CN117576085B - 一种基于全局莫兰指数的结肠癌预后预测方法及系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种基于全局莫兰指数的结肠癌预后预测方法及系统，获取结肠癌组织样品切片的全切片数字图像，所述结肠癌组织样品切片经染色及荧光免疫标记处理；提取数字图像中核心肿瘤区域中所有细胞的坐标，以及每个细胞的荧光强度值，并预设阳性阈值，筛选出超过阳性阈值的荧光强度值；基于筛选出的荧光强度值及对应的坐标值计算核心肿瘤区域的莫兰指数；获取莫兰指数的最佳截断值，基于最佳截断值将样品划分至不同风险组。本发明的量化指标考虑了整个肿瘤区域内的T细胞分布情况，同时顾及T细胞表达量的影响，指标覆盖的信息更全面，为评估结肠癌患者的预后提供新的指标和方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种基于全局莫兰指数的结肠癌预后预测方法及系统。
背景技术
全球范围内，结直肠癌发病率在常见的恶性肿瘤中位于第三位，是恶性肿瘤患者死亡第二最常见原因，结直肠癌给社会带来了巨大的负担，已成为全球重大公共卫生问题。
目前临床医生主要依靠TNM分期对结肠癌患者进行预后情况的判断，TNM分期主要根据肿瘤浸润情况、淋巴结转移数量和是否转移到其他部位等情况来确定肿瘤患者的临床病理分期，通常TNM分期越高意味着肿瘤进展程度越高，预后越差。然而在临床实践工作中经常会遇到处于相同TNM分期的结肠癌患者预后存在显著差别的情况，由此可见，TNM分期不是决定肿瘤患者预后的唯一因素。
有研究人员研究分析了不同中性粒细胞与淋巴细胞的比值、CD3和CD8阳性的T细胞在结直肠癌患者预后中的作用，但现有研究考虑的主要是CD3+T细胞的平均密度对预后的影响。也有研究人员研究CD3+T细胞的空间分布对预后的影响，但大多局限于肿瘤的局部分析，信息包含不够全面。
因此，探寻和建立一种更精准的结肠癌患者预后预测方法是本领域亟需解决的问题。
发明内容
本发明的第一目的在于针对现有技术和指标对结肠癌预后指导不足的问题，提供一种基于全局莫兰指数的结肠癌预后预测方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于全局莫兰指数的结肠癌预后预测方法，包括：
S1获取结肠癌组织样品切片的全切片数字图像，所述结肠癌组织样品切片经染色及荧光免疫标记处理；
S2提取数字图像中核心肿瘤区域中所有细胞的坐标，以及每个细胞的荧光强度值，并预设阳性阈值，筛选出超过阳性阈值的荧光强度值；
S3基于筛选出的荧光强度值及对应的坐标值计算核心肿瘤区域的莫兰指数；
S4获取莫兰指数的最佳截断值，基于最佳截断值将样品划分至不同风险组。
作为一种优选的实施方式，所述S1中，结肠癌组织样品切片利用HE染色及CD3荧光免疫标记处理。
作为一种优选的实施方式，所述S2中，筛选出超过阳性阈值的荧光强度值后，计算筛选出的荧光强度值与阳性阈值的比值，作为荧光强度值的校准值，利用校准值进行后续计算。强度校准可将不同阈值的荧光强度均一化，便于后续处理。
作为一种优选的实施方式，所述S3中，将所述数字图像划分为若干网格单元，利用每个网格单元中包含的细胞的平均荧光强度值表征网格的荧光强度，以网格为计算单元计算核心肿瘤区域的莫兰指数。肿瘤组织主体很大，细胞数目量级很大，将数字图像划分为网格后再计算莫兰指数，可降低计算量。
进一步的，取每个网格内的中心点坐标记为合并后网格（表征CD3+T淋巴细胞群）的坐标。
进一步的，还包括，根据划分后的网格数量对网格进行空间合并：
预设划分的最小网格单元是边长为a的正方形，如果划分后的网格数量超过预设的网格数量阈值，则对网格单元进行合并，直至网格数量低于预设的网格数量阈值；合并后的网格边长为n×a，n为自然数。优选的，最小网格单元边长为50~150μm。
作为一种优选的实施方式，所述S3中，基于下式计算核心肿瘤区域的莫兰指数I：
式中，i、j表示细胞/网格序号，w ij 为细胞/网格i到细胞/网格j的距离，W为所有w ij 的总和，m i 、m j 分别为细胞/网格i、j的荧光强度，为N个细胞/网格的平均荧光强度，N为细胞/网格数量。
