CN117560998A - 用于肉代用品组合物的色素 - Google Patents

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Abstract

本文公开了用于肉代用品的色素组合物和包含此类色素组合物的肉代用品。该色素组合物包含热不稳定AlacDFX变体多肽，例如热不稳定DFX多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:1至少80％相同的序列，并且包含相对于SEQ ID NO:1在选自由I76、H68、E106、K58、E108、K90、I15、I16、I89、Q88、F102、Y80、Y7以及它们的组合组成的组的位置处的突变。该色素组合物为肉代用品组合物提供粉红色和/或红色，该肉代用品组合物在烹饪后转变为棕色。

Description

用于肉代用品组合物的色素
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年7月1日提交的美国临时专利申请第63/217,572号的优先权，该美国临时专利申请以全文引用方式并入本文中。
对经由EFS-Web提交的序列表的参考
在2022年6月20日创建并且经由专利中心与本申请一起电子提交的大小为10.5kb的名称为“PT-1117-WO-PCT_ST25.txt”的序列表的ASCII文本文件的内容以全文引用方式并入本文中。
背景技术
由于多种原因，对基于植物的肉代用品的需求正在增加。许多消费者更喜欢表现最类似于动物肉的肉代用品选项，包括希望肉代用品的颜色在烹饪之前和之后与动物肉颜色相当。因此，需要一种可为肉代用品提供与天然动物肉相同或相似颜色的色素。当烹饪肉代用品时，可转变颜色的源自天然来源的色素是特别理想的。
发明内容
本公开提供了包含热不稳定脱硫铁氧还蛋白(DFX)非血红素铁结合蛋白多肽的组合物，该多肽包含与SEQ ID NO:1至少80％相同的序列和相对于SEQ ID NO:1在选自由异亮氨酸(I)76、组氨酸(H)68、谷氨酸(E)106、赖氨酸(K)58、E108、K90、I15、I16、亮氨酸(L)81、I89、谷氨酰胺(Q)88、苯丙氨酸(F)102、酪氨酸(Y)80、Y7以及它们的组合组成的组的位置处的突变。该多肽可包含与SEQ ID NO:1至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的序列。该多肽可包含相对于SEQ ID NO:1在选自由I76、H68以及它们的组合组成的组的位置处的突变。该多肽可包含以下中的至少一种：(i)相对于SEQ ID NO:1的I76被F取代；(ii)相对于SEQ ID NO:1的H68被精氨酸(R)取代；(iii)相对于SEQ ID NO:1的E106、K58、E108和/或K90被甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、脯氨酸(P)、缬氨酸(V)、L、I、甲硫氨酸(M)、F、Y、色氨酸(W)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、天冬酰胺(N)或Q取代；(iv)相对于SEQ IDNO:1的I15、I16、L81和/或I89被G、A、V、S或C取代；(v)相对于SEQ ID NO:1的Q88被G、A、V、L、I、M、S、T、C、K、R、D或E取代；以及(vi)相对于SEQ ID NO:1的F102、Y80和/或F7被G、A、V、S、T、C、N、Q、K、R、H、D或E取代。该多肽可包含与SEQ ID NO:4-9中的至少一者的序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的序列。在一些方面，当将多肽在80℃下加热20分钟时，在506nm的波长处光的吸光度相对于加热前的吸光度降低。吸光度相对于加热前的吸光度降低至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％。
例如，本公开提供了包含有效增加生的或未烹饪过的肉代用品的红色的量的如本文所述的热不稳定DFX的色素组合物。在一些方面，当将色素在80℃下加热20分钟时，在506nm处的吸光度相对于加热前在506nm处的吸光度降低。
本公开还提供了一种肉代用品，其包含如本文所述的热不稳定DFX多肽或色素组合物和非肉蛋白。肉代用品的红色在烹饪后可降低。非肉蛋白可为选自由豆类蛋白、豌豆蛋白、大豆蛋白、玉米蛋白和小麦蛋白组成的组的基于植物的蛋白质。非肉蛋白可以是基于真菌的真菌蛋白。该肉代用品可包含0.01重量％至6重量％、0.05重量％至5重量％、0.1重量％至3重量％、或0.5重量％至2重量％的如本文所述的热不稳定DFX多肽。肉代用品可包含在50重量％与80重量％之间、在55重量％与75重量％之间、或在58重量％与70重量％之间的水。肉代用品可包含在1重量％与25重量％之间、在1.5重量％与20重量％之间、在2重量％与15重量％之间、在2.5重量％与10重量％之间、在3重量％与8重量％之间、或在4重量％与7重量％之间的脂质组合物。脂质组合物可包含椰子油、棕榈油、葵花油、大豆油、菜籽油或它们的组合。肉代用品可包含在2重量％与30重量％之间、在5重量％与25重量％之间、在8重量％与20重量％之间、或在10重量％与19重量％之间的质构化的基于植物的蛋白质。质构化的基于植物的蛋白质可包括质构化豆类蛋白、质构化豌豆蛋白、质构化大豆粉、质构化大豆浓缩物、质构化小麦蛋白、马铃薯蛋白或它们的组合。肉代用品可包含在0.5重量％与8重量％之间、在1重量％与6重量％之间、在20重量％与40重量％之间、或在25重量％与35重量％之间的粉末状的基于植物的蛋白质。粉末状的基于植物的蛋白质可包括豆类蛋白分离物、豌豆蛋白分离物、大豆粉、大豆分离物、大豆浓缩物、活性小麦面筋、马铃薯蛋白、玉米蛋白分离物或它们的组合。肉代用品可包含至多2重量％、或在0.1重量％与2重量％之间的量的甲基纤维素。肉代用品可以不含任何组织来源的动物蛋白。肉代用品可以不含任何基于动物的蛋白质。
本公开还提供了一种包含编码热不稳定DFX多肽的外源多核苷酸的细胞，该多肽包含与SEQ ID NO:1至少80％相同的序列，并且包含相对于SEQ ID NO:1在选自由I76、H68、E106、K58、E108、K90、I15、I16、I89、Q88、F102、Y80、Y7以及它们的组合组成的组的位置处的突变。该多肽可包含与SEQ ID NO:1至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的序列。该多肽可包含相对于SEQ ID NO:1在选自由I76、H68以及它们的组合组成的组的位置处的突变。该多肽可包含以下中的至少一种：(i)相对于SEQ ID NO:1的I76被F取代；(ii)相对于SEQ ID NO:1的H68被精氨酸(R)取代；(iii)相对于SEQ ID NO:1的E106、K58、E108和/或K90被甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、脯氨酸(P)、缬氨酸(V)、L、I、甲硫氨酸(M)、F、Y、色氨酸(W)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、天冬酰胺(N)或Q取代；(iv)相对于SEQ IDNO:1的I15、I16、L81和/或I89被G、A、V、S或C取代；(v)相对于SEQ ID NO:1的Q88被G、A、V、L、I、M、S、T、C、K、R、D或E取代；以及(vi)相对于SEQ ID NO:1的F102、Y80和/或F7被G、A、V、S、T、C、N、Q、K、R、H、D或E取代。该多肽可包含与SEQ ID NO:4-9中的至少一者的序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的序列。细胞可以是植物细胞、真菌细胞或动物细胞，例如昆虫细胞或体外培养的哺乳动物或鸟类细胞。本文还提供了包含所述细胞的肉代用品组合物。
本公开还提供了一种质粒，该质粒包含编码热不稳定DFX多肽的多核苷酸，该多肽包含与SEQ ID NO:1至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的序列，并且包含相对于SEQ ID NO:1在选自由I76、H68、E106、K58、E108、K90、I15、I16、I89、Q88、F102、Y80、Y7以及它们的组合组成的组的位置处的突变。
本公开还提供了一种用于增加肉代用品的红色的方法，该方法包括在烹饪肉代用品之前，向包含非肉蛋白的肉代用品中添加热不稳定DFX多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:1至少80％相同的序列，并且包含相对于SEQ ID NO:1在选自由I76、H68、E106、K58、E108、K90、I15、I16、I89、Q88、F102、Y80、Y7以及它们的组合组成的组的位置处的突变。
本公开还提供一种用于降低烹饪过的肉代用品中的红色的方法，该方法包括烹饪包含非肉蛋白和热不稳定DFX多肽的肉代用品，该多肽包含与SEQ ID NO:1至少80％相同的序列，并且包含相对于SEQ ID NO:1在选自由I76、H68、E106、K58、E108、K90、I15、I16、I89、Q88、F102、Y80、Y7以及它们的组合组成的组的位置处的突变，由此烹饪过的肉代用品的红色相对于烹饪之前的肉代用品的红色降低。在一些方面，当在130℃下加热90秒时，肉代用品的L*a*b*比色法的a*值降低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。
