CN117599758A - 一种高效吸附羊乳中的黄曲霉毒素m1的吸附剂的制备方法 - Google Patents
一种高效吸附羊乳中的黄曲霉毒素m1的吸附剂的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117599758A CN117599758A CN202311484444.2A CN202311484444A CN117599758A CN 117599758 A CN117599758 A CN 117599758A CN 202311484444 A CN202311484444 A CN 202311484444A CN 117599758 A CN117599758 A CN 117599758A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pcn
- adsorbent
- adsorption
- afm1
- zno
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- MJBWDEQAUQTVKK-IAGOWNOFSA-N aflatoxin M1 Chemical compound C=1([C@]2(O)C=CO[C@@H]2OC=1C=C(C1=2)OC)C=2OC(=O)C2=C1CCC2=O MJBWDEQAUQTVKK-IAGOWNOFSA-N 0.000 title claims abstract description 77
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 title claims abstract description 62
- 235000020251 goat milk Nutrition 0.000 title claims abstract description 28
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 239000002108 aflatoxin M1 Substances 0.000 title claims abstract description 11
- 229930073161 aflatoxin M1 Natural products 0.000 title claims abstract description 11
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 27
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 11
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims abstract description 10
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 claims abstract description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-dimethylformamide Substances CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 11
- SJZOGPUPSBNNTA-UHFFFAOYSA-N 4-[4-amino-3,5-bis(4-carboxyphenyl)phenyl]benzoic acid Chemical compound C1(C(=O)O)=CC=C(C2=CC(C3=CC=C(C(=O)O)C=C3)=C(N)C(C3=CC=C(C(=O)O)C=C3)=C2)C=C1 SJZOGPUPSBNNTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 7
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims description 7
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 7
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 6
- CMOAHYOGLLEOGO-UHFFFAOYSA-N oxozirconium;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.[Zr]=O CMOAHYOGLLEOGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- ONDPHDOFVYQSGI-UHFFFAOYSA-N zinc nitrate Chemical compound [Zn+2].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O ONDPHDOFVYQSGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- SUAKHGWARZSWIH-UHFFFAOYSA-N N,N‐diethylformamide Chemical compound CCN(CC)C=O SUAKHGWARZSWIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 5
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 abstract description 97
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 30
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 14
