CN117547654A - 一种仿生负载rhBMP-2骨修复材料及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种仿生负载rhBMP‑2骨修复材料及其制备方法与应用，属于骨修复材料技术领域，本发明利用固相反应法和有机泡沫浸渍法合成多孔羟基磷灰石支架，以PLGA‑PEG‑PLGA三嵌段聚合物作为rhBMP‑2的缓释载体，将所述多孔羟基磷灰石支架与所述PLGA‑PEG‑PLGA三嵌段聚合物复合，制成仿生负载rhBMP‑2骨修复材料，解决了生长因子初始时间爆发式释放且释放量大、缓释时间较短等问题。
Description
技术领域
本发明属于骨修复材料技术领域，尤其涉及一种仿生负载rhBMP-2骨修复材料及其制备方法与应用。
背景技术
骨组织具有较高的自我修复能力，然而，严重骨折、感染灶或肿瘤切除导致的局部骨缺损，以及脊柱融合手术，尤其是颈椎前入路融合内固定术，常需行骨移植术。自体骨移植被认为是骨移植的“金标准”，因其含有骨修复所需的细胞、生长因子及血管，生物相容性佳，骨传导性、诱导性强，但存在需要额外手术、骨源有限、取骨部位疼痛和易发生并发症等问题。异体骨移植骨源不受限、无取骨区并发症，但存在潜在疾病传播、免疫排异反应和价格昂贵等缺点，临床应用受到限制。因此，生物材料作为骨替代材料得到了广泛的研究和开发。
常见的人工骨主要是无机材料，包括磷酸钙骨水泥、β-磷酸三钙等，虽取材广泛、操作简单，但骨传导性差，无促进细胞成骨分化、新骨形成能力。部分人工骨修复材料，如含有重组人骨形态发生蛋白-2(recombinant human bone morphogenetic protein 2，rhBMP-2)的骨优导，骨诱导性优良，然而骨传导性低，无法为细胞和血管的生长提供支撑和引导。另外，高龄、营养不良、糖尿病及骨质疏松等因素会导致机体的修复能力下降，骨缺损局部的血管数量少、功能差以及存在炎症反应等也不利于骨组织修复重建。目前可用的骨替代材料通常或表现出很差的“骨传导性”，或表现出有限的“骨诱导能力”，导致治疗效果不理想。因此，开发具有良好成骨能力的新型骨替代材料，能够支持受损组织，诱导成骨分化，重建受损骨组织的原始形态和功能是非常迫切的。
严重的骨损伤、骨缺损常需进行骨移植术，自体骨和异体骨移植因存在二次手术、骨源有限、骨诱导性低等问题，临床应用受限。负载rhBMP-2的组织工程骨具有取材方便、来源广泛、可个性化制备等优点，已成为骨修复的重要方式。但rhBMP-2的释放时间短，大剂量使用会导致骨囊肿等并发症。
发明内容
本发明利用聚乳酸-羟基乙酸-聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸(PLGA-PEG-PLGA)温敏水凝胶作为rhBMP-2的缓释载体，实现rhBMP-2在骨修复期间的长时间释放，并避免大剂量使用导致的并发症。将其与多孔羟基磷灰石(HA)支架复合，利用仿生自然骨有机物-无机物组分、多孔分层网状结构、优良骨传导性和骨诱导性的特点，制备具有高效成骨诱导活性的仿生复合骨修复材料。
为实现上述目的，本发明提供了一种仿生负载rhBMP-2骨修复材料，其以羟基磷灰石(HA)作为无机骨架成分，以PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物作为有机活性成分。
一种所述的仿生负载rhBMP-2骨修复材料的制备方法，利用固相反应法和有机泡沫浸渍法合成HA支架，以PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物作为rhBMP-2的缓释载体，将所述HA支架与所述PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物复合，制成仿生负载rhBMP-2骨修复材料。
进一步地，所述合成HA支架的方法如下：以CaCO3和CaHPO4·2H2O为原料，经高温煅烧制备HA支架。
分别称重43gCaHPO4·2H2O和25g CaCO3(二者均为分析纯)装入研磨罐中，并加入68mL酒精和34g氧化锆球，以400rpm研磨6h，65℃下干燥24h，于1300℃高温炉中煅烧6h，得到羟基磷灰石粉体(HA粉体)。
进一步地，所述合成HA支架的方法如下：称取15g HA粉体，按固相含量70％加入10.5ml去离子水为溶剂，粘结剂选用聚乙烯醇，分散剂采用聚乙二醇，球磨3h，得到流动性、粘度优良的有机泡沫浸渍浆料；
选取回弹性好、气孔均匀、气孔率高的聚氨酯泡沫材料，将所述聚氨酯泡沫材料制成6.0×3.0mm的圆柱，用氢氧化钠溶液进行预处理(即将聚氨酯泡沫材料浸入浓度为10～20wt％NaOH溶液中，在40～60℃下水解2～6h，反复揉搓并用清水冲洗、晾干；
利用有机泡沫浸渍法制备HA胚体，经手工揉搓法得到HA胚体：将预处理的聚氨酯泡沫材料挤压并浸入所述有机泡沫浸渍浆料中，利用聚氨酯泡沫材料的回弹吸附浆料，再手工适度挤压聚氨酯泡沫材料，使聚氨酯泡沫材料孔隙互通且聚氨酯泡沫材料上黏附有浆料，得到HA胚体，室温下自然晾干，然后于1275℃高温处理8h获得HA支架，高温处理时升温速度控制在4～15℃/min，升温速度愈慢则反应愈完全。
进一步地，所述PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物的制备方法如下：将装有20.25g聚乙二醇的三颈瓶置于油浴锅，设置温度为125℃、搅拌速度70r/min，抽真空3h，并置换氩气，每小时1次，自然冷却后，加入36.8g丙交酯和9.9g乙交酯，待完全溶解后加入含56μL辛酸亚锡的甲苯溶液，抽真空去除甲苯，设置油浴温度150℃，反应12h，抽真空去除残留原料和小分子产物，热水洗涤，冷冻干燥后得到PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物。
进一步地，将所述HA支架与所述PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物复合的方法如下：将PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物溶于生理盐水，得到PLGA-PEG-PLGA水凝胶；将rhBMP-2干粉加入所述PLGA-PEG-PLGA水凝胶中，充分分散，得到rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA溶液；将HA支架浸于所述rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA溶液中，抽真空，保温。
进一步地，所述PLGA-PEG-PLGA水凝胶的浓度为25wt％；PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物与生理盐水的比例为2.5g∶7.5mL。
进一步地，所述rhBMP-2干粉与浓度为25wt％PLGA-PEG-PLGA水凝胶的比例为1.8mg∶10mL。
所述的仿生负载rhBMP-2骨修复材料在修复骨损伤中的应用。
进一步地，所述骨损伤为骨缺损、骨不连或骨愈合延迟。
本发明PLGA-PEG-PLGA温敏水凝胶具有双网络结构，比传统的单聚合物水凝胶具有更好的弹性和韧性。PLGA-PEG-PLGA温敏水凝胶具有温敏相变特性，低温时为液态，温度升高后可变为固态凝胶，负载rhBMP-2的操作工艺简单。
本发明基于自然骨的化学组成、结构和性能，HA、rhBMP-2及PLGA-PEG-PLGA温敏水凝胶的优缺点，开发了一种具有有机物/无机物组分、多孔网络结构、仿生细胞外基质且可缓释rhBMP-2的高效骨修复材料。以HA作为无机相，PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物作为有机质成分，将多孔网络结构的HA支架与双网络结构的PLGA-PEG-PLGA温敏水凝胶复合仿生骨细胞外基质并负载rhBMP-2，制备具有高效成骨诱导活性的仿生骨修复材料。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：