附图说明
本专利或申请含有至少一张彩色绘制的附图。具有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将在请求和支付必要费用后由专利局提供。
附图通常以举例的方式而非限制的方式示出本文档中讨论的各种方面。
图1显示通过在第一单体(链A)的K90与第二单体(链B)的E108之间形成的盐桥(虚线)在AlacDFX中的二聚体稳定化。
图2显示了通过第一单体(链A)的I15与第二单体(链B)的I16之间的疏水相互作用(虚线)在AlacDFX中的二聚体稳定化。
图3显示了通过第一单体(链A)的Q88与第二单体(链B)的Q88之间的π-π堆叠相互作用(虚线)在AlacDFX中的二聚体稳定化。
具体实施方式
本文描述了包含热不稳定非血红素铁结合蛋白的用于肉代用品的色素组合物。热不稳定AlacDFX突变体可用于在烹饪之前具有与生的动物肉类似的粉红色/红色的色素组合物中，但AlacDFX蛋白中的突变使得色素组合物在加热期间易于降解。色素组合物的这种降解导致色素在加热后颜色基本上降低或者变为无色。因此，含有有效量的这种色素组合物的肉代用品将从生的时的红色转变为烹饪时的棕色或者不太红的颜色。在一个方面，棕色的出现是因为肉代用品中的色素组合物在加热期间变得至少部分无色，这使得由涉及肉代用品的其他组分的美拉德反应产生的棕色变得比用于肉代用品的其他色素更明显。
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。如本文所用，以下术语中的每一个具有如下文所定义的与之相关的含义。
如本文所用，术语“肉代用品”和“肉代用品组合物”可互换使用，是指模拟天然动物肉或天然动物肉组合物的一般外观、营养含量和/或味道的组合物，而不含有来自完整、活的脊椎动物的组织或细胞作为主要组分。例如，肉代用品可以不含或含有作为次要组分的天然存在的动物肌肉、脂肪或来自从整个脊椎动物(例如，牛、绵羊、猪、鸡、火鸡等)收获的肌肉组织的卫星细胞。在一些方面，肉代用品不含任何动物细胞，例如任何体内衍生的或体外培养的动物细胞。在一些方面，肉代用品不含任何基于动物的蛋白质，包括乳蛋白和卵蛋白。
本文所述的肉代用品和肉代用品组合物包括非肉蛋白、基于植物的蛋白质(例如，豆类蛋白、豌豆蛋白、大豆蛋白、小麦蛋白、鹰嘴豆蛋白、玉米蛋白等)、基于真菌的蛋白(例如，衍生自真菌(诸如镰刀菌(Fusarium venenatum)等的真菌蛋白)、体外培养的动物细胞(例如，培养的肌肉细胞、卫星细胞、脂肪细胞等)、昆虫蛋白质或它们的组合。肉代用品可包括基于植物的蛋白质，包括但不限于豌豆蛋白、大豆蛋白、小麦蛋白、鹰嘴豆蛋白和玉米蛋白。肉代用品可包括基于真菌的蛋白质，包括但不限于来自镰刀菌的真菌蛋白。肉代用品可包含真菌或微生物生物质，其包含基于真菌的蛋白质。肉代用品可包括体外培养的动物细胞，包括但不限于使用例如发酵、生物反应器、支架接种细胞培养或其他人工方法生长、分化和繁殖的肌肉细胞、卫星细胞和脂肪细胞。肉代用品可以包括基于植物的蛋白质、基于真菌的蛋白质、昆虫蛋白质和体外培养的动物细胞中的两种或更多种的组合。例如，肉代用品可以包括豌豆蛋白和真菌的真菌蛋白、大豆蛋白和培养的牛肌肉细胞、培养的禽类脂肪细胞和真菌的真菌蛋白，或基于植物的蛋白质、基于真菌的蛋白质、昆虫蛋白质和体外培养的动物细胞的任何其他组合。
在一些方面，肉代用品包括基于植物的蛋白质、基于真菌的蛋白质或它们的组合，并且不含任何基于动物的蛋白质或细胞。在一些方面，肉代用品包括基于植物的蛋白质、基于真菌的蛋白质、昆虫蛋白质以及它们的组合，并且不含任何基于脊椎动物的细胞或蛋白质。在一些方面，肉代用品包括基于植物的蛋白质，并且不含基于真菌、昆虫或基于动物的细胞或蛋白质。在一些方面，肉代用品包括基于真菌的蛋白质，并且不含基于植物、昆虫和基于动物的细胞和蛋白质。在一个方面，肉代用品包括昆虫蛋白质，并且不含基于植物、基于真菌和基于动物的细胞和蛋白质。在一些方面，肉代用品包括体内培养的动物细胞，并且不含基于植物的蛋白质、基于真菌的蛋白质、昆虫蛋白质和体内完整动物衍生的组织、细胞和蛋白质。
在一些方面，肉代用品可模拟牛肉产品，例如碎牛肉、牛排、牛肉干、牛肋、牛肉饼、牛肉香肠等。在一些方面中，肉代用品可模拟猪肉产品，例如碎猪肉、猪排、火腿、烟熏猪肉、培根、猪肉香肠、猪肉饼、猪肋等。在一些方面，肉代用品可模拟鸡肉产品，例如碎鸡肉、鸡胸肉、鸡腿肉、鸡大腿肉、鸡翅、鸡肉饼、鸡柳、鸡块、鸡肉香肠等。在一些方面，肉代用品可模拟火鸡产品，例如，碎火鸡肉、火鸡香肠、火鸡肉饼等。在一些方面，肉代用品可模拟贝类产品，例如螃蟹、龙虾、虾、小龙虾、蛤蜊、扇贝、牡蛎、贻贝等。在一些方面，肉代用品可模拟熏制、腌制或加工肉产品，例如冷熟肉食、萨拉米香肠、夏季香肠、意大利生醃火腿、博洛尼亚大熏肠、波兰熏肠等。
如本文所用，术语“非肉蛋白”是指来源于植物、真菌、昆虫、乳制品或体外培养的动物细胞的蛋白质，并且排除体内脊椎动物衍生的组织、细胞或蛋白质。例如，非肉蛋白可包括基于植物的蛋白质、基于真菌的蛋白、昆虫蛋白质、乳蛋白质(例如，酪蛋白和乳清)、来自体外培养的动物细胞的蛋白质或它们的组合。
如本文所用，术语“多肽”和“肽”可互换使用，是指给予所述大分子其功能和性质所必需的总的一级、二级、三级和四级氨基酸序列和结构。如本文所用，“酶”或“生物合成途径酶”是指催化化学反应的蛋白质。任何特定酶(独立地或作为生物合成途径的一部分)的叙述应理解为包括酶适当发挥功能所必需的辅因子、辅酶和金属。如本领域所理解的氨基酸和它们的三个字母和一个字母符号的概述提供于表1中。氨基酸名称、三个字母符号和一个字母符号在本文中可互换使用。
表1：氨基酸三个字母和一个字母符号
氨基酸 三个字母符号 一个字母符号
丙氨酸 Ala A
精氨酸 Arg R
天冬酰胺 Asn N
天冬氨酸 Asp D
半胱氨酸 Cys C
谷氨酸 Glu E
谷氨酰胺 Gln Q
甘氨酸 Gly G
组氨酸 His H
异亮氨酸 Ile I
亮氨酸 Leu L
赖氨酸 Lys K
甲硫氨酸 Met M
苯丙氨酸 Phe F
脯氨酸 Pro P
丝氨酸 Ser S
苏氨酸 Thr T
色氨酸 Trp W
酪氨酸 Tyr Y
缬氨酸 Val V
如本文所用，“AlacDFX”是指来自乳酸厌氧菌(Anaerotignumlactatifermentans)的非血红素铁结合脱硫铁氧还蛋白。GenBank ID A0A1M6L0Q2。AlacDFX的野生型多肽序列作为SEQ ID NO:1提供。
SEQ ID NO:1
MKAPRFFICKHCKNIITMVEDKGVPVVCCGEKMTELKANTSDGAGEKHVPVVQVEGSKVTVKVGEVTHPMLEEHHIAWIYLETSQGGQIKYLDHTGAPEAVFALAEGEQAVAAYEYCNLHGLWKAEI
如本文所用，术语“热不稳定AlacDFX”是指当在80℃下加热20分钟时，在506nm处的吸光度相对于加热前的吸光度降低的AlacDFX多肽。在一些方面，在加热后，热不稳定AlacDFX的吸光度小于加热前在506nm处的吸光度的80％、小于50％或小于20％。在视觉上，热不稳定AlacDFX的红色或粉红色的强度可在加热时降低，或者红色或粉红色可在加热后完全不存在。热不稳定AlacDFX多肽是热稳定野生型AlacDFX多肽的变体，其包括在加热时使AlacDFX多肽去稳定的一个或多个突变。
适用于本文所述的色素和组合物的热不稳定AlacDFX多肽包括SEQ ID NO:1的AlacDFX蛋白质的热不稳定突变体。热不稳定AlacDFX突变体包括一个或多个使多肽去稳定的突变，使得当在80℃下加热20分钟时，多肽在506nm处的吸光度和红色/粉红色相对于加热前的颜色和吸光度降低。突变可以是取代、缺失或插入。不希望受任何特定理论、方面或作用模式的束缚，使铁结合区域不稳定或有助于AlacDFX单体或二聚体结构完整性的区域不稳定的突变将产生热不稳定AlacDFX多肽。例如，参见，实施例2中提供的AlacDFX同源性模型的分析。用于本文所述的色素和组合物(例如，肉代用品)的热不稳定AlacDFX多肽可以是具有与SEQ ID NO:1至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的序列的多肽，并且包括相对于SEQ ID NO:1的至少一个突变，该突变使多肽去稳定，使得当在80℃下加热20分钟时，在506nm处的吸光度相对于加热前的吸光度降低。
来自热不稳定AlacDFX变体的AlacDFX中合适的去稳定突变包括但不限于相对于SEQ ID NO:1在位置I76、H68、E106、K58、E108、K90、I15、I16、L89、Q88、F102、Y80、Y7或它们的组合处的突变。去稳定突变可包括在选自由I76、H68、E106、K58、E108、K90、I15、I16、L89、Q88、F102、Y80、Y7以及它们的组合组成的组的一个或多个位置处的取代。去稳定突变可包括选自I76F和H68R的一个或多个取代基。
热不稳定AlacDFX多肽可包含相对于SEQ ID NO:1(SEQ ID NO:4)的I76F取代。热不稳定AlacDFX多肽可包含与SEQ ID NO:4至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的序列，并且包括相对于SEQ ID NO:1的I76F突变。