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 11
- 230000008859 change Effects 0.000 abstract description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 abstract description 4
- 239000003513 alkali Substances 0.000 abstract description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 abstract description 4
- 238000004064 recycling Methods 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 23
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 22
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 12
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 12
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 12
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 231100000678 Mycotoxin Toxicity 0.000 description 7
- 239000002636 mycotoxin Substances 0.000 description 7
- 239000002114 nanocomposite Substances 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 6
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 5
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 5
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 5
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 239000012621 metal-organic framework Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 3
- 229930195730 Aflatoxin Natural products 0.000 description 2
- XWIYFDMXXLINPU-UHFFFAOYSA-N Aflatoxin G Chemical compound O=C1OCCC2=C1C(=O)OC1=C2C(OC)=CC2=C1C1C=COC1O2 XWIYFDMXXLINPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 239000005409 aflatoxin Substances 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000004927 clay Substances 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920000344 molecularly imprinted polymer Polymers 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 description 2
- JDFUJAMTCCQARF-UHFFFAOYSA-N tatb Chemical compound NC1=C([N+]([O-])=O)C(N)=C([N+]([O-])=O)C(N)=C1[N+]([O-])=O JDFUJAMTCCQARF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100434480 Arabidopsis thaliana AFB2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000228197 Aspergillus flavus Species 0.000 description 1
- 241000228230 Aspergillus parasiticus Species 0.000 description 1
- 206010019851 Hepatotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000002115 aflatoxin B1 Substances 0.000 description 1
- OQIQSTLJSLGHID-WNWIJWBNSA-N aflatoxin B1 Chemical compound C=1([C@@H]2C=CO[C@@H]2OC=1C=C(C1=2)OC)C=2OC(=O)C2=C1CCC2=O OQIQSTLJSLGHID-WNWIJWBNSA-N 0.000 description 1
- WWSYXEZEXMQWHT-WNWIJWBNSA-N aflatoxin B2 Chemical compound C=1([C@@H]2CCO[C@@H]2OC=1C=C(C1=2)OC)C=2OC(=O)C2=C1CCC2=O WWSYXEZEXMQWHT-WNWIJWBNSA-N 0.000 description 1