1、以PLGA-PEG-PLGA水凝胶为rhBMP-2载体，可实现细胞因子的缓释，与HA多孔支架复合，可制得仿生自然骨结构和功能的骨修复材料。
2、rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA仿生复合骨修复材料能显著促进BMSCs黏附、铺展、增殖、向成骨细胞分化以及成骨相关基因和蛋白的表达。
3、rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA仿生复合骨修复材料可显著促进体内新骨生成，促进股骨髁临界骨缺损修复的能力优于市售磷酸钙人工骨，可达到近似自体骨修复的效果。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为实施例1固相反应法合成HA粉体的XRD结构衍射图；
图2为实施例1固相反应法合成HA粉体的TG-DSC曲线；
图3为实施例1中HA支架的宏观照片；
图4为实施例1中HA支架的孔和孔壁SEM形貌，其中A为镜下50倍(200μm)，B为镜下100倍(100μm)，C为镜下200倍(25μm)，D为镜下1000倍(10μm)；
图5为实施例1中PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物的1H NMR谱图；
图6为实施例1中25wt％的PLGA-PEG-PLGA水凝胶随温度变化的流变性；
图7为实施例1中25wt％的PLGA-PEG-PLGA水凝胶的相变温度，其中左图为31℃，右图为42℃；
图8为实施例1中rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA复合材料在缓冲液中rhBMP-2的累积释放曲线；
图9为第1天细胞在材料表面黏附与铺展的SEM图，其中A：HA组，B：PLGA-PEG-PLGA/HA组，C：rhBMP-2/HA组，D：rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA组；a、b、c及d图分别为A、B、C及D图中细胞放大图；
图10为各组材料与细胞共培养不同时间的OD值(*p<0.05,**p<0.01)；
图11为各组材料不同时间的细胞相对增殖率(*p<0.05,**p<0.01)；
图12为第7d各组材料细胞活/死染色(×40)结果；
图13为各组材料培养7d、14d矿化结节ALP染色(×40)结果；
图14为不同时间点各组材料的ALP活性(*p<0.05，**p<0.01)；
图15为各组材料培养7d、21d矿化结节茜素红染色(×40)结果；
图16为各组材料不同时间点的钙含量；
图17为各组材料第3d mRNA表达情况(*p<0.05,**p<0.01)；
图18为各组材料第7d mRNA表达情况(*p<0.05,**p<0.01)；
图19为各组材料第14d mRNA表达情况(*p<0.05,**p<0.01)；
图20为兔股骨髁临界骨缺损模型建立，其中A麻醉后手术部位备皮；B暴露股骨外侧髁；C环钻钻出缺损，植入材料；D缝合切口、消毒；
图21为各组材料植入4周后的标本大体图，其中A：HA组；B：PLGA-PEG-PLGA/HA组；C：rhBMP-2/HA组；D：rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA组；E：磷酸钙人工骨组；F：自体骨组；
图22为各组材料植入8周后的标本大体图，其中A：HA组；B：PLGA-PEG-PLGA/HA组；C：rhBMP-2/HA组；D：rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA组；E：磷酸钙人工骨组；F：自体骨组；
图23为各组材料植入12周后的标本大体图，其中A：HA组；B：PLGA-PEG-PLGA/HA组；C：rhBMP-2/HA组；D：rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA组；E：磷酸钙人工骨组；F：自体骨组。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明实施例中的室温指的是25±2℃。
统计学分析：实验数据以均数±标准差表示，组间比较用配对t检验和方差分析，P＜0.05时有统计学差异，应用SPSS27.0和GraphPad Prism 9.5.0进行结果分析。
本发明实施例中所用重组人骨形态发生蛋白(rhBMP-2)购自杭州九源基因工程有限公司；乙交酯、丙交酯和辛酸亚锡均购自上海国药集团化学试剂有限公司。
在本发明中，PLGA-PEG-PLGA水凝胶＝PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物+水；25wt％PLGA-PEG-PLGA水凝胶即PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物质量/水质量＝25wt％。
实施例1rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA骨修复材料(即仿生负载rhBMP-2骨修复材料)的制备
1、HA支架的制备
采用固相反应法，以分析纯的CaCO3、CaHPO4·2H2O为原料，制备HA粉体。其反应如下：
6CaHPO4·2H2O+4CaCO3→Ca10(PO4)6OH2+4CO2+12H2O
分别称重43gCaHPO4·2H2O和25g CaCO3(二者均为分析纯)装入研磨罐中，并加入68mL酒精和34g氧化锆球，以400rpm研磨6h，65℃下干燥24h，于1300℃高温炉中煅烧6h，得到HA粉体；称取15g HA粉体，按固相含量70％加入去离子水(10.5mL)为溶剂，粘结剂选用聚乙烯醇，分散剂采用聚乙二醇，球磨3h，得到流动性、粘度优良的有机泡沫浸渍浆料；选取回弹性好、气孔均匀、气孔率高的聚氨酯泡沫材料，将其制成6.0×3.0mm的圆柱，氢氧化钠溶液进行预处理(将聚氨酯泡沫材料浸入浓度为10～20wt％NaOH溶液中，在40～60℃下水解2～6h，反复揉搓并用清水冲洗、晾干)，获得孔隙互通的三维网状结构；利用有机泡沫浸渍浆料，经手工揉搓法得到HA胚体(将预处理的聚氨酯泡沫材料挤压并浸入有机泡沫浸渍浆料中，利用聚氨酯泡沫材料的回弹吸附浆料，再手工适度挤压聚氨酯泡沫材料，使聚氨酯泡沫材料孔隙互通且聚氨酯泡沫材料上黏附有浆料)，室温下自然晾干，后于1275℃高温下烧结8h，升温速度控制在5℃/min，获得HA支架。
取10mgHA粉体置于玻璃凹槽中，玻璃薄片按压表面，使其与玻璃薄片平行，将载有合成粉体的玻璃凹槽置于X射线衍射仪中，分析粉体物相组成。实验条件：Cu-Kα辐射，波长为0.15418nm，电压40KV，电流30mA，步长0.02°，扫描速度6°/min，扫描范围10～90°，测量角度误差小于±0.01。
固相反应法合成HA粉体的XRD结构衍射图见图1，图1中的衍射峰与标准衍射卡片对比，证实所合粉体的晶相组成为HA，以该粉体可制得HA多孔陶瓷支架。
利用热分析仪对HA粉体进行热重-差示扫描量热法(TG-DSC)分析，实验起始温度为环境温度，终止温度设置为1500℃，升温速率10℃/min，气氛为氮气。绘制TG-DSC曲线，制定HA支架烧结的升温机制。利用热分析仪分析HA粉体的理化性质在烧结过程中的变化，继而制定适宜的陶瓷支架烧结升温制度，HA粉体的TG-DSC曲线见图2，从图2中可以看出，TG曲线上存在两个明显的变化过程，对应DSC曲线上的吸热峰。第一阶段为室温到579.0℃，TG失重为2.00％，对应DSC第一个吸热峰，对应样品中结晶水的脱附。第二阶段为579.0℃到763.9℃，TG失重为3.49％，是主要失重阶段，对应DSC另一个吸热峰，这是由于样品的分解反应。
