芯片的制备方法
步骤1：母版制作：将SU-8 2050光致抗蚀剂旋涂到清洁的硅片上。在软烘焙之后，使用光刻机将特定形状的掩模放置在硅片上，并曝光。随后，使用显影剂溶液洗涤未固化的光致抗蚀剂。将所获得的硅片表面的微观结构用作模具。
步骤2：硅烷化处理：将步骤1得到的母版和三氯硅烷一起放置于真空干燥器中进行硅烷化处理，得到疏水表面。
步骤3：电极层制作：将AZ-1500光致抗蚀剂旋涂到玻璃片上。在软烘焙之后，使用光刻机将特定形状的掩模放置在玻璃片上并曝光。随后，使用显影剂溶液洗涤未固化的光致抗蚀剂。然后，将玻璃片置于高真空磁控溅射膜沉积系统中进行真空镀膜。依次溅射铬(50μm)和金(80μm)金属层。最后，在使用脱胶剂溶液去除玻璃片上多余的光致抗蚀剂之后获得电极层。
步骤4：芯片软光刻：PDMS是通过将固化剂和弹性体以1:10的比例混合来制备的，然后在真空中脱气30分钟以去除气泡。将PDMS混合物倒入模具上，并在80℃下固化30分钟。最后，将PDMS层从模具上剥离，打孔以形成入口。
步骤5：芯片键合：聚二甲基硅氧烷芯片结构面朝上，与溅射有铬和金的玻璃片一起平放进等离子清洗机，启动等离子打氧键合。程序结束后，迅速将载玻片朝上等离子处理的一面和聚二甲基硅氧烷芯片朝上的流道结构面压紧粘结，形成封闭流道。芯片放入80度烘箱中加热2小时。
上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (10)

1.一种用于隐球菌快速电裂解与高灵敏度电化学检测的微平台，其特征在于，所述微平台包括一种集成微流控芯片、外接电源、进样系统和/或显像系统；所述集成微流控芯片包括电裂解区、电化学检测区和电极阵列区；
所述电裂解区由样本入口、微流道、电极对和电穿孔流道组成，所述电极对设置在所述集成微流控芯片的底部，由多个两两交叉排列的电极竖直设置，所述电穿孔流道为多个横向蛇形排列的中空流道，设置在所述电极对的上方与所述电极对键合而成，其中每两个电穿孔流道相互连接处为电穿孔裂解处，所述电穿孔裂解处与所述电极对两两交叉排列处相对应；
所述电裂解区和所述电化学检测区通过微流道连接；
所述电化学检测区由工作电极、参比电极和对电极组成，所述工作电极上修饰有rGO/AuNPs纳米材料和分子探针，所述分子探针为核酸序列，其一端连接有巯基与所述rGO/AuNPs纳米材料连接，另一端连接有亚甲基蓝。
2.如权利要求1所述的微平台，其特征在于，所述电穿孔裂解处的长度为50-500μm，所述电穿孔裂解处的数量为1-36个。
3.如权利要求1所述的微平台，其特征在于，所述电极对为6组；所述电穿孔裂解处的数量为6-36个。
4.如权利要求1所述的微平台，其特征在于，所述工作电极上修饰的rGO/AuNPs纳米材料中rGO与AuNPs的体积比为4:1。
5.如权利要求1所述的微平台，其特征在于，所述电化学检测区的工作电极的数量为1-3个。
6.如权利要求1所述的微平台，其特征在于，所述分子探针包括SEQID NO.1～NO.3所示的任一序列。
7.一种利用电化学检测隐球菌核酸浓度的方法，应用于权利要求1-6任一项所述的微平台，其特征在于，包括以下步骤：
S01：将样本通过集成微流控芯片的样本入口加入，所述样本通过集成微流控芯片微流道进入电穿孔流道；
S02：通过外接电源对所述微流控芯片施加1-15V电压，使所述样本在电穿孔流道的电穿孔裂解处被电场裂解，释放出胞内DNA；
S03：被电裂解后的样本通过微流道进入电化学检测区与该区域中工作电极上的分子探针序列发生互补配对，配对成功后的分子探针上连接的亚甲基蓝离开工作电极表面，从而使电流信号降低；
S04：对工作电极进行差示脉冲伏安法测试，得到峰电流信号值。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，将已知亚型的不同浓度的隐球菌样本加入到集成微流控芯片中进行检测，根据得到的不同电流与所述隐球菌样本的DNA浓度对数之间的校准曲线，得到电信号与样品浓度之间的拟合方程。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，进一步将未知浓度的待测样本加入到集成微流控芯片中进行检测，根据电流值得到所述待测样本中隐球菌的核酸浓度和亚型。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述S03中，根据电流信号降低的程度判断样本中是否含有隐球菌；以及，所述S04中根据得到的电流信号值判断隐球菌的亚型。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN120079458A (zh) * 2025-04-28 2025-06-03 北京航空航天大学青岛研究院 一种微流控芯片、制备方法及检测方法

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