- 229930020125 aflatoxin-B1 Natural products 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 231100000357 carcinogen Toxicity 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- VZJJZMXEQNFTLL-UHFFFAOYSA-N chloro hypochlorite;zirconium;octahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.O.[Zr].ClOCl VZJJZMXEQNFTLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 239000002178 crystalline material Substances 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000007337 electrophilic addition reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007686 hepatotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000304 hepatotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000013178 mathematical model Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 239000002052 molecular layer Substances 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000001151 other effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 230000010399 physical interaction Effects 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 1
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 1
- 229930001119 polyketide Natural products 0.000 description 1
- 150000003881 polyketide derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002336 sorption--desorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 231100000378 teratogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003390 teratogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
- B01J20/223—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material containing metals, e.g. organo-metallic compounds, coordination complexes
- B01J20/226—Coordination polymers, e.g. metal-organic frameworks [MOF], zeolitic imidazolate frameworks [ZIF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
- A23C7/00—Other dairy technology
- A23C7/04—Removing unwanted substances other than lactose or milk proteins from milk
- A23C7/043—Removing unwanted substances other than lactose or milk proteins from milk using chemicals in liquid or solid state, e.g. flocculating, adsorbing or extracting agents
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/02—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material
- B01J20/06—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising oxides or hydroxides of metals not provided for in group B01J20/04
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
- B01J20/28002—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their physical properties
- B01J20/28011—Other properties, e.g. density, crush strength
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Abstract