肉眼观察支架的色泽、表面形貌及孔分布等；利用导电胶将支架粘于样品台上，表面喷金，扫描电镜下观察支架的孔径大小、孔壁结构及孔分布情况等。HA支架的宏观照片见图3，可见支架表面粗糙，无金属光泽，表面和内部可见与聚氨酯泡沫相似的大小较一致、均匀分布的大孔，且孔隙多数相互连通。
HA支架的孔和孔壁SEM形貌见图4，可知HA支架具有三维开孔网状结构，表面和内部存在大量分布均匀的孔洞，大孔的形状呈球形，均匀分布，孔径基本在300～600μm，孔与孔之间基本互通，孔隙率较高。支架孔壁上可见小孔，孔径为10～50μm。孔壁由大小均一的椭球形颗粒物构成，长约4～8μm，紧临的颗粒相互粘连，部分融合成短棒状，形成一定的微间隙，间隙约为1～3μm。
HA支架抗压强度的测定，采用AG-1力学测试机，设置压头速度为0.5mm/min。样品的底部直径记为d，每次测量的最大负荷记为Px，每个试样的抗压强度σx：
σx＝4Px/πdx 2
测试6个样品，取其平均值作为支架的抗压强度。
孔隙率测定，采用阿基米德法，测试6个试样，结果取其平均值。
质量测定，选择结构完整、大小相似的多孔HA支架6个，置于电子称上称重，计算单个支架质量M。
经测试，通过有机泡沫浸渍法和高温烧结制得的多孔HA支架，抗压强度为4.54±0.33Mpa，孔隙率达77.8％±1.06％，质量为33.20±2.53mg。
2、PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物制备
利用开环聚合法合成PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物：将装有20.25g聚乙二醇的三颈瓶置于油浴锅，设置温度为125℃、搅拌速度70r/min。抽真空3h，并置换氩气，每小时1次，自然冷却后，加入36.8g丙交酯和9.9g乙交酯，待完全溶解后加入含56μL辛酸亚锡的甲苯溶液，抽真空去除甲苯，设置油浴温度150℃，反应12h，抽真空去除残留原料和小分子产物，热水洗涤，冷冻干燥后得到PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物。
核磁共振氢谱：以氘代氯仿作为溶剂，内标为四甲基硅烷，通过1H NMR谱图计算PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物的分子量。PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物的1H NMR谱图见图5，计算得出其分子量为1744-1500-1744，LA:GA＝4:1。
3、rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA复合材料的制备
已用于临床的自固化磷酸钙人工骨，rhBMP-2浓度为0.3～3.0mg/g，为了与之对比骨修复效果，本发明制备了rhBMP-2浓度为180μg/mL的25wt％PLGA-PEG-PLGA水凝胶，rhBMP-2以180μg/mL的初始浓度，从25wt％PLGA-PEG-PLGA水凝胶中释放，体内外表现出优异的成骨诱导效果，而无并发症发生。具体方法如下：
取2.5g PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物溶于7.5mL的生理盐水，配制25wt％的PLGA-PEG-PLGA水凝胶；室温下将1.8mg rhBMP-2干粉加入装有10mL 25wt％PLGA-PEG-PLGA水凝胶的试管中，置于振荡器中，震荡1分钟，使rhBMP-2充分分散于PLGA-PEG-PLGA水凝胶中。室温下将HA支架完全浸于rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA溶液中，抽真空10min，使水凝胶充分填充于HA支架的空隙中，置于37℃恒温箱，待其凝固，即可得到rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA复合材料。
将25wt％的水凝胶溶液(即上述配制的25wt％的PLGA-PEG-PLGA水凝胶，下同)置于4℃冰箱中静置12h，后以15℃为初始温度，在0.5℃/min、10rad/s的条件下进行升温离心处理，通过流变仪测定三嵌段共聚物温敏水凝胶相变过程中的模量变化。25wt％的PLGA-PEG-PLGA水凝胶随温度变化的流变性见图6，当温度在15～31℃时，溶液保持流动溶胶状态，当温度超过31℃时，水凝胶开始发生相变，由溶胶转变为固态凝胶。
采用试管倒置法测定，取1mg 25wt％的水凝胶溶液于试管，设置恒温水浴箱以1℃/3min的升温速度，从15℃升温到50℃，正置放试管于水浴锅内。水凝胶相转变温度为完全倒置试管后凝胶静止不动30s以上时的水浴温度。试管倒置法测定25wt％的PLGA-PEG-PLGA水凝胶的相变温度，研究发现，当温度低于31℃时，水凝胶呈流动的液态；当温度升高超过31℃时(31℃～42℃)，复合物由具于流动性的液体变为了胶冻状固体，呈半透明(图7)。发生该现象的原因是，低温时PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物可自组装形成胶束，当温度升高时，胶束发生聚集，使共聚物水溶液变成凝胶，共聚物间相互的疏水作用是其凝胶化的驱动力。
取rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA溶液250μL至1.5mLEP管，置于37℃温箱中，使其相变形成凝胶。加入1.0mLPBS溶液至EP管，放回温箱中。于1h、2h、3h、6h、12h、1d、2d、3d、6d、14d、21d、28d、35d取样离心，收集上清液并换液。利用ELISA试剂盒测定rhBMP-2，计算各时间点的累积释放量，绘制rhBMP-2释放曲线。
图8是rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA复合材料在缓冲液中rhBMP-2的累积释放曲线，可以看出，rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA水凝胶具有双相释放特性，在早期时释放较快，后期可持续缓慢释放rhBMP-2。第1天，可释放rhBMP-2总量的26.3％，第3天时rhBMP-2累积释放率为42.7％。之后rhBMP-2释放速度较慢，第18天时rhBMP-2的累积释放量为73.8％，到28天时累积释放量为79.4％，具有优异的缓释特性。
按照前面所述的方法，测定rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA复合材料抗压强度，并与HA对比。复合rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA凝胶后，支架的质量可由33.202.53mg增加到125.261.63mg，抗压强度由4.540.33Mpa升高至8.371.39Mpa，与人体松质骨的抗压强度相匹配。
本发明通过固相反应法，将固态的Ca源和P源均匀混合，通过高温烧结制得HA粉体，XRD衍射图证实，所得粉体纯度高、晶格缺陷少。通过有机泡沫浸渍、高温烧结，构建了具有3D互连孔的HA支架，支架的多孔网状结构系聚氨酯泡沫在温度升高过程中气化、HA浆料凝固产生。支架的大孔孔径在300-600μm之间，大孔之间相互连通。孔壁上存在小孔隙，孔径在10-50μm之间。SEM见孔壁由粗糙的HA颗粒物构成，颗粒间存在微间隙。直径>100μm的孔隙可为成骨细胞、软骨细胞和血管内皮细胞的分化、扩增和迁移提供支架，有助于营养物质和代谢产物通过孔传递到孔内外，并为细胞外基质的连续沉积和储存提供了场所。此外，HA支架表现出了表面粗糙度。这种类型的多孔结构可显著增加移植物材料和新骨之间的表面积，这可以使材料与宿主骨形成牢固的连接。良好连通性的大小孔结构、孔壁粗糙的颗粒物、孔壁表面的微裂隙是骨修复材料良好生物活性和骨诱导性的结构基础。本发明合成的HA多孔支架满足细胞对孔隙要求，大孔、小孔的网状结构和孔壁微间隙，既增加了支架的内部连通性，又提高了支架的骨传导性，不仅有利于成骨细胞、血管内皮细胞向支架内部的长入，还有助于营养成分的输送、材料降解产物和组织代谢废物的排出。孔隙率是多孔支架表征的重要指标，孔隙率高意味着支架具有较大的比表面积，可为细胞的黏附、增殖和分化提供足够的空间。同时，支架的孔隙率越高，吸水率也越高。而吸水率高的材料有利于细胞在其表面的黏附和分布，还有助于植入机体后新生血管长入支架。本发明合成的HA多孔支架具有优良的孔隙率，为77.8％±1.06％，已达到临床对多孔支架孔隙率的要求，可为骨细胞、血管内皮细胞的黏附、长入提供通道和空间，有利于骨组织再生、缺损修复。支架的机械强度与孔隙率密切相关，孔隙率越高，抗压强度越低。HA骨修复材料虽具有良好的骨传导性、生物相容性等活性，但纯HA材料脆性高，应用常受限。本发明烧结的单一相HA支架，孔隙率高，符合骨修复要求，但抗压强度仅有4.54±0.33Mpa。然而，单一相的HA支架与rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA凝胶复合后，抗压强度可达8.37±1.39Mpa，与松质骨的抗压强度(2～12Mpa)相匹配，可满足非负重部位骨缺损修复的要求。
BMP-2因其强大骨诱导能力，一直是骨修复重建的关注重点。但是由于BMP-2的半衰期、消失快，局部应用时易被血流、组织液冲散、稀释。同时，BMP-2的使用剂量过低不足以诱导骨缺损愈合，大剂量则会导致囊肿样骨形成和明显的软组织肿胀。BMP-2靶向缓释可以减少骨诱导所需的剂量，同时亦可避免大剂量使用带来的副作用。目前缓释BMP-2的骨修复材料，在基础实验和临床应用中虽取得了较好的研究成就，但存在生长因子初始时间爆发式释放且释放量大、缓释时间较短等问题。
基于此，本发明提供了一种合适的负载释放基质，并确定了合适的负载浓度，对于诱导成骨具有重要的指导意义。
相比于其他缓释载体，PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物具有不可替代的优越性。首先PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物具有良好的生物相容性，植入体内不会引起明显的炎症反应，与其他聚合物相比，与负载的药物、蛋白或细胞的相互作用非常弱，负载的生物分子可以较长时间的保持活性，避免目的分子的早期失活。此外，PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物良好的生物降解性，在体内的降解产物为乳酸，而局部的弱酸性环境，可促进HA支架的降解，释放出Ca2+，继而为新的骨组织合成提供Ca源。良好的热致凝胶特性，使PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物，低温时为液态溶胶，体温时为固态凝胶，且在体内可保持1月余的凝胶形态。其含水量高、与细胞有高度的亲和性，将其作为rhBMP-2的载体，不仅可利用水凝胶的温敏性，实现生长因子体外液态负载，体内快速原位凝胶化，避免体液稀释、非缺损部位成骨等问题，而且可长时间持续地释放rhBMP-2，诱导BMSCs的成骨分化，促进骨再生，完成骨缺损的修复与重建。PLGA-PEG-PLGA聚合物具有与细胞外基质类似的三维网络结构，有利于营养物质、代谢废物转运，有助于细胞的黏附、生长和增值。本发明通过开环聚合法和冷冻干燥法合成25wt％PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物温敏水凝胶，在低温时呈溶胶状态，可完成rhBMP2的负载，较高温度时(31℃～42℃)，呈凝胶状。利用ELISA试剂盒测定生长因子体外释放情况，结果显示，在第1天，rhBMP-2突释量仅为总量的26.3％，第3天时rhBMP-2累积释放率为42.7％。之后rhBMP-2缓慢释放，到28天时累积释放量约为79.4％。相比其他缓释载体，本发明的缓释系统，初试时间药物突释量少，且可较长时间缓释rhBMP-2，可在骨再生的血肿机化期、骨痂形成期及骨痂塑形改造期持续平稳的释放rhBMP-2，诱导新骨再生。PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物具有立体交叉网状结构，第一个网络是完全交联的，主要提供机械强度和硬度，第二个网络通常是在已经形成的第一个网络的基础上填充(弱交联)的，主要增加了系统的弹性和韧性。与HA支架复合，可仿生天然骨组织的细胞外基质，既可提高复合材料的抗压强度，弥补单一相HA生物材料脆性高、断裂韧性不足、疲劳失效和机械强度低的问题，又可完成rhBMP-2的负载，实现骨诱导生长因子的体外持续释放，诱导骨组织生成。
由上述内容可知，本发明利用固相反应法联合有机泡沫浸渍法和高温烧结法可制得高孔隙率、孔隙连通好，具有大孔、微孔及微间隙的三维多孔HA支架；温敏特性的PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物低温时呈流动的溶胶状，可完成rhBMP-2负载，在体温时呈凝胶状，体外可持续稳定地释放rhBMP-2，满足骨组织工程的理想控释系统；PLGA-PEG-PLGA/HA支架具有仿生细胞外基质的结构和特性，抗压强度也显著高于单一相HA支架，符合非负重部位骨缺损修复材料的力学要求。
应用例1rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA复合材料体外促进成骨的作用和机制
将10月龄的SD大鼠处死，浸于酒精中予以皮肤消毒，于消毒好的无菌生物安全柜中解剖分离出完整股骨，酒精中浸泡后转移至PBS皿中。在超净台上剪掉股骨两端，用吸有完全培养基的注射器反复冲洗骨髓至培养皿，至股骨干变白。将培养皿置于细胞培养箱(37℃、5％CO2)中培养，24h后首次半换液，48h后全换液，以后每3d全换液一次。当细胞占总面积的85％～90％时，进行传代培养。弃去培养基，PBS洗涤两次，用0.25％的胰蛋白酶(购自Amresco公司)消化细胞，培养箱中放置2～3min。镜下观察细胞，当细胞突起收缩，间隙变大，形态变圆时，滴加含10％胎牛血清(购自Hyclone公司)的DMEM培养基(购自Hyclone公司)2mL终止消化。反复吹打细胞，1000rpm离心5min，获得细胞悬液，以1∶2进行传达培养。滴加含10％胎牛血清的DMEM培养基2mL，48h后第一次换液，之后每3d全换液一次。使用上述操作，传代至第三代BMSCs。
材料对BMSCs黏附和增殖的影响
(1)BMSCs与材料共培养
根据材料的组成，设置4个组：HA组、PLGA-PEG-PLGA/HA组、rhBMP-2/HA组、rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA组。对材料进行20kGy辐照消毒，置于24孔板。配制BMSCs悬液，细胞浓度为1×104个/mL。于材料表面滴加200μL细胞悬液和4mL DMEM培养基，于37℃、5％ CO2和95％湿度的细胞培养箱培养。
(2)BMSCs黏附及铺展
培养1d后取出种有细胞的样品，PBS清洗3次。利用4wt％多聚甲醛溶液对样品进行固定0.5h，再PBS清洗2min，清洗3次。-20℃下对材料冷冻6h，之后冻干机内干燥1d。样品表面喷金，扫描电镜下观察细胞的形态、细胞在材料表面的黏附及铺展情况。
第1天细胞在材料表面黏附与铺展的SEM图见图9，细胞与材料共培养1天，可见材料表面均有细胞黏附。HA组支架表面可见长梭形细胞黏附，胞体伸展；PLGA-PEG-PLGA/HA材料表面黏附的细胞数量增多，有的呈长梭形，有的呈纺锤形，并伸出伪足与材料黏附，相邻的细胞间可见拉网结构；rhBMP-2/HA材料表面细胞铺展良好，铺展的面积进一步扩大，细胞分散，呈不均匀的生长状态；rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA表面黏附的细胞数量更多，伸展面积更大，细胞均匀生长，并伸出大量伪足与临近细胞和材料连接。
(3)BMSCs增殖活性
将消毒后的各组材料置于EP管中，加入DMEM培养基，37℃、5％ CO2细胞培养箱内培养24h，制得材料浸提液。以1×104/孔的密度将BMSCs接种于96孔板，每组设置5个平行样，于培养箱内孵育24h，使细胞贴壁。对照组加入DMEM培养基，各材料组加入对应的材料浸提液，细胞培养箱继续培养。培养1d，2d及3d后取出，加入CCK-8试剂，细胞培养箱中孵育4h。酶标仪测定450nm处的吸光度(OD值)，每次检测6个试样，结果取平均值。以横轴为时间，纵轴为OD值，绘制BMSCs的增殖图。根据空白对照组和实验组的OD值，计算细胞相对增殖率(Relative Growth Rate，RGR)，RGR＝(材料组OD值/对照组OD值)×100％。
各组材料与细胞共培养不同时间的OD值(*p<0.05,**p<0.01)见图10，通过各组的OD值发现，细胞与材料浸提液共培养1天和2天后，各组的吸光度无统计学差异(p>0.05)；在第3天时，对照组、HA组和PLGA-PEG-PLGA/HA组的OD值差异无统计学意义(p>0.05)，rhBMP-2/HA组和rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA组的OD值无统计学差异，但均大于对照组、HA组和PLGA-PEG-PLGA/HA组的OD值，且差异有统计学意义(p<0.05)。
各组材料不同时间的细胞相对增殖率(*p<0.05,**p<0.01)见图11，通过分析每个材料组不同时间相较于空白对照组的细胞增殖情况(图11)，结果发现，4组材料第1天的细胞RGR均高于95％，且在第2天和第3天时，各材料组的RGR均大于100％。第1天和第2天时，各组的细胞RGR无统计学差异(p>0.05)，在第3天时，rhBMP-2/HA组和rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA组的RGR虽无统计学差异，但显著高于对照组、HA组和PLGA-PEG-PLGA/HA组，且差异存在统计学意义(p<0.05)。
根据GB/T16886标准，当细胞相对增殖率大于75％时，认为该材料具有良好的细胞相容性；当细胞相对增殖率大于100％时，认为材料无细胞毒性，且具有促进细胞增殖的效果。本发明中，各组材料的细胞相对增殖率在第1天时均大于95％，在第2天和第3天时，均大于100％，证实4种材料具有良好的细胞相容性，且可促进细胞的增殖。各组OD值和RGR结果显示，rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA组>rhBMP-2/HA组>PLGA-PEG-PLGA/HA组>HA组，表明rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA对BMSCs的增殖促进作用最强。
(4)BMSCs死/活荧光染色
加入材料浸提液与细胞培养，每3d换液一次，培养7d。将20μL PI(2mM)储备液和5μLCalcein-AM储备液(4mM)加入10mL PBS中，制备染色剂。第7天时，Trypsin-EDTA消化细胞，制成细胞悬液，1000rpm，离心3min。去除上清液，滴加PBS缓冲液，调整细胞数为1×105～1×106个/mL，移液器吹打，充分混匀。离心、PBS洗涤3次后，滴加200μL染色溶液，37℃下细胞培养箱内孵育0.5h。荧光显微镜下观察，先用490±10nm波长激发，绿色的是活细胞，死细胞呈红色，然后用545nm波长激发，仅能够看到红色的死细胞。
第7d各组材料细胞活/死染色(×40)结果见图12，HA组、PLGA-PEG-PLGA/HA组、rhBMP-2/HA组及rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA组的细胞存活良好，绿色荧光的活细胞占绝大多数，而红色荧光的死细胞仅为少数。
材料体外诱导BMSCs成骨分化的评价
利用消毒后的HA、PLGA-PEG-PLGA/HA、rhBMP-2/HA、rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA配制浸提液。各材料组和空白对照组设2个平行样本，将BMSCs接种于24孔细胞培养板，控制细胞密度为1×105个/孔，每孔加入0.5mL细胞培养液，于37℃、5％ CO2和95％湿度的细胞培养箱孵育24h。弃去培养液，滴加材料浸提液和成骨诱导液培养，每72h换液一次，诱导1-3w。通过茜素红染色和矿化钙含量测定，检测ALP染色和活性，实时定量PCR测定成骨基因(ALPmRNA、OPN mRNA、OCN mRNA和RunX-2mRNA)的表达，及成骨相关蛋白(Smad5、Smad1、p-Smad5、p-Smad1和RunX-2)表达的检测，评估各组材料在体外诱导BMSCs成骨分化的能力。
(1)ALP染色及活性检测
取培养7d和14d的样品，PBS清洗3次后加入4％多聚甲醛，固定30min，PBS清洗3次。细胞与ALP孵育液反应4h，PBS清洗3次。3.2％硝酸钴，浸透5min，PBS清洗3次。4.1％硫化铵浸透2.0～3.0min，PBS清洗3次。自然晾干，封片，镜下观察，阳性细胞呈灰色。
将培养7d和14d的样品加入1.5mL离心管。滴加RIPA裂解液200μL，12000rpm离心20min，取上清液。ALP试剂盒检测ALP活性，于底物、显色缓冲液中加入标准品、试样，细胞培养箱孵育10min。滴加100μL反应终止液于各孔，酶标仪测定405nm处OD值。各样品测定3次，样品的ALP活性取平均值。
各组材料培养7d、14d矿化结节ALP染色(×40)结果见图13，第7天时，空白对照组见极少的阳性颗粒；HA组见少量的淡灰色小颗粒；PLGA-PEG-PLGA/HA组呈现一定数量的阳性浅灰色颗粒；rhBMP-2/HA组可见较多的浅灰色颗粒，体积较大；rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA组浅灰色的阳性颗粒密度和体积进一步增大。第14天时，空白对照组见较多的灰黑色颗粒；HA组见一定程度灰黑色的阳性颗粒，数量较第7天时增多；PLGA-PEG-PLGA/HA组阳性颗粒染色加深，可见成团分布；rhBMP-2/HA组见强阳性的灰黑色颗粒，体积变大；rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA组灰黑色的成团结节数量和体积均增大，呈强阳性反应。
不同时间点各组材料的ALP活性(*p<0.05，**p<0.01)见图14，第7天时，各组的ALP活性无统计学差异(p>0.05)。第14天时，rhBMP-2/HA组和rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA组的ALP活性均明显高于HA组和PLGA-PEG-PLGA/HA组，差异均存在统计学意义(p<0.05)，而rhBMP-2/HA组和rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA组ALP不存在统计学差异(p>0.05)。相比于第7天，第14天时，各组的ALP活性均增加，差异存在统计学意义(p<0.05)。
(2)茜素红染色及钙含量测定
于培养第14d和21d取出细胞，PBS清洗3次，4％的多聚甲醛固定15min。PBS清洗3次，每孔加入0.5mL茜素红染液，室温下静置30min。蒸馏水清洗3次，去掉多余染液，中性红复染。自然干燥，封片，镜下观察，阳性为红色结节。
上述样品镜下观察拍照后，加入氯化十六烷基，室温下反应30min。1500rpm离心3min，吸取上清液。取100μL上清液，酶标仪测定560nm处的吸光度(OD值)，作为单纯细胞组吸光值。于10μL上清液中滴加90μL显色剂，混匀，孵育5min。酶标仪测定样品560nm处的OD值。每个样品测定3次，结果取平均值，样品的测定值＝样品的OD值-单纯细胞组OD值。根据所测样品的吸光值与钙含量标准曲线，计算钙含量。
各组材料培养7d、21d矿化结节茜素红染色(×40)结果见图15，第7天时，空白对照组见稀疏的淡红色小结节；HA组见散在的淡红色小结节；PLGA-PEG-PLGA/HA组可见少量的红色矿化结节，体积较小，部分结节中心的透光性低；rhBMP-2/HA组可见较多的小红色矿化结节；rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA组红染的矿化结节数量进一步增多。随着时间的推移，各组的结节数量增多、体积变大，染色程度逐渐增强。第21天时，空白对照组见较多的红色小结节，散在团块状结节；HA组见较多的红色结节，多为卵圆形，少数呈团块分布；PLGA-PEG-PLGA/HA组红色矿化结节的密度增加，团块状结节进一步增多，呈红色或褐色强阳性反应；rhBMP-2/HA组可见较多的红色结节，多数矿化结节沉积形成团块；rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA组见更多大体积的矿化结节，连成一片，呈红色强阳性。
各组材料不同时间点的钙含量见图16。第7天和第21天时，rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA组和rhBMP-2/HA组的钙含量均高于HA组和PLGA-PEG-PLGA/HA组，存在统计学差异(p<0.05)，而HA组和PLGA-PEG-PLGA/HA组的钙含量无统计学差异(p>0.05)。第21天时，rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA组的钙含量与rhBMP-2/HA组相比，差异具有统计学差异(p<0.05)。
成骨基因表达测定
(1)总RNA提取
取培养7d的细胞，PBS清洗3次，胰酶消化后收集细胞，PBS清洗3次。滴加1mLTrizol液，冰上放置5min，反复吹打，使细胞充分裂解，移入无酶的EP管中，冰上静置5min。滴加200μl氯仿，震荡混匀15s，静置3min，离心(4℃、12000rpm)10min。将上清液转移至新EP管，滴加异丙醇500μL，充分混匀，静置10min，离心(4℃、12000rpm)10min。弃上清液，滴加1mL预冷的75％乙醇对沉淀进行洗涤，离心(4℃、7500rpm)5min。弃乙醇，干燥，滴加30μLDEPC水，充分溶解RNA，获得总RNA，-80℃保存。
(2)引物设计
目标基因ALP、OPN、OCN、RunX-2及内参基因GAPDH的引物由上海生工科技有限公司设计合成，见表1。
表1PCR引物序列
(3)逆转录反应获得cDNA
室温下溶解RNA，去除基因组DNA，反应体积：5×gDNA Eraser Buffer 2.0μL，gDNAEraser 1.0μL，补加DEPC水至10.0μL，反应程序：42℃2min，4℃终止。反应体系：上述反应液10.0μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 10.0μL，RT Primer Mix*4 1.0μL，5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time)4.0μL，DEPC水4.0μL，设置PCR仪反应程序：37℃反应15min，85℃下反应5s，终止反应。
(4)qRT-PCR扩增
通过PCR实验，对目的基因的表达进行检测
反应体系：TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)10.0μl，PCR ForwardPrimer(10μM)0.8μl，PCR Reverse Primer(10μM)0.8μl，cDNA样品(<100ng)2.0μl，DEPC水6.4μl。反应程序：95℃预变性30s，95℃反应30s，60℃反应30s，PCR扩增40个循环。以管家基因GAPDH的表达作为内部参考对照，以标准化结果。每个样本设4个复孔。
BMSCs与各组材料培养3天时，成骨相关基因的表达情况见图17。rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA组ALP mRNA和RunX-2mRNA的表达量均显著高于rhBMP-2/HA组、PLGA-PEG-PLGA/HA组和HA组，差异存在统计学意义(p<0.05)。rhBMP-2/HA组、PLGA-PEG-PLGA/HA组和HA组，ALP mRNA和RunX-2mRNA表达量的组间差异也具有统计学意义(p<0.05)。OCN mRNA和OPN mRNA的表达量，rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA组最高，但四组间的差异无统计学意义(p>0.05)。
第7天时，各组ALP mRNA、RunX-2mRNA、OCN mRNA及OPN mRNA的表达量均较第3天时增加(见图18)。ALP mRNA和RunX-2mRNA表达量的组间差异均具有统计学意义(p<0.05)，其中rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA组显著高于其他组，差异明显。OCN mRNA的表达量，rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA组显著高于HA组和PLGA-PEG-PLGA/HA组，差异存在统计学意义(p<0.05)，而rhBMP-2/HA组与rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA组、HA组和PLGA-PEG-PLGA/HA组，组间的差异不存在统计学意义(p>0.05)。OPN mRNA的表达量，rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA组最高，rhBMP-2/HA组次之，两组间的差异及两组与PLGA-PEG-PLGA/HA组间的差异，无统计学意义(p>0.05)，而与HA组的差异具有统计学意义(p<0.05)。
第14天时，各组ALP mRNA、RunX-2mRNA的表达量较第7天时均下降，而OCN mRNA和OPN mRNA的表达量升高，其中rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA组各基因表达量均最高，且与其他组的差异具有统计学意义(p<0.05)。rhBMP-2/HA组各基因表达量与PLGA-PEG-PLGA/HA组和HA组差异也具有统计学意义(p<0.05)。PLGA-PEG-PLGA/HA组与HA组ALP mRNA和RunX-2mRNA的表达量差异虽不具有统计学意义(p>0.05)，但OCN mRNA和OPN mRNA的表达量存在统计学差异(p<0.05)(见图19)。
上述结果表明，rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA材料无细胞毒性，细胞相容性良好。温敏水凝胶的亲水性及HA支架的表面形貌，可吸附BMSCs，促进细胞在支架表面的黏附、增殖；rhBMP-2可提高HA支架的成骨诱导性，PLGA-PEG-PLGA具有细胞外基质作用，可实现rhBMP-2的缓慢释放，诱导成骨，HA支架可为细胞黏附、增殖提供支架，并为成骨分化后期提供钙源，rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA复合材料对BMSCs具有良好的相容性，可显著促进体外BMSCs的黏附、增殖和成骨分化，效果优于rhBMP-2/HA、PLGA-PEG-PLGA/HA和HA材料。
应用例2rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA复合材料体内促进成骨的作用和机制
(一)股骨髁临界骨缺损修复实验
1、实验分组
选取54只新西兰兔(清洁级，雄性，6月龄，体重2.5～3.0kg，由上海交通大学农生实验实习场有限公司提供。按照GB14925--2010标准条件进行饲养，术前1周进行适应性饲养)，随机分为A、B、C、D、E、F 6组，每组9只。A组：植入HA支架；B组：植入PLGA-PEG-PLGA/HA材料；C组：植入rhBMP-2/HA材料；D：植入rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA仿生材料，E组：植入市售的磷酸钙人工骨，F组：植入自体骨。
2、股骨髁临界骨缺损模型建立及材料植入
动物称重后，以速眠新经耳缘静脉注射麻醉。侧卧位固定，股骨远端消毒、铺巾。在膝关节上约1.0cm处作一约2.0cm纵切切口，逐层分离皮下组织、肌肉，暴露股骨外侧髁，并行骨膜剥离，暴露过程中注意保护腓总神经。股骨外髁处用环钻钻取直径6mm、深度3mm的圆柱样骨缺损，术区予以止血，F组将钻取的骨质原位填充，其余各组植入对应材料，逐层缝合切口，敷料包扎固定(图20)。
3、术后处理
所有实验兔术后置于清洁笼子复苏，手术当天禁食水，术后第2天允许进食水。术后5天内，每天肌肉注射兽用青霉素钠80万/单位。每日观察大白兔的精神、进食、尿便、下肢活动、切口愈合及死亡情况。
4、大体标本采集及观察
术后4周、8周和12周时，空气栓塞法每组处死3只实验兔，按原切口切开皮肤，观察标本的完整性，骨缺损处的隆起、凹陷或平滑程度，缺损界限的清晰度，材料周围有无炎症、脓肿、包块组织、凝胶流出，材料表面及周围的软组织面积、材料与缺损断端间隙的大小、材料上新骨的面积、硬度和光滑程度。
5、Micro-CT检查
标本大体观察后，利用Micro-CT扫描标本，测量并分析骨组织参数：骨小梁厚度、骨小梁数量、骨小梁分离度、骨体积分数和骨密度。
6、组织学分析
通过HE染色、Masson染色评估新骨生成、成熟情况及血管新生情况。Micro-CT扫描后的标本用4％多聚甲醛溶液固定1天，蒸馏水清洗3次。利用10％乙二胺四乙酸溶液对标本脱钙处理半月，每天更换脱钙液。脱钙后，利用不同浓度乙醇溶液对标本逐级脱水，每次脱水3小时。二甲苯溶液浸泡标本至透明状后，放入包埋器中，利用石蜡液包埋固定标本，利用切片机将标本以5um切片，切片放入40℃水槽，载玻片插入水中，将切片粘于载玻片中央，温箱烘干。二甲苯溶液浸泡切片，至石蜡洗脱。无水乙醇浸泡切片10分钟，两次，利用浓度递减的乙醇溶液浸泡切片，每次3分钟，最后蒸馏水冲洗。标本行HE染色，利用苏木素染色5～10分钟，蒸馏水浸泡分钟，1％盐酸和70％酒精分化半分钟，蒸馏水冲洗3分钟，0.5％伊红水溶液染色3分钟，梯度酒精(70％、80％、90％及100％)各脱水1分钟，二甲苯透明3次，每次10分钟，载玻片晾干后，滴加中性树胶，盖玻片封片。行Masson染色时，切片在酸性品红液中染色5～10分钟，蒸馏水漂洗，磷钼酸溶液中染色5分钟，不水洗，用苯胺蓝染色5分钟，1％乙酸处理1分钟，载玻片水冲洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，晾干后树胶封片。载玻片晾干后，滴加树胶，盖玻片封片。光学显微镜下新骨生成、成熟及血管再生情况。
(二)骨缺损修复实验结果
1、术后动物一般情况
术后30min，HA组有1只兔子死亡，考虑麻醉药物过量导致，当天予以补足数量。麻醉苏醒后，所有动物分笼饲养，饮食、二便均正常。术后1周内，所有动物手术侧下肢活动受限，跛行，之后活动逐渐恢复正常。所有实验动物的切口均愈合良好，无不良反应，且顺利存活至取材时间。
2、标本大体形貌
术后4周时，各组股骨髁标本完整，材料在位。HA组骨缺损处清晰可见植入的材料，无脱出或明显的移位，一层很薄的纤维组织膜覆盖于材料表面，材料和周围宿主骨组织的界限清晰。PLGA-PEG-PLGA/HA组的骨缺损面积未见减小，材料填充于其中，空隙结构清晰，材料表面可见纤维样软组织膜覆盖，与股骨髁骨质的分界线清晰可见。rhBMP-2/HA组缺损面积略减小，缺损边缘可见少量的骨样组织，缺损中央的材料被软组织膜覆盖，材料-股骨髁骨界面结合，未见移位、松动。rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA组骨缺损面积轻度减小，缺损表面的软组织与正常股骨髁表面的筋膜组织颜色一样，材料边缘可见增生的骨样组织覆盖，中间纤维组织包被，材料与缺损处的骨界面结合。磷酸钙人工骨组缺损区表面大部分被软组织覆盖，可见少部分人工骨轮廓，人工骨周围可见新生的骨样硬组织。自体骨组缺损区模糊不清，被较薄的软组织覆盖，表面光滑、平整，植入骨与正常周围骨的间隙减小、界面开始模糊(图21)。
术后8周时，各组骨缺损处可见较明显的纤维结缔组织再生，各材料被软组织覆盖，未见脓肿、溃乱等炎症反应，剔除软组织后，可见材料与宿主骨界面愈合情况。HA组材料的部分边缘见新生骨组织，与缺损断端形成新鲜的骨性结合，两者的界限不明显，致使骨缺损的面积减小，而无新骨生成的材料边缘，其与宿主骨界限清晰可见，材料的轮廓也较清楚。PLGA-PEG-PLGA/HA组可见缺损处表面较平滑，材料在位，其空隙结构模糊。新生的骨组织由材料边缘向内生长，缺损的部分边缘被骨样组织覆盖，与周围的宿主骨形成结合。rhBMP-2/HA组缺损面积明显减小，尤其是缺损的骨干端，被骨样硬组织包被，材料与骨组织界面融合，对材料施加外力，未有松动感，未见材料发生移位。rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA组缺损表面无凹陷或隆起，材料边缘见较多的新生的骨组织，牢固结合，外力作用下不会发生活动、移位。磷酸钙人工骨组缺损区表面光滑，被较薄的纤维软组织覆盖，人工骨边缘的新生骨与宿主骨部分融合，界线模糊。自体骨组缺损区被规则的软组织覆盖，表面光滑、平整，植入骨-正常周围骨间隙被骨样硬组织填充，几乎整合为一体(图22)。
术后12周时，各组骨缺损处被明显的纤维结缔组织覆盖，与周围宿主骨表面的软组织颜色、质地一样，未见炎症反应。HA组缺损的边缘被新生骨组织填充覆盖，颜色与宿主骨的一样，中央可见薄层的骨样组织，看不清材料，施加外力，未见明显的破损、裂缝。PLGA-PEG-PLGA/HA组缺损表面光滑、平整，被新生的骨痂包被，骨痂的中心颜色淡、周围的颜色与正常股骨髁相同，与材料结合牢固，质地不软。rhBMP-2/HA组缺损处骨组织增生、覆盖，与宿主骨发生融合，导致缺损线消失，且缺损处的骨组织成熟，与宿主骨无明显的差异。rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA组原缺损表面见较厚的质韧纤维组织，骨修复近乎完成，骨组织的硬度、色泽与正常宿主骨相似，表面光滑。磷酸钙人工骨组缺损区表面光滑，被纤维结缔组织覆盖，人工骨与宿主骨表面发生融合，界线近乎消失，但新生骨较薄、颜色较淡。自体骨组缺损区被规则的软组织覆盖，表面光滑、平整，植入骨与周围骨完全整合，融合为一体，界线消失(图23)。
新西兰大白兔骨组织成熟快，骨形态与人体相似度高，常被用于骨骼肌肉系统的研究。兔股骨髁因解剖位置表浅，定位标志清楚，手术操作中容易找寻，且松质骨丰富，容易实现骨缺损模型的建立，故常作为骨缺损造模部位。对于特定动物，当某一部位骨组织的缺损面积超过临界范围时，机体不能完成自我修复。新西兰兔股骨髁临界缺损的直径为6mm。因此，本发明选择制备股骨外侧髁直径6mm的缺损来评估材料的体内成骨活性。骨修复过程主要包括炎症反应和血肿机化期、骨痂形成期和骨痂改造塑形期。在血肿发生机化时，会引起无菌性炎症，产生包括BMP-2在内的众多细胞生长因子，可刺激BMSCs向骨缺损区迁移，并激活细胞的骨修复机制。内源性BMP-2含量少，因此无法有效刺激BMSCs成骨分化完成骨修复。当将BMP-2通过载体负载植入体内后，可有效地富集BMSCs，促进骨修复。目前已应用于临床的自固化磷酸钙人工骨，rhBMP-2的浓度为0.3～3.0mg/g。本发明研究发现，以25wt％PLGA-PEG-PLGA三嵌段温敏水凝胶作为rhBMP-2的缓释载体，应用于骨组织修复，当rhBMP-2以180μg/mL的初始浓度从PLGA-PEG-PLGA水凝胶中释放，可表现出优异的成骨诱导效果，而不会发生骨样囊肿等并发症，25wt％PLGA-PEG-PLGA温敏水凝胶具有很好的缓释特性是其主要的原因。因此，本发明选择以180μg/mL的rhBMP-2/水凝胶浓度用于骨修复的研究，以市售的磷酸钙人工骨和新西兰兔自体骨作为对照组，通过标本的大体观察、Micro-CT影像和组织学检测，对材料在动物体内促进新骨形成的能力进行综合评价。
将不同组分的材料植入体内修复股骨髁临界骨缺损，结果显示，rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA仿生复合材料具有优良的体内骨缺损修复能力，在术后的4周、8周及12周，新生骨小梁的数量、厚度、骨密度及新生骨体积分数均高于市售人工骨和其他材料组，新生骨组织向缺损区迁移、铺展，骨缺损的面积随时间进行性减小。在新生骨组织形成过程中，HA支架逐渐发生降解，释放的钙离子和磷酸离子被身体吸收和利用，使移植物材料和宿主骨之间获得良好的整合。同时，PLGA-PEG-PLGA三嵌段温敏水凝胶继续以缓慢的速度释放rhBMP-2，刺激BMSCs向缺损区迁移、增殖，向成骨细胞分化，诱导骨组织形成，加速骨缺损的修复。组织学结果表明，在整个随访期间，可以清楚地观察到新骨的渐进形成及其在支架材料孔隙中的重建。在骨修复过程中，HA支架主要起骨传导、支持缺损区并提供钙磷的作用，而rhBMP-2起高效的骨诱导作用，诱导BMSCs的成骨分化，并刺激巨噬细胞，加强其活性，加速材料的降解、新骨形成。术后12周时，rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA复合材料大部分已经降解，取而代之的是新形成的骨，植入物材料的残余被新的骨小梁包围，新骨形成面积大于其他材料，新生骨组织已完成改造塑形，多见成熟的板层骨。rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA仿生复合骨修复材料在术后随访期间表现出仅略弱于自体骨的修复能力，骨修复性能优于市售人工骨和其他材料，PLGA-PEG-PLGA三嵌段温敏水凝胶可能发挥了重要作用，该水凝胶可实现rhBMP-2的持续缓释，较长时间诱导BMSCs的成骨分化。HA支架在降解过程中产生的Ca2+、P3+可为基质矿化、新骨组织形成提供原料。另外，仿生的有机物-无机物复合组成成分、多孔的网状结构和微米形貌，有利于成骨相关基因和蛋白的表达，ECM的分泌、成熟和矿化。
以上，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种仿生负载rhBMP-2骨修复材料，其特征在于，其以羟基磷灰石作为无机骨架成分，以PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物作为有机活性成分。
2.一种权利要求1所述的仿生负载rhBMP-2骨修复材料的制备方法，其特征在于，利用固相反应法和有机泡沫浸渍法合成多孔羟基磷灰石支架，以PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物作为rhBMP-2的缓释载体，将所述多孔羟基磷灰石支架与所述PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物复合，制成仿生负载rhBMP-2骨修复材料。
3.根据权利要求2所述的仿生负载rhBMP-2骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述合成多孔羟基磷灰石支架的方法如下：以CaCO3和CaHPO4·2H2O为原料，经高温煅烧制备多孔羟基磷灰石支架。
4.根据权利要求3所述的仿生负载rhBMP-2骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述合成多孔羟基磷灰石支架的方法如下：
分别称重43gCaHPO4·2H2O和25g CaCO3装入研磨罐中，并加入68mL酒精和34g氧化锆球，以400rpm研磨6h，65℃下干燥24h，于1300℃高温炉中煅烧6h，得到羟基磷灰石粉体；
称取15g羟基磷灰石粉体，按固相含量70％加入水为溶剂，粘结剂选用聚乙烯醇，分散剂采用聚乙二醇，球磨3h，得到有机泡沫浸渍浆料；
将聚氨酯泡沫材料制成6.0×3.0mm的圆柱，用氢氧化钠溶液进行预处理；
利用有机泡沫浸渍法制备多孔羟基磷灰石胚体，室温下自然晾干，然后于1275℃高温处理8h获得多孔羟基磷灰石支架。
5.根据权利要求2所述的仿生负载rhBMP-2骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物的制备方法如下：将装有20.25g聚乙二醇的三颈瓶置于油浴锅，设置温度为125℃、搅拌速度70r/min，抽真空3h，并置换氩气，每小时1次，自然冷却后，加入36.8g丙交酯和9.9g乙交酯，待完全溶解后加入含56μL辛酸亚锡的甲苯溶液，抽真空，设置油浴温度150℃，反应12h，抽真空，热水洗涤，冷冻干燥后得到PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物。
6.根据权利要求2所述的仿生负载rhBMP-2骨修复材料的制备方法，其特征在于，将所述多孔羟基磷灰石支架与所述PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物复合的方法如下：将PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物溶于生理盐水，得到PLGA-PEG-PLGA水凝胶；将rhBMP-2干粉加入所述PLGA-PEG-PLGA水凝胶中，充分分散，得到rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA溶液；将多孔羟基磷灰石支架浸于所述rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA溶液中，抽真空，保温。
7.根据权利要求6所述的仿生负载rhBMP-2骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述PLGA-PEG-PLGA水凝胶的浓度为25wt％。
8.根据权利要求7所述的仿生负载rhBMP-2骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述rhBMP-2干粉与浓度为25wt％PLGA-PEG-PLGA水凝胶的比例为1.8mg∶10mL。
9.权利要求1所述的仿生负载rhBMP-2骨修复材料在修复骨损伤中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述骨损伤为骨缺损、骨不连或骨愈合延迟。
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