CN114569722B - 抑制血小板焦亡的试剂在制备预防和/或治疗脓毒症的药物中的用途 - Google Patents

抑制血小板焦亡的试剂在制备预防和/或治疗脓毒症的药物中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了抑制血小板焦亡的试剂在制备预防和/或治疗脓毒症的药物中的用途，其中，所述脓毒症为严重脓毒症或脓毒性休克。在本发明中，发明人首次发现了严重脓毒症与血小板焦亡的密切关联性，揭示了GSDMD依赖的血小板焦亡的病理过程，同时发现血小板焦亡是基于血浆中异常增加的S100A8/A9通过上调TLR4信号通路诱导产生，从而对于严重脓毒症针对性治疗靶点的开发提供了理论依据。而且，本发明成功构建得到特异性GSDMD敲除的血小板和TLR4敲除血小板，并通过血小板置换或输注等方式证实了两者对于严重脓毒症的治疗效果，为严重脓毒症的过度炎症反应和输注血小板提供了新的治疗策略。

Description

抑制血小板焦亡的试剂在制备预防和/或治疗脓毒症的药物 中的用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及抑制血小板焦亡的试剂在制备预防和/或治疗脓毒症的药物中的用途。
背景技术
脓毒症(Sepsis)是指由感染引起的全身炎症反应综合征，是导致全球范围内儿童死亡的主要病因之一，对于该病的治疗往往会对患者家庭带来严重的经济负担，因此，脓毒症的预防和早期治疗对于患者家庭具有极为重要的意义。
相关技术研究表明，全球范围内脓毒症住院致死率约为12.1％，其中，脓毒症休克致死率达到32.3％。虽然近年来，全球医疗水平和大众生活水平在不断的提高，尤其是对于婴幼儿的健康与疾病治疗关注度也在不断上升，但在实际临床实践中，儿童重症监护室中高致死率的脓毒症病因和机制仍尚未完全清楚。目前对于脓毒症的临床治疗大多采用抗生素和对症支持治疗，但效果有限且容易病程加重，这不仅会给患者家庭带来严重的经济负担，也对患者家属带来了极大的心理恐慌，不利于疾病的进一步治疗。因此，深入探索脓毒症的发病机制，寻找新的防治靶点，对诊断和防治脓毒症具有重要的科学意义和临床价值。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出抑制血小板焦亡的试剂在制备预防和/或治疗脓毒症的药物中的用途。发明人利用血小板特异性GSDMD敲除小鼠验证了严重脓毒症中存在GSDMD依赖的血小板焦亡病理过程，同时发现严重脓毒症的血浆中异常增加的S100A8/A9通过上调TLR4/NLRP3/Caspase 1/GSDMD信号通路诱导血小板焦亡，并释放IL-1β等促进炎症因子风暴加剧炎症反应，因此揭示了抑制血小板焦亡的试剂在治疗或辅助治疗严重脓毒症中的可行性。
本发明的第一个方面，提供抑制血小板焦亡的试剂在制备预防和/或治疗脓毒症的药物中的应用。
在脓毒症发生发展过程中，涉及到多种发病机制包括炎症网络效应，免疫功能失调，血小板功能异常和基因多态性等，其仅仅只关注于免疫细胞的功能失调，而并未发觉其他关键致死因素如血小板减少及其调控炎症反应的系统。在本发明中，发明人发现脓毒症患者的血小板降低会加重炎症反应，但在炎症减轻后伴随血小板恢复正常甚至出现高峰，同样，在以脓毒症小鼠模型为对象的试验中，也可以发现活化的血小板可通过分泌激活细胞因子等加剧炎症，同时放大的炎症反应会引起大量血小板破坏而造成不良循环反馈，而这一点着重出现在脓毒症患者病程发展到严重脓毒症至休克期间。在发展到严重脓毒症后，通常会出现血小板数量急剧减少，从而引起血小板的功能异常和持续耗损促使脓毒症的快速发展，最终导致全身器官衰竭，直接加剧了脓毒症死亡率的上升。因此，发现严重脓毒症导致血小板数量急剧减少的作用机制并能以此作为突破口对于未来有效治疗严重脓毒症具有十分重要的意义。
在本发明中，发明人发现严重脓毒症或脓毒性休克与血小板焦亡具有十分密切的相关性。细胞焦亡(Pyroptosis)又称细胞炎性坏死，是炎症或感染引起的一种的程序性细胞死亡，表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，导致细胞内容物的释放进而激活强烈的炎症反应。其与细胞凋亡(apoptosis)不同，细胞凋亡主要涉及凋亡Caspases家族3，7，9蛋白激活的非炎症的程序性细胞死亡，形态特征为核破裂，质膜起泡，细胞皱缩，有凋亡小体形成。目前，相关技术中尚未公开过血小板焦亡是否是基于某种特定的病理过程，也并未指出其在脓毒症中的病理作用。
在本发明的一些实施方式中，所述脓毒症为轻度脓毒症、中度脓毒症、严重脓毒症、脓毒性休克；在本发明的一些优选实施方式中，所述治疗包括辅助治疗。
在本发明的一些实施方式中，所述脓毒症为严重脓毒症或脓毒性休克。
发明人通过试验验证，发现严重脓毒症(包括脓毒性休克)在病理机制上区别于轻度脓毒症，除血小板数量显著降低外，其在促炎细胞因子水平和血小板参数上均显著高于轻度脓毒症患者和正常人，且一般脓毒症的常规治疗手段(例如血小板输注等)无法有效治疗严重脓毒症(包括脓毒性休克)，甚至当给与严重脓毒症伴血小板减少的患者输注正常外源性的血小板可能无益于甚至某些情况下反而可能会加重患者的病程进展。
在本发明的一些优选实施方式中，所述严重脓毒症或脓毒性休克具有如下(1)～(3)任一项中的特征：(1)出现持续性血小板减少并出血，输注正常外源性血小板无法治愈；(2)出现持续性血小板死亡，和/或细胞具有细胞焦亡特征；(3)具有脓毒症临床表现，且出现炎症因子风暴或过度炎症反应症状。
在本发明的一些优选实施方式中，所述抑制血小板焦亡的试剂选自如下(1)～(3)中的一项或多项：(1)含有干扰或阻断血小板中TLR4-NLRP3-ASC-Caspase 1-GSDMD信号通路的试剂，所述试剂包括抑制或下调血小板中TLR4表达的试剂、抑制或下调血小板中NLRP3表达的试剂、抑制或下调血小板中ASC表达的试剂、抑制或下调血小板中Caspase 1活性的试剂、抑制或下调GSDMD表达的试剂中的一种或一种以上的组合；(2)含有抑制或下调血浆中异质二聚体S100A8/A9表达的试剂；(3)无或低表达TLR4-NLRP3-ASC-Caspase1-GSDMD信号通路中的物质的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物，包括无或低表达TLR4的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物、无或低表达NLRP3的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物、无或低表达ASC表达的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物、无或低表达Caspase 1的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物、无或低表达GSDMD的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物中的一种或一种以上的组合。
在本发明的一些优选实施方式中，所述抑制血小板焦亡的试剂选自如(1)～(6)任一项中的试剂：(1)含有抑制或下调血小板GSDMD表达的物质的试剂；(2)含有抑制或下调血浆中S100A8/A9表达的物质的试剂；(3)含有抑制或下调血小板TLR4表达的物质的试剂；(4)含有干扰或阻断血小板TLR4信号通路的物质的试剂；(5)无表达或低表达GSDMD的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物；(6)无表达或低表达TLR4的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物。
在本发明中，发明人发现S100A8/A9作为一种关键诱发因子与血小板焦亡有着极为密切的关联性，从而对于严重脓毒症的治疗也有着极为重要的影响。S100A8和S100A9是属于S100家族的Ca2+结合蛋白，主要表达于免疫细胞如中性粒细胞和单核细胞，二者在体内通常以异质二聚体(S100A8/A9)的形式存在，进一步与Toll样受体4(TLR4)结合，激活下游炎症信号通路。在本发明中，发明人发现脓毒症早期血浆内高水平的S100A8/A9与严重脓毒症(包括脓毒性休克)患者的死亡率增高密切相关。此外，S100A8/A9是TLR4的内源性激活因子，涉及调控脓毒症病理过程中炎症的级联反应，而本发明正是首次发现了S100A8/A9与血小板在脓毒症病情进展中的相互作用，从而得到了有效治疗严重脓毒症的开拓性思路。
