CN117582539A - 含有l-精氨酸修饰的多金属氧酸盐的双层水凝胶敷料及其制备方法 - Google Patents
含有l-精氨酸修饰的多金属氧酸盐的双层水凝胶敷料及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种含有L‑精氨酸修饰的多金属氧酸盐的双层水凝胶敷料及其制备方法。该敷料由DMSO和水作为二元溶剂且含有聚乙烯醇和羟丙甲基纤维素的外层水凝胶和由壳聚糖季铵盐、亚麻籽胶以及聚乙烯醇构成的内层水凝胶组成，在内层水凝胶中负载了修饰有L‑精氨酸的多金属氧酸盐纳米簇，可以在糖尿病伤口的过氧化微环境刺激下释放NO，NO作为信号分子具有可以促进细胞增殖迁移的作用，此外通过NO和壳聚糖季铵盐的协同作用，水凝胶系统表现出优异的抗菌性能。释放的NO还可以促进内皮细胞增殖迁移，可加快伤口的愈合过程。本发明制备的水凝胶伤口敷料可提供湿润的创面环境，抗菌性能优良，具有良好的生物相容性，可促进糖尿病伤口愈合。
Description
技术领域
本发明涉及水凝胶伤口敷料技术领域，具体涉及一种含有L-精氨酸修饰的多金属氧酸盐的双层水凝胶敷料及其制备方法。
背景技术
糖尿病是一种常见的代谢性疾病。糖尿病患者由于严重的高血糖引起的难以愈合的慢性伤口，导致更容易被细菌感染，血管生成障碍，以及持续性炎症和长期无法愈合的慢性伤口。因此，避免细菌感染和减轻炎症对于糖尿病慢性伤口的管理至关重要。
通过新型敷料处理伤口可以有效的预防上述问题发生，而良好的敷料需要同时具备价格低廉、使用方便、安全无毒、保湿性强等优点，并且需要吸收渗出液，防止二次感染及损伤。
近年来水凝胶作为一种生物材料，具有良好的生物相容性和对渗出物的吸收能力，基本能够满足人们对理想伤口敷料的要求，已成为伤口敷料领域的研究热点。
水凝胶是一种通过高分子聚合物发生交联得到的具有三维网状结构的新型材料。天然和合成的高分子聚合物大多用于制作现代新型水凝胶伤口敷料。天然聚合物具有良好的生物相容性、生物降解性、无毒性和低成本的优势，而成为近年来在伤口敷料应用中的焦点，但此类材料合成的水凝胶普遍存在力学强度较差，稳定性不够好等问题。
合成聚合物通过对其分子结构进行人为设计并合成，赋予其良好的机械性能，但是常常由于其生物相容性和生物降解性较差而限制了在实际情况中的应用。此外，抗生素作为水凝胶中常见的抑菌剂，虽然能起到快速的杀菌效果,但其结构的不稳定性和滥用不仅对人体有很强的毒副作用,还会导致耐药细菌的出现。
综上，目前现有的单一功能的水凝胶敷料，均存在不能为糖尿病伤口愈合提供有利条件的缺点。
发明内容
本发明为了解决现有水凝胶普遍存在的力学强度较差，稳定性不好的问题，提供一种含有L-精氨酸修饰的多金属氧酸盐的双层水凝胶敷料及其制备方法，该方法制备的水凝胶具有良好的抑菌性能以及促进伤口愈合的功能，且具有良好的力学性能，可以为糖尿病伤口愈合提供较为理想的环境。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种含有L-精氨酸修饰的多金属氧酸盐的双层水凝胶敷料的制备方法，
1)制备L-精氨酸修饰的多金属氧酸盐复合纳米颗粒；
2)由二甲基亚砜和水作为二元溶剂与聚乙烯醇和羟丙甲基纤维素反应制备外层水凝胶；
3)将亚麻籽胶、壳聚糖季铵盐和步骤1)所得的复合纳米颗粒加入聚乙烯醇混合前体溶液中搅拌使其完全溶解，浇筑到外层水凝胶表面，反复冻融后获得纳米颗粒双层水凝胶伤口敷料。
进一步，步骤1)所述纳米颗粒的制备方法为：将碳化钼分散为悬浮液，加入20％-30％过氧化氢溶液并搅拌反应12h，通过离心取上清液进行冷冻干燥得多金属氧酸盐，称取冻干后的多金属氧酸盐和L-精氨酸，并用Tris-HCl缓冲液溶解，搅拌过夜，反应完成后，水洗离心并冷冻干燥。
进一步，步骤2)所述外层水凝胶的制备方法为：将二甲基亚砜加入到羟丙基甲基纤维素和水的混合物，搅拌至羟丙基甲基纤维素完全分散并溶解，然后加入聚乙烯醇，并在连续搅拌下加热至完全溶解，进行超声震荡以去除气泡，反复冻融得到外层水凝胶。
进一步，步骤3)聚乙烯醇混合前体溶液的制备方法为将聚乙烯醇加入到去离子水中，搅拌2h以确保聚乙烯醇完全分散，并在连续搅拌下加热至90℃，直到聚乙烯醇完全溶解。
进一步，步骤1)中多金属氧酸盐和L-精氨酸的质量比为1:1-1.5。
进一步，步骤2)中二甲基亚砜和水的体积比为1-2:1。
进一步，步骤2)中羟丙甲基纤维素的质量浓度为3％-5％，聚乙烯醇的质量浓度为8％-12％。
进一步，步骤3)中壳聚糖季铵盐的质量浓度为2％-5％，亚麻籽胶的质量浓度为2％-5％，聚乙烯醇的质量浓度为8％-12％。
进一步，冻融循环次数为3-5次。
上述制备方法制备所得的双层水凝胶敷料。
与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：
1)本发明提出合成具有多重功能的双层水凝胶敷料，双层水凝胶敷料由两层结构和功能不同的水凝胶组成，可以最大限度地减少天然和合成水凝胶各自的缺点，成为了较具吸引力和前景的创面敷料。
2)本发明将聚乙烯醇溶解于由二甲基亚砜(DMSO)和水构成的二元体系中，利用冻融的方法使得聚乙烯醇发生物理交联，同时加入羟丙基甲基纤维素使其在二元溶剂作用下自组装成为纳米纤维以对水凝胶的力学性能进行增强，设计合成了具有良好机械性能和防冻性能且安全无毒的水凝胶，可用于双层水凝胶敷料的外层。
2)本发明制得的多金属氧酸盐是一类阴离子金属氧化物，因其带负电荷的阴离子特性以及氧化还原特性，与炎症过氧化微环境下可产生活性氧，和细菌细胞膜相互作用，从而导致细菌发生破裂和溶解；L-精氨酸是一类带有胍基链的氨基酸，其可以在伤口炎症过氧化微环境下产生的过量的活性氧的作用下转化为NO和鸟氨酸，产生的NO能显著促进创面愈合，抑制炎症，具有抗菌活性，可以刺激血管生成，且长期治疗过程中无不良反应，使得本发明复合水凝胶体系可以抑制细菌，防止伤口发生感染，同时在伤口愈合过程中释放NO，以促进伤口加速愈合。
3)本发明所制得的水凝胶，具有良好的生物相容性，对伤口基本无刺激，保湿性能良好，可以为伤口提供湿润环境，减轻更换敷料时产生的疼痛。
4)本发明方法反应条件温和，制备工艺简单，可利于批量生产。
附图说明
图1为水凝胶样品多功能特性的表征。其中：
(a)不同溶剂的外层水凝胶的拉伸性能和防冻性能。
(b)外层水凝胶的负重情况(质量为50g)。
(c)内层水凝胶与皮肤、塑料、玻璃和木材的粘附性能。
(d)内层水凝胶和外层水凝胶的结合情况(透明部分为外层水凝胶，红色部分为内层水凝胶)。
(e)水凝胶样品溶胀的照片。
(f)水凝胶样品的溶胀率。
(g)水凝胶的FT-IR光谱。
(h)水凝胶的XPS光谱。
图2为水凝胶的力学性能表征。其中：
(a)双层水凝胶的频率扫描流变学分析曲线。
(b)双层水凝胶的时间扫描流变学分析曲线。
(c)双层水凝胶的粘度曲线。
(d)水凝胶样品的应力-应变曲线。
(e)水凝胶在拉伸后的破裂过程。
(f)水凝胶样品的粘附性。
(g)水凝胶样品的水分含量。
(h)水凝胶样品的保水率。
图3为水凝胶样品的抗菌活性表征。其中：
(a)大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌分别与不同水凝胶共培养后的琼脂平板涂布抑菌实验。
(b)大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌在水凝胶上的SEM形态图。
(c)水凝胶对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抑菌圈图片。
(d)大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抑菌区直径量化图。
图4为水凝胶的细胞相容性表征。其中
不同浓度水凝胶浸提液处理NIH/3T3细胞后的荧光显微照片(a)和细胞存活率(b)。
(c)不同时间点NIH/3T3细胞划痕图像。
(d)量化各实验组NIH/3T3细胞的体外划痕闭合结果。
不同浓度水凝胶浸提液处理HUVECs后的荧光显微照片(e)和细胞活力(f)。
(g)不同时间点HUVECs细胞划痕图像。
(h)量化各试验组的HUVECs细胞体外划痕闭合结果。
图5为不同时间慢性糖尿病伤口的代表性图片。
图6为体内糖尿病伤口愈合情况的评估。
(a)各组不同时间点的糖尿病慢性伤口愈合率。
(b)各组不同时间点的剩余伤口面积。
(c)糖尿病慢性伤口的愈合痕迹分析。
具体实施方式
下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细描述：
一种含有L-精氨酸修饰的多金属氧酸盐的双层水凝胶敷料的制备方法步骤为：
1)制备L-精氨酸修饰的多金属氧酸盐复合纳米颗粒；
将碳化钼分散在去离子水中并磁力搅拌，得到浓度为0.1-0.3g/mL的碳化钼悬浮液中加入1-2mL的浓度为20-30％的H2O2溶液并搅拌反应12h，获得深蓝色产物；通过离心(3000rpm)沉淀反应不完全的原料，取上清液进行冷冻干燥，即得到多金属氧酸盐。按质量比为1:11:1.5的比例称取多金属氧酸盐和L-精氨酸置于玻璃闪瓶中，分别用2mL Tris-HCl缓冲液(pH＝8.5)溶解；将L-精氨酸溶液逐滴滴加到多金属氧酸盐溶液中搅拌过夜；反应完成后，3500rpm条件下，用30kDa离心管水洗离心3次，每次1015min；冷冻干燥后得到L-精氨酸修饰的多金属氧酸盐，置于4℃冰箱中备用。
2)外层水凝胶的合成；
将二甲基亚砜(DMSO)加入到3-5％的羟丙基甲基纤维素水悬浮液中(VDMSO：V水＝1：1-2：1)，搅拌2h以确保羟丙基甲基纤维素完全分散并溶解，然后将聚乙烯醇加入悬浮液中，使得聚乙烯醇浓度为8％-12％，并在连续搅拌下加热至90℃，直到聚乙烯醇完全溶解；将聚乙烯醇-羟丙基甲基纤维素混合物进行超声震荡以去除气泡，然后将其转移到模具中，并在-20℃下放置12h以进行凝胶化，再将得到的聚乙烯醇-羟丙基甲基纤维素水凝胶从冰箱中取出，在室温下放置3h。重复上述反复冻融操作共3-5次，得到外层水凝胶，置于4℃冰箱中备用。
3)L-精氨酸修饰的多金属氧酸盐负载的双层水凝胶的合成
将亚麻籽胶、壳聚糖季铵盐和步骤1)所得的复合纳米颗粒加入聚乙烯醇混合前体溶液中搅拌使其完全溶解，浇筑到外层水凝胶表面，反复冻融后获得纳米颗粒双层水凝胶伤口敷料。
步骤3)聚乙烯醇混合前体溶液的制备方法为将聚乙烯醇加入到去离子水中，搅拌2h以确保聚乙烯醇完全分散，并在连续搅拌下加热至90℃，直到聚乙烯醇完全溶解。
所述步骤3)中壳聚糖季铵盐的质量浓度为2％-5％，亚麻籽胶的质量浓度为2％-5％，聚乙烯醇的质量浓度为8％-12％。
所述冻融循环次数为3-5次。
将聚乙烯醇加入到去离子水中，使得聚乙烯醇浓度为8％-12％，搅拌2h以确保聚乙烯醇完全分散，并在连续搅拌下加热至90℃，直到聚乙烯醇完全溶解；称取亚麻籽胶、壳聚糖季铵盐和L-精氨酸修饰的多金属氧酸盐，加入到聚乙烯醇溶液中，使其浓度分别为2％-5％、2％-5％以及0.2％-0.5％，并搅拌使其完全溶解，得到聚乙烯醇、亚麻籽胶、壳聚糖季铵盐以及L-精氨酸修饰的多金属氧酸盐的混合物，进行超声震荡以去除气泡，然后将其转移到底部置有外层聚乙烯醇-羟丙基甲基纤维素水凝胶的模具中，并在-20℃下放置12h以进行凝胶化，再将得到的双层水凝胶从冰箱中取出，在室温下放置3h；重复上述反复冻融操作共3-5次，得到双层水凝胶，置于4℃冰箱中备用。
实施例1
将2g碳化钼分散在20mL去离子水中并磁力搅拌。然后向碳化钼的悬浮液中加入2mL 20％的过氧化氢溶液并搅拌反应12h，获得深蓝色产物。通过离心(3000rpm)沉淀反应不完全的原料，取上清液进行冷冻干燥，即得到多金属氧酸盐。按质量比1:1的比例称取多金属氧酸盐和L-精氨酸各20mg置于玻璃闪瓶中，分别用2mL Tris-HCl缓冲液(pH＝8.5)溶解。将L-精氨酸溶液逐滴滴加到多金属氧酸盐溶液中搅拌过夜。反应完成后，3500rpm条件下，用30kDa离心管水洗离心3次，每次10min。冷冻干燥后得到L-精氨酸修饰的多金属氧酸盐，置于4℃冰箱中备用。
将6mL的二甲基亚砜(DMSO)加入到4mL的4％的羟丙基甲基纤维素水悬浮液中(VDMSO：V水＝3：2)，搅拌2h以确保羟丙基甲基纤维素完全分散并溶解。然后将聚乙烯醇(1.0g)加入悬浮液中，并在连续搅拌下加热至90℃，直到聚乙烯醇完全溶解。将聚乙烯醇-羟丙基甲基纤维素混合物进行超声震荡以去除气泡，然后将其转移到模具中，并在-20℃下放置12h以进行凝胶化，再将得到的聚乙烯醇-羟丙基甲基纤维素水凝胶从冰箱中取出，在室温下放置3h。重复上述反复冻融操作共3次，得到外层水凝胶，置于4℃冰箱中备用。
将聚乙烯醇(1.0g)加入到10mL的去离子水中，搅拌2h以确保聚乙烯醇完全分散，并在连续搅拌下加热至90℃，直到聚乙烯醇完全溶解。称取0.3g的亚麻籽胶、0.3g的壳聚糖季铵盐和0.02g的L-精氨酸修饰的多金属氧酸盐，加入到聚乙烯醇溶液中，并搅拌使其完全溶解，得到聚乙烯醇、亚麻籽胶、壳聚糖季铵盐以及L-精氨酸修饰的多金属氧酸盐的混合物，进行超声震荡以去除气泡，然后将其转移到底部置有外层聚乙烯醇-羟丙基甲基纤维素水凝胶的模具中，并在-20℃下放置12h以进行凝胶化，再将得到的双层水凝胶从冰箱中取出，在室温下放置3h。重复上述反复冻融操作共3次，得到双层水凝胶，置于4℃冰箱中备用。如图1所示，得到的双层水凝胶具有良好的拉伸延展性和粘附性，可以将各种物品粘附在皮肤表面而不脱落。此外，双层水凝胶还具有良好的溶胀性能，说明其在吸收伤口表面渗出液之后体积膨胀程度较小，可以避免对伤口的压迫。
实施例2
将3g碳化钼分散在30mL去离子水中并磁力搅拌。然后向碳化钼的悬浮液中加入1mL 30％的过氧化氢溶液并搅拌反应12h，获得深蓝色产物。通过离心(3000rpm)沉淀反应不完全的原料，取上清液进行冷冻干燥，即得到多金属氧酸盐。按质量比1:1.5的比例称取多金属氧酸盐和L-精氨酸各30mg置于玻璃闪瓶中，分别用2mL Tris-HCl缓冲液(pH＝8.5)溶解。将L-精氨酸溶液逐滴滴加到多金属氧酸盐溶液中搅拌过夜。反应完成后，3500rpm条件下，用30kDa离心管水洗离心3次，每次15min。冷冻干燥后得到L-精氨酸修饰的多金属氧酸盐，置于4℃冰箱中备用。
将5mL的二甲基亚砜(DMSO)加入到5mL的5％的羟丙基甲基纤维素水悬浮液中(VDMSO：V水＝3：2)，搅拌2h以确保羟丙基甲基纤维素完全分散并溶解。然后将聚乙烯醇(1.0g)加入悬浮液中，并在连续搅拌下加热至90℃，直到聚乙烯醇完全溶解。将聚乙烯醇-羟丙基甲基纤维素混合物进行超声震荡以去除气泡，然后将其转移到模具中，并在-20℃下放置12h以进行凝胶化，再将得到的聚乙烯醇-羟丙基甲基纤维素水凝胶从冰箱中取出，在室温下放置3h。重复上述反复冻融操作共5次，得到外层水凝胶，置于4℃冰箱中备用。
将聚乙烯醇(1.0g)加入到10mL的去离子水中，搅拌2h以确保聚乙烯醇完全分散，并在连续搅拌下加热至90℃，直到聚乙烯醇完全溶解。称取0.4g的亚麻籽胶、0.4g的壳聚糖季铵盐和0.03g的L-精氨酸修饰的多金属氧酸盐，加入到聚乙烯醇溶液中，并搅拌使其完全溶解，得到聚乙烯醇、亚麻籽胶、壳聚糖季铵盐以及L-精氨酸修饰的多金属氧酸盐的混合物，进行超声震荡以去除气泡，然后将其转移到底部置有外层聚乙烯醇-羟丙基甲基纤维素水凝胶的模具中，并在-20℃下放置12h以进行凝胶化，再将得到的双层水凝胶从冰箱中取出，在室温下放置3h。重复上述反复冻融操作共5次，得到双层水凝胶，置于4℃冰箱中备用。
实施例3
将5g碳化钼分散在20mL去离子水中并磁力搅拌。然后向碳化钼的悬浮液中加入2mL 25％的过氧化氢溶液并搅拌反应12h，获得深蓝色产物。通过离心(3000rpm)沉淀反应不完全的原料，取上清液进行冷冻干燥，即得到多金属氧酸盐。按质量比1:1.2的比例称取多金属氧酸盐和L-精氨酸各20mg置于玻璃闪瓶中，分别用2mL Tris-HCl缓冲液(pH＝8.5)溶解。将L-精氨酸溶液逐滴滴加到多金属氧酸盐溶液中搅拌过夜。反应完成后，3500rpm条件下，用30kDa离心管水洗离心3次，每次13min。冷冻干燥后得到L-精氨酸修饰的多金属氧酸盐，置于4℃冰箱中备用。
将5mL的二甲基亚砜(DMSO)加入到4mL的4％的羟丙基甲基纤维素水悬浮液中(VDMSO：V水＝3：2)，搅拌2h以确保羟丙基甲基纤维素完全分散并溶解。然后将聚乙烯醇(1.0g)加入悬浮液中，并在连续搅拌下加热至90℃，直到聚乙烯醇完全溶解。将聚乙烯醇-羟丙基甲基纤维素混合物进行超声震荡以去除气泡，然后将其转移到模具中，并在-20℃下放置12h以进行凝胶化，再将得到的聚乙烯醇-羟丙基甲基纤维素水凝胶从冰箱中取出，在室温下放置3h。重复上述反复冻融操作共4次，得到外层水凝胶，置于4℃冰箱中备用。
将聚乙烯醇(1.0g)加入到10mL的去离子水中，搅拌2h以确保聚乙烯醇完全分散，并在连续搅拌下加热至90℃，直到聚乙烯醇完全溶解。称取0.5g的亚麻籽胶、0.5g的壳聚糖季铵盐和0.05g的L-精氨酸修饰的多金属氧酸盐，加入到聚乙烯醇溶液中，并搅拌使其完全溶解，得到聚乙烯醇、亚麻籽胶、壳聚糖季铵盐以及L-精氨酸修饰的多金属氧酸盐的混合物，进行超声震荡以去除气泡，然后将其转移到底部置有外层聚乙烯醇-羟丙基甲基纤维素水凝胶的模具中，并在-20℃下放置12h以进行凝胶化，再将得到的双层水凝胶从冰箱中取出，在室温下放置3h。重复上述反复冻融操作共4次，得到双层水凝胶，置于4℃冰箱中备用。如图2所示，得到的双层水凝胶具有良好的流变性能和拉伸性能，可以减轻外界剪切应力对伤口的机械损伤。此外，水凝胶具有良好的保湿性能，可以为伤口提供利于其愈合的湿润环境。
采用实施例1制备的双层水凝胶进行测试，本测试用于说明本发明中制备的水凝胶的抑菌性能。
菌种选择：选择大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)这四种常见的致病细菌作为模型菌种进行测试。
测试方法：采用琼脂平板涂布法以及抑菌圈实验来表征水凝胶敷料的抗菌性能。
(1)琼脂平板涂布法：将各组水凝胶样品(质量为1g)分别置于5mL离心管中，并相应加入2mL的1×106CFU/mL的大肠杆菌悬液，使其与水凝胶样品充分接触。实验分为5组，即外层水凝胶组(Outer hydrogel)、内层水凝胶组(Inner hydrogel)、双层水凝胶组(Bilayer hydrogel)、负载多金属氧酸盐的双层水凝胶组(BH+POM)和本发明负载L-精氨酸修饰的多金属氧酸盐双层水凝胶组(BH+POM@L-Arg)。另设空白对照组，不作任何处理。
金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌实验组操作步骤同上。在37℃的培养箱中培养4h后，取50μL菌液稀释到1mL，并取100μL涂在固体营养琼脂表面，在37℃培养箱中培养24h，记录菌落生长图片。
(2)抑菌圈法：将100μL细菌悬浮液(106CFU/mL)均匀地涂抹在琼脂培养基上，然后将直径约为10mm的水凝胶样品放在培养基中间。在37℃培养箱中培养24h，记录菌落生长图片。用图像分析程序(Image J)量化抑菌圈的直径，评价水凝胶样品的抗菌性能。
将与细菌共培养完成后的水凝胶收集起来并用福尔马林溶液进行固定，用乙醇梯度脱水后自然风干，利用扫描电子显微镜观察其表面细菌形态。
测试结果：如图3a所示，BH+POM@L-Arg水凝胶组的琼脂平板上菌落数量明显少于空白对照组，而且BH+POM@L-Arg水凝胶表面的细菌形态收缩甚至断裂(图3b)，说明细菌形态被破坏。BH+POM@L-Arg水凝胶组的抑菌区直径最大(图3c，d)，说明其抑菌能力更好。
采用实施例1制备的双层水凝胶进行测试，本测试用于说明本发明中制备的水凝胶的细胞相容性。
细胞选择：本实验利用NIH/3T3细胞和HUVEC细胞对水凝胶的细胞相容性进行评估。
测试方法：本实验通过MTT法和FDA染色发对水凝胶的细胞相容性进行评价。首先水凝胶在紫外光下照射24h进行灭菌，然后浸入DMEM培养基中，在37℃下浸泡24h，得到浓度为0、25、50mg/mL的浸出液。使用96孔板进行培养，每孔接种3×104个NIH/3T3细胞，贴壁12小时后分别依次加入不同浓度梯度的各组水凝胶浸出液100μL，并设置不添加浸出液的细胞作为对照组，放置在CO2浓度为5％，温度为37℃的恒温培养箱中继续孵育24h。孵育完成后，向各孔中加入20μL的MTT(5mg/mL)，避光反应4h后吸去各孔中的培养液，再向每孔中加入150μL的DMSO，处理完毕后将其置于摇床中震荡15min。最后用酶标仪在570nm波长处测定各孔吸光度值(ODs)，空白组吸光度值(ODb)用培养基、MTT和DMSO来代替以进行测定，对照组的吸光度值则记作ODc。每个样品设置3个平行实验。计算各组的相对细胞存活率。
使用含10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的DMEM培养基，将细胞在24孔板中于37℃条件下贴壁培养12h后，每孔更换为1mL水凝胶浸提液培养基(0、25、50mg/mL)。继续孵育24h后，弃掉孔中的水凝胶培养基，每孔细胞用100μL的0.01％ FDA染色5min，用PBS洗掉后，利用荧光显微镜拍照记录细胞形态图像，采用Image J软件根据细胞形态图像计算细胞存活率。
为了进一步评估水凝胶对细胞迁移的影响，进行了细胞划痕试验。将状态良好的细胞接种于6孔板中，使细胞刚好形成贴壁单层。随后弃去培养基，用无菌20μL移液器吸头在孔板上垂直刮擦单层细胞以形成规则划痕，再用PBS缓冲液洗去细胞碎片，并加入新培养基，接下来向每个孔中加入2mL水凝胶浸提液，空白对照为PBS缓冲液。在37℃条件下培养24h后，用倒置显微镜观察每个孔中细胞的划痕状态以评估水凝胶对细胞迁移的影响。用Image J软件测量划痕面积，并计算细胞迁移率。
测试结果：如图4a，b，e，f所示，经过24h的孵育后，细胞存活率均在90％以上，说明水凝胶具有良好的生物相容性，对正常细胞无毒副作用。此外，BH+POM@L-Arg水凝胶组的细胞划痕面积显著减少(图4c，d，g，h)，证明BH+POM@L-Arg水凝胶能显著促进细胞迁移。
采用实施例1制备的双层水凝胶进行测试，本测试用于说明本发明中制备的双层水凝胶的促进糖尿病伤口愈合的能力。
测试对象选择：采用8周龄雄性KM小鼠，初始体重25-30g。
测试方法：采用8周龄雄性KM小鼠，适应性喂养1周，禁食12h后，根据体重空腹注射链脲佐菌素STZ(柠檬酸钠缓冲液配置，浓度为1％)，给药剂量为180mg/kg一次性给药，注射2h后再添加饲料。注射4天后，测量小鼠空腹血糖，采用上午9点禁食下午3点测血糖的方式。在尾尖静脉取血，利用血糖试纸和血糖仪，测得血糖值高于16.7mmol/L即视为造模成功，成模后的小鼠有多饮，多尿，多食等症状。
将造模成功的糖尿病KM小鼠(平均体重40g)饲养在受控环境中(12:12小时昼夜节律，恒温23±2℃、湿度50％-60％)，可自由饮水和进食。对小鼠进行腹腔注射麻醉，用电动剃毛刀剃净背部毛发。然后，在每只小鼠背部建立直径约10mm的圆形伤口。实验组分别用外层水凝胶、内层水凝胶、双层水凝胶、负载多金属氧酸盐的双层水凝胶和负载L-精氨酸修饰的多金属氧酸盐的双层水凝胶处理。对照组除用PBS冲洗外，不做任何处理。分别于术后0d、3d、6d、9d、12d、15d用相机对不同组的伤口进行拍照记录，并通过Image J软件量化伤口面积以进行比较。
测试结果：如图5和图6所示，在整个愈合过程中，BH+POM@L-Arg组伤口愈合率最高(92.5％±0.83％)，剩余创面面积最小(0.061±0.017cm2)，该过程中的实验组伤口愈合率始终小于空白对照组。说明BH+POM@L-Arg水凝胶具有促进糖尿病伤口愈合的作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种含有L-精氨酸修饰的多金属氧酸盐的双层水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，步骤为：
1）制备L-精氨酸修饰的多金属氧酸盐复合纳米颗粒；
2）由二甲基亚砜和水作为二元溶剂与聚乙烯醇和羟丙甲基纤维素反应制备外层水凝胶；
3）将亚麻籽胶、壳聚糖季铵盐和步骤1）所得的复合纳米颗粒加入聚乙烯醇混合前体溶液中搅拌使其完全溶解，浇筑到外层水凝胶表面，反复冻融后获得纳米颗粒双层水凝胶伤口敷料。
2.根据权利要求1所述的一种含有L-精氨酸修饰的多金属氧酸盐的双层水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，步骤1）所述纳米颗粒的制备方法为：将碳化钼分散为悬浮液，加入20%-30%过氧化氢溶液并搅拌反应12h，通过离心取上清液进行冷冻干燥得多金属氧酸盐，称取冻干后的多金属氧酸盐和L-精氨酸，并用Tris-HCl缓冲液溶解，搅拌过夜，反应完成后，水洗离心并冷冻干燥。
3.根据权利要求1所述的一种含有L-精氨酸修饰的多金属氧酸盐的双层水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，步骤2）所述外层水凝胶的制备方法为：将二甲基亚砜加入到羟丙基甲基纤维素和水的混合物，搅拌至羟丙基甲基纤维素完全分散并溶解，然后加入聚乙烯醇，并在连续搅拌下加热至完全溶解，进行超声震荡以去除气泡，反复冻融得到外层水凝胶。
4.根据权利要求1所述的一种含有L-精氨酸修饰的多金属氧酸盐的双层水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，步骤3）聚乙烯醇混合前体溶液的制备方法为将聚乙烯醇加入到去离子水中，搅拌2 h以确保聚乙烯醇完全分散，并在连续搅拌下加热至90 ℃，直到聚乙烯醇完全溶解。
5.根据权利要求2所述的含有L-精氨酸修饰的多金属氧酸盐的双层水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，所述的步骤1）中多金属氧酸盐和L-精氨酸的质量比为1:1-1.5。
6.根据权利要求3所述的含有L-精氨酸修饰的多金属氧酸盐的双层水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，所述的步骤2）中二甲基亚砜和水的体积比为1-2:1。
7.根据权利要求3所述的含有L-精氨酸修饰的多金属氧酸盐的双层水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，所述的步骤2）中羟丙甲基纤维素的质量浓度为3%-5%，聚乙烯醇的质量浓度为8%-12%。
8.根据权利要求3所述的含有L-精氨酸修饰的多金属氧酸盐的双层水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，所述步骤3）中壳聚糖季铵盐的质量浓度为2%-5%，亚麻籽胶的质量浓度为2%-5%，聚乙烯醇的质量浓度为8%-12%。
9.根据权利要求3所述的含有L-精氨酸修饰的多金属氧酸盐的双层水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，所述冻融循环次数为3-5次。
10.如权利要求1所述制备方法制备所得的双层水凝胶敷料。
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