SEQ ID NO:4
MKAPRFFICKHCKNIITMVEDKGVPVVCCGEKMTELKANTSDGAGEKHVPVVQVEGSKVTVKVGEVTHPMLEEHHFAWIYLETSQGGQIKYLDHTGAPEAVFALAEGEQAVAAYEYCNLHGLWKAEI
热不稳定AlacDFX多肽可包含相对于SEQ ID NO:1(SEQ ID NO:5)的H68R取代。热不稳定AlacDFX多肽可包含与SEQ ID NO:5至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的序列，并且包括相对于SEQ ID NO:1的H68R突变。
SEQ ID NO:5
MKAPRFFICKHCKNIITMVEDKGVPVVCCGEKMTELKANTSDGAGEKHVPVVQVEGSKVTVKVGEVTRPMLEEHHIAWIYLETSQGGQIKYLDHTGAPEAVFALAEGEQAVAAYEYCNLHGLWKAEI
热不稳定AlacDFX多肽可包含相对于SEQ ID NO:1(SEQ ID NO:6)在位置E106、K58、E108和K90中的一个或多个位置处的取代。热不稳定AlacDFX多肽可包含与SEQ ID NO:6至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的序列，并且包括相对于SEQ IDNO:1在位置E106、K58、E108和K90中的一个或多个位置处的取代。
SEQ ID NO:6
MKAPRFFICKHCKNIITMVEDKGVPVVCCGEKMTELKANTSDGAGEKHVPVVQVEGSX1 VTVKVGEVTHPMLEEHHIAWIYLETSQGGQIX2 YLDHTGAPEAVFALAX3 GX4 QAVAAYEYCNLHGLWKAEI
其中X1＝K、G、A、P、V、L、I、M、F、Y、W、S、T、C、N或Q，X2＝K、G、A、P、V、L、I、M、F、Y、W、S、T、C、N或Q，X3＝E、G、A、P、V、L、I、M、F、Y、W、S、T、C、N或Q，并且X4＝E、G、A、P、V、L、I、M、F、Y、W、S、T、C、N或Q，其中如果X1为K，X2为K并且X4为E，那么X3不可为E，如果X1为K,X2为K并且X3为E,X4不可为E，如果X2为K,X3为E并且X4为E,那么X1不可为K，并且如果X1为K,X3为E并且X4为E，那么X2不可为K。
热不稳定AlacDFX多肽可包括相对于SEQ ID NO:1(SEQ ID NO:7)在位置I15、I16、I89中的一个或多个位置处的取代。热不稳定AlacDFX多肽可包含与SEQ ID NO:7至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的序列，并且包括相对于SEQ ID NO:1在位置I15、I16、I89中的一个或多个位置处的取代。
SEQ ID NO:7
MKAPRFFICKHCKNXXTMVEDKGVPVVCCGEKMTELKANTSDGAGEKHVPVVQVEGSKVTVKVGEVTHPMLEEHHIAWIYLETSQGGQXKYLDHTGAPEAVFALAEGEQAVAAYEYCNLHGLWKAEI
其中X＝I、L、G、A、V、S或C，并且至少一个X不为I或L。
热不稳定AlacDFX多肽可包括相对于SEQ ID NO:1(SEQ ID NO:8)在位置Q88处的取代。热不稳定AlacDFX多肽可包含与SEQ ID NO:8至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的序列，并且包括相对于SEQ ID NO:1在位置88处的取代。
SEQ ID NO:8
MKAPRFFICKHCKNIITMVEDKGVPVVCCGEKMTELKANTSDGAGEKHVPVVQVEGSKVTVKVGEVTHPMLEEHHIAWIYLETSQGGXIKYLDHTGAPEAVFALAEGEQAVAAYEYCNLHGLWKAEI
其中X＝G、P、C、S、A、M、T、K、L、V或I
热不稳定AlacDFX多肽可包括相对于SEQ ID NO:1(SEQ ID NO:9)在位置F102、Y80和F7中的一个或多个位置处的取代。热不稳定AlacDFX多肽可包含与SEQ ID NO:9至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的序列，并且包括相对于SEQ ID NO:1在位置F102、Y80和F7中的一个或多个位置处的取代。
SEQ ID NO:9
MKAPRFXICKHCKNIITMVEDKGVPVVCCGEKMTELKANTSDGAGEKHVPVVQVEGSKVTVKVGEVTHPMLEEHHIAWIXLETSQGGQIKYLDHTGAPEAVXALAEGEQAVAAYEYCNLHGLWKAEI
其中X＝F、Y、G、A、V、S、T、C、N、Q、K、R、H、D或E，并且至少一个X不为Y或F。
与本文所述的多肽具有基本同一性或同源性的变体或序列可用于实施所公开的色素、组合物和方法。此类序列可称为变体或修饰的序列。即，多肽序列可被修饰但仍保留表现出期望的活性的能力。通常，变体或修饰的序列可包括与野生型、天然存在的多肽序列或与如本文所述的变体多肽的为或大于约45％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的序列同一性。
如本文所用，短语“％序列同一性”、“％同一性”和“百分比同一性”可互换使用，并且是指使用标准化算法比对的至少两个氨基酸序列或至少两个核酸序列之间的残基匹配的百分比。氨基酸和核酸序列比对的方法是众所周知的。序列比对和序列同一性的生成包括使用计算方法进行的全局比对和局部比对。可以使用具有默认参数的BLAST(国家生物信息中心(NCBI)基于局部比对的搜索工具)版本2.2.31进行比对。可以使用具有以下默认参数的标准蛋白质BLAST来确定氨基酸序列之间的氨基酸序列同一性％：最大靶序列：100；短查询：自动调整短输入序列的参数；期望阈值：10；字长：6；查询范围内的最大匹配数：0；矩阵：BLOSUM62；空位罚分：(存在：11，扩展：1)；成分调整：条件成分得分矩阵调整；过滤器：未选择；遮罩：未选择。可以使用具有以下默认参数的标准核苷酸BLAST来确定核酸序列之间的核酸序列同一性％：最大靶序列：100；短查询：自动调整短输入序列的参数；期望阈值：10；字长：28；查询范围内的最大匹配数：0；匹配/失配得分：1、-2；空位罚分：线性；过滤器：低复杂度区域；遮罩：仅用于查找表的遮罩。使用具有默认参数的NCBI BLAST版本2.2.31算法相对于参考序列具有XX％(例如，80％)的同一性得分的序列被视为至少XX％相同，或者等效地与参考序列具有XX％的序列同一性。
多肽或多核苷酸序列同一性可以在整个定义的多肽序列(例如，如特定SEQ ID号所定义的)的长度上测量，或者可以在较短的长度上测量，例如，在取自较大的定义的多肽序列的片段(例如，至少15个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少70个或至少150个连续残基的片段)的长度上测量。此类长度仅是示例性的，并且应理解，本文、表、图或序列表中所示序列支持的任何断片长度可用于描述可测量百分比同一性的长度。
本文公开的多肽可包括“变体”多肽、“突变体”和“其衍生物”。如本文所用，术语“野生型”是本领域技术人员所理解的术语，并且意指多肽在自然界中的典型形式，区别于变体或突变形式。如本文所用，“变体”、“突变体”或“衍生物”是指具有与参考蛋白质或多肽分子不同的氨基酸序列的多肽分子。变体或突变体相对于参考分子可具有一个或多个氨基酸残基的插入、缺失或取代。
本文考虑的多肽变体、突变体、衍生物或片段的氨基酸序列可包括相对于参考氨基酸序列的保守氨基酸取代。例如，变体、突变体、衍生物或片段多肽可包括相对于参考分子的保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是氨基酸取代为不同氨基酸的那些取代，其中该取代被预测为对参考多肽的性质的干扰最小。换句话说，保守氨基酸取代基本上保留了参考多肽的结构和功能。保守氨基酸取代通常维持(a)取代区域中多肽主链的结构，例如β片层或α螺旋构象，(b)取代位点处分子的电荷和/或疏水性，和/或(c)侧链的体积。
如本文所用，术语“多核苷酸”、“多核苷酸序列”和“核酸序列”和“核酸”可互换使用并且是指核苷酸序列或其任何片段。这些短语还指天然或合成来源的DNA或RNA，其可以是单链或双链的并且可以表示有义链或反义链。DNA多核苷酸可以是cDNA或基因组DNA序列。
如果处于其天然状态或当通过本领域技术人员已知的方法操作时，多核苷酸可被转录和/或翻译以产生多肽或其片段，则称该多核苷酸编码多肽。这种多核苷酸的反义链也被认为编码该序列。
本领域技术人员理解遗传密码的简并性以及多种多核苷酸可以编码相同的多肽。在一些方面中，多核苷酸(即编码AlacDFX多肽的多核苷酸)可经密码子优化以在特定细胞内表达，该特定细胞包括但不限于植物细胞、细菌细胞、真菌细胞或动物细胞。尽管本文公开了由乳酸厌氧菌中发现的多核苷酸序列编码的多肽，但可使用编码本文所述的多肽的期望形式的任何多核苷酸序列。因此，可使用非天然存在的序列。这些序列可能是期望的，例如，以增强多肽或蛋白质的异源表达系统中的表达。用于产生简并编码序列的计算机程序是可获得的并且可用于此目的。铅笔、纸、遗传密码和人手也可用于产生简并编码序列。
本文还提供编码热不稳定AlacDFX多肽的多核苷酸。多核苷酸可编码本文所述的任何热不稳定AlacDFX多肽，例如，多核苷酸可编码与SEQ ID NO:1至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的多肽，该多肽包括相对于SEQ ID NO:1在位置I76、H68、E106、K58、E108、K90、I15、I16、L89、Q88、F102、Y80、Y7或它们的组合处的突变。
本文所述的多肽可作为构建体的一部分提供。如本文所用，术语“构建体”是指重组多核苷酸，包括但不限于DNA和RNA，该DNA和RNA可以是单链或双链的并且可以代表有义链或反义链。重组多核苷酸是通过实验室方法形成的多核苷酸，该多核苷酸包括衍生自至少两种不同天然来源的多核苷酸序列，或者它们可以是合成的。因此，构建体可包括通过例如基因组编辑技术引入的对内源基因的新修饰。构建体还可以包括使用例如重组DNA方法产生的重组多核苷酸。构建体可以是包括与编码热不稳定EforRed多肽的多核苷酸可操作地连接的启动子的载体。如本文所用，术语“载体”是指能够转运与其连接的另一多核苷酸的多核苷酸。载体可以是质粒，其是指环状双链DNA环，额外的DNA片段可以整合到该环中。
还提供了包括本文所述的任何多核苷酸、构建体或载体的细胞。细胞可以是原核细胞或真核细胞。合适的原核细胞包括细菌细胞，例如，大肠杆菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)细胞。合适的真核细胞包括但不限于真菌细胞、植物细胞和动物细胞。合适的真菌细胞包括但不限于镰刀菌、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)和黑曲霉(Aspergillus niger)细胞。合适的植物细胞包括但不限于豌豆细胞(豌豆(Pisum sativum))、玉米细胞(玉米(Zea mays))、大豆细胞(大豆(Glycine max))和小麦细胞(小麦属(Triticum sp.))。合适的动物细胞包括但不限于肌肉细胞(例如肌细胞、成肌细胞、肌卫星和卫星细胞)和脂肪细胞(例如脂肪细胞或脂肪祖细胞，诸如间充质干细胞)。合适的动物细胞可以是哺乳动物(例如牛、猪和羊)、禽类(例如家禽)、甲壳纲动物(例如虾、龙虾和螃蟹)、软体动物(例如蛤蜊、贻贝、扇贝和牡蛎)或昆虫细胞。在一些方面，细胞是可食用的蘑菇细胞，其是指对于人类消费而言安全的蘑菇。例如，可食用的蘑菇细胞可以是镰刀菌、双孢蘑菇(Agaricus bisporus)、香菇(Lentinula edodes)或草菇(Volvariella volvacea)细胞。
本文描述了含有热不稳定AlacDFX的色素组合物，以及包括这种色素组合物的肉代用品。本文公开的色素组合物可用于为肉代用品提供与生的天然动物肉的颜色类似的颜色。此外，这些色素组合物在加热时改变颜色，并且可为整个肉代用品组合物提供总体颜色变化，这模拟了在天然动物肉上烹饪的效果。在一个方面，色素组合物为生的、未烹饪过的肉代用品提供粉红色和/或红色，其在烹饪肉代用品之后转变为棕色、白色、无色或者较浅的红色。
当被烹饪时，由于降解，色素组合物本身失去其粉红色或者红色，并且如果发生足够的降解，色素组合物可能变为无色。因此，烹饪过的肉代用品的棕色不一定是由于色素组合物变成棕色，而是由于色素组合物失去其淡红色。烹饪过的肉代用品中降解的色素组合物不再掩盖肉代用品的其他颜色，并且与肉代用品中的美拉德反应相关的棕色变得更明显。
当加热到通常用于烹饪肉的范围内的温度时，色素组合物的红色基本上降低或者消除。当在80℃加热20分钟时，色素组合物从粉红色和/或红色变为较浅的粉红色/红色或变为基本上无色。该色素组合物可用于将肉代用品的颜色从粉红色和/或红色变为棕色和/或较浅的粉红色/红色，如通过将包括该色素组合物的肉代用品在80℃加热20分钟所表现的。
色素组合物样品颜色的变化可使用亨特色度计测量，并且报告为与加热之前的样品相比，加热后可见光吸光度的相对变化百分比。当热不稳定AlacDFX、色素组合物或肉代用品在130℃的热板上加热90秒时，色素组合物的L*a*b*比色法的a*值相对于加热前的a*值降低。a*值可降低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％。同样，当热不稳定AlacDFX、色素组合物或肉代用品在80℃下加热20分钟时，在506nm波长处的光的吸光度相对于加热之前的吸光度降低。在506nm处的吸光度可降低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％。
本文所述的色素组合物包括AlacDFX多肽的热不稳定变体。色素组合物中AlacDFX多肽的热不稳定变体可以是本文所述的任何热不稳定变体。例如，色素组合物可包括具有与SEQ ID NO:1至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的序列的多肽，并且相对于SEQ ID NO:1包括至少一个突变，该突变使多肽去稳定，使得当在80℃下加热20分钟时，在506nm处的吸光度相对于加热前的吸光度降低。色素组合物可包括具有与SEQ IDNO:1至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的序列的多肽，相对于SEQID NO:1在选自由I76、H68、E106、K58、E108、K90、I15、I16、L89、Q88、F102、Y80、Y7或它们的组合组成的组的至少一个位置中具有突变。色素组合物可包括具有与SEQ ID NO:1至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的序列的多肽，该多肽包括相对于SEQID NO:1选自I76F、H68R以及它们的组合的取代。
色素组合物可包括具有与SEQ ID NO:4至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的序列并且包括相对于SEQ ID NO:1的I76F取代的多肽。色素组合物可包括具有与SEQ ID NO:5至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的序列并且包括相对于SEQ ID NO:1的H68R取代的多肽。色素组合物包括具有与SEQ ID NO:6至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的序列的多肽，并且包括相对于SEQID NO:1在选自E106、K58、E108、K90以及它们的组合的位置处的突变。色素组合物可包括具有与SEQ ID NO:7至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的序列，并且包括相对于SEQ ID NO:1在选自I15、I16、I89以及它们的组合的位置处的突变。色素组合物可包括与SEQ ID NO:8至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的多肽，并且包括相对于SEQ ID NO:1在位置Q88处的突变。色素组合物可包括具有与SEQ ID NO:9至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的序列的多肽，并且包括相对于SEQID NO:1在选自F102、Y80、F7以及它们的组合的位置处的突变。
色素组合物可以这样的水平包括在肉代用品中，该水平在肉代用品中提供增加的或者改善的粉红色和/或红色，同时还在烹饪后在肉代用品中提供增加的或者改善的棕色。在一个方面，色素组合物以使得热不稳定AlacDFX基于湿(总)重量为至少0.01％、0.05％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、1.0％、1.25％或1.5％的水平用于肉代用品组合物中。色素组合物可以使得热不稳定AlacDFX在0.01重量％至6重量％、0.05重量％至5重量％、0.1重量％至3重量％、或0.5重量％至2重量％范围内的水平用于肉代用品组合物中。
色素组合物可另外包括载体或稀释剂。色素组合物还可以包括AlacDFX多肽与另一种颜色或色素的共混物。例如，色素组合物可以包括AlacDFX多肽和基于水果或蔬菜提取物的色素组合物。
本文所述的色素组合物可用作任何肉代用品组合物中的色素。通常，本文所述的肉代用品组合物包括非肉蛋白(例如，基于植物的蛋白质)，并且任选地包括水、脂质组合物、纤维、淀粉、胶凝剂(例如，甲基纤维素)、防腐剂、调味剂或它们的组合。肉代用品可以是模仿碎肉和成型的肉类(例如，碎牛肉、肠或生肉已经磨碎和重整的另一种肉类产品)、熟食肉或乳化肉类(例如，热狗、博洛尼亚大熏肠和其他加工的肉类)或全肌肉(例如，作为来自动物的全肌肉的鸡胸肉、牛排等)的形式。肉代用品可包括质构化的基于植物的蛋白质、粉状的基于植物的蛋白质、基于植物的蛋白分离物或它们的组合。肉代用品可包括在2重量％与30重量％之间、在5重量％与25重量％之间、在8重量％与20重量％之间、或在10重量％与19重量％之间的质构化的基于植物的蛋白质。肉代用品可包括在0.5重量％与8重量％之间、在1重量％与6重量％之间、在20重量％与40重量％之间、或在25重量％与35重量％之间的粉末状的基于植物的蛋白质或基于植物的蛋白质分离物。
如本文所用，“质构化的蛋白质”和“质构化的基于植物的蛋白质”可互换使用，并且是指从可食用蛋白质来源加工的可食用食品成分，并且其特征在于具有结构完整性和可鉴定的结构，使得呈现为纤维、碎片、大块、小块、颗粒、切片等的个别单元将经受水合和烹饪或用于生产供消费的食品的其他程序。通常，使用质构化的基于植物的蛋白质来模拟肉的质构并且结合肉代用品组合物中的水。产生质构化的蛋白质的可食用蛋白质来源可包括但不限于豆类(例如，豆类蛋白)、豌豆、大豆、玉米、小麦、鹰嘴豆、马铃薯等。质构化的蛋白质可包括但不限于质构化豆类蛋白、质构化豌豆蛋白、质构化大豆粉、质构化大豆浓缩物、质构化小麦蛋白、质构化马铃薯蛋白或它们的组合。本领域已知和描述的蛋白质质构化的方法可包括例如高温和高压挤出、旋转、冷冻质构化、化学或酶促质构化等。
本文所述的肉替代品还可包括非质构化的基于植物的蛋白质，例如粉末状的基于植物的蛋白质、基于植物的蛋白质分离物、基于植物-蛋白质的面粉、植物-蛋白质浓缩物、它们的组合等。粉末状的基于植物的蛋白质和基于植物的蛋白质分离物可包括用作食品成分的基于植物的蛋白质的可溶形式。非质构化的基于植物的蛋白质可包括但不限于豌豆蛋白、脱脂大豆粉、脱脂大豆分离物、大豆浓缩物、活性小麦面筋、马铃薯蛋白、玉米蛋白分离物或它们的组合。
肉代用品可包括高水分的质构化的基于植物的蛋白质。通常，在添加至肉代用品配置物中之前，将高水分的质构化的基于植物的蛋白质进行水合，并且因此基于肉代用品组合物的重量，其可以占更高的百分比。例如，肉代用品组合物可包括在25重量％与98重量％之间、在50重量％与95重量％之间、或在60重量％与90重量％之间的高水分的质构化的基于植物的蛋白质。
肉代用品可包括一种或多种脂质组合物，例如脂肪、油或它们的组合。通常，脂肪是指在室温为固体的脂质组合物，而油在室温为液体。脂质组合物可包括饱和脂肪酸(也称为“饱和脂肪”)、不饱和脂肪酸(也称为“不饱和脂肪”)或它们的组合。脂质组合物可包括但不限于植物油、椰子油、棕榈油、葵花油、大豆油、菜籽油或它们的组合。肉代用品组合物可包括在1重量％与25重量％之间、在1.5重量％与20重量％之间、在2重量％与15重量％之间、在2.5重量％与10重量％之间、在3重量％与8重量％之间、或在4重量％与7重量％之间的脂质组合物。
在一些方面，替代本文所述的脂质组合物或除其之外，肉代用品可包括脂质模拟物。如本文所用，术语“脂质模拟物”是指当用作食品成分时模拟脂质组合物的形式、功能、质构、口感和味道的化合物或组合物。用于本文所述的肉代用品组合物中的脂质模拟物可包括但不限于纤维、淀粉、碳水化合物、蛋白质或它们的组合。在一些方面，脂质模拟物可以是植物提取物。肉代用品组合物可包括在1重量％与25重量％之间、在1.5重量％与20重量％之间、在2重量％与15重量％之间、在2.5重量％与10重量％之间、在3重量％与8重量％之间、或在4重量％与7重量％之间的脂质模拟物。当脂质模拟物与脂质组合物组合使用时，肉代用品可包括在1重量％与25重量％之间、在1.5重量％与20重量％之间、在2重量％与15重量％之间、在2.5重量％与10重量％之间、在3重量％与8重量％之间、或在4重量％与7重量％之间的脂质模拟物与脂质组合物的组合。
肉代用品可包括水。例如，肉代用品可包括在50％(wt)与80％(wt)之间、在55％(wt)与75％(wt)之间、或在58％(wt)与70％(wt)之间的水。
肉代用品可包括纤维。纤维可包括但不限于果胶、苹果纤维、车前草、亚麻纤维、米糠精华、魔芋粉等。肉代用品可包括在0.1％(wt)与3％(wt)之间、在0.1％(wt)与2％(wt)之间、或在0.5％(wt)与2％(wt)之间的纤维。肉代用品可包括至多1％(wt)、至多1.5％(wt)、至多2％(wt)、至多2.5％(wt)或至多3％(wt)的量的纤维。
肉代用品可包括淀粉。淀粉可包括预糊化淀粉、改性淀粉或它们的组合。淀粉可包括但不限于玉米淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉等。肉代用品可包括在0.1％(wt)与3％(wt)之间、在0.1％(wt)与2％(wt)之间、或在0.5％(wt)与2％(wt)之间的淀粉。肉代用品可包括至多1％(wt)、至多1.5％(wt)、至多2％(wt)、至多2.5％(wt)或至多3％(wt)的量的淀粉。
肉代用品可包括胶凝剂。胶凝剂可包括但不限于甲基纤维素、卵清蛋白、酪蛋白、果胶、水胶体(例如，瓜尔胶、黄原胶、刺槐豆胶等)、大豆蛋白、卡诺拉蛋白(canolaprotein)、交联酶(例如，转谷氨酰胺酶)及它们的组合。肉代用品可包括在0.1％(wt)与3％(wt)之间、在0.1％(wt)与2％(wt)之间、或在0.5％(wt)与2％(wt)之间的胶凝剂。肉代用品可包括至多1％(wt)、至多1.5％(wt)、至多2％(wt)、至多2.5％(wt)或至多3％(wt)的量的胶凝剂。
在一些方面，胶凝剂是甲基纤维素。肉代用品可包括在0.1％(wt)与3％(wt)之间、在0.1％(wt)与2％(wt)之间、或在0.5％(wt)与2％(wt)之间的甲基纤维素。肉代用品可包括至多1％(wt)、至多1.5％(wt)、至多2％(wt)、至多2.5％(wt)或至多3％(wt)的量的甲基纤维素。
肉代用品可包括防腐剂。例如，肉代用品可包括防腐剂，诸如山梨酸钾、培养的葡萄糖、醋等。
肉代用品可包括色素。用于肉代用品组合物的色素是本领域已知和描述的，并且可包括但不限于水果和蔬菜提取物(例如，甜菜汁和甜菜提取物)、含血红素的蛋白质等。
肉代用品可包括调味剂或调料。例如，肉代用品可包括天然或人造调味剂和/或调料。调料可包括但不限于酵母菌提取物、香料、甜辣椒、蒜(例如，蒜粉、蒜末、脱水蒜)、洋葱(例如，洋葱粉、洋葱末、脱水洋葱)、牛至、欧芹、甜味剂、食盐(例如，氯化钠或氯化钾)、辣椒、辣椒粉、孜然、生姜等。
肉代用品可包括甜味剂。合适的甜味剂是已知的并且描述于本领域中。甜味剂可以是无热量甜味剂或有热量甜味剂中的至少一种。甜味剂可以是任何类型的甜味剂，例如，从植物或植物产品中获得的甜味剂或者从植物中获得的物理改性或化学改性的甜味剂或者合成甜味剂。
一种示例性但非限制性的肉代用品组合物是包含以下组分的组合物：植物蛋白(例如，织构化的豌豆蛋白和/或豌豆蛋白)、水、植物油、风味成分、盐、糖、粘合剂和本文所述的色素组合物。本文所述的色素组合物还可用于除肉代用品以外的食品应用中。
本文所述的肉代用品可包括一种或多种细胞，该细胞包含编码如本文所述的热不稳定AlacDFX多肽的外源多核苷酸。例如，肉代用品可包括如本文所述的真菌、植物或动物细胞，该细胞包含编码本文所述的热不稳定AlacDFX多肽的外源多核苷酸。
本文还提供了一种用于增加肉代用品的红色的方法。增加肉代用品的红色的方法包括在烹饪肉代用品之前向该肉代用品中添加热不稳定AlacDFX多肽，其中相对于没有热不稳定AlacDFX多肽的肉代用品，未烹饪过的肉代用品的红色增加。该方法还可以包括将热不稳定AlacDFX多肽添加到非肉蛋白中以形成相对于没有AlacDFX多肽的非肉蛋白具有增加的红色的肉代用品。热不稳定AlacDFX多肽可以是如本文所述的任何热不稳定AlacDFX多肽。例如，待添加到肉代用品中的热不稳定AlacDFX多肽可包含与SEQ ID NO:1至少80％相同的序列，并且包含相对于SEQ ID NO:1在选自由I76、H68、E106、K58、E108、K90、I15、I16、L89、Q88、F102、Y80、Y7以及它们的组合组成的组的位置处的突变。
还提供了一种用于降低烹饪过的肉代用品中的红色的方法。降低烹饪过的肉代用品中红色的方法包括烹饪包含非肉蛋白和热不稳定AlacDFX多肽的肉代用品，由此烹饪过的肉代用品的红色相对于烹饪前的肉代用品降低。热不稳定AlacDFX多肽可以是如本文所述的任何热不稳定AlacDFX多肽。例如，待添加到肉代用品中的热不稳定AlacDFX多肽可包含与SEQ ID NO:1至少80％相同的序列，并且包含相对于SEQ ID NO:1在选自由I76、H68、E106、K58、E108、K90、I15、I16、L89、Q88、F102、Y80、Y7以及它们的组合组成的组的位置处的突变。
实施例
通过参考以下实验性实施例进一步详细描述本发明。除非另有说明，提供这些实施例仅用于说明目的，并不旨在进行限制。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为涵盖由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变化。
实施例1-脱硫铁氧还蛋白的热稳定性
来自乳酸厌氧菌(AlacDFX；SEQ ID NO:1)的脱硫铁氧还蛋白具有红色，当用于肉代用品组合物中时，其赋予类似于未烹饪过的肉或生肉的颜色的红色。然而，AlacDFX是热稳定的并且在加热时不会失去其红色。
使用易错PCR产生AlacDFX突变体文库。在Mn2+存在下，用非校对DNA聚合酶对还包括编码His6标签的区域和蛋白酶切割位点(MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH，SEQ ID NO:3)的野生型AlacDFX cDNA序列(SEQ ID NO:2)进行易错PCR，将得到的多核苷酸转化到大肠杆菌中，并且选择得到的红色大肠杆菌菌落用于进一步筛选。所选菌落在96孔液体培养物中生长，裂解细胞，并从细胞碎片中除去裂解物上清液。在80℃下加热20分钟之前和之后测量裂解物上清液在506nm处的吸光度。在50ml培养物中重复展现加热后A506降低的裂解物。来自50ml培养物的裂解物的结果以及相对于SEQ ID NO:1的去稳定突变的表征示于表A中。表A中的“加热后在506nm处的吸光度％”是加热后与加热前的裂解物相比在506nm处的吸光度％。
表A：50mL裂解物热稳定性
裂解物 加热后在506nm处的吸光度％ 突变
3D6 45％ I76F
2E8 47％ H68R
实施例2：AlacDFX同源性模型和稳定性预测
使用超氧化物还原酶(PDB ID 1Y07)的x射线晶体结构构建AlacDFX蛋白的同源性模型。这个模型用于鉴定预期会降低AlacDFX的热稳定性的突变。
首先，残基E106、K58、E108和K90中的一个或多个的突变将使二聚体内单个单体之间的盐桥去稳定(图1)。在AlacDFX模型中，来自一种单体的残基E106和E108分别与其他单体的残基K58和K90形成盐桥。预期这些残基中的任何一个或多个的突变破坏蛋白质的四级结构，产生热不稳定AlacDFX蛋白，其在加热时在506nm处的吸光度降低。E106、K58、E108和K90中的一个或多个中的突变可以是非保守氨基酸取代，例如，去除带电荷侧链的取代(例如，G、A、P、V、L、I、M、F、Y、W、S、T、C、N或Q的取代)，或增加侧链体积的取代(例如，F、Y或W的取代)。
I15、I16或L89通过取代较小(即体积较小)残基的突变将破坏二聚化界面。在AlacDFX模型中，残基I15、I16和L89位于二聚化界面处，并且这些残基的侧链大小有助于二聚体界面的稳定。预期这些残基中的任何一个或多个的突变破坏蛋白质的四级结构，产生热不稳定AlacDFX蛋白，其在加热时在506nm处的吸光度降低。I15、I16或L89中的一个或多个突变可以是具有较小侧链的氨基酸(例如，G、A、S或C)的取代。
通过取代非芳族残基的Q88突变将破坏蛋白质中的π-π堆叠相互作用，导致去稳定化。在该模型中，Q88与来自二聚体的其他单体的Q88残基具有π-π堆叠相互作用。当Q88被G、P、C、S、A、M、T、K、L、V或I取代时，侧链-侧链π-π堆叠相互作用将被破坏，产生热不稳定AlacDFX蛋白，其在加热时在506nm处的吸光度降低。
AlacDFX模型的特征在于由至少残基F102、Y80和F7形成的疏水核心。例如在取代较小或带电荷的氨基酸(例如，G、A、V、S、T、C、N、Q、K、R、H、D或E)时使该疏水核心变松将产生热不稳定AlacDFX蛋白，其在加热时在506nm处的吸光度降低。
序列表
<110> 嘉吉公司
<120> 用于肉代用品组合物的色素
<130> Protein-PT-117-WO-PCT
<150> US 63/217,572
<151> 2021-07-01
<160> 9
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 127
<212> PRT
<213> 乳酸厌氧菌（Anaerotignum lactatifermentans）
<400> 1
Met Lys Ala Pro Arg Phe Phe Ile Cys Lys His Cys Lys Asn Ile Ile
1 5 10 15
Thr Met Val Glu Asp Lys Gly Val Pro Val Val Cys Cys Gly Glu Lys
20 25 30
Met Thr Glu Leu Lys Ala Asn Thr Ser Asp Gly Ala Gly Glu Lys His
35 40 45
Val Pro Val Val Gln Val Glu Gly Ser Lys Val Thr Val Lys Val Gly
50 55 60
Glu Val Thr His Pro Met Leu Glu Glu His His Ile Ala Trp Ile Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Thr Ser Gln Gly Gly Gln Ile Lys Tyr Leu Asp His Thr Gly
85 90 95
Ala Pro Glu Ala Val Phe Ala Leu Ala Glu Gly Glu Gln Ala Val Ala
100 105 110
Ala Tyr Glu Tyr Cys Asn Leu His Gly Leu Trp Lys Ala Glu Ile
115 120 125
<210> 2
<211> 444
<212> DNA
<213> 乳酸厌氧菌（Anaerotignum lactatifermentans）
<400> 2
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60
atgaaggcgc cgcgcttctt tatctgcaaa cactgtaaga acatcatcac catggtagaa 120
gataaaggcg tgccggtcgt ctgttgcggt gaaaaaatga cagaattaaa agcgaatacc 180
tccgacggtg ccggtgaaaa acacgtcccg gttgtccagg tggaaggctc taaagtgact 240
gtcaaagtgg gtgaagtgac tcaccctatg ctggaagaac accatatcgc ttggatctac 300
ctggagactt cacaaggcgg tcagattaaa tacttagacc atacgggtgc gccggaggca 360
gtctttgcac tggccgaggg cgaacaagca gtcgctgcat acgaatattg caacttacat 420
ggattatgga aagccgaaat ctaa 444
<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 3
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His
20
<210> 4
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 4
Met Lys Ala Pro Arg Phe Phe Ile Cys Lys His Cys Lys Asn Ile Ile
1 5 10 15
Thr Met Val Glu Asp Lys Gly Val Pro Val Val Cys Cys Gly Glu Lys
20 25 30
Met Thr Glu Leu Lys Ala Asn Thr Ser Asp Gly Ala Gly Glu Lys His
35 40 45
Val Pro Val Val Gln Val Glu Gly Ser Lys Val Thr Val Lys Val Gly
50 55 60
Glu Val Thr His Pro Met Leu Glu Glu His His Phe Ala Trp Ile Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Thr Ser Gln Gly Gly Gln Ile Lys Tyr Leu Asp His Thr Gly
85 90 95
Ala Pro Glu Ala Val Phe Ala Leu Ala Glu Gly Glu Gln Ala Val Ala
100 105 110
Ala Tyr Glu Tyr Cys Asn Leu His Gly Leu Trp Lys Ala Glu Ile
115 120 125
<210> 5
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 5
Met Lys Ala Pro Arg Phe Phe Ile Cys Lys His Cys Lys Asn Ile Ile
1 5 10 15
Thr Met Val Glu Asp Lys Gly Val Pro Val Val Cys Cys Gly Glu Lys
20 25 30
Met Thr Glu Leu Lys Ala Asn Thr Ser Asp Gly Ala Gly Glu Lys His
35 40 45
Val Pro Val Val Gln Val Glu Gly Ser Lys Val Thr Val Lys Val Gly
50 55 60
Glu Val Thr Arg Pro Met Leu Glu Glu His His Ile Ala Trp Ile Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Thr Ser Gln Gly Gly Gln Ile Lys Tyr Leu Asp His Thr Gly
85 90 95
Ala Pro Glu Ala Val Phe Ala Leu Ala Glu Gly Glu Gln Ala Val Ala
100 105 110
Ala Tyr Glu Tyr Cys Asn Leu His Gly Leu Trp Lys Ala Glu Ile
115 120 125
<210> 6
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (58)..(58)
<223> X为K、G、A、P、V、L、I、M、F、Y、W、S、T、C、N或Q
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (90)..(90)
<223> X为K、G、A、P、V、L、I、M、F、Y、W、S、T、C、N或Q
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (106)..(106)
<223> X为E、G、A、P、V、L、I、M、F、Y、W、S、T、C、N或Q
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (108)..(108)
<223> X为E、G、A、P、V、L、I、M、F、Y、W、S、T、C、N或Q
<400> 6
Met Lys Ala Pro Arg Phe Phe Ile Cys Lys His Cys Lys Asn Ile Ile
1 5 10 15
Thr Met Val Glu Asp Lys Gly Val Pro Val Val Cys Cys Gly Glu Lys
20 25 30
Met Thr Glu Leu Lys Ala Asn Thr Ser Asp Gly Ala Gly Glu Lys His
35 40 45
Val Pro Val Val Gln Val Glu Gly Ser Xaa Val Thr Val Lys Val Gly
50 55 60
Glu Val Thr His Pro Met Leu Glu Glu His His Ile Ala Trp Ile Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Thr Ser Gln Gly Gly Gln Ile Xaa Tyr Leu Asp His Thr Gly
85 90 95
Ala Pro Glu Ala Val Phe Ala Leu Ala Xaa Gly Xaa Gln Ala Val Ala
100 105 110
Ala Tyr Glu Tyr Cys Asn Leu His Gly Leu Trp Lys Ala Glu Ile
115 120 125
<210> 7
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (15)..(16)
<223> X为I、L、G、A、V、S或C
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (15)..(89)
<223> X为I、L、G、A、V、S或C；并且至少一个X不为I或L
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (89)..(89)
<223> X为I、L、G、A、V、S或C
<400> 7
Met Lys Ala Pro Arg Phe Phe Ile Cys Lys His Cys Lys Asn Xaa Xaa
1 5 10 15
Thr Met Val Glu Asp Lys Gly Val Pro Val Val Cys Cys Gly Glu Lys
20 25 30
Met Thr Glu Leu Lys Ala Asn Thr Ser Asp Gly Ala Gly Glu Lys His
35 40 45
Val Pro Val Val Gln Val Glu Gly Ser Lys Val Thr Val Lys Val Gly
50 55 60
Glu Val Thr His Pro Met Leu Glu Glu His His Ile Ala Trp Ile Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Thr Ser Gln Gly Gly Gln Xaa Lys Tyr Leu Asp His Thr Gly
85 90 95
Ala Pro Glu Ala Val Phe Ala Leu Ala Glu Gly Glu Gln Ala Val Ala
100 105 110
Ala Tyr Glu Tyr Cys Asn Leu His Gly Leu Trp Lys Ala Glu Ile
115 120 125
<210> 8
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (88)..(88)
<223> X为G、P、C、S、A、M、T、K、L、V或I
<400> 8
Met Lys Ala Pro Arg Phe Phe Ile Cys Lys His Cys Lys Asn Ile Ile
1 5 10 15
Thr Met Val Glu Asp Lys Gly Val Pro Val Val Cys Cys Gly Glu Lys
20 25 30
Met Thr Glu Leu Lys Ala Asn Thr Ser Asp Gly Ala Gly Glu Lys His
35 40 45
Val Pro Val Val Gln Val Glu Gly Ser Lys Val Thr Val Lys Val Gly
50 55 60
Glu Val Thr His Pro Met Leu Glu Glu His His Ile Ala Trp Ile Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Thr Ser Gln Gly Gly Xaa Ile Lys Tyr Leu Asp His Thr Gly
85 90 95
Ala Pro Glu Ala Val Phe Ala Leu Ala Glu Gly Glu Gln Ala Val Ala
100 105 110
Ala Tyr Glu Tyr Cys Asn Leu His Gly Leu Trp Lys Ala Glu Ile
115 120 125
<210> 9
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (7)..(7)
<223> X为F、Y、G、A、V、S、T、C、N、Q、K、R、H、D或E
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (7)..(102)
<223> X为F、Y、G、A、V、S、T、C、N、Q、K、R、H、D或E；并且至少
一个X不为Y或E
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (80)..(80)
<223> X为F、Y、G、A、V、S、T、C、N、Q、K、R、H、D或E
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (102)..(102)
<223> X为F、Y、G、A、V、S、T、C、N、Q、K、R、H、D或E
<400> 9
Met Lys Ala Pro Arg Phe Xaa Ile Cys Lys His Cys Lys Asn Ile Ile
1 5 10 15
Thr Met Val Glu Asp Lys Gly Val Pro Val Val Cys Cys Gly Glu Lys
20 25 30
Met Thr Glu Leu Lys Ala Asn Thr Ser Asp Gly Ala Gly Glu Lys His
35 40 45
Val Pro Val Val Gln Val Glu Gly Ser Lys Val Thr Val Lys Val Gly
50 55 60
Glu Val Thr His Pro Met Leu Glu Glu His His Ile Ala Trp Ile Xaa
65 70 75 80
Leu Glu Thr Ser Gln Gly Gly Gln Ile Lys Tyr Leu Asp His Thr Gly
85 90 95
Ala Pro Glu Ala Val Xaa Ala Leu Ala Glu Gly Glu Gln Ala Val Ala
100 105 110
Ala Tyr Glu Tyr Cys Asn Leu His Gly Leu Trp Lys Ala Glu Ile
115 120 125

Claims (40)

1.一种热不稳定脱硫铁氧还蛋白(DFX)非血红素铁结合蛋白多肽，所述多肽包含与SEQID NO:1至少80％相同的序列和相对于SEQ ID NO:1在选自由异亮氨酸(I)76、组氨酸(H)68、谷氨酸(E)106、赖氨酸(K)58、E108、K90、I15、I16、亮氨酸(L)81、I89、谷氨酰胺(Q)88、苯丙氨酸(F)102、酪氨酸(Y)80、Y7以及它们的组合组成的组的位置处的突变。
2.根据权利要求1所述的热不稳定DFX，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:1至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的序列。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的热不稳定DFX，其中所述多肽包含相对于SEQ IDNO:1在选自由I76、H68以及它们的组合组成的组的位置处的突变。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的热不稳定DFX，其中所述多肽包含以下中的至少一种：
(i)相对于SEQ ID NO:1的I76被F取代；
(ii)相对于SEQ ID NO:1的H68被精氨酸(R)取代；