在本发明中，发明人还发现了TLR4信号通路与脓毒症的关系。发明人发现，细胞焦亡是通过激活细胞TLR4信号通路，启动NLRP3炎症小体及其下游信号通路的，说明TLR4参与调控细胞焦亡，从而使发明人明确了参与调控S100A8/A9诱导血小板焦亡的可能机制包括：S100A8/A9与血小板的TLR4结合、S100A8/A9促进血小板中线粒体ROS生成、激活ROS/NLRP3经典焦亡信号通路等。
在本发明的一些实施例中，所述抑制血小板焦亡的试剂包括如(1)～(3)中的试剂的至少一种或两种或三种：(1)含有通过改造血小板GSDMD表达的物质的试剂；(2)含有抑制或下调血浆中S100A8/A9表达的物质的试剂；(3)含有抑制或下调血小板TRL4表达的物质的试剂；
在本发明的一些实施例中，所述抑制血小板焦亡的试剂包括如(1)～(2)中的试剂的至少一种或两种：(1)无表达或低表达GSDMD的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物；(2)无表达或低表达TLR4的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物。
在本发明的一些实施例中，所述抑制血小板焦亡的试剂包括如(1)～(2)中的试剂的至少一种或两种：(1)含有通过改造血小板GSDMD表达的物质的试剂；(2)无表达或低表达GSDMD的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物；
在本发明的一些实施例中，所述抑制血小板焦亡的试剂包括如(1)～(3)中的试剂的至少一种或两种：(1)含有抑制或下调血小板TRL4表达的物质的试剂；(2)含有干扰或阻断TLR4信号通路的物质的试剂；(3)无表达或低表达TLR4的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物。
在本发明的一些实施例中，所述抑制血小板焦亡的试剂包括如(1)～(2)中的试剂的至少一种或两种：(1)含有抑制或下调血小板TRL4表达的物质的试剂；(2)无表达或低表达TLR4的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物。
在本发明的一些实施例中，所述抑制血小板焦亡的试剂包括如(1)～(3)中的试剂的至少一种或两种或三种：(1)含有通过改造血小板GSDMD表达的物质的试剂；(2)含有抑制或下调血浆中S100A8/A9表达的物质的试剂；(3)含有抑制或下调血小板TRL4表达的物质的试剂。
在本发明的一些实施例中，所述抑制血小板焦亡的试剂包括含有通过改造血小板GSDMD表达而包装的物质的试剂。
在本发明的一些实施例中，所述抑制血小板焦亡的试剂包括含有抑制或下调血浆中S100A8/A9表达的物质的试剂。
在本发明的一些实施例中，所述抑制血小板焦亡的试剂包括含有抑制或下调血小板TRL4表达的物质的试剂。
在本发明的一些实施例中，所述抑制血小板焦亡的试剂包括含有干扰或阻断TLR4信号通路的物质的试剂。
在本发明的一些实施例中，所述抑制血小板焦亡的试剂包括无表达或低表达GSDMD的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物。
在本发明的一些实施例中，所述抑制血小板焦亡的试剂包括无表达或低表达TLR4的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物。
在本发明的一些实施方式中，所述含有抑制或下调血小板GSDMD表达的物质的试剂包括血小板GSDMD抑制剂、抑制或下调血小板GSDMD表达的RNA干扰物中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述含有抑制或下调血浆中S100A8/A9表达的物质的试剂包括血浆中S100A8/A9抑制剂、抑制或下调血浆中S100A8/A9表达的RNA干扰物中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述含有抑制或下调血小板TRL4表达的物质的试剂包括血小板TRL4抑制剂、抑制或下调血小板TRL4表达的RNA干扰物中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述含有干扰或阻断TLR4信号通路的物质的试剂包括Resatorvid(TAK-242)、雷帕霉素中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述预防脓毒症的药物包括预防脓毒症的制剂、组合物或血液制品。
在本发明的一些实施方式中，所述血液制品包括血小板和/或其药学上可接受的输注替代物。
在本发明的一些实施方式中，所述输注替代物包括人造血小板替代物、重组凝血因子、纤维蛋白原和血小板生成素模拟物中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述输注替代物均为人源性输注替代物。
本发明的第二个方面，提供一种血液制品，所述血液制品中含有敲除或抑制TLR4-NLRP3-ASC-Caspase 1-GSDMD信号通路中的物质的血小板。
在本发明的一些实施方式中，所述血小板选自GSDMD敲除的血小板、TLR4敲除的血小板、NLRP3敲除的血小板、ASC敲除的血小板、Caspase 1敲除的血小板中的一种或一种以上的组合。
本发明的第三个方面，提供一种血液制品在制备预防和/或治疗血小板焦亡导致的疾病的药物中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述脓毒症为轻度脓毒症、中度脓毒症、严重脓毒症、脓毒性休克；在本发明的一些优选实施方式中，所述治疗包括辅助治疗。
在本发明的一些实施方式中，所述脓毒症为严重脓毒症或脓毒性休克。
在本发明的一些优选实施方式中，所述严重脓毒症或脓毒性休克具有如下(1)～(3)任一项中的特征：(1)出现持续性血小板减少并出血，输注正常外源性血小板无法治愈；(2)出现持续性血小板死亡，和/或细胞具有细胞焦亡特征；(3)具有脓毒症临床表现，且出现炎症因子风暴或过度炎症反应症状。
在本发明的一些实施方式中，所述血液制品中含有敲除或抑制TLR4-NLRP3-ASC-Caspase 1-GSDMD信号通路中的物质的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物。
在本发明的一些实施方式中，所述血小板选自GSDMD敲除的血小板、TLR4敲除的血小板、NLRP3敲除的血小板、ASC敲除的血小板、Caspase 1敲除的血小板中的一种或一种以上的组合。
在本发明的一些实施方式中，所述输注替代物包括人造血小板替代物、重组凝血因子、纤维蛋白原和血小板生成素模拟物中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述输注替代物均为人源性输注替代物。
在本发明的一些实施方式中，所述血液制品的使用方法为全身性血小板输注或替换。
本发明的第四方面，提供一种制剂或组合物，所述制剂或组合物包括抑制血小板焦亡的试剂。
在本发明的一些实施方式中，所述制剂或组合物用于预防/治疗/辅助治疗脓毒症。
在本发明的一些实施方式中，所述脓毒症为严重脓毒症或脓毒性休克。
在本发明的一些实施方式中，所述制剂或组合物还包括药学上可接受的载体。
在本发明中，“药学上可接受的载体”是指这样一类化合物、材料、组合物、媒介物等，其在合理的医学判断范围内适合用于与人和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应或者其它问题或并发症。例如液体或固体填充剂、稀释剂、稀释剂等，与制剂或组合物中的其它成分相容并且对患者无害。
在本发明的一些实施方式中，所述药物组合物配置成液体剂型或固体剂型，所述液体剂型选自注射剂、混悬剂、口服液；所述固体剂型选自片剂、胶囊剂、散剂、冻干剂、安瓿、栓剂。在本发明的一些实施方式中，所述药物组合物的剂型所适用的对象为婴幼儿、儿童、青少年、成人或老人，更优选为婴幼儿和儿童。
在本发明的一些实施方式中，所述制剂或组合物可以是血液制品。在本发明的一些实施方式中，所述血液制品包括血小板和/或其药学上可接受的输注替代物。
在本发明的一些实施方式中，所述输注替代物包括人造血小板替代物、重组凝血因子、纤维蛋白原和血小板生成素模拟物中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述输注替代物均为人源性输注替代物。
