CN117547551A - 基于间充质干细胞源性外泌体在哮喘治疗药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于哮喘治疗药物技术领域，公开了一种基于间充质干细胞源性外泌体在哮喘治疗药物中的应用，培养人脐带间充质细胞，并通过超离心提取其外泌体；通过透射电镜、纳米颗粒追踪器、Westernblot和纳米流式细胞术进行验证；同时，建立慢性哮喘动物模型和慢性哮喘动物模型；在OVA暴露过程中，外泌体组小鼠连续注射hucMSCs‑Exos，对照组小鼠注射DPBS，Sham组小鼠用相同体积的DPBS代替OVA；用免疫荧光法检测小鼠肺组织中SMA‑α、CC‑10、ki67、SPC、Hopx的表达。肝细胞间充质干细胞外泌体可减轻气道重塑，改善哮喘症状，可以降低哮喘母亲后代的哮喘易感性。

Description

基于间充质干细胞源性外泌体在哮喘治疗药物中的应用
技术领域
本发明属于哮喘治疗药物技术领域，尤其涉及一种基于间充质干细胞源性外泌体在难治性哮喘治疗中的应用。
背景技术
目前，哮喘是儿童最常见的喘息性疾病之一，是一种具有多种表型和严重程度的异质性疾病，已知其与遗传因素相关。在哮喘形成之前，气道炎症导致气道重塑，进而加剧炎症和症状。为了打破这一恶性循环，为母亲患哮喘的后代寻找方法，利用人脐带间充质干细胞来源的外泌体研究其对哮喘小鼠及哮喘母亲后代肺结构的变化，并进一步初步探讨了其机制。
哮喘是目前儿童最常见的慢性喘息疾病之一，严重哮喘的发病率较高儿童时期哮喘的医疗负担可能会延伸到青春期和成年期，并伴有包括肺功能异常在内的后遗症，对正常生活有强烈的影响，以淋巴细胞增多和嗜酸性粒细胞增多、杯状细胞化生、平滑肌激活和气道过度活跃为特征哮喘被广泛认为是一种慢性炎症性疾病。此外，儿童哮喘的发育规划是复杂的，直接或间接地导致了一些原因，如感染、过敏、环境和遗传因素。在这些危险因素中，母亲的哮喘是一个公认的儿童哮喘气喘和哮喘同时，它也增加了妊娠并发症的风险Sly，P.D等人研究表明，哮喘母亲所生的儿童哮喘在非哮喘儿童中更常见。虽然确切的机制尚不清楚，但更早和更适当地使用吸入糖皮质类固醇(ICS)来改善哮喘控制似乎是关键；然而，传统哮喘治疗的最佳效果只能控制症状，而不是治愈症状，一旦患者接触到过敏原或感染，病情可能会加重。因此，寻找一种更好的哮喘治疗方法是很重要的，它尤其可以降低患有哮喘的母亲的后代对哮喘的易感性。
众所周知的“细胞外囊泡(EV)”在2011年被定义为脂质双层封闭和细胞来源颗粒的外泌体(Exos)作为一种EV及其最重要的活性成分，具有含有跨膜蛋白的脂质双分子。外泌体的直径为40～160nm，通过多种方式参与受体细胞的生理过程，如诱导细胞信号分子的交换、酶和遗传物质的运输等，也可作为靶向治疗的药物载体，外泌体不仅在细胞膜、细胞核组成和信号转导中发挥着重要作用，而且在细胞间的通信中也起着重要作用。一旦释放，Exos可以通过体液，如血液、淋巴和呼吸道分泌物，在不同组织或器官中的细胞之间进行远程通信。同时，由于外泌体含有大量的核酸、蛋白质、脂质和代谢物，可以改变受体细胞或组织的生理状态，并直接调控受体细胞的基因表达，人间充质干细胞来源的外泌体(hMSCs-Exos)已被证实可促进肺泡成熟和肺血管发育，减轻肺动脉高压的形成，同时可调节肺巨噬细胞的表型，减少肺纤维化的形成，在这些hMSCs-Exos中，来自人脐带间充质干细胞(hucMSCs-Exos)的外泌体被认为是最好的，因为它们促进增殖的能力更强，而且更快、更容易获得。
现有技术1：使用骨髓源性干细胞(BM-MSCs)的外泌体治疗哮喘
这项技术涉及使用骨髓源性干细胞(BM-MSCs)的外泌体来治疗哮喘。这种方法的基本原理是，BM-MSCs外泌的外泌体具有免疫调节和抗炎性质，它们可能对哮喘的治疗有益。
技术问题：
1.骨髓样本的获取对患者来说是一种入侵性操作，并且可能会带来疼痛和并发症。
2.BM-MSCs的来源(即供者)可能会对治疗效果产生影响，因为各个供者之间的细胞活力和功能可能存在差异。
3.BM-MSCs生成的外泌体可能含有不可预知的蛋白质和RNA分子，这可能会引发未知的副作用。
现有技术2：使用皮肤源性干细胞(ADSCs)的外泌体治疗哮喘
这项技术包括使用皮肤源性干细胞(ADSCs)的外泌体来治疗哮喘。这种方法的基本原理是，ADSCs的外泌体可以促进炎症后的修复，并可能有助于哮喘的治疗。
技术问题：
1.皮肤源性干细胞的获取需要进行皮肤活检，这是一种侵入性操作，可能会给患者带来疼痛和并发症，尤其是在慢性疾病患者中。
2.ADSCs的生物学性质可能会受到供者年龄、健康状况和生活方式的影响，这可能会影响到外泌体的质量和治疗效果。
3.尽管ADSCs的外泌体在一些初步的研究中显示出治疗潜力，但是对其具体作用机制和可能的副作用仍然需要进一步研究。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于间充质干细胞源性外泌体在难治性哮喘治疗中的应用。
本发明是这样实现的，一种基于间充质干细胞源性外泌体在哮喘治疗药物中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种所述基于间充质干细胞源性外泌体在哮喘治疗药物中的应用的验证方法，所述验证方法，包括以下步骤：
第一步，培养人脐带间充质细胞hucMSCs，并通过超离心提取其外泌体hucMSCs-Exos；
第二步，通过透射电镜TEM、纳米颗粒追踪器NTA、Westernblot和纳米流式细胞术NFCM进行验证；同时，采用PN21 C57bl/6小鼠建立慢性哮喘动物模型，按照公认的卵清蛋白OVA方案建立慢性哮喘动物模型；
第三步，在OVA暴露过程中，外泌体组小鼠连续注射hucMSCs-Exos，对照组小鼠注射DPBS，Sham组小鼠用相同体积的DPBS代替OVA；通过HE、Masson和PAS方法验证了所有动物气道的特异性变化；
第四步，用免疫荧光法检测小鼠肺组织中SMA-α、CC-10、ki67、SPC、Hopx的表达。
进一步，所述验证方法通过WB检测Akt/mTOR和RhoA/ROCK通路的表达变化；对hucMSCs-Exos进行了转录组测序。
进一步，所述验证方法的原代细胞培养，人脐带间充质干细胞hucMSCs采用改良的外植体方法进行分离和培养，用杜尔贝科磷酸盐缓冲盐清洗脐带，纵向切开，并切除动脉和静脉；然后，将软凝胶组织解剖成1～3mm3，并单独放置在6孔板上，加入改良培养基MEM-α，添加10％胎牛血清和青霉素/链霉素；将培养皿在37℃和5％CO的潮湿气氛中培养10～12天；在整个潜伏期中，定期添加补充的MEM-α，最终去除脐带组织；用培养基洗涤平板三次后，将塑料贴壁细胞菌落使用胰蛋白酶消化，并使用添加10％胎牛血清和青霉素/链霉素的MEM-α进行培养；在第3～5代时，hucMSCs在10层康宁细胞培养室中扩增。
进一步，所述验证方法的间细胞造血干细胞表面标记物的特征和分化能力，包括：在第5代，使用流式细胞术进行细胞表面表征，利用标记抗体建立的MSC标记物的表达，选择hucMSCs；具体来说，使用apc偶联的CD105、APC偶联的CD73、FITC偶联的CD90和PE偶联的CD44鉴定阳性标记，使用FITC偶联的CD11b、PE偶联的CD31鉴定阴性标记；流式细胞仪分析采用贝克曼库尔特细胞弯曲流式细胞仪，配备407nm、488nm和640nm激光器，以及CytExpert软件。
进一步，所述验证方法的外泌体Exos的命名、收获和分离，Exos指sEV直径40-150nm，密度1.18g/ml，和建立的表达包括TSG101，ALIX，CD9、CD63，CD81，在无血清培养基中培养48小时；获得Exos，一系列的微分离心步骤删除细胞，细胞碎片3000×g20 min，凋亡残余12000×g45 min，所有步骤确保在4℃环境CM然后使用超离心50.2Ti转子1.5h在120000×g4℃；收集沉淀，并转移到SW41 Ti转子，在120,000×g下再2小时℃；最后，轻轻弃去上清液，用200μL DPBS重悬沉淀。
进一步，所述验证方法的透射电镜TEM，将sEV制备的5μL样品吸附在碳涂层网格上1分钟，这些栅格通过暴露在辉光放电中30秒而形成亲水性；除去多余的液体，用一滴水清洗网格；再次去除多余的液体后，用1％醋酸铀酰染色15秒；用JEM-1400FLASH透射电子显微镜TEM检测吸附的Exos。
进一步，所述验证方法的纳米颗粒跟踪分析NTA，在纳米颗粒跟踪分析系统上，采用纳米颗粒跟踪分析NTA确定了MEx的大小和浓度分布，并进行分析；将样品装入泵浦，跟踪纳米粒子的布朗运动，同时根据Stokes-爱因斯坦方程计算纳米颗粒的粒径，根据跟踪的粒子数计算溶液中的粒子浓度；在分析前，将Exos样品用无囊泡的超纯水稀释。
进一步，所述验证方法的外泌体标记物的特征，首先对提取的外泌体进行Westernblot分析，CD81、CD63和TSG101作为阳性标记，GM130作为阴性标记，进一步区分蛋白质聚集物和外泌体，使用纳米颗粒流式细胞术来鉴定分离的外泌体的表面标记物，用NTA测定浓度后，将样品稀释至1×107粒子/mL在DPBS中；取100μL稀释样品，室温孵育，每种抗体pe偶联CD9、pe偶联CD63和apc偶联CD81保护5μL 45分钟；在培养过程中，采用间歇性摇晃进行彻底混合。使用的流式细胞仪是Cytoflex，选择了一个405/10的过滤器，事件率设置为高水平；选择散射信号检测参数VSSC-H，并将阈值参数设置为“高度”；使用0.1μm Millex-VV注射器过滤器单元，用1％次氯酸钠溶液彻底清洗仪器，用通过Millex-VV注射器过滤器过滤的超纯水冲洗系统，光路使用粒子珠进行校准进行校准；在检测到阳性信号后，收集并记录数据，在原样品中加入0.1％的Triton X-100，然后在室温下孵育1-2分钟；对样本进行重新分析，如果阳性信号随着背景信号的增加而消失，则表明存在具有膜性结构的外泌体，而不是蛋白质聚集物。
进一步，在每个组织块0.3cm×0.3cm中，加入500μL含有0.1％苯甲基磺酰氟的裂解缓冲液，将混合物均质化，收集裂解液，离心去除沉淀；随后，将30μg提取的蛋白质在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上分离，浓度范围为10-12％；将这些蛋白质电泳转移到0.45μm的PVDF膜上，并在含有0.5‰的Triton-100和5％脱脂奶粉的PBS中封闭1小时；将膜在4℃与一抗孵育过夜，包括单克隆、单克隆抗Akt抗体、单克隆抗pAkt抗体、单克隆抗mtoR抗体、单克隆抗pmTOR抗体、单克隆抗RONK1抗体、多克隆抗RhoA抗体、单克隆抗β-actin抗体，一抗孵育后，细胞膜与辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育；采用增强化学发光法检测蛋白表达。
结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
第一、本发明发现hucMSCs-Exos干预可有效改善哮喘肺损伤的核心特征，并明显降低支气管肺泡灌洗液中IL-6和TNF-α的水平。此外，它还降低了患有慢性哮喘母亲的后代对哮喘的易感性。与OVA组相比，Exos组CC10表达改善，而肺中Ki67表达降低。在子代中，与OVA组相比，PN1和PN4中Hopx而不是SPC的表达明显增加，但PN14中的表达差异无统计学意义，与WB的结果一致。与母体结果不同，母亲接受hucMSC-Exos的后代肺中CC10和Ki67的表达均低于对照组。此外，发现在OVA组中，PECAM-1、SMA-α、磷酸化的Rock1(p-ROCK1)和Caspase-8的表达均被激活，而hucMSCs-Exos可以缓解它们的表达。hucMSCs-Exos的RNA测序显示了几个与哮喘相关的miRNAs，它们可能在该疾病的外泌体治疗过程中发挥关键作用。
第二，脐带间充质干细胞外泌体可减轻气道重塑，改善哮喘症状。此外，hucMSCs-Exos可以降低哮喘母亲后代的哮喘易感性，可能是通过将相关miRNAs转移给胎儿，促进其肺发育，抑制哮喘过程中上皮细胞的异常增殖和坏死。在本发明中检测了hucMSCs-Exos在慢性哮喘小鼠中的作用，并进一步观察了在同一环境暴露条件下，后代的肺发育和肺结构的变化。假设，hucMSCs-Exos将哮喘转化为一种可治疗的疾病，并降低了哮喘母亲的后代对哮喘的易感性。
第三，本发明使用透射电镜(TEM)的验证方法，该方法可以提供直观的图像证据，展示外泌体的形状和大小。这种方法用于确认sEV样品的纯度和完整性，这是一种有效的验证方法，可以提高外泌体研究的准确性和可靠性。
本发明使用纳米颗粒跟踪分析(NTA)的验证方法，该方法可以准确地确定外泌体的大小和浓度分布。这种方法对于理解外泌体的功能，以及研究其在各种生理和病理过程中的作用至关重要。通过提供精确的分布和浓度数据，NTA能够提高研究结果的可靠性。
本发明使用外泌体标记物的特征的验证方法，包括使用Westernblot和纳米颗粒流式细胞术来鉴定外泌体的表面标记物。这种方法可以在分子水平上进一步区分蛋白质聚集物和外泌体，为更深入地研究外泌体的性质和功能提供了可能。此外，它还引入了一个检测阳性信号是否因为背景信号的增加而消失的步骤，这是一种有效的方式，可以进一步确认样本中存在的是具有膜性结构的外泌体，而不是蛋白质聚集物。
本发明在组织块中提取和分析蛋白质的方法。这种方法的显著优点在于它可以在更复杂的生物样本中，如组织块，进行外泌体相关蛋白质的分析，这对于理解这些蛋白质在组织或细胞中的具体功能和作用提供了可能。此外，这种方法还包括使用增强化学发光法来检测蛋白表达，这是一种灵敏且精确的方法，可以提供关于蛋白质表达水平的定量信息。
附图说明
图1是本发明实施例提供的基于间充质干细胞源性外泌体在哮喘治疗药物中的应用的验证方法流程图；
图2是本发明实施例提供的成功地提取并鉴定了hucMSCs-Exos示意图；A：用无FBS培养基培养后，收集细胞上清，超离心法提取外泌体。B：通过NTA检测颗粒大小和浓度。C：WB显示已建立的exos相关标记表达，四跨蛋白(CD63和CD81)，TSG101。外泌体免疫印迹检测GM130为阴性；D：透射电镜(TEM)图像显示异质的Exos形态(比例尺＝200nm,100nm)。E,F：采用Nanoflow对表面标记物进行识别。珠子用于校准机器，而DPBS和ddH2O作为对照，以及不含外泌体的抗体。记录好阳性信号后，每个样品中加入0.1％Triton-100再静置1～2min，阳性信号消失，背景信号增加；
图3是本发明实施例提供的hucMSCs-Exos改善OVA诱导的气道炎症示意图；A：ova致哮喘小鼠模型方案。B：各组病理染色。F：苏木精伊红(H&E)染色评分(HE评分)：HE染色后对气道周围炎症细胞浸润程度评分，评分范围为0～4分。G：马松三色染色：这种染色方法用于评估组织中胶原沉积。H：PAS(PeriodicAcid-Schiff)染色：PAS染色用于鉴定糖原、粘蛋白等富含碳水化合物的物质，PAS染色后对气道上皮杯状细胞化生程度进行评分，评分范围为0～4。与假手术组比较，OVA组3项评价指标均明显升高，Exos干预后均有所缓解(P<0.0001，*P<0.001，P<0.01，*P<0.05)。C、D、E：各组半胱氨酸的炎性因子。与假手术组比较，TNF-α、IL-6水平升高，且可通过hucMSCs-Exos降低TNF-α、IL-6水平(P<0.01，*P<0.05)；
图4是本发明实施例提供的humscs-exos通过抑制Rock1的磷酸化抑制气道上皮细胞的坏死下垂和异常增殖。A,B,C：IF法检测各组Caspase-8的表达和Rock1的磷酸化(p-ROCK1)。假手术组几乎检测不到Caspase-8，模型组(OVA+DPBS)表达量最高，Exos组表达量明显降低(*P<0.001，P<0.01)。同时，模型组P-rock1的表达均高于sham组和Exos组(P<0.01，*P<0.05)。D、E、F：IF法检测PECAM-1和SMA-α的表达。作为血管内皮标志物的PECAM-1在假手术组中表达最低，除血管内皮外极少见表达。暴露于OVA后，PECAM-1的表达升高，出现在肺血管-支气管间质组织中，humscs-exos干预可减轻但不能根除PECAM-1的表达(P<0.01)。与PECAM-1类似，模型组与假手术组相比，SMA-α表达上调，hucMSCs-Exos降低了升高部分(*P<0.001，P<0.01)。G、H、I：IF法观察各组CC-10、Ki67的表达情况。模型组Ki67的表达显著升高，且集中在异常增殖部位的气道亚区，而hucMSCs-Exos明显减轻Ki67的表达(P<0.01，*P<0.05)。模型组CC-10表达降低，Exos干预可部分升高(P<0.01，*P<0.05)；L：TEM观察到的超微结构(比例尺＝2μm,500nm)。模型组气道上皮和肺泡均可见明显的坏死性上睑垂，Exos组似乎有所缓解：蓝色箭头表示核周染色质聚集，怀疑核膜破裂，红色箭头表示线粒体肿胀，嵴消失，黄色箭头表示粗内质网扩张，绿色箭头表示板层体存在液泡。M：WB法检测Akt/mTOR和RhoA/ROCK1通路的表达变化。Akt和mTOR的磷酸化被hucMSCs-Exos激活，而RhoA/ROCK1被下调。
图5是本发明实施例提供的外泌体干预促进了母亲哮喘后代的肺部发育；A：ova诱导的母哮喘小鼠方案及其后代哮喘诱导方案。B：各模型小鼠子代P1、P4、P14的HE染色(比例尺＝100μm)。作为肺发育的标志，卵母组子代MLI在P1和P4较其他两组宽(P<0.01，*P<0.05)。C、D、E：IF法分别检测AT1和AT2细胞标志物Hopx和SPC的表达情况(比例尺＝50μm)。在PN1中，Exos组Hopx表达升高，OVA组SPC表达上调(*P<0.05)。在PN4中，OVA组Hopx的表达显著降低，Exos干预可改善Hopx的表达，而SPC则相反(P<0.01，*P<0.05)。在PN14中，OVA组的Hopx表达降低，且Exos无法逆转，而SPC在OVA组的表达高于sham组，且Exos干预进一步激活了SPC(P<0.01，*P<0.05)。F：病理染色和评价，如上所述(比例尺＝50μm)。与假手术组相比，OVA组HE评分、PAS评分、气道基底膜厚度3项评价指标均显著升高，Exos干预后差异有统计学意义(*P<0.001，P<0.01，*P<0.05)；
图6是本发明实施例提供的外泌体通过抑制RhoA/ROCK1途径干预母体哮喘抑制性坏死下垂和后代哮喘模型中的异常增殖。A,B,C：IF法检测各组Caspase-8的表达和Rock1的磷酸化(p-ROCK1)。通过ova诱导的Caspase-8在各组均被激活，可能表明坏死下垂参与了哮喘的发病机制。子代组中，模型组(OVA+DPBS)Caspase-8表达最高，Exos组表达明显降低(P<0.01)，与母代组趋势相似。与假手术组比较，模型组P-rock1表达升高(*P<0.05)。D、E、F：IF法检测PECAM-1和SMA-α的表达。在三组中，PECAM-1不仅可以在血管内皮中观察到，而且可以在血管内皮中观察到模型组均出现异常形态，表达量最高，Exos干预可使其减轻。与假手术组比较，与PECAM-1相似，SMA-α在模型组表达最高，Exos组表达最低(P<0.01，*P<0.05)。G、H、I：IF法观察各组CC-10、Ki67的表达情况。模型组Ki67的表达明显上调，且集中在异常增殖部位的气道亚区，而hucMSCs-Exos明显减轻Ki67的表达，与母组相同(*P<0.05)。而Exos组CC-10的表达进一步降低(*P<0.05)。L：Western blotting法检测RhoA/ROCK1通路的变化。RhoA及其下游的ROCK1可以通过hucMSCs-Exos干预下调；
图7是本发明实施例提供的hucMSCs-Exos可以传递与哮喘相关的有效mirna，发挥治疗作用；A：为了进一步研究hucMSCs-Exos治疗哮喘的可能机制，本发明对外泌体进行了转录组测序，并将结果与哮喘患者的测序数据进行了比较。本发明共鉴定出974个共有的mirna，并对这些共有的mirna进行了进一步的数据分析。接下来，本发明使用miEAA网站进行数据分析，然后选择FDR(Benjamini-Hochberg)调整作为p值调整范围。p值小于0.05为显著水平。B,C,D：GO分析。E,F,G：KEGG分析；
图8是本发明实施例提供的成功培养并鉴定了hucMSCs。A：原代细胞在第10天左右从脐带组织中爬出(比例尺＝200μm)。B：消化至第3代(比尺＝200μm)。C：成功鉴定成骨、脂肪生成和软骨生成(标尺＝100μm)。D～K：经同型抗体调整后，流式细胞术检测CD105、CD73、CD44、CD90为阳性，CD31为阴性；
图9是本发明实施例提供的母组BALF细胞类型及比例，随机选择了几个不同的视野，在400倍的放大显微镜下进行细胞计数。在每个字段中至少计数和分类200个单元格(如果单元格少于200个，则计数所有单元格)。中性粒细胞：与红细胞相比，中性粒细胞体积较大，细胞核呈分节状，胞质呈淡紫红色。淋巴细胞：比红细胞稍大，大而圆的细胞核呈深蓝紫色，占据细胞的大部分，少量的细胞质呈淡蓝色，细胞核一侧细胞质呈细线状延伸。巨噬细胞：大小约为10-30μm，形状不规则或圆形/椭圆形，细胞核偏心或位于中心，细胞质丰富，颜色从浅蓝色到灰红色不等，常呈灰红色或紫红色小颗粒。与假手术组比较，中性粒细胞和淋巴细胞增加，巨噬细胞减少。Exos干预可显著降低中性粒细胞比例(P<0.01，*P<0.05)。然而，在本发明的模型的半胱氨酸中未见嗜酸性粒细胞。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一、解释说明实施例。为了使本领域技术人员充分了解本发明如何具体实现，该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。
本发明实施例提供的基于间充质干细胞源性外泌体在哮喘治疗药物中的应用
如图，1所示，本发明实施例提供的基于间充质干细胞源性外泌体在哮喘治疗药物中的应用的验证方法，包括以下步骤：
S101：培养人脐带间充质细胞(hucMSCs)，并通过超离心提取其外泌体(hucMSCs-Exos)；
S102：通过透射电镜(TEM)、纳米颗粒追踪器(NTA)、Westernblot(WB)和纳米流式细胞术(NFCM)进行验证；同时，采用PN21 C57bl/6小鼠建立慢性哮喘动物模型，按照公认的鸡蛋清(OVA)方案建立慢性哮喘动物模型；
S103：在OVA暴露过程中，外泌体组小鼠连续注射hucMSCs-Exos，对照组小鼠注射DPBS，Sham组小鼠用相同体积的DPBS代替OVA；通过HE、Masson和PAS的方法验证了所有动物气道的特异性变化；
S104：用免疫荧光法检测小鼠肺组织中SMA-α、CC-10、ki67、SPC、Hopx的表达。
为了阐明hucMSCs-Exos治疗作用的可能机制，本发明通过WB检测了Akt/mTOR和RhoA/ROCK通路的表达变化。此外，本发明还对hucMSCs-Exos进行了转录组测序，以研究hucMSCs-Exos中调控哮喘过程的吞咽因子。
实施例1：
1.方法和材料
1.1研究和批准
人脐带来自出生时的健康足月婴儿(所有个人及其父母均知情同意参与本发明，并由四川大学华西第二大学医院医学研究伦理委员会批准，医学研究2022伦理批准No.290)。所有动物实验均经中国伦理委员会和华西第二大学医院动物中心批准，并按照伦理标准进行.
1.2原代细胞培养
人脐带间充质干细胞(hucMSCs)采用改良的外植体方法进行分离和培养，如前所述；总之，用杜尔贝科磷酸盐缓冲盐(DPBS，Invitrogen，MA，US)清洗脐带，纵向切开，并切除动脉和静脉。然后，将软凝胶组织解剖成小块(1～3mm3)，并单独放置在6孔板上，加入改良培养基-α(MEM-α，Invitrogen，MA，MS)，添加10％胎牛血清(FBS，Invitrogen，MA，US)和青霉素/链霉素。然后将培养皿在37℃和5％CO的潮湿气氛中培养10～12天；在整个潜伏期中，定期添加补充的MEM-α，最终去除脐带组织。用培养基洗涤平板三次后，将塑料贴壁细胞菌落胰蛋白酶化，并使用添加10％胎牛血清和青霉素/链霉素的MEM-α进行培养。在第3代～5时，hucMSCs在10层康宁细胞细胞培养室中扩增。值得注意的是，使用了多个脐带，每条脐带产生单个的间充质干细胞集落。每个独立的体内实验都使用了不同的Exos制剂。
1.3间细胞造血干细胞表面标记物的特征和分化能力
在第5代，使用流式细胞术进行细胞表面表征。用于细胞仪分析的抗体来自美国MA的Invitrogen。利用标记抗体建立的MSC标记物的表达，选择hucMSCs。具体来说，使用APC偶联的CD105、APC偶联的CD73、FITC偶联的CD90和PE偶联的CD44(Invitrogen，MA，US)鉴定阳性标记，使用FITC偶联的CD11b、PE偶联的CD31鉴定阴性标记(图8)。流式细胞仪分析采用贝克曼库尔特细胞弯曲流式细胞仪，配备407nm、488nm和640nm激光器，以及CytExpert软件(v5.0.3)。根据制造商的说明，分别使用成骨、脂肪生成分化试剂盒(Cyagen生物科学公司，CN)和软骨细胞分化试剂盒评估hucMSCs培养成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的分化潜力。
1.4外泌体(Exos)的命名、收获和分离
外泌体的分离和鉴定是按照国际细胞外囊泡协会(ISEV)在2018年细胞外囊泡研究最小信息(MISEV)中概述的指南进行的，Exos，指sEV直径约40-150nm，的密度约1.18g/ml，和建立的表达包括TSG101，ALIX，CD9、CD63，CD81和FLOT-1，在无血清培养基中培养48小时。获得Exos，一系列的微分离心步骤删除细胞(750×g10 min)，细胞碎片(3000×g20min)，凋亡残余(12000×g45min)，所有步骤都确保在4℃环境CM然后使用超离心50.2Ti转子1.5h在120000×g4℃.接下来，仔细收集沉淀，并转移到SW41 Ti转子，在120,000×g下再2小时℃.最后，轻轻弃去上清液，用200μL DPBS重悬沉淀。
1.5透射电镜(TEM)
为了评估Exos的形貌，将sEV制备的5μL样品吸附在碳涂层网格(电子显微镜科学，PA，US)上1分钟。这些栅格通过暴露在辉光放电中30秒而形成亲水性。除去多余的液体，用一滴水清洗网格。再次去除多余的液体后，用1％醋酸铀酰染色15秒。用JEM-1400FLASH透射电子显微镜(TEM)检测吸附的Exos.
1.6纳米颗粒跟踪分析(NTA)
在纳米颗粒跟踪分析系统(ZetaView、粒子Metrix、GER)上，采用纳米颗粒跟踪分析(NTA)确定了MEx的大小和浓度分布，并按照上述方法进行了分析；将样品装入泵浦，跟踪纳米粒子的布朗运动，同时根据Stokes-爱因斯坦方程计算纳米颗粒的粒径，根据跟踪的粒子数计算溶液中的粒子浓度。在分析前，将Exos样品用无囊泡的超纯水稀释.
1.7外泌体标记物的特征
根据传统的鉴定方法，本发明首先对提取的外泌体进行Westernblot(WB)分析。CD81(蛋白中国，CN)、CD63(蛋白中国，CN)和TSG101(蛋白中国，CN)作为阳性标记，GM130(CST，美国)作为阴性标记。为了进一步区分蛋白质聚集物和外泌体，本发明使用纳米颗粒流式细胞术来鉴定分离的外泌体的表面标记物。用NTA测定浓度后，将样品稀释至1×107粒子/mL在DPBS中。然后，取100μL稀释样品，室温孵育，每种抗体pe偶联CD9、pe偶联CD63和apc偶联CD81(Invitrogen，MA，US)保护5μL45分钟。在培养过程中，采用间歇性摇晃进行彻底混合。使用的流式细胞仪是Cytoflex(贝克曼库尔特)，选择了一个405/10的过滤器，事件率设置为高水平。选择散射信号检测参数VSSC-H，并将阈值参数设置为“高度”。使用0.1μmMillex-VV注射器过滤器单元(默克公司，美国)，用1％次氯酸钠溶液彻底清洗仪器，然后用通过Millex-VV注射器过滤器过滤的超纯水冲洗系统。光路使用粒子珠进行校准(ApogeeMix，UK)进行校准。在检测到阳性信号后，收集并记录数据。随后，在原样品中加入0.1％的Triton X-100，然后在室温下孵育1-2分钟。然后对样本进行重新分析，如果阳性信号随着背景信号的增加而消失，则表明存在具有膜性结构的外泌体，而不是蛋白质聚集物。
1.8西部布洛廷
在每个组织块(0.3cm×0.3cm)中，加入500μL含有0.1％苯甲基磺酰氟(PMSF，米利波尔，US)的裂解缓冲液(Solarbio，CN)。将混合物均质化，收集裂解液，离心去除沉淀。随后，将30μg提取的蛋白质在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上分离，浓度范围为10-12％。然后将这些蛋白质电泳转移到0.45μm的PVDF膜(美国)上，并在含有0.5‰的Triton-100(Solarbio，CN)和5％脱脂奶粉的PBS中封闭1小时。然后将膜在4℃与一抗孵育过夜，包括单克隆、单克隆抗Akt抗体(CST，美国)、单克隆抗pAkt抗体(CST，美国)、单克隆抗mtoR抗体(CST，美国)、单克隆抗pmTOR抗体(CST，美国)、单克隆抗RONK1抗体(CST，美国)、多克隆抗RhoA抗体(CST，美国)、单克隆抗β-actin抗体(Milipore，美国)。一抗孵育后，细胞膜与辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育(蛋白质蛋白集团，Inc.，美国)。最后，采用增强化学发光法(G：BOX Chemi XRQ，UK)检测蛋白表达。
1.9OVA诱导的哮喘模型
PN21雌性小鼠(C57bl/6)暴露于OVA致敏和刺激，如前所述：
实验1：小鼠(n＝6)分别给予2次50mg OVA腹腔注射(IP)，2.5％OVA雾化致敏3周，然后每周尾静脉注射hucMSCs-Exos一次(图3的A)。假手术组和模型组分别用DPBS替代OVA暴露和Exos干预。
实验2：小鼠(n＝3)腹腔注射3次50mg OVA(IP)致敏，2％OVA雾化4周，然后每周注射hucMSCs-Exos尾空注射1次。假手术组和模型组分别用DPBS替代OVA暴露和Exos干预。在那之后，这些雌性小鼠与健康的雄性小鼠交配。除了一只雌性老鼠在一周内受孕失败外，其他的老鼠都成功地生下了幼崽。用PN1、PN4和PN14观察肺发育，每组左侧幼鼠自PN21后暴露于OVA致敏和挑战(图5的A)。
1.10肺组织灌注、解剖及组织学检查
腹腔注射(IP)60mg/kg戊巴比妥麻醉后，经右心室(RV)在恒定压力下灌注PBS。小心地切除左肺，并在-80℃下保存。右肺用4％多聚甲醛(PFA)原位充气至15-20cmH2O的固定压力，然后在4％PFA中保存过夜。随后，将固定的肺组织转移到75％乙醇(EtOH)中，然后组织脱水器(Leica-ASP 6025，GER)脱水过夜。石蜡包埋，切片成四个不同的右肺叶。最后，将肺组织石蜡包埋进行切片。
1.11肺实质形态测量学和免疫荧光法
肺切片用苏木精和伊红(H&E)进行一般组织形态染色，Masson三色染色评估胶原沉积，周期性酸席夫染色(PAS)观察气道上皮细胞化生。使用奥林巴斯BX53显微镜(奥林巴斯，日本)在200×，400×下从5μm厚的肺切片中随机选择区域。使用在相同的放大倍数下获得的标准显微米图像进行图像校准。在分析中，故意避免使用大的气道和血管，以关注肺形态测量。为了测量平均线性截距(MLI)，在图像上覆盖一个间隔为58μm的平行线网格，并测量由牙槽壁截距定义的每个弦的长度。采用点计数法测定肺泡壁组织的体积密度(组织密度)。在每幅图像上叠加计算机生成的30×30网格，计数落在肺泡壁组织上的点，计算体积密度。为了评估HE和PAS评分，本发明评估炎症细胞浸润程度和发育不良至0～4级。
采用免疫荧光法(IF)检测特异性标记物的表达和定位。不久，新鲜的肺组织切片在二甲苯中脱石蜡并再水合。抗原与1×EDTA(CN)和阻塞5％驴血清，肺组织切片孵化主要抗体((Caspase-8，CST，美国)，(PECAM-1，Hopx和CC10，圣塔克鲁兹，美国)，(磷酸化岩石1，原，美国)，(Ki67和α-SMA，Abcam，英国)，美国)在4℃过夜之后，切片用3％PBST洗涤，与不同荧光通道的驴抗兔或小鼠二抗(抗原，美国)以及DAPI在室温黑暗中孵育1小时。随后，用3％PBST洗涤后，使用FV3000共聚焦显微镜(奥林巴斯，日本)观察并记录载玻片。为了提高每个蛋白表达的平均荧光强度(MFI)，本发明使用了FV软件。
1.12统计分析
使用GraphPad Prism 8.0.2软件(GraphPad软件，圣地亚哥，美国)进行统计分析。数据以三次独立实验的平均±标准差(SD)表示。为了评估两组间的差异，本发明采用了双侧学生t检验、双向方差分析和双向方差分析。采用皮尔逊相关系数分析来检验基因之间的相关性。P值<为0.05为差异有统计学意义。
二、应用实施例。为了证明本发明的技术方案的创造性和技术价值，该部分是对权利要求技术方案进行具体产品上或相关技术上的应用实施例。
三、实施例相关效果的证据。本发明实施例在研发或者使用过程中取得了一些积极效果，和现有技术相比的确具备很大的优势，下面内容结合试验过程的数据、图表等进行描述。
1结果
1.1成功提取并鉴定出hucMSCs-Exos。
为了更好地研究hucMSCs-Exos的功能，本发明首先成功地提取和培养了健康足月婴儿出生时去除脐带中的人脐带间充质干细胞(hucMSCs)。然后，通过检测hucMSCs的成骨、脂肪生成和软骨生成的分化鉴定，以及流式细胞术检测其阳性和阴性标记，其中阳性标记CD105、CD73、CD44、CD90和标记CD31均为阴性(图8)。
通过经典的超速离心法从肝细胞间充质干细胞中提取外泌体。新鲜hucMSCs-Exos的NTA和TEM显示，一个异质性的Exos群体的平均直径为150nm，证明了外泌体的典型形态特征(图2(B，D))。通过westorn印迹法，Exos相关标记CD63、CD81和TSG101表达，而GM130为阴性，这是一种在外泌体中未发现的高尔基体蛋白(图2的C)。为了进一步验证外泌体是膜结构，而不是蛋白聚集物，本发明采用纳米荧光技术检测了外泌体的典型标记物CD9、CD63和CD81。首先，确认这些标记物呈阳性，然后，在外泌体样本中加入0.1％的Triton-100。静置2分钟后，再次检查混合物，原始的阳性信号消失(图2的(E、F))。
1.2在OVA暴露期间，连续的hucMSCs-Exos干预明显改善了气道炎症细胞浸润和杯状细胞化生。
雌性小鼠自PN21以来经历了OVA致敏和攻毒阶段(图3的A)。为观察各组的病理特征，本发明分别检测HE评分、气道基底膜厚度和PAS评分。假组相比，炎症细胞浸润和气道上皮细胞模型组(OVA+DPBS)激活但严重，同样，TNF-α和IL-6在支气管肺泡灌洗液(BALF)增加(图3的B～E)，这也表明，哮喘小鼠模型是成功的。经hucMSCs-Exos干预后，检测到的所有这些特征均有明显改善，BALF中中性粒细胞和淋巴细胞的比例也有明显改善(图9)。
1.3外泌体干预通过抑制Rock1的磷酸化来抑制气道上皮细胞的坏死和异常增殖。
为了进一步研究hucMSCs-Exos干预ova诱导的哮喘的机制，本发明首先在TEM中观察了肺组织。有趣的是，与假手术组相比，本发明发现模型组的气道和肺泡上皮细胞均有坏死，而在Exos组中似乎有所缓解(图4的L)。因此，本发明通过免疫荧光法在共聚焦显微镜下观察到了这一现象。在sham组中，作为坏死的标志，caspase-8在气道上皮细胞和肺泡中均未见表达，但在模型组不同气道的异常增殖区明显增加(图4的A)。与TEM结果相似，Exos组casepase-8的异常激活降低，同时RhoA通路下游关键因子ROCK1的磷酸化水平下降，显示平均荧光强度(MFI)下降(图4的A～C)。
血小板内皮细胞粘附分子-1(PECAM-1)，又称CD31，是最常用的血管上皮细胞的生物标志物。同时，在淋巴细胞、巨噬细胞和中性粒细胞中均有特异性表达。在本发明中，本发明发现OVA暴露后PECAM-1不仅出现在肺血管上皮细胞中，而且出现在血管和支气管之间的肺间质组织中，提示OVA诱导哮喘的肺间质炎症，可通过hucMSCs-Exos干预缓解(图4的D，E)。为了更直观地了解外泌体是否能抑制气道上皮细胞的异常增殖，这是反复喘息甚至最终死亡的主要因素，本发明采用免疫荧光法检测了CC10、ki67和α-SMA的表达。正如本发明所预期的那样，与模型组相比，Exos组的ki67和α-SMA的MFI下降，而CC10则相反(图4的D、F和G～I)。此外，最明显的增殖区域是气道下的肺间质组织，hucMSCs-Exos干预也可抑制其增殖区域。
Akt/mTOR通路是促进细胞增殖的重要信号通路。为了弄清楚异常细胞增殖的抑制是否与之有关，本发明采用WB的方法检测了该通路。正如本发明所预期的那样，Akt和mTOR的磷酸化均被激活。同时，RhoA/ROCK1信号通路仍被下调(图M)。
1.4外泌体干预促进了早期阶段的肺发育，并降低了OVA诱发的母亲哮喘后代的哮喘易感性。
在哮喘的危险因素中，遗传因素一直被认为是诱发哮喘的关键原因。为了阐明hucMSCs-Exos是否会干扰这一过程，本发明收集了PN1、PN4诱导哮喘的后代，以及PN1、PN4-Exos的肺组织，PN21子代用来建立了另一个哮喘小鼠模型(图5的A)。
为了评估后代的肺泡形成的过程，这是肺发育的一个标志，本发明确定了所有实验组的MLI值。与sham组相比，PN1和PN4模型组的MLI明显增加，且也大于Exos组，差异有统计学意义(图5的B)。Hopx和SPC作为AT1和AT2的经典标志物，通常用于评价肺的发育。在本发明中，本发明发现模型组PN4和PN14模型组中Hopx的表达较假手术组明显降低。相反，在模型组中，SPC的表达量则有所增加。经雌性小鼠外泌体干预后，Hopx的表达增加，而SPC的表达降低(图5的C、5的D和图5的E)。接下来，本发明使用OVA建立自PN21以来的急性小鼠模型，并在最后一次手术后一天被处死。然后，本发明收集肺组织进行HE、masson和PAS染色。与假手术组相比，OVA组后代的HE评分、气道基底膜厚度和PAS评分均明显高于其他组，通过hucMSCs-Exos干预在母亲哮喘期均得到缓解(图5的F)。
1.5外泌体干预母亲哮喘，通过抑制RhoA/ROCK1通路，抑制后代哮喘模型中气道上皮细胞和肺血管内皮细胞的坏死和异常增殖。
为了进一步研究外泌体干预对母体哮喘后代影响的可能机制，本发明采用免疫荧光法检测了与之前模型一致的相关标记物。Caspase-8在所有OVA暴露小鼠中均被激活，主要聚集在气道下区，专门的坏死参与了OVA诱导哮喘的发病机制。与假手术组相比，OVA组中Caspase-8的表达量较高，而hucMSCs-Exos干预可降低这一表达量(图6的A，图6的B)。与母鼠相似，PECAM-1在母体OVA组中的表达较高，而在Exos组中下降，同时α-SMA的表达变化相同(图6的D、图6的E和图6的F)。此外，本发明发现母体OVA组子代肺血管内皮形态有明显变化。既往病理染色结果显示气道下和血管周围区明显异常增生，IF结果中PECAM-1标记物显示血管内皮发育不良，因此，本发明进一步检测了不同组肺组织中Ki67和CC10的表达。正如本发明所预期的那样，Ki67在母体OVA组中的表达在三组中最高，主要集中在亚气道空间，而CC10的表达可通过母体外泌体干预被明显抑制(图6的G、图6的H和图6的I)。
RhoA/ROCK作为一种著名的信号通路，诱导细胞骨架重组、细胞迁移和应激纤维形成，与内皮细胞通透性、组织收缩和生长等多种生理功能有关。Abedi F和他的同事们已经报道了15RhoA/ROCK信号通路的上调导致肺内皮细胞炎症、免疫细胞迁移、凋亡、凝血、收缩和细胞粘附的增加。在本发明的研究中，本发明发现RhoA/ROCK通路通过OVA模拟被激活，随后ROCK1磷酸化被激活，这在母体和子代OVA组中都可以通过hucMSCs-Exos被抑制。此外，外泌体干预也可以降低RhoA和ROCK1的表达(图6的A、图6的C和图6的J)。
1.6hucMSCs-Exos可传递与哮喘相关的有效miRNAs，发挥治疗作用。
虽然本发明得出的结论是，hucMSCs-Exos可以逆转哮喘的核心特征，
恢复肺结构，减少坏死和肺血管肌肉化，也可促进母亲哮喘后代肺发育的早期阶段，其中hucMSCs-Exos的深入分子机制尚不清楚。为了进一步挖掘治疗性的生物学信息，本发明通过转录组学研究对hucMSCs-Exos进行了测序。与发现的对照组相比，hucMSCs-Exos吞噬了大量的miRNAs，如miR-let7a-5p、miR-125a-5p等。接下来，本发明匹配了hucMSCs-Exos和哮喘患者中的两组不同的miRNA16，并发现hucMSCs-Exos包含974个参与哮喘发病机制的miRNAs(图7的A)。然后，本发明对这些数据进行了GO和KEGG分析，并富集为一些非常有用的途径，如“上皮细胞正向调控到间充质转化”、“mTOR信号通路”、“肌动蛋白细胞骨架调控”等(图7的B-图7的G)。
严重哮喘，也称为难治性或治疗难治性哮喘，是一种慢性呼吸道疾病，其特征是气道的气道炎症，它通常对标准的哮喘药物有耐药性，需要专门的管理方法。严重哮喘患者会经历频繁和严重的哮喘发作，肺功能下降，生活质量差；这些症状可能会使人身体虚弱，并对日常活动产生重大影响。管理严重的哮喘需要一个多维的方法，包括个性化的治疗计划，密切的监测，并经常使用先进的疗法，如生物药物，更糟糕的是，母亲的哮喘会影响后代的几个方面。遗传因素在哮喘的发病机制中起着关键作用；母体哮喘可影响胎儿的肺发育。研究表明，母亲的哮喘增加了儿童持续喘息和更严重的呼吸道症状的风险，盖奇·S和他的团队已经证实了这一点，妊娠期间哮喘控制不良可能导致胎儿的氧气和营养供应受限，可能导致后代肺结构和功能的改变，甚至最终发展为早产儿的支气管肺发育不良。此外，母亲的哮喘也可以增加儿童过敏致敏的可能性，促进了后代哮喘的发展。在本发明中证实了母亲哮喘对早期肺泡发育有抑制作用，在OVA暴露时，MLI更宽，AT1细胞成熟下降，肺结构更差。
随着干细胞治疗的发展，几项使用动物模型的临床前研究显示了良好的结果，表明干细胞移植可以改善肺功能，减少气道炎症，修复哮喘受损的肺组织。这些研究表明，干细胞可能具有免疫调节特性、组织修复和再生能力，另一方面，在涉及哮喘患者的临床试验中，早期研究表明，一些患者的肺功能得到改善，哮喘症状减轻，并减少了救援药物的使用。然而，基于干细胞的治疗仍然面临挑战，包括优化细胞传递方法，解决潜在的风险，如免疫排斥和致瘤性。然而，随着进一步的研究，“无细胞治疗”成为疾病治疗的一个里程碑。近年来，术语“细胞外囊泡”被认为是由脂质双分子层包围的细胞衍生颗粒的集体名称。这个术语包括两种主要类型的囊泡，即“外泌体”和“外泌体”，它们通过在细胞间转移生物活性分子，如蛋白质、脂质和核酸，在细胞间的通信中起着至关重要的作用，是细胞间通信的重要机制，在各种生理和病理过程中发挥了关键作用。对干细胞在肺发育中的研究表明，它们参与了分支形态发生、肺泡发生和肺血管发育等关键过程；在本发明中进一步证明，hucMSCs-Exos不仅可以显著减轻气道炎症细胞浸润和杯状细胞化生，还改善哮喘母亲的不良影响的后代，通过促进AT2细胞分化为AT1细胞和稳定肺结构时OVA暴露。岩石等；通过对小鼠进行的谱系追踪研究，阐明了SFTPC+AT2细胞在体内作为一个群体增殖并产生AT1细胞，提示AT2细胞具有作为肺泡干细胞的潜力。的研究结果显示，hucMSCs-Exos在母体哮喘期干预可以逆转子代PN1和PN4中AT1细胞的减少，可能恢复AT2细胞向AT1细胞受损分化途径，维持有效的气体交换；坏死是一种程序性细胞死亡的形式，不同于凋亡，凋亡是另一种众所周知的程序性细胞死亡形式，其特征是调节和炎症性细胞死亡过程，包括细胞肿胀、破裂和细胞内内容物的释放，气道上皮细胞在哮喘的发病机制中起着至关重要的作用。研究表明，气道上皮细胞的异常坏死可导致上皮屏障的损伤和破坏，促进炎症和气道高反应性，同时，与mTOR通路密切相关。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.使用间充质干细胞源性外泌体(MSC-Exos)作为哮喘治疗药物的主要成分，其中，该外泌体来源于人脐带间充质干细胞(hucMSCs)。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于,其验证方法包括：
-培养人脐带间充质细胞hucMSCs，利用超离心法提取hucMSCs产生的外泌体；
-利用透射电镜(TEM)、纳米颗粒追踪器(NTA)、Westernblot和纳米流式细胞术(NFCM)进行外泌体的形态、尺寸、浓度和蛋白质表达的验证；
-在OVA暴露过程中，对小鼠进行hucMSCs-Exos的连续注射治疗，并通过HE染色和Masson染色来验证气道的特异性变化；
-利用免疫荧光法检测小鼠肺组织中SMA-α、CC-10、ki67、SPC、Hopx的表达，以评估hucMSCs-Exos的治疗效果。
3.如权利要求2所述的验证方法，其特征在于,，该验证方法进一步包括利用Westernblot检测Akt/mTOR和RhoA/ROCK信号通路的表达变化，以及对hucMSCs-Exos进行转录组测序，用于解析其可能的分子机制。
4.如权利要求2所述的验证方法，其特征在于,，该验证方法的hucMSCs的培养采用改良的外植体法进行，包括用磷酸盐缓冲盐清洗脐带、纵向切开、去除动脉和静脉、将脐带组织切割成1～3mm3的块状放在6孔板上进行培养。
5.如权利要求2所述的验证方法，其特征在于,，该验证方法利用流式细胞术对第5代hucMSCs的表面标记物进行表征，并利用相关抗体对MSC标记物表达进行确认，以此鉴定hucMSCs的干细胞性质和分化能力。
6.如权利要求2所述的验证方法，其特征在于,，该验证方法的外泌体(指sEV，直径40-150nm，密度1.18g/ml)的命名、收获和分离，包括在无血清培养基中培养hucMSCs，然后通过连续的微分离心步骤收集外泌体。
7.如权利要求2所述的验证方法，其特征在于,，所述验证方法的透射电镜TEM，将sEV制备的5μL样品吸附在碳涂层网格上1分钟，栅格通过暴露在辉光放电中30秒而形成亲水性；除去多余的液体，用一滴水清洗网格；再次去除多余的液体后，用1％醋酸铀酰染色15秒；用JEM-1400FLASH透射电子显微镜TEM检测吸附的Exos。
8.如权利要求2所述的验证方法，其特征在于,，所述验证方法的纳米颗粒跟踪分析NTA，在纳米颗粒跟踪分析系统上，采用纳米颗粒跟踪分析NTA确定了MEx的大小和浓度分布，并进行分析；将样品装入泵浦，跟踪纳米粒子的布朗运动，同时根据Stokes-爱因斯坦方程计算纳米颗粒的粒径，根据跟踪的粒子数计算溶液中的粒子浓度；在分析前，将Exos样品用无囊泡的超纯水稀释。
9.如权利要求2所述的验证方法，其特征在于,，所述验证方法的外泌体标记物的特征，首先对提取的外泌体进行Westernblot分析，CD81、CD63和TSG101作为阳性标记，GM130作为阴性标记，进一步区分蛋白质聚集物和外泌体，使用纳米颗粒流式细胞术来鉴定分离的外泌体的表面标记物，用NTA测定浓度后，将样品稀释至1×107粒子/mL在DPBS中；取100μL稀释样品，室温孵育，每种抗体pe偶联CD9、pe偶联CD63和apc偶联CD81保护5μL 45分钟；在培养过程中，采用间歇性摇晃进行彻底混合。使用的流式细胞仪是Cytoflex，选择了一个405/10的过滤器，事件率设置为高水平；选择散射信号检测参数VSSC-H，并将阈值参数设置为“高度”；使用0.1μm Millex-VV注射器过滤器单元，用1％次氯酸钠溶液彻底清洗仪器，用通过Millex-VV注射器过滤器过滤的超纯水冲洗系统，光路使用粒子珠进行校准进行校准；在检测到阳性信号后，收集并记录数据，在原样品中加入0.1％的TritonX-100，然后在室温下孵育1-2分钟；对样本进行重新分析，如果阳性信号随着背景信号的增加而消失，则表明存在具有膜性结构的外泌体，而不是蛋白质聚集物。
10.如权利要求2所述的验证方法，其特征在于,，在每个组织块0.3cm×0.3cm中，加入500μL含有0.1％苯甲基磺酰氟的裂解缓冲液，将混合物均质化，收集裂解液，离心去除沉淀；随后，将30μg提取的蛋白质在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上分离，浓度范围为10-12％；将这些蛋白质电泳转移到0.45μm的PVDF膜上，并在含有0.5‰的Triton-100和5％脱脂奶粉的PBS中封闭1小时；
将膜在4℃与一抗孵育过夜，包括单克隆、单克隆抗Akt抗体、单克隆抗pAkt抗体、单克隆抗mtoR抗体、单克隆抗pmTOR抗体、单克隆抗ROCK1抗体、多克隆抗RhoA抗体、单克隆抗β-actin抗体，一抗孵育后，细胞膜与辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育；采用增强化学发光法检测蛋白表达。
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