本发明公开了一种高效吸附羊乳中的黄曲霉毒素M1的吸附剂的制备方法，包括，将PCN‑777分散在超纯水中，超声处理获得PCN‑777悬浮液；向PCN‑777悬浮液中加入ZnO纳米颗粒胶体溶液，在室温下将所得混合物搅拌，将得到的沉淀物用甲醇清洗，真空烘箱干燥，得到所述吸附剂。本发明成功制备了一种经济高效、具有良好吸附性能的吸附剂材料ZnO@PCN‑777，来用于羊乳中AFM1的去除，在真实羊乳应用中，ZnO@PCN‑777对AFM1的去除效率也达到了93％以上，并且吸附过程没有引起羊乳品质的变化，同时它具有较好的稳定性和可重复使用性，耐高温和耐酸碱，将吸附的物质去除后，可以很快恢复颗粒的吸附能力，从而实现循环使用。
Description
技术领域
本发明属于检测技术领域，具体涉及到一种高效吸附羊乳中的黄曲霉毒素M1的吸附剂的制备方法。
背景技术
黄曲霉毒素主要是黄曲霉和寄生曲霉通过聚酮合成转化途径产生,具有肝毒性,被世界卫生组织列为一级致癌物。饲料受到黄曲霉毒素B1污染，被动物食用后，会代谢产生黄曲霉毒素M1(Aflatoxin M1,AFM1)，这些代谢产物会存在于乳、蛋、尿和肉中，最常见的是乳及乳制品中，人体长期摄入被污染乳品可产生中毒、致癌、致突变和致畸等作用。科学家们虽长期致力于乳品中黄曲霉毒素预防及降解技术的研究，但迄今为止仍缺乏经济适用、大规模有效的解决污染的办法。因此，为了确保食品安全，保护人体健康，建立高效的去除乳中AFM1的方法势在必行。
常见乳中的AFM1去除技术主要分为生物降解、物理化学技术和吸附法三种方法。尽管生物降解方法具有节能、环保等诸多优点，但由于代谢物的复杂性和未知性以及操作条件恶劣，生物降解方法很少用于大规模工业生产。物理和化学技术是乳中AFM1解毒较为实用的方法。然而，化学方法很容易导致溶剂残留，影响乳的营养成分。乳中AFM1的物理解毒策略可分为辐照解毒和吸附解毒两大类。紫外线辐射、伽马射线照射和微波处理是减少乳中AFM1的常用方法。虽然辐照方法非常适合大规模使用，但这些方法通常耗时，射线可能会破坏乳中的健康成分。吸附法具有操作简单、效率高、成本低、毒性低等优点，是比较理想的方法。因此，通过各种吸附剂去除毒素的吸附方法操作简单、效率高、成本低、毒性小，是一个很有前途的方向。
目前的AFM1吸附剂主要有粘土、活性炭、有机高分子材料和生物材料等。粘土和活性炭价格低廉，但是这些材料的吸附能力和去除效率并不理想，很少用于复杂基质；且在解毒过程中需要更大量的吸附剂，这可能导致由于吸附剂吸附而导致乳中营养物质的损失。分子印迹聚合物(MIP)被发现对AFM1具有选择性吸附能力。但由于这类有机高分子材料是以AFM1为分子模板，采用聚合方法合成的，在吸附过程中使用MIP吸附剂有可能污染乳类。
因此，开发高效、绿色、安全、实用、经济的新型吸附剂迫在眉睫。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种高效吸附羊乳中的黄曲霉毒素M1的吸附剂的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种高效吸附羊乳中的黄曲霉毒素M1的吸附剂的制备方法，包括，
将2,4,6-三(4-羧基苯基)-苯胺、八水氧氯化锆溶于溶剂中，超声溶解后加入三氟乙酸，加热反应，冷却到室温后，离心、洗涤、干燥，得到PCN-777白色粉末；
将柠檬酸钠缓缓倒入加热的去离子水中，搅拌直到完全溶解，加入硝酸锌，在60～80℃的温度下搅拌20～30min，待其冷却到室温，即可获得ZnO纳米颗粒胶体溶液；
将PCN-777分散在超纯水中，超声处理获得PCN-777悬浮液；
向PCN-777悬浮液中加入ZnO纳米颗粒胶体溶液，在室温下将所得混合物搅拌，将得到的沉淀物用甲醇清洗，真空烘箱干燥，得到所述吸附剂。
作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述将2,4,6-三(4-羧基苯基)-苯胺、八水氧氯化锆溶于溶剂，其中，2,4,6-三(4-羧基苯基)-苯胺与八水氧氯化锆的比例为40～60mg：150～200mg，所述溶剂包括二乙基甲酰胺。
作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述2,4,6-三(4-羧基苯基)-苯胺与溶剂的比例为60mg：8～12mL。
作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述加热反应，其中，反应温度为100～120℃，加热时间为10～12小时。
作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述离心、洗涤、干燥，得到PCN-777白色粉末，其中，所述离心转速为8000rpm，离心时间为6分钟，洗涤包括用DMF洗涤2～3次，干燥温度为60～80℃。
作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述将PCN-777分散在超纯水中，其中，PCN-777与超纯水的比例为100mg：100mL。
作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述向PCN-777悬浮液中加入ZnO纳米颗粒胶体溶液，其中，PCN-777悬浮液与ZnO纳米颗粒胶体溶液的体积比为1:1。
本发明的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种制备方法制得的吸附剂。
本发明的另一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种吸附剂在吸附羊乳中的黄曲霉毒素M1中的应用。
本发明有益效果：
本发明成功制备了一种经济高效、具有良好吸附性能的吸附剂材料ZnO@PCN-777，来用于羊乳中AFM1的去除，在真实羊乳应用中，ZnO@PCN-777对AFM1的去除效率也达到了93％以上，并且吸附过程没有引起羊乳品质的变化，同时它具有较好的稳定性和可重复使用性，耐高温和耐酸碱，将吸附的物质去除后，可以很快恢复颗粒的吸附能力，从而实现循环使用。因此，ZnO@PCN-777作为一种新型吸附剂，具有良好的稳定性和生物相容性，有望应用于乳品行业中去除AFM1的污染。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本发明实施例中吸附剂制造原理图。