在本发明的一些优选实施方式中，所述抑制血小板焦亡的试剂选自如下(1)～(3)中的一项或多项：(1)含有干扰或阻断血小板中TLR4-NLRP3-ASC-Caspase 1-GSDMD信号通路的试剂，所述试剂包括抑制或下调血小板中TLR4表达的试剂、抑制或下调血小板中NLRP3表达的试剂、抑制或下调血小板中ASC表达的试剂、抑制或下调血小板中Caspase 1活性的试剂、抑制或下调GSDMD表达的试剂中的一种或一种以上的组合；(2)含有抑制或下调血浆中异质二聚体S100A8/A9表达的试剂；(3)无或低表达TLR4-NLRP3-ASC-Caspase1-GSDMD信号通路中的物质的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物，包括无或低表达TLR4的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物、无或低表达NLRP3的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物、无或低表达ASC表达的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物、无或低表达Caspase 1的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物、无或低表达GSDMD的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物中的一种或一种以上的组合。
在本发明的一些实施方式中，所述抑制血小板焦亡的试剂包括如下(1)～(6)任一项中的试剂：(1)含有抑制或下调血小板GSDMD表达的物质的试剂；(2)含有抑制或下调血浆中S100A8/A9表达的物质的试剂；(3)含有抑制或下调血小板TLR4表达的物质的试剂；(4)含有干扰或阻断血小板TLR4信号通路的物质的试剂；(5)无表达或低表达GSDMD的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物；(6)无表达或低表达TLR4的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物。
在本发明的一些实施例中，所述抑制血小板焦亡的试剂包括如(1)～(3)中的试剂的至少一种或两种或三种：(1)含有通过改造血小板GSDMD表达的物质的试剂；(2)含有抑制或下调血浆中S100A8/A9表达的物质的试剂；(3)含有抑制或下调血小板TRL4表达的物质的试剂；
在本发明的一些实施例中，所述抑制血小板焦亡的试剂包括如(1)～(2)中的试剂的至少一种或两种：(1)无表达或低表达GSDMD的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物；(2)无表达或低表达TLR4的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物。
在本发明的一些实施例中，所述抑制血小板焦亡的试剂包括如(1)～(2)中的试剂的至少一种或两种：(1)含有通过改造血小板GSDMD表达的物质的试剂；(2)无表达或低表达GSDMD的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物；
在本发明的一些实施例中，所述抑制血小板焦亡的试剂包括如(1)～(3)中的试剂的至少一种或两种：(1)含有抑制或下调血小板TRL4表达的物质的试剂；(2)含有干扰或阻断TLR4信号通路的物质的试剂；(3)无表达或低表达TLR4的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物。
在本发明的一些实施例中，所述抑制血小板焦亡的试剂包括如(1)～(2)中的试剂的至少一种或两种：(1)含有抑制或下调血小板TRL4表达的物质的试剂；(2)无表达或低表达TLR4的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物。
在本发明的一些实施例中，所述抑制血小板焦亡的试剂包括如(1)～(3)中的试剂的至少一种或两种或三种：(1)含有通过改造血小板GSDMD表达的物质的试剂；(2)含有抑制或下调血浆中S100A8/A9表达的物质的试剂；(3)含有抑制或下调血小板TRL4表达的物质的试剂。
在本发明的一些实施例中，所述抑制血小板焦亡的试剂包括含有通过改造血小板GSDMD表达而包装的物质的试剂。
在本发明的一些实施例中，所述抑制血小板焦亡的试剂包括含有抑制或下调血浆中S100A8/A9表达的物质的试剂。
在本发明的一些实施例中，所述抑制血小板焦亡的试剂包括含有抑制或下调血小板TRL4表达的物质的试剂。
在本发明的一些实施例中，所述抑制血小板焦亡的试剂包括含有干扰或阻断TLR4信号通路的物质的试剂。
在本发明的一些实施例中，所述抑制血小板焦亡的试剂包括无表达或低表达GSDMD的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物。
在本发明的一些实施例中，所述抑制血小板焦亡的试剂包括无表达或低表达TLR4的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物。
在本发明的一些实施方式中，所述含有抑制或下调血小板GSDMD表达的物质的试剂包括血小板GSDMD抑制剂、抑制或下调血小板GSDMD表达的RNA干扰物中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述含有抑制或下调血浆中S100A8/A9表达的物质的试剂包括血浆中S100A8/A9抑制剂、抑制或下调血浆中S100A8/A9表达的RNA干扰物中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述含有抑制或下调血小板TRL4表达的物质的试剂包括血小板TRL4抑制剂、抑制或下调血小板TRL4表达的RNA干扰物中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述含有干扰或阻断TLR4信号通路的物质的试剂包括Resatorvid(TAK-242)、雷帕霉素中的至少一种。
本发明的第五个方面，提供一种血液制品。在本发明的一些实施方式中，所述血液制品包括血小板和/或其药学上可接受的输注替代物。
在本发明的一些实施方式中，所述血液制品中含有以下物质中的至少一种：GSDMD敲除的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物、S100A8/A9敲除的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物、TLR4敲除的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物。
在本发明的一些实施方式中，所述血液制品中含有以下物质中的至少一种：GSDMD敲除的血小板、TLR4敲除的血小板。
在本发明的一些实施方式中，所述血液制品中含有以下物质中的至少一种：GSDMD敲除的血小板、TLR4敲除的血小板。
在本发明的一些实施方式中，所述血液制品为：GSDMD敲除的血小板和TLR4敲除的血小板。
在本发明的一些实施方式中，所述血液制品中为GSDMD敲除的血小板。
在本发明的一些实施方式中，所述血液制品为TLR4敲除的血小板。
在本发明的一些实施方式中，所述血液制品中含有以下物质中的至少一种：GSDMD敲低的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物、TLR4敲低的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物。
在本发明的一些实施方式中，所述血液制品中含有以下物质中的至少一种：GSDMD敲低的血小板、TLR4敲低的血小板。
在本发明的一些实施方式中，所述血液制品中含有以下物质中的至少一种：GSDMD敲低的血小板、TLR4敲低的血小板。
在本发明的一些实施方式中，所述血液制品为：GSDMD敲低的血小板和TLR4敲低的血小板。
在本发明的一些实施方式中，所述血液制品中为GSDMD敲低的血小板。
在本发明的一些实施方式中，所述血液制品为TLR4敲低的血小板。
在本发明的一些实施方式中，所述血液制品用于预防/治疗/辅助治疗脓毒症。
在本发明的一些实施方式中，所述脓毒症为严重脓毒症或脓毒性休克。
在本发明的一些实施方式中，所述输注替代物包括人造血小板替代物、重组凝血因子、纤维蛋白原和血小板生成素模拟物中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述输注替代物均为人源性输注替代物。
现有技术中均不建议根据血小板水平进行预防性血小板输注，对于不伴有血小板减少性多器官衰竭的患者，尤其不建议使用血浆置换的方式进行治疗，而对于伴有血小板减少性多器官衰竭的患者，目前并无有效的推荐治疗手段(参考《拯救脓症运动儿童脓毒性休克和脓毒症相关器官功能障碍国际指南》)。