(iii)相对于SEQ ID NO:1的E106、K58、E108和/或K90被甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、脯氨酸(P)、缬氨酸(V)、L、I、甲硫氨酸(M)、F、Y、色氨酸(W)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、天冬酰胺(N)或Q取代；
(iv)相对于SEQ ID NO:1的I15、I16、L81和/或I89被G、A、V、S或C取代；
(v)相对于SEQ ID NO:1的Q88被G、A、V、L、I、M、S、T、C、K、R、D或E取代；以及
(vi)相对于SEQ ID NO:1的F102、Y80和/或F7被G、A、V、S、T、C、N、Q、K、R、H、D或E取代。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的热不稳定DFX，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:4-9中的至少一者的序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的序列。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的热不稳定DFX，其中，当所述多肽在80℃下加热20分钟时，在506nm波长处的光的吸光度相对于加热前的吸光度降低。
7.根据权利要求6所述的热不稳定DFX，其中所述吸光度相对于加热前的吸光度降低至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％。
8.一种用于肉代用品的色素组合物，所述色素组合物包含有效增加生肉或未烹饪的肉代用品的红色的量的根据权利要求1至7中任一项所述的热不稳定DFX多肽。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中当所述色素在80℃下加热20分钟时，在506nm处的吸光度相对于加热前在506nm处的吸光度降低。
10.一种肉代用品，所述肉代用品包含：
根据权利要求1至7中任一项所述的热不稳定DFX多肽或根据权利要求8或9所述的色素组合物，和
非肉蛋白。
11.根据权利要求10所述的肉代用品，其中所述肉代用品的红色在烹饪后降低。
12.根据权利要求10或11所述的肉代用品，其中所述非肉蛋白是选自由豆类蛋白、豌豆蛋白、大豆蛋白、玉米蛋白和小麦蛋白组成的组的基于植物的蛋白质。
13.根据权利要求10或11所述的肉代用品，其中所述非肉蛋白是基于真菌的真菌蛋白。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的肉代用品，其中所述肉代用品包含0.01重量％至6重量％、0.05重量％至5重量％、0.1重量％至3重量％或0.5重量％至2重量％的所述热不稳定DFX多肽。
15.根据权利要求10至14中任一项所述的肉代用品，其中所述肉代用品包含在50重量％与80重量％之间、在55重量％与75重量％之间、或在58重量％与70重量％之间的水。
16.根据权利要求10至15中任一项所述的肉代用品，其中所述肉代用品包含在1重量％与25重量％之间、在1.5重量％与20重量％之间、在2重量％与15重量％之间、在2.5重量％与10％重量％之间、在3重量％与8重量％之间、或在4重量％与7重量％之间的脂质组合物。
17.根据权利要求16所述的肉代用品，其中所述脂质组合物包含椰子油、棕榈油、葵花油、大豆油、菜籽油或它们的组合。
18.根据权利要求10至17中任一项所述的肉代用品，其中所述肉代用品包含在2重量％与30重量％之间、在5重量％与25重量％之间、在8重量％与20重量％之间、或在10重量％与19重量％之间的质构化的基于植物的蛋白质。
19.根据权利要求18所述的肉代用品，其中所述质构化的基于植物的蛋白质包括质构化豆类蛋白、质构化豌豆蛋白、质构化大豆粉、质构化大豆浓缩物、质构化小麦蛋白、马铃薯蛋白或它们的组合。
20.根据权利要求10至18中任一项所述的肉代用品，其中所述肉代用品包含在0.5重量％与8重量％之间、在1重量％与6重量％之间、在20重量％与40重量％之间、或在25重量％与35重量％之间的粉末状的基于植物的蛋白质。
21.根据权利要求20所述的肉代用品，其中所述粉末状的基于植物的蛋白质包括豆类蛋白分离物、豌豆蛋白分离物、大豆粉、大豆分离物、大豆浓缩物、活性小麦面筋、马铃薯蛋白、玉米蛋白分离物或它们的组合。
22.根据权利要求10至21中任一项所述的肉代用品，其中所述肉代用品包含至多2重量％或在0.1重量％与2重量％之间的量的甲基纤维素。
23.根据权利要求10至22中任一项所述的肉代用品，其中所述肉代用品不含任何组织来源的动物蛋白。
24.根据权利要求10至23中任一项所述的肉代用品，其中所述肉代用品不含任何基于动物的蛋白质。
25.一种用于增加肉代用品的红色的方法，所述方法包括：
在烹饪所述肉代用品之前，向包含非肉蛋白的肉代用品中添加热不稳定DFX多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:1至少80％相同的序列，并且包含相对于SEQ ID NO:1在选自由I76、H68、E106、K58、E108、K90、I15、I16、I89、Q88、F102、Y80、Y7以及它们的组合组成的组的位置处的突变。
26.一种用于降低烹饪过的肉代用品中的红色的方法，所述方法包括：
烹饪包含非肉蛋白和热不稳定DFX多肽的肉代用品，所述多肽包含与SEQ ID NO:1至少80％相同的序列，并且包含相对于SEQ ID NO:1在选自由I76、H68、E106、K58、E108、K90、I15、I16、I89、Q88、F102、Y80、Y7以及它们的组合组成的组的位置处的突变，由此所述烹饪过的肉代用品的红色相对于烹饪之前的所述肉代用品的红色降低。
27.根据权利要求26所述的方法，其中当在130℃下加热90秒时，所述肉代用品的L*a*b*比色法的a*值降低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。
28.一种包含编码热不稳定DFX多肽的外源多核苷酸的细胞，所述多肽包含与SEQ IDNO:1至少80％相同的序列，并且包含相对于SEQ ID NO:1在选自由I76、H68、E106、K58、E108、K90、I15、I16、I89、Q88、F102、Y80、Y7以及它们的组合组成的组的位置处的突变。
29.根据权利要求28所述的细胞，其中所述热不稳定DFX多肽包含与SEQ ID NO:1至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的序列。
30.根据权利要求28或29所述的细胞，其中所述多肽包含相对于SEQID NO:1在选自由I76、H68以及它们的组合组成的组的位置处的突变。
31.根据权利要求30所述的细胞，其中所述多肽包含相对于SEQ ID NO:1的I76F或H68R取代。
32.根据权利要求28或29所述的细胞，其中所述多肽包含以下中的至少一种：
(i)相对于SEQ ID NO:1的I76被F取代；
(ii)相对于SEQ ID NO:1的H68被精氨酸(R)取代；
(iii)相对于SEQ ID NO:1的E106、K58、E108和/或K90被甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、脯氨酸(P)、缬氨酸(V)、L、I、甲硫氨酸(M)、F、Y、色氨酸(W)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、天冬酰胺(N)或Q取代；
(iv)相对于SEQ ID NO:1的I15、I16和/或I89被G、A、V、S或C取代；
(v)相对于SEQ ID NO:1的Q88被G、A、V、L、I、M、S、T、C、K、R、D或E取代；以及
(vi)相对于SEQ ID NO:1的F102、Y80和/或F7被G、A、V、S、T、C、N、Q、K、R、H、D或E取代。
33.根据权利要求28至30中任一项所述的细胞，其中所述热不稳定DFX多肽包含与SEQID NO:4-9中的至少一者的序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的序列。
34.根据权利要求28至33中任一项所述的细胞，其中所述细胞是植物细胞。
35.根据权利要求28至33中任一项所述的细胞，其中所述细胞是真菌细胞。
36.根据权利要求28至33中任一项所述的细胞，其中所述细胞是动物细胞。
37.根据权利要求36所述的细胞，其中所述细胞是昆虫细胞。
38.根据权利要求36所述的细胞，其中所述细胞是体外培养的哺乳动物或禽类细胞。
39.一种肉代用品，所述肉代用品包含根据权利要求28至38中任一项所述的细胞。
40.一种质粒，所述质粒包含编码热不稳定DFX多肽的多核苷酸，所述多肽包含与SEQID NO:1至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的序列，并且包含相对于SEQ ID NO:1在选自由I76、H68、E106、K58、E108、K90、I15、I16、I89、Q88、F102、Y80、Y7以及它们的组合组成的组的位置处的突变。
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