图2为本发明实施例中吸附剂用量对吸附效果影响图。
图3为本发明实施例中吸附时间对吸附效果影响图。
图4为本发明实施例中解析溶剂对吸附效果影响图。
图5为本发明实施例中吸附剂重复次数对吸附效果影响图。
图6为本发明实施例中AFM1吸附的伪一级动力学模型图。
图7为本发明实施例中AFM1吸附的伪二级动力学模型图。
图8为本发明实施例中AFM1吸附的Langmuir模型图。
图9为本发明实施例中AFM1吸附的Freundlich模型图。
图10为本发明实施例中3种材料的吸附效果研究对比图。
图11为本发明实施例中不同毒素的吸附性研究对比图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
本发明中实验材料：
所有化学品和试剂均为分析级或以上；八水氧氯化锆(ZrOCl2.8H2O)、2,4,6-三(4-羧基苯基)-苯胺(TATB)、三氯乙酸、二甲基甲酰胺(DMF)、二乙基甲酰胺(DEF)、甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、柠檬酸钠溶液、Zn(NO3)2·6H2O、用甲醇单独配制AFM1标准溶液，4℃保存后使用。
本发明中标准溶液的配置：
使用甲醇稀释10μg/mL的AFM1溶液，制得2、1.5、1.0、0.5、0.3、0.1μg/mL的AFM1标准溶液。
实施例1
MOF材料PCN-777的合成：
(1)首先，将TATB(60mg)和ZrOCl2.8H2O(200mg)溶于DEF(12ml)，超声溶解后加入0.6ml三氟乙酸；
然后将混合物在120℃下加热12小时；
混合液冷却到室温后，在8000rpm下离心6分钟，用DMF洗涤两次；
最后在60℃的烘箱中干燥后，得到PCN-777白色粉末。
(2)ZnO纳米颗粒的合成：
烧杯中加入300mL超纯水,加热至60℃,将0.075g柠檬酸钠缓缓倒入,搅拌直到完全溶解，再将0.05g硝酸锌加入烧杯中，在80℃的温度下搅拌30min，待其冷却到室温，即可获得ZnO纳米颗粒。
(3)吸附剂ZnO@PCN-777的合成：
首先，将100mg的PCN-777分散在100毫升的超纯水中；
将该混合物超声处理5分钟以获得PCN-777悬浮液；
接着，加入100毫升获得的ZnO纳米颗粒胶体溶液，在室温下将所得混合物搅拌2小时；
最后将得到的沉淀物用甲醇清洗并用真空烘箱干燥，吸附剂制造原理图参见图1。
(4)将1.5mg吸附剂加入到2mL不同浓度的AFM1标准液中。然后将混合溶液以110rpm的转速放置在摇床上，以吸附AFM1。
40min后，通过离心分离吸附剂，取上清液进行AFM1浓度的测定。
用1mL乙腈对吸附剂进行解吸1h，最后通过离心取上清液进行测定分析。ZnO@PCN-777对AFM1的吸附量可由下式计算:
其中Qt(mg/g)为ZnO@PCN-777的吸附量，C0(mg/L)和Ct(mg/L)分别为上清液中0min和t时间AFM1的初始和残留量，V(L)为吸附溶液的总体积，m为ZnO@PCN-777的添加量(mg)，W(％)为ZnO@PCN-777对AFM1的去除效率。
(5)条件优化
AFM1去除效率随着吸附剂用量的增加而增加，这是因为吸附位点的数量的增加随着ZnO@PCN-777含量的增加而增加，为了筛选最佳吸附剂剂量，在2mL 0.1mg/L的AFM1溶液中添加了不同剂量的ZnO@PCN-777，并在1h后离心取上清液进行AFM1残余浓度的检测，结果如图2所示。当吸附剂用量为0.075％(w/w)时，AFM1去除率可达94％以上。因此，从经济和现实的角度考虑，选择为0.075％(w/w)最佳吸附剂量。
在去除过程中，优化吸附时间是非常重要的，足够的吸附时间可以更大程度的去除AFM1。将0.075％(w/w)的ZnO@PCN-777添加到2mL 0.1mg/L的AFM1溶液中，通过检测不同时间段上清液中残留的AFM1浓度来确定吸附平衡的时间。结果如图3所示，在前10min中内，AFM1去除率显著增加，在40min后，吸附效果几乎不随时间的延长而变化，因此选择40min作为最佳吸附时间。
合适的解吸溶剂可以在一定时间内有效地将AFM1从吸附剂中洗脱。一方面，有利于评价吸附剂的吸附性能；另一方面，有利于目标分析物AFM1的定性和定量检测。因此选择了不同种类的解析液，来考察其对AFM1的解吸效果。如图4所示，在相同条件下使用乙腈、乙醇、甲醇和乙酸乙酯溶液为解析剂时，乙腈峰面积最大，这表明乙腈的解吸效果最好。因此，在进一步的研究中选择乙腈。
通过重复实验对ZnO@PCN-777的可重用性进行了评价。吸附剂在每个循环前用甲醇和超纯水离心洗涤三次并使用真空烘箱进行干燥。结果表明，经过15次吸附-解吸循环后，AFM1的去除率仍大于85％(图5)。因此，制备的ZnO@PCN-777具有良好的耐久性，是一种强吸附性的材料。
实施例2
(1)吸附动力学：
本研究采用拟一级和拟二级动力学模型来评价AFM1在ZnO@PCN-777纳米复合材料中的吸附机理，拟一阶动力学表示为式(1)，拟二阶动力学模型表示为式(2)，通过吸附量随时间的变化曲线研究吸附动力学。
如图6和图7所示。吸附在前10min内迅速发生，在到达40min后，曲线变化趋势基本一致。因此，40min为平衡吸附时间。
ln(Qe-Qt)＝lnQe-K1t (1)
其中，K1(1/min)和K2(g/mg·min)是伪一阶和伪二阶速率常数。Qe和Qt分别为平衡态和t时刻吸附剂的吸附量(mg/g)，Ce为上清液中AFM1残留量(mg/L)。通过比较俩种模拟决定系数R2的大小，来评判此吸附剂在标准溶液中的吸附结果符合哪种动力学模型。
吸附动力学拟合结果如表1所示。
表1
在本实验中，根据模拟的决定系数R2，伪二级动力学模型在不同浓度标准溶液中的拟合结果优于拟一级动力学模型，且拟合得到的平衡吸附量均比伪一级动力学模型拟合得到的结果要大一些，这说明伪二级动力学模型能更好地描述AFM1在ZnO@PCN-777上的吸附动力学过程。