作为一种优选的实施方式，所述S4中，基于最大选择秩统计获取莫兰指数的最佳截断值。
作为一种优选的实施方式，所述S4还包括，将莫兰指数与TNM分期结合进行结肠癌预后预测。具体的，利用TNM分期进行结肠癌预后预测后，利用莫兰指数对每个分期进一步分组。
本发明的另一目的在于提供一种基于全局莫兰指数的结肠癌预后预测系统，包括：
图像采集模块，获取结肠癌组织样品切片的全切片数字图像，所述结肠癌组织样品切片经染色及荧光免疫标记处理；
细胞识别模块，提取数字图像中核心肿瘤区域中所有细胞的坐标，以及每个细胞的荧光强度值，并预设阳性阈值，筛选出超过阳性阈值的荧光强度值；
莫兰指数计算模块，基于筛选出的荧光强度值及对应的坐标值计算核心肿瘤区域的莫兰指数；
结肠癌预后预测模型建立模块，获取莫兰指数的最佳截断值，基于最佳截断值将样品划分至不同风险组。
作为一种优选的实施方式，所述莫兰指数计算模块还包括网格划分单元：将所述数字图像划分为若干网格单元，利用每个网格单元中包含的细胞的平均荧光强度值表征网格的荧光强度，以网格为计算单元计算核心肿瘤区域的莫兰指数。
优选的，网格划分单元根据划分后的网格数量对网格进行空间合并：
预设划分的最小网格单元是边长为a的正方形，如果划分后的网格数量超过预设的网格数量阈值，则对网格单元进行合并，直至网格数量低于预设的网格数量阈值；合并后的网格边长为n×a，n为自然数。
肠道作为全身免疫细胞富集的重要器官，免疫微环境改变在结直肠癌的发生发展中发挥重要作用，而免疫微环境中免疫细胞成分多样、功能各异，且具有不同的空间分布特点。全局莫兰指数（Global Moran's I）是一种空间自相关的度量指标，Moran's I>0表示空间正相关性，其值越大，空间相关性越明显。Moran's I<0表示空间负相关性，其值越小，空间差异越大，否则，Moran's I = 0，空间呈随机性。本申请通过莫兰指数来指征各类免疫细胞空间分布的相关性，进一步找到影响患者生存和预后的免疫细胞种类及其空间分布特征，建立了一种新型的结肠癌患者预后预测方法。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
1、本发明提供了能够用于结肠癌患者预后预测的免疫细胞空间分布相关量化指标，与检测结肠癌预后相关的基因、蛋白及单个类型淋巴细胞的数量或者密度相比，以本发明提供的量化指标作为标志物进行结肠癌的预后预测，能够更精准客观地反映患者的免疫状态，具有更高的预后预测准确性，为评估结肠癌患者的预后提供新的指标和方法。
2、本发明的量化指标考虑了整个肿瘤区域内的T细胞分布情况，同时顾及T细胞表达量（荧光强度）的影响，指标覆盖的信息更全面。
3、本发明提供的结肠癌预后风险模型能与TNM分期结合更好地对结肠癌患者进行预后风险分层，指导临床对不同预后的患者分别制定更有针对性的治疗方案，有利于实现精准医疗。
附图说明
图1为切片WSI图像中网格合并后的CD3+淋巴细胞表达及荧光强度。
图2是基于CD3 Moran I的生存分析结果。
图3是CD3 Moran I与TNM分期结合区分结肠癌患者预后的示意图。
图4是II期患者中CD3 Moran I区分的不同分组复发风险示意图。
图5是多因素分析结果。
图6是多因素分析中不同因素所占权重。
前述图示1-6中，作为英文形式表达的各坐标、标识或其他表示，均为本领域所公知的，并不在本例中再做赘述。
实施方式
下面结合附图说明和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步阐述。
实施例中使用的主要试剂和仪器如表1所示。
表1 主要试剂及设备
实施例1
1、病例选择
本实施例共纳入141例结肠癌患者手术切除的病理组织样本，收集这些患者详细的临床病理信息，如：TNM分期、术前CEA和CA19.9水平、肿瘤位置、临床风险因素（根据神经浸润、淋巴血管浸润定义）及肿瘤复发或转移等预后情况，本实施例中收集的临床病理信息具体见表2。
表2 141例结肠癌患者临床病理信息
2、对上述141例结肠癌患者手术切除的病理组织样本制备组织切片
（1）取新鲜结肠癌组织标本，包含肿瘤主体部分，于10%中性缓冲福尔马林中浸泡24~48小时使之固定，将其沿纵向切面平放于包埋盒内。