而在本发明中，发明人打破固有思路，基于其发现，采用基因工程对输注用血小板进行改造，使其能够在不影响输注安全性的前提下优先缓解脓毒症病人的病情恶化，尤其是发明人所提供的靶向血小板GSDMD/TRL4敲除的血小板更是显示出了极佳的治疗效果，为脓毒症提供了一种新的潜在辅助治疗手法，有效阻断GSDMD依赖的血小板焦亡引发的炎症风暴，防止严重脓毒症在临床上的急性恶化，给广大脓毒症患者的健康带来福音。
本发明的第六个方面，提供本发明第三个方面所述的制剂或组合物和本发明第五个方面所述的血液制品在制备治疗或辅助治疗血小板焦亡的药物中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述血液制品的使用方法为全身性输注或替换。
在本发明中，发明人通过全身性血小板置换，在脓毒症小鼠模型上验证了上述含有GSDMD敲除血小板或TLR4敲除血小板对于严重脓毒症治疗的可行性，其中，脓毒症小鼠输注无GSDMD敲除血小板的IL-1β，TNFα和IL-6含量分别比脓毒症小鼠输注生理盐水降低11％，3％及23％，然而脓毒症小鼠输注GSDMD敲除血小板的IL-1β，TNFα和IL-6含量则分别比脓毒症小鼠输注生理盐水降低59％，42％及52％，且脓毒症小鼠输注GSDMD敲除的血小板后存活率达到了60％。脓毒症小鼠输注正常血小板后的IL-1β，TNFα和IL-6含量分别比脓毒症小鼠输注生理盐水降低27％，27％及10％，脓毒症小鼠输注TLR4敲除血小板的IL-1β，TNFα和IL-6含量则分别比脓毒症小鼠输注生理盐水降低43％，38％及42％，且脓毒症小鼠输注TLR4敲除血小板后存活率达到了50％。
本发明的第七个方面，提供检测血小板数量的试剂在制备脓毒症诊断试剂中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述脓毒症诊断试剂用于区分轻度脓毒症和严重脓毒症。在本发明的一些实施方式中，所述脓毒症诊断试剂的使用方法为：
取脓毒症患者血样，检测血样中的血小板含量，以正常人血样为对照，当血样中的血小板含量与正常人血样存在显著差异时，判定受试者处于严重脓毒症；若否，则为轻度脓毒症。
发明人发现，虽然轻度脓毒症和严重脓毒症在表征上极为相似，但从本发明中的试验中发现轻度脓毒症和严重脓毒症存在着一个极为显著的参数差异——血小板数量及其参数。而且，发明人还发现，即便对于脓毒症患者输注血小板，严重脓毒症患者输注后只能短暂保持血小板水平，输注后次日又显著降低，且其数量差异与轻度脓毒症和正常存在显著性差异。
本发明的第八个方面，提供检测血小板焦亡相关蛋白的表达水平的试剂在制备脓毒症诊断试剂中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述脓毒症诊断试剂用于区分健康者、脓毒症。
在本发明的一些实施方式中，所述血小板焦亡相关蛋白包括血小板内的GSDMD蛋白、ASC蛋白、IL-1β、和TLR4蛋白中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述应用包括采用检测血小板内的GSDMD蛋白、ASC蛋白、IL-1β、和TLR4蛋白中的至少一种蛋白的表达水平的试剂来区分健康者、轻度脓毒症和严重脓毒症。
在本发明的一些实施方式中，所述应用包括：采用检测血小板内的GSDMD蛋白的表达水平的试剂、检测血浆中S100A8/A9蛋白表达水平的制剂、ASC蛋白、IL-1β、和检测血小板内TLR4蛋白表达水平的试剂，其中的任一种试剂或任意两种、三种、四种试剂或者任意五种试剂，或者任意的能同时检测其中一种或两种、三种、四种或五种蛋白水平的试剂，检测血小板内的五种蛋白中任意一种、两种、三种、四种或五种的表达水平，以此来区分健康者和脓毒症。
具体地，在一些实施方式中，与健康者相比，血小板的GSDMD蛋白的表达水平、血浆中S100A8/A9蛋白的表达水平、和/或血小板内TLR4蛋白的表达水平增加或显著增加，来判定其为脓毒症。
在本发明的一些实施方式中，所述脓毒症为严重脓毒症或脓毒性休克。
本发明的第九个方面，提供一种治疗或辅助治疗脓毒症的方法。
在本发明的一些实施方式中，治疗或辅助治疗浓度者的方法为使用药效有效量的抑制血小板焦亡的试剂/制剂/组合物。
在本发明的一些优选实施方式中，所述抑制血小板焦亡的试剂选自如下(1)～(3)中的一项或多项：(1)含有干扰或阻断血小板中TLR4-NLRP3-ASC-Caspase 1-GSDMD信号通路的试剂，所述试剂包括抑制或下调血小板中TLR4表达的试剂、抑制或下调血小板中NLRP3表达的试剂、抑制或下调血小板中ASC表达的试剂、抑制或下调血小板中Caspase 1活性的试剂、抑制或下调GSDMD表达的试剂中的一种或一种以上的组合；(2)含有抑制或下调血浆中异质二聚体S100A8/A9表达的试剂；(3)无或低表达TLR4-NLRP3-ASC-Caspase1-GSDMD信号通路中的物质的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物，包括无或低表达TLR4的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物、无或低表达NLRP3的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物、无或低表达ASC表达的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物、无或低表达Caspase 1的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物、无或低表达GSDMD的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物中的一种或一种以上的组合。
在本发明的一些实施方式中，所述抑制血小板焦亡的试剂/制剂/组合物包括如下(1)～(6)任一项中的试剂：(1)含有抑制或下调血小板GSDMD表达的物质的试剂；(2)含有抑制或下调血浆中S100A8/A9表达的物质的试剂；(3)含有抑制或下调血小板TLR4表达的物质的试剂；(4)含有干扰或阻断血小板TLR4信号通路的物质的试剂；(5)无表达或低表达GSDMD的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物；(6)无表达或低表达TLR4的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物。
在本发明的一些实施方式中，关于抑制血小板焦亡的试剂/制剂/组合物的方案的选择可以参见本发明上述第三方面的治疗或辅助治疗脓毒症应用中或参见本发明上述第四方面的制剂或组合物中的一些方案。
在本发明的一些实施方式中，所述脓毒症为严重脓毒症或脓毒性休克。
本发明的第十个方面，提供一种治疗或辅助治疗脓毒症的方法。
在本发明的一些实施方式中，所述抑制血小板焦亡的试剂/制剂/组合物包括如下(1)～(6)任一项中的试剂：(1)含有通过抑制或下调血小板GSDMD表达的物质的试剂；(2)含有抑制或下调血浆中S100A8/A9表达的物质的试剂；(3)含有抑制或下调血小板TLR4表达的物质的试剂；(4)含有干扰或阻断血小板TLR4信号通路的物质的试剂；(5)无表达或低表达GSDMD的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物；(6)无表达或低表达TLR4的血小板和/或其药学上可接受的输注替代物。
在本发明的一些实施方式中，关于抑制血小板焦亡的试剂/制剂/组合物的方案的选择可以参见本发明上述第一方面的预防和/或治疗脓毒症应用中或参见本发明上述第四方面的制剂或组合物中的一些方案。
在本发明的一些实施方式中，所述脓毒症为严重脓毒症或脓毒性休克。
本发明的第十一个方面，提供一种诊断脓毒症的方法。
在本发明的一些实施方式中，通过血样中的血小板含量来区分轻度脓毒症与重度脓毒症。具体地，当血样中的血小板含量与正常人血样存在显著差异时，判定受试者处于严重脓毒症；若否，则为轻度脓毒症。
在本发明的一些实施方式中，通过观察血小板焦亡的出现区分受试者属于正常或是脓毒症，观察血小板焦亡的出现可以包括：血小板出现肿胀破裂、或GSDMD蛋白、ASC蛋白、IL-1β、和TLR4蛋白中的至少一种蛋白的表达水平的增加。
本发明的有益效果是：
1.本发明首次发现了严重脓毒症与血小板焦亡的关联性，揭示了GSDMD依赖的血小板焦亡的病理过程，为脓毒症特别是严重脓毒症的治疗提供了思路。