一般来说，伪一阶模型的吸附过程以物理相互作用为主，而伪二阶模型则认为整个吸附过程主要依赖化学吸附。因此ZnO@PCN-777吸附AFM1的过程以化学吸附为主，吸附剂的亲水位点可以与真菌毒素之间形成吸附力或键合力，通过电子的重新分配或交换，将AFM1从溶液中吸附并固定在吸附剂上，实现毒素的去除和净化。
(2)吸附热力学
吸附等温线提供了水溶液中AFM1浓度与ZnO@PCN-777平衡吸附量关系的重要信息。根据吸附剂的性质和相互作用的类型，吸附等温线遵循不同的数学模型，本文采用Langmuir模型和Freundlich模型来描述吸附等温线。Langmuir模型为式(3)，Freundlich模型为式(4)。
其中Qm为饱和吸附容量(mg/g)，KL为Langmuir常数(L/mg)，KF为Freundlich吸附常数(mg/g)，n为吸附分子与吸附剂表面作用强度有关的参数，其值总是大于1
图8和图9为对ZnO@PCN-777纳米复合材料对AFM1的吸附等温线采用Langmuir和Freundlich模型拟合的曲线，通过对不同温度的比较，发现吸附剂的吸附量均随温度的升高而增加，由此可见温度越高，吸附剂对AFM1的吸附能力就越强。
表2为采用Langmuir和Freundlich这俩种模型拟合得到的参数结果。
由表2可见不同温度下俩种模型拟合的相关系数均达到了0.9以上，Freundlich模型的相关系数均大于Langmuir模型，表明ZnO@PCN-777纳米复合材料对AFM1的吸附等温线使用Freundlich模型的拟合效果优于Langmuir模型，这说明本实验的等温吸附过程更符合Freundlich模型。这表明该吸附过程是在非均匀表面上的非理想吸附，可能存在多分子层吸附，以非专性吸附为主。随着温度的上升，1/n的值逐渐增大，这也表明ZnO@PCN-777与AFM1之间的吸附力会越大，当离心去除吸附剂时，AFM1不易从吸附剂上脱离。
实施例3
ZnO@PCN-777吸附效果比较：
为了评估ZnO@PCN-777纳米复合材料合成前后对AFM1的去除效果，在室温下将0.075％(w/w)的PCN-777、ZnO和ZnO@PCN-777加入到2mL0.1mg/L的AFM1溶液中，在吸附1h后通过检测上清液中残留AFM1的浓度来观测三种材料的吸附效果。
结果如图10所示，PCN-777和ZnO对AFM1的去除效果都在80％以下，均不如结合之后的吸附效果好。这主要是因为俩种材料的结合会使吸附比表面积增大，从而提供了更多的吸附位点，使得更多的AFM1与吸附剂接触，增加了AFM1与吸附剂之间的接触时间和扩散路径，从而增强了吸附效果。
实施例4
广谱性研究：
为了评估ZnO@PCN-777纳米复合材料在不同真菌毒素中的吸附能力，在室温下将0.075％(w/w)吸附剂加入到2mL不同种类毒素(AFM1、AFB1、AFB2和OTA)的溶液中，在吸附2h后通过检测上清液中残留毒素的浓度来观测吸附剂的吸附效果。
结果如图11所示，ZnO@PCN-777纳米复合材料对以上四种毒素均有明显的吸附效果，去除率均在90％以上。这主要是因为真菌毒素中的中的π键或不饱和键可以与吸附剂中的亲电中心发生亲电加成反应，形成共价键，其次PCN-777具有大介孔笼，孔隙率高，介孔分子筛可以产生强大的毛细力，加速吸附过程，且末端含有羟基，可以与真菌毒素中的氢键供体或受体形成氢键。这些化学反应可以导致真菌毒素与吸附剂之间的牢固结合，从而有效地去除或降低真菌毒素的浓度。
实施例5
ZnO@PCN-777对羊奶中AFM1的吸附效果评价：
为了评价ZnO@PCN-777的在实际应用中的效果，向羊奶样品中添加0.05、0.1和0.2μg的AFM1、以及0.025％和0.05％的吸附剂(w/w)来研究ZnO@PCN-777对羊奶中AFM1的吸附作用，吸附在室温下进行，2h后将羊奶样品7000rpm离心10min，此时在离心管中形成三种不同的相。
将上层脂肪层丢弃，取中间水相采用0.45μm聚偏氟乙烯超滤膜过滤，并使用PBS溶液稀释10倍，然后对AFM1的浓度进行检测。检测结果如表3所示，在经过ZnO@PCN-777吸附后，羊奶中残余的AFM1均达到了国标(GB2761-2017)要求，即不超过0.5μg/Kg。
表3ZnO@PCN-777吸附后羊奶中残余的AFM1浓度(n＝3)
同时考虑到ZnO@PCN-777对羊奶品质的影响，在添加吸附剂后测定了羊奶的脂肪含量、蛋白质含量、乳糖含量、pH和酸度等理化性质，结果如表4所示，没有检测到羊奶营养物质的明显减少，这证明ZnO@PCN-777纳米复合材料对蛋白质、乳糖和脂肪等物质无明显吸附倾向。
表4ZnO@PCN-777吸附后羊奶理化性质的变化(n＝3)
金属有机骨架(MOF)是一类由金属离子和金属簇与有机桥接剂和配体结合而成的多孔晶体材料。MOF的优异性能，包括孔径可调、比表面积大、孔隙率和稳定性高，使其成为各种污染物去除应用中最先进形式的吸附剂，可用于去除乳中的真菌毒素。ZnO纳米颗粒拥有较大的比表面积，可以吸附溶解在水或气体中的重金属、有机物、染料等有害物质，从而将其从环境中去除。它具有较好的稳定性和可重复使用性，耐高温和耐酸碱，将吸附的物质去除后，可以很快恢复颗粒的吸附能力，从而实现循环使用。同时黄曲霉毒素结构中的羰基具有孤对电子，容易与带正电的金属中心相互作用，从而促进吸附过程。
本发明成功制备了一种安全、绿色、具有良好吸附性能的吸附剂材料ZnO@PCN-777，来用于羊乳中AFM1的去除，考察了吸附剂用量、吸附时间、解析液种类和可重复使用性等吸附参数对吸附过程的影响，确定了吸附剂使用的最佳条件；吸附动力学和热力学研究表明，AFM1在ZnO@PCN-777的吸附行为可用伪二阶动力学模型和Freundlich模型来描述。此外，在真实羊乳应用中，ZnO@PCN-777对AFM1的去除效率也达到了93％以上，并且吸附过程没有引起羊乳品质的变化。
因此，ZnO@PCN-777作为一种新型吸附剂，具有良好的稳定性和生物相容性，同时它具有较好的稳定性和可重复使用性，耐高温和耐酸碱，将吸附的物质去除后，可以很快恢复颗粒的吸附能力，从而实现循环使用，有望应用于乳品行业中去除AFM1的污染。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的范围当中。