（2）将包埋盒置于脱水机中用不同浓度乙醇和二甲苯脱水，并浸蜡。
（3）将组织置于包埋机中，加入融化的蜡包埋并标记，-20℃中冷却凝固，完全凝固后将蜡块取出并进行修整、切片。
（4）将修剪后的蜡块置于切片机，设置切片厚度为4微米，将切好的组织移至摊片机，用正电荷防脱载玻片轻轻捞起摊平的组织切片，用烤片机适度烤片，标记后存于切片盒内。
（5）对组织切片进行HE染色，通过显微镜观察明确组织病理改变，选定WSI扫描图像中圈选核心肿瘤区域，即感兴趣区域ROI（region of interest），排除坏死、出血等不良区域，保留结构完整的肿瘤主体区域。
3、免疫组织化学染色
将上述（4）中备好的4微米石蜡切片进行CD3荧光免疫组织化学染色。切片经过脱蜡、水化、抗原修复、封闭、抗CD3抗体孵育、二抗孵育及TSA荧光显色、DAPI复染细胞核，防荧光淬灭剂封片等系列操做后完成染色。
4、全片扫描组织图像
将染色完毕的切片装入TissueFAXS SL自动数字扫描仪，2.5倍镜头下预览待扫描切片的组织区域，并设置DAPI标记细胞核及opal620标记CD3荧光信号的最佳曝光时间及荧光阈值等参数，保持扫描参数，20倍镜头下扫描仪对组织切片进行全片扫描，最后获得完整的WSI。
5、CD3+T淋巴细胞在肿瘤组织中的空间位置提取
病理医生使用数字病理分析软件StrataQuest7.0在荧光WSI中圈选ROI，ROI包含肿瘤主体区域，避开坏死、出血及非特异性着色等区域。进一步地，该软件通过细胞核识别算法将ROI中所有细胞进行拆分，同时可以获得每个拆分细胞的空间位置，即其细胞核质心的X、Y轴坐标值；通过荧光识别算法对拆分细胞进行CD3蛋白表达定量，即CD3荧光强度值，并且确定阳性强度阈值。
6、结肠癌肿瘤组织中CD3+T淋巴细胞空间分布特征分析
首先，使用CD3的阳性强度阈值（c: cutoff）对CD3+T淋巴细胞的荧光强度（x:Intensity）进行校准，得到校准后的荧光强度（y: scaled_Intensity），公式如下：
由于肿瘤组织主体很大，细胞数目量级很大，因此我们采用spatial-grid-based的方法，将肿瘤组织中的CD3+T淋巴细胞按照每100μm×100μm的网格进行空间合并，具体为：
将图片中的肿瘤组织划分为100μm×100μm的网格，对网格进行n次合并，1次合并即原始网格尺寸（最小网格单元），根据合并后网格的数量判断是否需进一步合并，2次合并后，单个网格尺寸为200 μm×200 μm，如此顺序优化，n次合并后单个网格尺寸为100*nμm×100*nμm，直至合并后网格数目低于预设值，本实施例中预设值为10000。
取每个网格内的中心点坐标记为合并后CD3+T淋巴细胞群的X（Xmedoid）和Y（Ymedoid）坐标，取每个网格内CD3+T淋巴细胞的平均校准后荧光强度记为合并后CD3+T淋巴细胞群的荧光强度m（mean_scaled_Intensity），合并后的CD3+T淋巴细胞群个数即网格个数记为N，合并后的CD3+T淋巴细胞表达及荧光强度如图1所示，图中X_loc、Y_loc分别为网格横纵坐标。
根据以下公式计算肿瘤区域的莫兰指数I（以下称为CD3 Moran I）：
式中，i、j表示网格序号，w ij 为网格i到周围网格j的距离（如以i网格为核心，计算周围网格j与i之间的距离得到w ij ），W为所有w ij 的总和，m i 、m j 分别为网格i、j的荧光强度，为N个网格的平均荧光强度，N为网格数量。
7、在结肠癌队列样本中使用单因素分析和/或多因素分析CD3 Moran I对结肠癌患者预后的有效性
使用R包survminer的函数surv_cutpoint获取CD3 Moran I的最佳截断值为0.0785，使用此截断值将队列划分成Score High组和Score Low组，并使用R包survminer和survival进行生存分析。
生存分析结果如图2所示，图2中CD3_group即训练队列，训练队列中Score Low组（低分组）47例结肠癌患者无进展生存时间（progression-free survival，PFS）显著低于94例Score High组（高分组）的结肠癌患者（P=0.00361，HR=2.487）。
将CD3 Moran I与TNM分期结合，即：在TNM分期结果中，对每个分期利用莫兰指数进一步分组。CD3 Moran I可以在各分期中进一步区分结肠癌患者的预后，结果如图3所示。特别是在二期患者中，CD3 Moran I Score Low组的复发风险是Score High组复发风险的3.4倍，且趋于显著（P=0.0744），如图4。
将CD3 Moran I、性别、年龄、肿瘤位置、TNM 分期（TNM stage）、术前CEA和CA19.9水平、肿瘤神经浸润及淋巴血管浸润等临床危险因素进行多因素分析，结果如图5所示，CD3Moran I是结肠癌患者趋于独立显著的预后因素（P=0.052），在多因素分析的所有相关因素中所占的权重为（18.5%），如图6。
Claims (8)
1.一种基于全局莫兰指数的结肠癌预后预测方法，其特征在于，包括：
S1获取结肠癌组织样品切片的全切片数字图像，所述结肠癌组织样品切片经染色及荧光免疫标记处理；
S2提取数字图像中核心肿瘤区域中所有细胞的坐标，以及每个细胞的荧光强度值，并预设阳性阈值，筛选出超过阳性阈值的荧光强度值；
S3基于筛选出的荧光强度值及对应的坐标值计算核心肿瘤区域的莫兰指数；将所述数字图像划分为若干网格单元，利用每个网格单元中包含的细胞的平均荧光强度值表征网格的荧光强度，以网格为计算单元基于下式计算核心肿瘤区域的莫兰指数I：
；
式中，i、j表示网格序号，w ij 为网格i到网格j的距离，W为所有w ij 的总和，m i 、m j 分别为网格i、j的荧光强度，为N个网格的平均荧光强度，N为网格数量；
S4获取莫兰指数的最佳截断值，基于最佳截断值将样品划分至不同风险组。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S1中，结肠癌组织样品切片利用HE染色及CD3荧光免疫标记处理。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S2中，筛选出超过阳性阈值的荧光强度值后，计算筛选出的荧光强度值与阳性阈值的比值，作为荧光强度值的校准值，利用校准值进行后续计算。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括，根据划分后的网格数量对网格进行空间合并：
预设划分的最小网格单元是边长为a的正方形，如果划分后的网格数量超过预设的网格数量阈值，则对网格单元进行合并，直至网格数量低于预设的网格数量阈值；合并后的网格边长为n×a，n为自然数。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，最小网格单元边长为50~150μm。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S4中，基于最大选择秩统计获取莫兰指数的最佳截断值。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S4还包括，将莫兰指数与TNM分期结合进行结肠癌预后预测。
8.一种基于全局莫兰指数的结肠癌预后预测系统，其特征在于，包括：
图像采集模块，获取结肠癌组织样品切片的全切片数字图像，所述结肠癌组织样品切片经染色及荧光免疫标记处理；
细胞识别模块，提取数字图像中核心肿瘤区域中所有细胞的坐标，以及每个细胞的荧光强度值，并预设阳性阈值，筛选出超过阳性阈值的荧光强度值；
莫兰指数计算模块，基于筛选出的荧光强度值及对应的坐标值计算核心肿瘤区域的莫兰指数；将所述数字图像划分为若干网格单元，利用每个网格单元中包含的细胞的平均荧光强度值表征网格的荧光强度，以网格为计算单元基于下式计算核心肿瘤区域的莫兰指数I：
；
式中，i、j表示网格序号，w ij 为网格i到网格j的距离，W为所有w ij 的总和，m i 、m j 分别为网格i、j的荧光强度，为N个网格的平均荧光强度，N为网格数量；
结肠癌预后预测模型建立模块，获取莫兰指数的最佳截断值，基于最佳截断值将样品划分至不同风险组。
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