2.本发明首次发现了严重脓毒症中血小板焦亡的作用机理，发现了血小板焦亡是基于血浆中异常增加的S100A8/A9通过上调TLR4/NLRP3信号通路诱导产生，从而进一步导致炎症因子风暴，从而对于严重脓毒症针对性治疗靶点的开发提供了理论依据。
3.本发明成功构建得到特异性GSDMD敲除的血小板和TLR4敲除血小板，并通过血小板置换或输注等方式证实了两者对于严重脓毒症的治疗效果，为严重脓毒症的过度炎症反应和输注血小板提供了新的治疗策略。
附图说明
图1为本发明实施例中的技术路线示意图。
图2为健康人和脓毒症患者血浆中白介素1-β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNFα)和白介素6(IL-6)的水平，其中，*代表与健康对照相比，#代表与脓毒症相比，*为p<0.05,**为p<0.01和***p<0.001，#同理。
图3为不同程度脓毒症患者中血小板参数统计图，严重脓毒症/脓毒症休克与健康对照/脓毒症相比，血小板平均体积、血小板平均宽度、大型血小板比率、血小板数量均呈显著性差异。
图4为严重脓毒症伴血小板减少的患者输注正常外源性血小板后血小板动态变化和凝血功能情况，其中，A为临床上输注2次正常血小板的一周动态情况(n＝3)；B为严重脓毒症伴血小板减少的患者输注正常外源性血小板24小时后D-二聚体含量(n＝14)；C和D为严重脓毒症伴血小板减少的患者输注正常外源性血小板24小时后血活酶时间(n＝18～20)。
图5为血小板蛋白质组学分析严重脓毒症(包括脓毒性休克)患者的血小板蛋白表达水平，其中，A为蛋白表达火山图，红色表示蛋白表达增加，蓝色表示减少，差异倍数中断>1.5和p值<0.05；B为脓毒症组GO聚集的生物学过程，KEGG或高表达的Reactome terms条形图；C为严重脓毒症和健康样本中与不同程序性细胞死亡信号通路相关的代表蛋白聚类图。
图6为脓毒症中血小板焦亡经典信号通路激活情况实物图，其中，A为由低倍和高倍透射电子显微镜下的脓毒症患者和健康对照者的血小板超微结构图，比例尺:1μm和500nm；B为脓毒症患者血小板炎症小体免疫荧光染色结果，绿色为CD41、红色为ASC，蓝色为NLRP3紫色表示重叠，比例尺：1μm和5μm。
图7为脓毒症中血小板焦亡经典信号通路激活情况及统计图，其中，A为脓毒症患者血小板中活化Caspase 1的表达及其定量情况，B为脓毒症患者血小板中GSDMD、GSDMD的N端和ASC蛋白的表达及其定量情况，C为健康对照者组和脓毒症组血小板来源的IL-1β的表达情况；*p<0.05,**p<0.01和***p<0.001；NS，没有统计学意义。
图8为本发明实施例中的血小板特异性GSDMDflox/flox PF4-Cre小鼠模型所用的打靶质粒图谱。
图9为各实验组小鼠经典血小板功能的对比统计图，A为各实验组小鼠的P选择素在膜上的易位情况，横坐标为P选择素的荧光强度，纵坐标为细胞数量，基线为基础状态无凝血酶；B为各实验组小鼠的剪尾凝血时间情况对比图，***p<0.001；NS，没有统计学意义。
图10为GSDMDflox/flox小鼠与GSDMDflox/floxPF4-Cre小鼠的血小板焦亡形态特征，其中，A为CLP诱导后的共聚焦显微镜持续时间成像及焦亡胀大细胞数统计，比例尺:5μm；B为高倍透射电子显微镜下有或无CLP诱导的血小板透射电镜图及焦亡形态特征况统计，标尺:500nm；*p<0.05,**p<0.01和***p<0.001；NS，没有统计学意义。
图11为输注外源性的GSDMD敲除血小板对脓毒症小鼠的血小板水平(A)、血浆中IL-1β水平(B)、TNFα水平(C)和IL-6水平(D)的影响，以及存活率对比图(E)，*p<0.05,**p<0.01和***p<0.001；NS，没有统计学意义。
图12为严重脓毒症患者血浆中异质二聚体S100A8/A9的水平，***p<0.001。
图13为脓毒症患者和健康对照者血浆中异质二聚体S100A8/A9水平与血小板焦亡相关性的散点图，r为相关系数。
图14为人重组S100A8/A9蛋白和其抑制剂帕奎莫德(Paquinimod)处理后的血小板免疫荧光染色结果，绿色为CD41、红色为ASC，蓝色为NLRP3，紫色表示重叠，比例尺：1μm和5μm。
图15为人重组S100A8/A9蛋白和其抑制剂帕奎莫德处理后的血小板中pro-Caspase 1、激活的Caspase 1、GSDMD和GSDMD N端蛋白的表达及其定量情况(n＝6)，***p<0.001。
图16为人重组S100A8/A9蛋白和其抑制剂帕奎莫德处理后的血小板的流式细胞术分析散点图和统计直方图，***p<0.001。
图17为输注外源性的TLR4敲除血小板对脓毒症小鼠的血小板水平(A)、血浆中IL-1β水平(B)、TNFα水平(C)和IL-6水平(D)的影响，以及存活率对比图(E)，*p<0.05,**p<0.01和***p<0.001；NS，没有统计学意义。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
在本发明中，“药学上可接受的”是指这样一类，其在合理的医学判断范围内适合用于与人和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应或者其它问题或并发症。“药学上可接受的载体”是指是指这样一类化合物、材料、组合物、媒介物等，其在合理的医学判断范围内适合用于与人和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应或者其它问题或并发症。例如液体或固体填充剂、稀释剂、稀释剂等，与制剂或组合物中的其它成分相容并且对患者无害。
在本发明中，术语“严重脓毒症(severe sepsis)”是指存在心血管功能障碍、急性呼吸窘迫综合征或≥2个器官系统功能障碍的脓毒症
在本发明中，术语“脓毒性休克(septic shock)”是在一小时内给予至少40mL/kg的液体复苏后，仍持续性存在心血管功能障碍的脓毒症。
作为本发明领域技术人员，应该理解的是，脓毒症作为全身性炎症反应综合征的一种特定形式，在本发明中适用于严重脓毒症或脓毒性休克的情形或试剂或应用，也应该适用于全身性炎症反应综合征的预防/治疗中。
术语“基因表达”是指基因中其编码信息首先转变为信使RNA，然后转变为蛋白质的过程；术语“无表达”或“低表达”则是指通过调控上述基因表达过程，使目的基因不表达或以低于正常表达量的形式表达。所述调控包括：转录调控、转录后调控、翻译调控和翻译后调控。
术语“抑制”是指在基因表达调控中使基因沉默(如knock down(敲低)和knockout(敲除))。
术语“下调”是指在基因表达调控中，调控结果为使基因表达水平降低者，也被称为负性调控。
“GSDMD”为gasdermin家族成员gasdermin D的简称，是一种细胞焦亡的关键效应蛋白。
“TLR4”为Toll样受体4(Toll-like receptor 4)的的简称，是一种I型跨膜蛋白，其由TLR4基因编码，并表达于包括单核细胞，巨嗜细胞在内的多种组织细胞中，可以识别革兰氏阴性细菌的脂多糖，并通过NF-κB或JNK/SAPK途径启动细胞内的信号转导。
“S100A8/A9”是指S100A8/A9异质二聚体。S100A8/A9异质二聚体由大量存在于中性粒细胞胞质中的钙结合蛋白S100A8和S100A9结合得到，S100A8和S100A9蛋白主要通过结合并活化Toll样受体和糖基化终产物受体从而介导细胞内的炎症信号传导等途径，在炎症中发挥重要的调节作用。
术语“试剂/药物/制剂的施用”泛指针对患者的病情和个体化情况所选择或调整的治疗药物、剂量、用法、给药频次及给药疗程。药物的给药途径包括口服、静脉注射(静注)、肌肉注射(肌注)、皮下注射(皮下)。药物还可舌下含化(舌下)、直肠灌注(直肠给药)、滴眼、鼻腔喷雾、口腔喷雾(吸入剂)，也可皮肤局部(表面)或全身(经皮)用药。
应该理解的是，本发明中所述的试剂/制剂/组合物中所含有的抑制血小板焦亡的试剂，并不限定于该试剂/制剂/组合物仅且仅能包含该试剂本身，在包含了有效量或其上的抑制血小板焦亡的试剂的这样的试剂/制剂/组合物，即可以实现本发明中所述的目的。在这样的试剂/制剂/组合物中，还可以包含其他载体或辅料，或者包含其他疾病的药物的联合使用，又或者包含同样针对本发明所述的脓毒症药物的使用。
作为本领域技术人员，可以理解的是，本发明中的试剂/制剂/组合物可以与针对其他疾病的药物或者针对本发明所述的脓毒症的其他药物进行联合施用，或者在本发明的技术人员能够理解或实现的范围内，与其他药物(包括其他疾病药物或者针对脓毒症的其他药物)联合制备在某种制剂/组合物中，这样的使用同样应该理解为属于本发明的发明目的范畴。
若本发明中所述，术语“输注”泛指采用一定的器械或装置通过静脉血管缓缓输入或注射(血液等)。
为便于本领域技术人员理解，本发明中给出了某些方案具体阐述了试剂在预防/治疗脓毒症特别是重度脓毒症中的应用，但是这样的方案不应作为本发明的试剂或应用或方法的限制，本发明领域技术人员在能够理解或实现的范围内，基于本发明的发明主旨和目的，在了解本发明所述抑制血小板焦亡在重度脓毒症中的效果的基础上，同样可以采用其他方法实现同样的目的。例如，作为一个范例，本发明的发明人可以从正常人体或者从患者中分离血小板，将血小板中的抑制血小板焦亡蛋白进行敲除或改造(例如敲除GSDMD)，再回灌输注患者体内。这样的方法或应用以及从这样的方法中获得的试剂同样应该纳入本发明的保护范围。
在本发明实施例中，发明人通过以下内容来阐述抑制血小板焦亡的试剂(在下述实施例中，抑制血小板焦亡的试剂包括但不限于敲除了GSDMD的血小板)在制备预防和/或治疗脓毒症的药物中的可行性：
(1)利用血小板特异性GSDMD敲除小鼠揭示了严重脓毒症中存在GSDMD依赖的血小板焦亡病理过程；
(2)阐明严重脓毒症中血浆中异常增加的S100A8/A9通过上调TLR4/NLRP3/Caspase1/GSDMD信号通路诱导血小板焦亡，并释放IL-1β等促进炎症因子风暴加剧炎症反应；
(3)通过输注TLR4敲除血小板改善严重脓毒症小鼠中炎症并显著提高了其存活率；
(4)通过输注GSDMD敲除血小板改善严重脓毒症小鼠中炎症并提高了其存活率。
技术路线示意图如图1所示。
样本纳入准则
在本实施例中，脓毒症队列的招募严格按照国际指南(参考：Dellinger RP,LevyMM,Rhodes A,Annane D,Gerlach H,Opal SM,Sevransky JE,Sprung CL,Douglas IS,Jaeschke R,Osborn TM,Nunnally ME,Townsend SR,Reinhart K,Kleinpell RM,AngusDC,Deutschman CS,Machado FR,Rubenfeld GD,Webb S,Beale RJ,Vincent JL,Moreno R；Surviving Sepsis Campaign Guidelines Committee including The PediatricSubgroup.Surviving Sepsis Campaign:international guidelines for management ofsevere sepsis and septic shock,2012.Intensive Care Med.2013Feb；39(2):165-228.doi:10.1007/s00134-012-2769-8.Epub 2013Jan 30.PMID:23361625；PMCID:PMC7095153.)进行。其中，儿科脓毒症的定义为全身炎症反应综合征和疑似或证实感染。
具有脓毒症临床表现为：血培养或无菌体腔内培养出致病菌(目前的脓毒症诊断的黄金标准)，或至少满足如下临床表现四项的两项标准即诊断为儿科脓毒症：①受试者温度＜36℃或＞38℃；②受试者血样中白细胞(WBC)数目≥34×109/L或＜5×109/L；③出现血小板减少症(血小板数目＜100,000μL-1)；④呼吸率＞20次/分钟，且PaO2<4.3kPa(32mmHg)。
在本实施例中，脓毒症队列是于2019年11月至2021年8月在广州医科大学附属广州妇女儿童医学中心按照上述纳入准则招募得到的，共招募93名脓毒症患者(0～18岁)和75名年龄相匹配的健康对照受试者。所有标本采集均获得受试者家属签署的知情同意，并得到广州市妇女儿童医疗中心机构审查委员会批准(人类调查委员会第201944101号)。
样品处理
分别从上述招募的健康对照者和严重脓毒症患者中抽取其外周静脉血约3mL，加入至含有3.8％柠檬酸钠(w/v)的抗凝管。按照参考文献1(Tang WH,Stitham J,JinY,etal.Aldose reductase-mediated phosphorylation of p53 leads to mitochondrialdysfunction and damage in diabetic platelets.Circulation.2014Apr；129(15):1598-1609.DOI:10.1161/circulationaha.113.005224.PMID:24474649；PMCID:PMC3989377.)一文中的血小板分离技术分离血小板。具体步骤为：将上述抗凝管以250g常温离心15分钟，加入终浓度为100nM前列腺素E1(PGE1，Sigma)，1000g继续常温离心5分钟。弃去上清后，洗涤血小板沉淀，用3mLHank's平衡盐溶液(HBSS，Gibco)重悬。然后采用荧光激活细胞分选仪(FACS，BD FACSCantoTM)分析血小板特异性标记物CD41(使用CD41抗体(纯度>95％，PE anti-human CD41+，Biolegend))，测定分离后的血小板纯度。调整血小板浓度至108血小板/mL用作后续实验浓度。
下述实施例中的血小板制备方法均按照本实施例中所述步骤进行。
严重脓毒症与一般脓毒症的特征性研究
相关技术中指出严重脓毒症患者相较于一般脓毒症(或称轻度脓毒症)患者会出现更高的严重并发症发生几率(高约14％)和死亡率(高约50％)，因此，有效诊断/预防或治疗严重脓毒症才能够真正意义上的降低脓毒症的危害性。
在本实施例中，发明人通过商用ELISA试剂盒检测一般脓毒症患者和严重脓毒症(包括脓毒性休克患者)患者血浆中促炎细胞因子(其中，S100A8/A9，CUSABIO CSB-E12149(人)，IL-1β使用博士德EK0392(人)或EK0394 Mouse(小鼠)，TNFα使用CSB-E04740h(人)或CSB-E04741m(小鼠)，IL-6使用CUSABIO CSB-E04638h(人)或CSB-E04639m(小鼠))水平和采用血液学分析仪(Sysmex Corporation,XN-350)分析全血血小板计数及参数。
结果如图2和图3所示。
可以发现，严重脓毒症和脓毒性休克患者在促炎细胞因子水平和血小板参数上基本一致，并且显著高于轻度脓毒症患者和正常人。而且，通过对一般脓毒症患者和严重脓毒症患者的持续追踪检测发现，一般脓毒症患者在持续观测14天内血小板数目无统计学变化，而严重脓毒症(伴或不伴脓毒性休克)患者在观测28天内血小板数目相比于一般脓毒症患者一直处于低水平状态，说明严重脓毒症(包括脓毒性休克)在病理机制上有别于轻度脓毒症，而这可能是对于一般脓毒症的常规治疗手段无法有效治疗严重脓毒症(包括脓毒性休克)的原因。
为了验证上述猜想，发明人采用血小板输注对筛选出的严重脓毒症病例进行治疗。具体治疗方法为：在试验开始第2天对严重脓毒症病例进行血小板输注(输注量为1U，即每袋内含血小板≥2.5×1011，红细胞含量＜0.41ml，ABO血型相同，规格:150～250ml/袋)，然后间隔5天后进行第二次输注(输注量为1U，同上)，每天监测严重脓毒症病例的血小板数量变化。
结果如图4所示。
通过对比严重脓毒症(伴血小板减少)的患者输注前后血小板水平对比，可以发现严重脓毒症患者两次输注血小板均只能短暂保持血小板水平，输注后次日又显著降低(图4A)。对此，发明人对这些严重脓毒症患者进行了输注后24小时的纤溶系统活性筛查，发现严重脓毒症患者的D-二聚体(D-Dimer)含量显著增加，提示体内有出血增加趋势(图4B)。进一步进行凝血功能指标检测后发现活化部分凝血活酶时间APTT(图4C)和血浆凝血酶时间TT凝血时间延长(图4D)。以上结果提示当给与严重脓毒症出现血小板减少的患者输注正常外源性的血小板不能有效缓解低水平的血小板，反而会加重患者的病程进展。因此，可以说明常规的轻度脓毒症治疗手段不能有效治疗严重脓毒症。
基于上述发现，为了进一步探究在严重脓毒症病理条件下血小板蛋白的变化情况，发明人利用应用数据非依赖采集质谱(DIA-MS)对3例严重脓毒症患者以及3例健康对照者的纯化血小板进行高通量蛋白质组学分析。
其中，具体分析方法为：从严重脓毒症患者(n＝3)和健康者(n＝3)中分离纯净的血小板提取蛋白，经华大蛋白质组学进行蛋白酶解，酶解所有蛋白为肽段，将所有样本进行DIA模式检测、DDA建库检测和DIA定量检测，下机的DDA数据使用MaxQuant整合的Andromeda引擎完成鉴定。利用建立的谱库，对获得的DIA数据进行Spectronaut处理分析，保留时间预测类型设置为动态iRT，肽和蛋白水平q值截止设置为1％，归一化策略设置为局部归一化。导出Spectronaut正常报告，并使用MSstats进行下游数据处理，包括数据转换强度、不同条件的中位规范化和蛋白质汇总。基于预先设定的对照组，使用MSstats中的混合线性模型评估差异蛋白表达。以差异倍数>1.5且P值<0.05判定差异有统计学意义，利用欧氏距离和层次聚类对所有有效差异蛋白表达进行热图分析。
结果如图5所示。
通过高通量蛋白质组学分析得到的火山图中，可以发现健康对照组和脓毒症组的蛋白表达差异明显(红色表示显著上调，蓝色表示显著下调，差异倍数中断>1.5和p值<0.05)。通过差异蛋白富集通路分析显示，患者的血小板凋亡和坏死(包括焦亡)通路显著上调(图5B)。聚类热图的结果显示了在脓毒症病理条件下非经典焦亡蛋白Caspase 4没有显著性增加，但是典焦亡关键蛋白GSDMD和ASC在脓毒症血小板中表达上调(图5C)。以上数据表明在脓毒症中经典焦亡蛋白GSDMD和ASC表达显著上调。
此外，发明人还通过透射电子显微镜(TEM)观察严重脓毒症患者和健康对照者的血小板超微结构。
结果如图6和7所示。
可以发现，严重脓毒症血样中得到的血小板除了存在凋亡病理现象，还观察到细胞肿胀、细胞结构丧失、质膜破裂和胞质内容物释放的特征，符合细胞焦亡晚期的形态特点。此外，在脓毒症血小板中可见细胞膜破裂(图6A中红色箭头周围区域)，并观察到其释放的细胞内容物。运用激光共聚焦显微镜扫描发现脓毒症中血小板的NLRP3与ASC相互作用形成炎性小体(图6B)。与健康对照者血小板相比，脓毒症中血小板Caspase 1的活性显著增加(图7A)。血小板活化的GSDMD和ASC表达显著增加(图7B)，这与上述DIA-MS分析的结果相一致。活化的Caspase 1不仅激活下游GSDMD关键蛋白，而且将前体IL-1β切割为成熟的促炎细胞因子。与健康对照者相比，脓毒症中血小板分泌的IL-1β水平显著升高(图7C)。以上结果提示严重脓毒症可诱导血小板焦亡经典信号通路激活并释放促炎因子IL-1β。
基于小鼠模型探究GSDMD对于严重脓毒症的调控作用
为了进一步研究GSDMD是否是血小板焦亡的关键调控分子，发明人首次采用GSDMDflox/flox小鼠与血小板特异性PF4-Cre小鼠杂交(巨核细胞特异表达Cre，与带有两个FloxP位点的FloxP小鼠交配后，在Cre特异表达的组织或者器官或细胞中，目标基因中两个FloxP位点间的外显子或元件将被删除，达到条件性敲除或过表达的目的)，繁殖出血小板特异性GSDMD敲除小鼠(GSDMDflox/floxPF4-Cre小鼠)，以此对比判断GSDMD对于血小板的实际影响。
(1)敲除小鼠动物模型的构建：
在下述实施例中，所使用的GSDMDflox/flox小鼠模型的构建由中国上海模型生物中心利用同源重组原理设计得到，具体构建方案为：设计打靶质粒载体(质粒图谱如图8所示)，其中，靶基因选择为GSDMD基因(Ensembl号为ENSMUSG00000022575)。载体经电转入C57BL/6J小鼠胚胎干细胞(ES)中，并利用G418和更昔洛韦进行药物双选，筛选出同源重组克隆。通过PCR鉴定出目标同源重组的ES克隆，并进行了测序验证。扩增阳性的ES细胞克隆，将其微注射到C57BL/6J小鼠囊胚中获得嵌合后代(GSDMDflox/flox小鼠)。得到的小鼠(GSDMDflox/flox小鼠)通过与PF4-Cre小鼠杂交，获得血小板特异性GSDMD基因敲除小鼠(GSDMDflox/floxPF4-Cre小鼠)。
其中，PCR鉴定所用引物为：
上游引物P8：5'-AGGGCGTCAGATCTCATTACAG-3'(SEQ ID NO：1)；
下游引物P9：5'-TTCCCATCGACGACATCAGAGACT-3'(SEQ ID NO：2)。
结果如表1和图9所示。
其中，血小板数量采用血液学分析仪进行计数。
表1GSDMDflox/flox小鼠与GSDMDflox/floxPF4-Cre小鼠的血小板参数对比情况
Figure BDA0003535371100000201
Figure BDA0003535371100000211
可以发现，在诱发脓毒症之前，GSDMDflox/flox小鼠与GSDMDflox/floxPF4-Cre小鼠的血小板参数并无显著差异，而且对比两种小鼠的经典血小板功能也没有发现显著差异(图9)。
进一步对同窝未诱发脓毒症的GSDMDflox/flox小鼠与GSDMDflox/floxPF4-Cre小鼠血样中分离纯化的血小板，使用焦亡诱导剂脂多糖(LPS，10μg/mL)和尼日利亚霉素(Nigericin，5μM)刺激后，通过显微电镜实时观察刺激20分钟后的血小板形态变化。
结果如图10所示。
可以发现，GSDMDflox/flox小鼠的血小板出现快速肿胀和膜破裂等形态学特征，但并未在GSDMDflox/floxPF4-Cre小鼠的血小板中观测到同样的情况。
(2)脓毒症小鼠的诱导构建：
在本实施例中，采用盲肠结扎穿孔法(CLP)诱导脓毒症，具体诱导方法为：选取上述实验动物(5周龄左右)，每组4～5只，构建开始前禁食12小时，使用戊巴比妥钠腹腔麻醉后，切开腹部皮肤约2～3cm，分离盲肠远端和大肠系膜，轻轻将盲肠内粪便挤向大肠端。在盲肠远端1/3处用手术线结扎，用1mm直径大小的针头在结扎部位穿刺2次后关腹手术。术后皮下给生理盐水补充体液。术后紧密观察7天内存活情况，并分别取2，4，6和12小时存活小鼠的血小板并用于后续实验。对照组采用假手术方式，仅做开腹和分离盲肠和关腹部手术。以上小鼠均在广州医科大学动物设施无菌条件下饲养和操作。所有小鼠实验均符合动物保护、福利、伦理和3R(Replacement,Reduce,Refine)原则。
取各实验组小鼠的静脉血，加入凝血酶(终浓度为0.1U/mL)共孵育30分钟，空白对照不添加任何血样。用流式细胞术检测凝血酶刺激后，P选择素在膜上的易位情况。同时检测血小板数量和其他相关参数。其中，小鼠尾部出血时间的测定方法为：用尾断头台方法将小鼠剪尾后浸入37℃温盐水中，测量小鼠的尾巴出血时间。
利用这些GSDMDflox/flox小鼠和GSDMDflox/floxPF4-Cre小鼠采用上述方法进行CLP诱导脓毒症造模后，通过透射电子显微镜扫描观察到GSDMDflox/flox小鼠的血小板出现肿胀破裂并发现释放的细胞内容物，但这种细胞结构改变的情况并未在CLP诱导造模后的GSDMDflox/flox PF4-Cre小鼠中发现，从而可以说明GSDMD是诱导血小板焦亡的必要调控分子。
基于小鼠模型探究输注外源性的GSDMD敲除血小板对于严重脓毒症的治疗作用
为了进一步研究GSDMD对于治疗血小板焦亡引发的严重脓毒症的重要意义，发明人通过输注外源性GSDMD敲除血小板和外源性无GSDMD敲除血小板(即GSDMDflox/flox血小板)替换GSDMDflox/flox小鼠中内源性血小板，从而阻断GSDMD依赖的血小板焦亡。
内源性血小板清除采用血清抗体清除法，具体步骤为：选取5周龄实验小鼠(GSDMDflox/flox小鼠)，尾静脉注射等量兔抗小鼠血小板多克隆抗体(购自Mybiosource,货号MBS524066)或生理盐水(normal saline)，注射量为5μL/只。注射完成24小时后(减少体内血小板但不影响白细胞数量)，制备总数量为2.7×108的纯化替换血小板(体积为200μL，浓度为6x 1010血小板/升，其中外源性GSDMD敲除血小板取自上述GSDMDflox/floxPF4-Cre小鼠，外源性无GSDMD敲除血小板则取自上述GSDMDflox/flox小鼠，血小板获取及纯化方式同上述实施例)，将纯化替换血小板尾静脉输注(200μL)给清除内源性血小板的小鼠体内。
按照上述实施例中的方法利用CLP诱导制备脓毒症小鼠模型(使用GSDMDflox/flox小鼠)，按照上述步骤进行血小板替换，设置空白对照，检测诱导前以及诱导完成6小时后的血小板数量及炎症水平(检测方法同上述实施例，其中，诱导前及过程中采用眼眶采血取少量30μL，诱导后采用心脏穿刺采全血)，并观察一周小鼠存活率。对照组为假手术组。
结果如图11所示。
使用CLP诱导脓毒症6小时后，输注生理盐水的小鼠比假手术小鼠的血小板数量降低6倍，输注GSDMD敲除血小板的脓毒症小鼠和输注无GSDMD敲除血小板(GSDMDflox/flox血小板)的脓毒症小鼠的血小板数量分别比仅输注生理盐水的脓毒症小鼠组增加49％和69％，提示输注GSDMD敲除血小板可部分恢复严重脓毒症所导致的低水平的血小板数。同时，发明人还发现CLP诱导脓毒症小鼠输注生理盐水比假手术小鼠输注生理盐水后的IL-1β，TNFα和IL-6含量分别增加20倍，2倍及3倍，脓毒症小鼠输注无GSDMD敲除血小板(GSDMDflox/flox血小板)的IL-1β，TNFα和IL-6含量分别比脓毒症小鼠输注生理盐水降低11％，3％及23％，但是脓毒症小鼠输注GSDMD敲除血小板的IL-1β，TNFα和IL-6含量则分别比脓毒症小鼠输注生理盐水降低59％，42％及52％，提示输注GSDMD敲除血小板可显著降低严重脓毒症的高水平炎症。而且，在进一步观察中，还发现脓毒症小鼠输注生理盐水存活率仅为20％，脓毒症小鼠输注无GSDMD敲除血小板(GSDMDflox/flox血小板)后存活率为40％，而脓毒症小鼠输注特异性GSDMD敲除血小板后存活率达到了60％，提示输注GSDMD敲除血小板能够显著提高严重脓毒症小鼠的存活率。综上所述，上述结果提示通过特异性阻断GSDMD依赖的血小板焦亡可以有效改善严重脓毒症小鼠的血小板数量和炎症水平，并提高患病小鼠存活率。
S100A8/A9对于严重脓毒症中血小板焦亡的影响
发明人在研究中还发现，异质二聚体S100A8/A9在严重脓毒症患者血浆中异常升高(图12，检测使用CUSABIO CSB-E12149(人)ELISA检测试剂盒，检测步骤参考使用说明书)，说明S100A8/A9可能参与严重脓毒症中的血小板焦亡。
为此，发明人进一步检测了脓毒症患者中血小板的焦亡比率(通过检测活化的Caspase 1阳性血小板，检测基于Caspase 1的检测试剂盒，检测步骤参考使用说明书)与血浆中S100A8/A9水平的相关性。结果发现脓毒症患者中血小板的焦亡比率与血浆中S100A8/A9水平呈正相关关系(图13)。
由于血小板高表达TLR4，其与血液循环中S100A8/A9结合并激活下游信号，因此，发明人进一步探究S100A8/A9是否通过TLR4途径诱导严重脓毒症中血小板焦亡。
从脓毒症患者分离纯化血小板，分别加入终浓度为1μg/mL rhS100A8/A9(重组人S100A8/A9，购自BioLegend公司)或10μM帕奎莫德处理，然后采用免疫荧光染色检测CD41、ASC和NLRP3的表达情况。设置空白对照(不加入rhS100A8/A9或帕奎莫德诱导)。
结果如图14所示。可以发现，与溶剂对照相比，重组人S100A8/A9可诱导血小板中NLRP3-ASC炎症小体形成。
进一步采用蛋白印迹法测定rhS100A8/A9和帕奎莫德诱导后的血小板中pro-Caspase 1、Caspase 1(casp 1p10)、GSDMD和GSDMD-N端蛋白的表达水平，内参为α-actinin。
结果如图15所示。可以发现，与溶剂对照相比，rhS100A8/A9诱导血小板中GSDMD和Caspase 1的活性显著增加。结合流式细胞术对经rhS100A8/A9或帕奎莫德处理后的血小板Caspase 1活性(采用FAM-FLICACaspase 1检测试剂盒(Immuno Chemistry))的检测结果(图16)。而图15和16中均显示出了帕奎莫德能够减少NLRP3炎性小体形成，抑制Caspase1和GSDMD(兔抗anti-GSDMD C-terminus(NOVFUS)，二抗为Alexa Fluor 594偶联抗兔IgG(BioLegend))的活性，结合现有技术中公开的帕奎莫德具有阻止S100A9与TLR4相互结合从而阻断S100A9下游信号通路的作用，能够有效说明S100A8/A9是通过激活TLR4途径诱导血小板焦亡。
基于小鼠模型探究输注外源性的TLR4敲除血小板对于严重脓毒症的治疗作用
为了探究TLR4是否参与S100A8/A9诱导的血小板焦亡，发明人通过输注外源性Tlr4-/-血小板替换野生型(WT)小鼠中内源性血小板，从而阻断TLR4信号通路。
在本实施例中所使用的TLR4缺陷(Tlr4-/-)小鼠和野生型(WT)小鼠均来自JacksonLaboratory，且小鼠品系背景均为C57BL/6小鼠(美国Bar Harbor)。
内源性血小板清除采用血清抗体清除法，具体步骤为：选取正常5周龄小鼠(WT小鼠)，尾静脉注射等量兔抗小鼠血小板多克隆抗体(购自Mybiosource,货号MBS524066)或生理盐水(normal saline)，注射量为5μL/只。注射完成24小时后(减少体内血小板但不影响白细胞数量)，制备总数量为2.7×108的纯化替换血小板(体积为200μL，浓度为6x1010血小板/升，其中外源性Tlr4-/-血小板取自Tlr4-/-小鼠，常规血小板则取自WT小鼠，血小板获取及纯化方式同上述实施例)，将纯化替换血小板尾静脉输注(200μL)给清除内源性血小板的小鼠体内。
按照上述实施例中的方法利用CLP诱导制备脓毒症小鼠模型(使用WT小鼠)，按照上述步骤进行血小板替换，设置空白对照，检测诱导前以及诱导完成6小时后的血小板数量及炎症水平(检测方法同上述实施例，其中，诱导前及过程中采用眼眶采血取少量30μL，诱导后采用心脏穿刺采全血)，并观察一周小鼠存活率。对照组为假手术组。
结果如表2和图17所示。
表2 Tlr4-/-血小板替换小鼠和WT血小板替换小鼠的血小板参数对比情况
血液学分析仪检测血小板参数 Tlr4<sup>-/-</sup>血小板替换小鼠 WT血小板替换小鼠 P值
血小板数量(×10<sup>9</sup>/L) 978.80±145.55 938.80±35.54 0.567
血小板平均体积(MPV,fL) 6.44±0.17 6.48±0.08 0.6454
血小板平均宽度(PDW,fL) 5.60±0.22 5.78±0.18 0.1975
大型血小板比率(P-LCR,％) 2.04±0.95 2.34±0.96 0.6334
在诱导小鼠脓毒症之前，首先比较Tlr4-/-血小板替换小鼠和WT血小板替换小鼠的血小板数量和参数，发现两者并无显著差异。而使用CLP诱导脓毒症6小时后，输注生理盐水的小鼠比假手术小鼠的血小板数量降低5.4倍，输注TLR4敲除血小板和输注WT血小板的CLP诱导脓毒症小鼠的血小板数量分别比输注生理盐水的CLP诱导脓毒症小鼠的血小板数量增加33％和62％，提示输注TLR4敲除血小板可部分恢复严重脓毒症所导致的低水平的血小板数。同时，发明人还发现CLP诱导脓毒症小鼠输注生理盐水比假手术小鼠输注生理盐水后的IL-1β，TNFα和IL-6含量分别增加27倍，2倍及3倍，脓毒症小鼠输注WT血小板后的IL-1β，TNFα和IL-6含量分别比脓毒症小鼠输注生理盐水降低27％，27％及10％，脓毒症小鼠输注TLR4敲除血小板的IL-1β，TNFα和IL-6含量则分别比脓毒症小鼠输注生理盐水降低43％，38％及42％，提示输注TLR4敲除血小板可显著降低严重脓毒症的高水平炎症。而且，在进一步观察中，还发现脓毒症小鼠输注生理盐水存活率仅为25％，脓毒症小鼠输注WT血小板后存活率未发生显著变化，仍为25％，然而脓毒症小鼠输注TLR4敲除血小板后存活率上升为50％，提示输注TLR4敲除血小板可增加脓毒症小鼠的存活率。综上所述，上述结果提示通过阻断TLR4信号引发的血小板焦亡可以有效改善严重脓毒症小鼠的血小板数量和炎症水平，并提高患病小鼠的存活率。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州市妇女儿童医疗中心
<120> 抑制血小板焦亡的试剂在制备预防和/或治疗脓毒症的药物中的用途
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agggcgtcag atctcattac ag 22
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ttcccatcga cgacatcaga gact 24

Claims (7)

1.血液制品在制备预防和/或治疗血小板焦亡导致的疾病的药物中的应用；所述血小板焦亡导致的疾病为严重脓毒症或脓毒性休克；所述血液制品中含有ASC敲除的血小板。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述严重脓毒症或脓毒性休克具有如下（1）~（3）任一项中的特征：
（1）出现持续性血小板减少并出血，输注正常外源性血小板无法治愈；
（2）出现持续性血小板死亡，且细胞具有细胞焦亡特征；
（3）具有脓毒症临床表现，且出现炎症因子风暴或过度炎症反应症状。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述血液制品的使用方法为全身性血小板输注或替换。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物配置成液体剂型或固体剂型，所述液体剂型或固体剂型选自注射剂、冻干剂、安瓿。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型所适用的为婴幼儿、儿童、青少年、成人或老人。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型所适用的为婴幼儿和儿童。
7.血小板中ASC表达的检测试剂和/或血浆中异质二聚体S100A8/A9表达检测试剂在制备脓毒症诊断产品中的应用，
所述诊断产品用于判断脓毒症的严重程度。
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