Claims (9)
1.一种高效吸附羊乳中的黄曲霉毒素M1的吸附剂的制备方法，其特征在于：包括，
将2,4,6-三(4-羧基苯基)-苯胺、八水氧氯化锆溶于溶剂中，超声溶解后加入三氟乙酸，加热反应，冷却到室温后，离心、洗涤、干燥，得到PCN-777白色粉末；
将柠檬酸钠缓缓倒入加热的去离子水中，搅拌直到完全溶解，加入硝酸锌，在60～80℃的温度下搅拌20～30min，待其冷却到室温，即可获得ZnO纳米颗粒胶体溶液；
将PCN-777分散在超纯水中，超声处理获得PCN-777悬浮液；
向PCN-777悬浮液中加入ZnO纳米颗粒胶体溶液，在室温下将所得混合物搅拌，将得到的沉淀物用甲醇清洗，真空烘箱干燥，得到所述吸附剂。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述将2,4,6-三(4-羧基苯基)-苯胺、八水氧氯化锆溶于溶剂，其中，2,4,6-三(4-羧基苯基)-苯胺与八水氧氯化锆的比例为40～60mg：150～200mg，所述溶剂包括二乙基甲酰胺。
3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述2,4,6-三(4-羧基苯基)-苯胺与溶剂的比例为60mg：8～12mL。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述加热反应，其中，反应温度为100～120℃，加热时间为10～12小时。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述离心、洗涤、干燥，得到PCN-777白色粉末，其中，所述离心转速为8000rpm，离心时间为6分钟，洗涤包括用DMF洗涤2～3次，干燥温度为60～80℃。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述将PCN-777分散在超纯水中，其中，PCN-777与超纯水的比例为100mg：100mL。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述向PCN-777悬浮液中加入ZnO纳米颗粒胶体溶液，其中，PCN-777悬浮液与ZnO纳米颗粒胶体溶液的体积比为1:1。
8.如权利要求1～7中任一所述的制备方法制得的吸附剂。
9.权利要求1所述的吸附剂在吸附羊乳中的黄曲霉毒素M1中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311484444.2A CN117599758A (zh) | 2023-11-09 | 2023-11-09 | 一种高效吸附羊乳中的黄曲霉毒素m1的吸附剂的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311484444.2A CN117599758A (zh) | 2023-11-09 | 2023-11-09 | 一种高效吸附羊乳中的黄曲霉毒素m1的吸附剂的制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117599758A true CN117599758A (zh) | 2024-02-27 |
Family
ID=89955382
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311484444.2A Pending CN117599758A (zh) | 2023-11-09 | 2023-11-09 | 一种高效吸附羊乳中的黄曲霉毒素m1的吸附剂的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117599758A (zh) |
-
2023
- 2023-11-09 CN CN202311484444.2A patent/CN117599758A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Munjur et al. | Biodegradable natural carbohydrate polymeric sustainable adsorbents for efficient toxic dye removal from wastewater | |
| Yan et al. | Removal of various cationic dyes from aqueous solutions using a kind of fully biodegradable magnetic composite microsphere | |
| Rui et al. | Selective extraction and enrichment of aflatoxins from food samples by mesoporous silica FDU-12 supported aflatoxins imprinted polymers based on surface molecularly imprinting technique | |
| Wang et al. | Equilibrium, kinetics and mechanism of Au3+, Pd2+ and Ag+ ions adsorption from aqueous solutions by graphene oxide functionalized persimmon tannin | |
| Zhang et al. | Preparation of core–shell magnetic ion-imprinted polymer for selective extraction of Pb (II) from environmental samples | |
| Chwastowski et al. | Adsorption of hexavalent chromium from aqueous solutions using Canadian peat and coconut fiber | |
| Staroń et al. | Sorption and desorption studies on silver ions from aqueous solution by coconut fiber | |
| Hande et al. | Highly selective monitoring of metals by using ion-imprinted polymers | |
| Kausar et al. | Equilibrium, kinetic and thermodynamic studies on the removal of U (VI) by low cost agricultural waste | |
| Gatabi et al. | Facile and efficient removal of Pb (II) from aqueous solution by chitosan-lead ion imprinted polymer network | |
| Wang et al. | Preparation of a novel chelating resin containing amidoxime–guanidine group and its recovery properties for silver ions in aqueous solution | |
| Hassanzadeh et al. | An effective approach for fast selective separation of Cr (VI) from water by ion-imprinted polymer grafted on the electro-spun nanofibrous mat of functionalized polyacrylonitrile | |
| Jiang et al. | Equipping an adsorbent with an indicator: a novel composite to simultaneously detect and remove heavy metals from water | |
| Liang et al. | Metal organic framework-molecularly imprinted polymer as adsorbent in matrix solid phase dispersion for pyrethroids residue extraction from wheat | |
| Amin et al. | Biosorption of mercury (II) from aqueous solution by fungal biomass Pleurotus eryngii: isotherm, kinetic, and thermodynamic studies | |
| CN111471147A (zh) | 双模板分子氨基功能化金属有机骨架印迹聚合物及其合成方法和应用 | |
| Bilgic et al. | A novel biosorbent functionalized pillar [5] arene: Synthesis, characterization and effective biosorption of Cr (VI) | |
| Wu et al. | Synthesis of cobalt-based magnetic nanoporous carbon core-shell molecularly imprinted polymers for the solid-phase extraction of phthalate plasticizers in edible oil | |
| Onditi et al. | Removal of Pb2+ and Cd2+ from drinking water using polysaccharide extract isolated from cactus pads (Opuntia ficus indica) | |
| CA2762628A1 (en) | Porous polymeric separation material | |
| CN114100582A (zh) | 水凝胶型复合材料及其制备方法及利用其去除苯系物的方法和应用 | |
| Büyüktiryaki et al. | Mimicking receptor for methylmercury preconcentration based on ion-imprinting | |
| Fat'hi et al. | Synthesis of calcon-imprinted magnetic chitosan nanoparticles as a novel adsorbent and its application in selective removal of calcon dye from aqueous solutions | |
| Niu et al. | Preparation of magnetic carbonized polyaniline nanotube and its adsorption behaviors of xanthene colorants in beverage and fish samples | |
| Öztürk et al. | Development of a novel IMAC sorbent for the identification of melamine in dairy products by HPLC |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |