CN117545733A - 提取和发酵方法 - Google Patents

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CN117545733A CN202180099684.3A CN202180099684A CN117545733A CN 117545733 A CN117545733 A CN 117545733A CN 202180099684 A CN202180099684 A CN 202180099684A CN 117545733 A CN117545733 A CN 117545733A
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Abstract

本文公开了从糠麸中获得阿魏酸，随后对该糠麸进行后续发酵的方法。

Description

提取和发酵方法
发明领域
本发明总体上涉及生物技术领域。特别地，本发明涉及提取和发酵方法。
发明背景
糠麸(bran)是制粉工业(flour milling industry)的主要侧流产物。它通常被用作饲料成分。然而，由于非淀粉多糖含量高，将其包含在饲料中受到限制，尤其是在单胃动物中更是如此。例如，麦麸还含有大量阿魏酸，并且有研究聚焦于探索从麦麸中提取酚酸的方法。然而，缺少将这两个过程组合用于处理麦麸的技术探索。因此，对更好地利用作为副产物获得的糠麸的组合方法存在需求。
概述
在一方面，本公开内容涉及从糠麸中获得阿魏酸，随后对该糠麸进行后续发酵的方法，该方法包括：a.将糠麸、水和酶合并以获得混合物，其中该酶水解(半)纤维素；b.在孵育步骤中孵育步骤a的混合物；c.将步骤b的混合物分离成液相和固相；d.分离步骤c中获得的液相并从所述液相中获得阿魏酸；e.用发酵糠麸的微生物接种步骤c获得的固相；f.在发酵步骤中孵育步骤e的接种的固相；从而获得发酵的糠麸。
附图简述
当与非限制性实例和附图结合考虑时，参考详述将更好地理解本发明，在附图中：
图1显示了概述糠麸的阿魏酸提取和发酵的“整合方法”的示意图。
图2显示了用于处理糠麸(在本实例中为麦麸)的三种方法的实验设置和结果。“整合方法”包括酶处理，随后使用DSM33837进行固态发酵。“对照方法”是指在不添加任何外源酶或DSM33837的情况下，使麦麸处于水中(1:1.2.5比例，w/w)。“发酵”仅涉及固态发酵中的DSM33837。
图3显示了麦麸的干燥且改性产物的表征。通过“整合方法”、“发酵”或“对照方法”获得产物。图3a显示了在来自“整合方法”和“发酵”的产物中回收到DSM33837的活菌落形成单位，但未从“对照方法”的产物中回收到DSM33837的活菌落形成单位。图3b显示了来自“整合方法”和“发酵”的产物中还原糖含量增加，但来自“对照方法”的产物中还原糖含量未增加。这些结果显示与DSM33837一起孵育的麦麸，在并入或不并入阿魏酸提取步骤的情况下，均导致麦麸的功能性增加。
图4显示了用于处理糠麸(通过麦麸的实例示出)的“替代方法”的实验设置和结果。“替代方法”包括单一步骤中的酶处理和芽孢杆菌发酵。使用“替代方法”，无法从其检测出可定量的阿魏酸。
图5显示了概述应用于麦麸的阿魏酸提取和发酵的实例的所要求保护的方法的示意图。
发明详述
阿魏酸具有抗氧化特性，为其在健康、化妆品和食品中提供了许多潜在商业应用。从产物例如但不限于糠麸中提取阿魏酸和其他酚类化合物是使这种木质纤维素生物质有价值的一个令人感兴趣的主题。
在本公开内容中，使用酶法以环境友好的方法提取阿魏酸。此外，由本文公开的方法得到的糠麸不含溶剂，并且可用于其他应用，例如但不限于动物饲料成分。
阿魏酸的提取可以对各种类型的生物质(例如但不限于玉米秸秆、米糠、麦麸)进行。因此，在一个实例中，阿魏酸从糠麸中提取。
如本文所公开的，提取以酶促方式进行。因此，在一个实例中，从微生物获得酶。在另一个实例中，酶可以是合成酶或重组酶，例如，使用本领域已知的遗传方法在实验室中获得的酶。只要所需的酶由微生物产生，本领域技术人员就能够使用本领域已知的方法获得所述酶。例如，这样的酶可以从曲霉属的种(Aspergillus sp.)的微生物中分离或获得。
阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase；FAE)，也称为阿魏酰酯酶(feruloylesterase)，是能够水解形成植物细胞壁的多糖和酚酸之间存在的酯键的酶。阿魏酸酯酶已被证明与其他半纤维素酶协同起作用以分解木质纤维素生物质。换言之，在本文公开的方法和过程中可以使用水解(半)纤维素的酶。
本文所描述的方法可以使用本文公开的一种或更多种酶进行。在一个实例中，这些酶是但不限于阿魏酸酯酶、木聚糖酶及其组合。在一个实例中，阿魏酸酯酶可以从以下示例性微生物中的任一种或更多种中获得：黑曲霉(Aspergillus niger)、塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)、土曲霉(Aspergillus terreus)、棒曲霉(Aspergillusclavatus)；嗜淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)和/或瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)。在另一个实例中，酶是黑曲霉阿魏酸酯酶(AnFAE)。
如本文所用的，糠麸也称为磨坊糠麸，是指谷皮(grain husk)或谷物的坚硬外层，所述谷物例如但不限于谷类植物谷物。它由糊粉和果皮的组合组成。它与胚芽一样是全谷物的不可或缺的一部分，并且通常是精制谷物生产中碾磨的副产物。糠麸占小麦籽粒总重量的约10％至15％。具体地，麦麸是在碾磨过程中产生的丰富的副产物。此外，由于胚乳的不完全分离，麦麸含有10％至25％的淀粉，并且含有约35％的非淀粉碳水化合物，所述非淀粉碳水化合物主要由麦麸中的主要纤维成分阿拉伯糖基木聚糖(arabinoxylan)组成。糠麸存在于谷类植物谷物(包括但不限于稻米、玉米(玉蜀黍)、小麦、燕麦、大麦、黑麦和小米)中。糠麸与谷壳(chaff)不同，谷壳是围绕谷物的较粗糙的鳞状物质，但不构成谷物本身的一部分，并且人难以对其进行消化。
术语“粗粉(meal)”是指各种谷物的粗磨可食用部分。粗粉通常用于动物饲料，并且其特征还可以在于是比粉更粗的共混物，其中粉是指通过研磨原谷物、根、豆类、坚果或种子制成的粉末。需要注意的是，这不仅指常用的小麦粉，还指原谷物、根、豆类、坚果或种子的研磨产物。“粗粉”还指谷物、糠麸或油籽的油提取完成后剩余的产物。粗粉可以含有或可以不含有其他添加剂和剂(agent)，用于例如富集粗粉或防止研磨后结块。
如本文所用的，术语“脱脂”是指从所讨论的产物中除去脂肪。例如，当与粗粉结合使用时，脱脂粗粉是指所具有的脂肪含量低于未处理的(非脱脂的)粗粉的粗粉。
如本领域技术人员将理解的，本公开的方法可以对天然富含阿魏酸的糠麸进行。因此，在一个实例中，糠麸是含有阿魏酸的糠麸。在另一个实例中，糠麸从谷物中获得，该谷物例如但不限于小麦、玉蜀黍、稻米、脱脂稻米、高粱、大麦、黑麦和燕麦。在另一个实例中，本文公开的糠麸是麦麸。
阿拉伯糖基木聚糖进一步与不同水平的酚酸(例如阿魏酸)有关。因此，本文公开了能够从糠麸中提取阿魏酸的方法。本文公开的方法还允许以顺序或整合方法或过程的形式对阿魏酸提取后剩余的产物进行后续发酵。
大量非淀粉碳水化合物(例如阿拉伯糖基木聚糖)可以给例如牲畜带来消化问题。此外，木聚糖可通过在含有木聚糖或阿拉伯糖基木聚糖的粗粉中捕获能量和营养物质而作为抗营养组分。因此，本文公开的微生物起到发酵生物质的作用，以改善生物质的生物化学和营养组成。换言之，生物质的发酵产生了“预消化”形式，从而提高使用本文公开的方法处理的粗粉和糠麸中所含营养物质和能量的生物利用度。
本领域技术人员将理解，本文公开的方法和过程可以使用能够进行发酵的微生物来进行。具体地，本文所用的微生物必需能够发酵发酵过程的起始物料。因此，在一个实例中，使用微生物进行发酵，该微生物例如但不限于芽孢杆菌属的种(Bacillus spp.)、乳杆菌属的种(Lactobacillus spp.)、曲霉属的种(Aspergillus spp.)、链球菌属的种(Streptococcus spp.)及其组合的微生物。在另一个实例中，微生物可以是但不限于芽孢杆菌属的种的菌株DSM33837、DSM33839和DSM33838及其组合。在另一个实例中，微生物是DSM33837。
本公开内容描述了糠麸预处理方法和在前述方法中提取阿魏酸。在一个实例中，本文获得的糠麸可以用作例如动物饲料成分。因此，在一个实例中，公开了从糠麸中获得阿魏酸(也称为提取步骤)，随后在提取后对糠麸进行后续发酵的方法，该方法包括：将糠麸、水和酶合并以获得混合物，其中该酶水解(半)纤维素；在孵育步骤中孵育该混合物；将该混合物分离成液相和固相；分离获得的液相并从所述液相中获得阿魏酸；用发酵糠麸的微生物接种获得的固相；在发酵步骤中孵育接种的固相；从而获得发酵的糠麸。在另一个实例中，在从液相获得阿魏酸之后，将剩余的液相返回到提取步骤的起始物料中。在另一个实例中，本文获得的发酵糠麸作为动物饲料成分，用于动物饲料中。
在一个实例中，孵育步骤(例如本文公开的步骤b)进行至少15分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、至少9小时、至少10小时、至少11小时、至少12小时、至少13小时、至少14小时、至少15小时、至少16小时、至少17小时、至少18小时、至少19小时、至少20小时、至少21小时、至少22小时、至少23小时或至少24小时，或约15分钟、约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时或约24小时。
如本领域技术人员所理解的，孵育步骤的持续时间将取决于例如所用酶的质量(并从而取决于酶的功效)。因此，酶的效率越高，孵育持续时间可以越短。这种持续时间还可以取决于所用起始物料的类型和质量。
如本领域技术人员所理解的，本文公开的孵育步骤或本文公开的酶消化是否已进行足够长的时间将取决于，例如，期望产物的释放是否能够被检测到和/或进行定量。在一个实例中，阿魏酸的检测和/或定量指示已成功进行孵育步骤。
在另一个实例中，如本文所公开的，糠麸、水和酶的合并根据糠麸与水的比例进行。值得注意的是，当麦麸与等量的水(即糠麸与水的比例为1:1)混合时，糠麸将吸收所有液体，并且不可能将液体与糠麸分离开。因此，如本文所公开的，糠麸与水以但不限于以下的比例合并：至少1:5(糠麸比水)，或约1:6、约1:7、约1:8、约1:9、约1:10、约1:11、约1:12、约1:13、约1:14、约1:15、约1:16、约1:17、约1:18、约1:19、约1:20、约1:21、约1:22、约1:23、约1:24、约1:25、约1:26、约1:27、约1:28、约1:29、约1:30、约1:31、约1:32、约1:33、约1:34、约1:35、约1:36、约1:37、约1:38、约1:39、约1:40、约1:41、约1:42、约1:43、约1:44、约1:45、约1:46、约1:47、约1:48、约1:49或约1:50。
在一个实例中，阿魏酸酯酶的量为但不限于每克糠麸至少0.10μg，或每克糠麸约0.11μg、约0.12μg、约0.13μg、约0.14μg、约0.15μg、约0.16μg、约0.17μg、约0.18μg、约0.19μg或约0.20μg。
在另一个实例中，木聚糖酶的量为但不限于每克糠麸至少0.4％，或每克糠麸约0.5％、每克糠麸约0.6％、每克糠麸约0.7％、每克糠麸约0.8％、每克糠麸约0.9％、每克糠麸约1％、每克糠麸约1.5％或每克糠麸约2％。
如本文公开的“替代方法”所示，所要求保护的方法的子过程的进行顺序对所得产物有影响。例如，如果发酵步骤在酶提取/消化之前进行，则可能出现以下问题：在发酵过程中细菌分泌的蛋白酶可抑制阿魏酰酯酶活性，从而对该方法的产量产生负面影响；将来自发酵的细菌延续到阿魏酸提取的液相中可妨碍阿魏酸的纯化和水的再利用，并使其复杂化，从而使所得方法较不经济；在不受理论束缚的情况下，酶消化(为了将阿魏酸释放到液相中)需要大量水。因此，如果酶消化与细菌发酵同时进行，则可能无法有效释放阿魏酸；如果同时或以相反的顺序进行该方法，则细菌发酵产生的还原糖将从发酵的糠麸中被冲走，从而降低所得发酵糠麸的营养含量和营养价值。
为了从本文公开的方法的产物中获得阿魏酸，需要将阿魏酸与其(载体)液相分离。本领域技术人员将理解，这可以使用本领域已知的方法来实现。这些方法可以是但不限于蒸馏、真空蒸馏、分批蒸馏、连续蒸馏、溶剂萃取和固相萃取。
在一个实例中，从本文公开的方法获得的阿魏酸以每克糠麸0.4mg阿魏酸至每克糠麸6mg阿魏酸的产量获得。在另一个实例中，阿魏酸的产量为0.4mg至0.8mg、0.5mg至1mg、0.75mg至1.25mg、0.8mg至1.3mg、0.9mg至1.4mg、1.3mg至1.8mg、1.5mg至2mg、1.75mg至2.25mg、1.8mg至2.3mg、1.9mg至2.4mg、2.3mg至2.8mg、2.5mg至3mg、2.75mg至3.25mg、2.8mg至3.3mg、2.9mg至3.4mg、3.3mg至3.8mg、3.5mg至4mg、3.75mg至4.25mg、3.8mg至4.3mg、3.9mg至4.4mg、4.3mg至4.8mg、4.5mg至5mg、4.75mg至5.25mg、4.8mg至5.3mg、4.9mg至5.4mg、5.3mg至5.8mg、或5.5mg至6mg。在另一个实例中，阿魏酸的产量为每克糠麸1.5mg至1.75mg阿魏酸。在又另一个实例中，阿魏酸的产量为每克糠麸约1.65mg阿魏酸。
此外，固相或组分与液相的分离可以使用例如但不限于离心、过滤和沉降的方法进行。
在一个实例中，本文公开的发酵步骤是固态发酵(SSF)步骤。
尽管文献中已提出碱和酶处理用于提取阿魏酸，但这些方法存在一些问题，例如环境问题和可持续性以及成本。在本申请中，这些问题已经通过例如使提取阿魏酸中使用的水再循环，以及在产生动物饲料成分的发酵过程中使用残留的麦麸来解决。动物饲料成分的实例包括但不限于作为本文公开的糠麸发酵过程的结果的含有益生菌芽孢杆菌的动物饲料成分。与未经历所要求保护的方法的糠麸相比，通过本文公开的方法获得的此类动物饲料成分具有增加的还原糖含量。
为了使糠麸(例如麦麸)有价值，本公开内容示出示例性工作流，其中首先从糠麸中提取阿魏酸，随后对残留的糠麸进行后续固态发酵(SSF)，然后可以对其进行进一步加工以用于产生动物饲料成分。(参见例如图1)。
另外，本文公开的酶处理允许阿魏酸的提取，而不损害后续发酵所需的微生物的生长。含有残留酶的用于阿魏酸提取的水可被再利用于处理后续批次的糠麸。这还将对本文公开的方法具有积极的经济影响，然后与已知方法相比，本文公开的方法被认为是环境友好的且具有成本效益。
此外，显示了与非发酵的糠麸相比，通过微生物发酵的糠麸含有更高量的还原糖，从而显示并突出了从本文公开的方法获得的糠麸提高其所含营养物质的生物利用度。
为了说明上述内容，如本文公开的实验部分所描述的进行实验。
16小时后，将液体级分与麦麸分离。通过高效液相色谱(HPLC)分析来自该液相的阿魏酸。阿魏酸产量为1.65g/kg麦麸，如表1中提供的结果所示。
表1显示了从本文公开的三种方法(即“整合方法”、“对照方法”和“发酵”)提取的阿魏酸的定量结果。16小时后，将液体级分与麦麸分离。通过HPLC对来自液相的阿魏酸进行分析。使用阿魏酸标准曲线对阿魏酸的量进行定量。低于标准曲线所涵盖的范围的值被认为是不可定量的(N.Q.)。“整合方法”的阿魏酸产量为1.65mg/g麦麸。用其他方法处理的麦麸未产生可定量的产量。
残留的麦麸用DSM33837进行固态发酵，并且然后进行干燥。对干燥的固态发酵(SSF)产物进行再水化，并分析活微生物、还原糖含量。
“替代方法”设置的结果(参见图4)表明，当酶提取和细菌发酵同时进行时，在该方法中没有回收到可定量的阿魏酸(数据未显示)，这突出了在单个方法流中组合两个过程的挑战。
本文示例性描述的本发明可以在不存在本文未具体公开的任何一个或更多个要素、一个或更多个限制的情况下适当地实践。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应被广泛地理解并且不受限制。此外，本文中使用的术语和表达已被用作描述性而非限制性的术语，并且在使用此类术语和表达时无意排除所示出和所描述的特征或其部分的任何等同物，但是应认识到在本发明要求保护的范围内可以进行各种修改。因此，应当理解，尽管已经通过优选的实施方案和任选的特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以对本文公开的本发明实施的修改和变化进行修改和变化，并且此类修改和变化被认为在本发明的范围内。
如本申请中所用的，单数形式“一(a、an)”和“该”包括复数引用，除非上下文另外明确指出。例如，术语“一种基因标志物”包括多于一种基因标志物，包括其混合物和组合。
如本文所用的，术语“约”在制剂组分浓度的背景下通常是指规定值的+/-5％，更通常是指规定值的+/-4％，更通常是指规定值的+/-3％，更通常是指规定值的+/-2％，甚至更通常是指规定值的+/-1％，并且甚至更通常是指规定值的+/-0.5％。
贯穿本公开内容，某些实施方案可以以范围形式公开。应当理解，以范围形式进行描述仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对所公开的范围的范围的僵化限制。因此，范围的描述应当被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，例如1至6的范围的描述应当被认为具体公开了子范围，例如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的各个数值，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的宽度如何，这均适用。
某些实施方案也可以在本文中广泛且一般性地描述。落入属的公开内容的范围内的每个较窄的种和亚属分组也形成本公开内容的一部分。这包括实施方案的属的描述，具有从该属中除去任何主题的附带条件或负面限制，无论本文是否具体述及所切除的材料。
本文已广泛且一般性地描述了本发明。落入属的公开内容的范围内的每个较窄的种和亚属分组也形成本发明的一部分。这包括本发明的属的描述，具有从该属中除去任何主题的附带条件或否定限制，无论本文是否具体述及所切除的材料。
其他实施方案在所附权利要求和非限制性实例内。此外，当本发明的特征或方面按照马库什组描述时，本领域技术人员将认识到本发明也因此按照马库什组的任何单独成员或成员亚组进行描述。
实验部分
麦麸的酶处理
将麦麸在121℃高压灭菌15分钟，并在烤箱中干燥过夜。将灭菌的麦麸(19g)置于1升锥形烧瓶中。在“整合方法”中，添加237.5g水、2.85μg重组黑曲霉阿魏酸酯酶(AnFAE)和95μL(0.5％(v/w))市售木聚糖酶(Megazyme)。这意味着每克麦麸使用的阿魏酸酯酶和市售木聚糖酶的量分别为0.15μg和0.5％。在酶水解中使用的麦麸与水的比例为1:12.5(将12.5g水添加至1g麦麸中)。在“对照方法”中，将237.5g水添加至麦麸中。在“发酵”中，将19g水添加至麦麸中。所有烧瓶在37℃孵育16小时。回收液体级分，离心，并保存用于阿魏酸分析。处理的麦麸随后用于固态发酵。时间0小时被采用为酶水解前，并且时间16小时为酶水解后。
固态发酵(SSF)产物的产生
在开始润湿的麦麸的固态发酵之前，将50ml falcon聚丙烯管中的1g无菌麦麸用1ml(1.6×108CFU)DSM33837接种，并允许其在37℃孵育3小时。随后，在“整合方法”的烧瓶中，将1g接种的麦麸与酶处理的麦麸充分混合。在“对照方法”中，将1g无菌麦麸和1ml水在烧瓶中与水处理的麦麸充分混合。在“发酵”中，将1g无菌麦麸和1ml水在烧瓶中与预先润湿的麦麸充分混合。发酵在37℃总计进行24小时。发酵后，用双层粗棉布覆盖烧瓶，并在60℃培养箱中干燥，直至多余水分被完全蒸发。
固态发酵(SSF)还原糖的测量
使用本领域中描述的3,5-二硝基水杨酸(DNS)方法，检查固态发酵(SSF)过程中释放的总还原糖。将300μl适当稀释的无细胞发酵粗提物添加到900μl DNS试剂中，并在100℃煮沸5分钟。随后，测量540nm处的吸光度(A540nM)，并从木糖标准曲线外推释放的还原糖的量。
固态发酵(SSF)产物干燥后的活微生物菌落计数
通过在10ml蒸馏水中再水化1g干燥的固态发酵产物并充分振荡，检查从干燥后的固态发酵(SSF)产物中活微生物的回收情况。将悬浮液连续稀释至10-4。将稀释的样品铺板在LB(Luria Bertani)琼脂板上并在37℃孵育过夜。对所得菌落形成单位(CFU)进行计数并用于计算样品中存在的CFU/g粗粉。
使用高效液相色谱(HPLC)对阿魏酸进行定量.
通过HPLC(Shimadzu Prominence LC-20AD系统，配备有二极管阵列检测器SPD-M2A)测定阿魏酸的浓度。C18柱(5μm×250mm×4.6mm)(ODS-HYPERSIL-2,Thermo Fisher)用梯度流动相洗脱，所述梯度流动相由作为洗脱剂A的0.1％乙酸和作为洗脱剂B的100％甲醇组成。流量保持在每分钟1ml。柱温箱设置在24℃。将10μl适当稀释的样品注射至柱中进行分析。监测340nm处的峰值。使用阿魏酸标准曲线对阿魏酸的量进行定量。
使用毕赤酵母表达系统产生重组阿魏酸酯酶
对编码来自黑曲霉的阿魏酸酯酶基因(AnFAE)的DNA进行密码子优化并合成。使用EcoRI/NotI限制性位点将该基因克隆到pPIC9K载体中，并在毕赤酵母GS115中表达。通过在缓冲的基础甲醇复合培养基(buffered minimal methanol-complex medium；BMMY；0.1M磷酸钾缓冲液pH 6.0、1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％不含氨基酸的YNB、0.4μg/ml生物素、1％甲醇)中在28℃振荡(200rpm)生长细胞来实现蛋白表达。每12小时用1％甲醇饲养细胞，持续4天。随后，将培养物以4,000rpm离心30分钟以获得并除去细胞沉淀物。浓缩含有黑曲霉阿魏酸酯酶的上清液，并使用牛血清白蛋白(BSA)作为标准品，通过Bradford法测定蛋白浓度。将无细胞上清液用作后续实验的粗酶。
合成基因的DNA序列如下，EcoRI限制性位点位于5’端，并且NotI限制性位点位于3’端(加下划线)：
合成基因的蛋白序列如下(与蛋白数据库中的XP_001393337.1序列相同)：
微生物菌株的分离与鉴定
将1克农业植物生物质和5ml无菌蒸馏水添加至50ml falcon聚丙烯管中，并在37℃培养箱中培养。数天后，将培养物样品在Luria Bertani(LB)琼脂板上划线，并在37℃孵育过夜。通过反复划线进行传代培养以获得纯培养物。挑取生长的单菌落并接种到LB肉汤中在37℃以220rpm过夜。次日，收集培养物，用水洗涤，并以初始OD600为0.2接种到含有0.5％(w/v)山毛榉木木聚糖作为唯一碳源的M9基本培养基(6.78g/LNa2HPO4·7H20，3g/LKH2PO4，1g/L NH4Cl，0.5g/L NaCl)中。将管在37℃以220rpm孵育几天，并通过使用Azurine交联木聚糖(AZCL-木聚糖)的平板筛选评估它们的酶活性，随后使用3,5-二硝基水杨酸(DNS)方法进行木聚糖酶活性测定。选择具有高木聚糖酶活性的分离株并在-80℃储存在30％甘油中以供进一步分析。
微生物鉴定
通过16S rRNA测序进一步鉴定分离的菌株的系统发生。基因组DNA提取按照Hoffman等人(1987；Gene；57；267-272)描述的方法进行，并用作PCR模板，使用以下通用引物进行16S rRNA部分基因扩增(～500bp)：WIC1P2336(5’-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3’；SEQ ID NO:3)和WIC1P2337(5’-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3’；SEQ ID NO:4)。纯化扩增子并进行测序。使用国家生物技术信息中心(NCBI)上的基本局部比对搜索工具(BLASTN)对GenBank数据库进行序列相似性和同源性分析。
“替代方法”的描述
在“替代方法”中，酶提取和细菌发酵同时进行。为此，用1ml(1.6×108CFU)DSM33837接种1g无菌麦麸，并允许在37℃培养3小时。随后，在“替代方法”的烧瓶中，将1g接种的糠麸与19g麦麸、19g水和2.85μg黑曲霉阿魏酸酯酶充分混合。将烧瓶在37℃孵育16小时。此后，添加另外的200g水，并在37℃孵育另外的6小时。移出液体级分，离心，并保存用于阿魏酸分析。
序列表
<110> 丰益国际有限公司
<120> 提取和发酵方法
<130> 77142SG
<160> 4
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 794
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 黑曲霉(Aspergillus niger)阿魏酸酯酶基因（AnFAE）的DNA序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(6)
<223> EcoRI限制性位点
<220>
<221> misc_feature
<222> (787)..(794)
<223> NotI限制性位点
<400> 1
gaattcgctt ccactcaggg tatttccgag gacttgtaca acagattggt tgagatggcc 60
actatctccc aagctgctta cgctgacttg tgtaacatcc catccaccat catcaagggt 120
gagaaaatct acaacgccca gaccgacatt aacggttgga tcttgagaga tgacacctcc 180
aaagagatca tcaccgtttt cagaggtact ggttccgaca ccaacttgca gttggacact 240
aactacactc tgaccccatt cgacactttg ccacagtgta acgactgtga agttcacggt 300
ggttactaca tcggttggat ttccgttcaa gaccaggttg agtccttggt taagcaacag 360
gcttctcagt acccagacta cgctttgact gttactggtc actctttggg tgcttctatg 420
gctgctttga cagctgctca attgtccgct acttacgaca acgttagact gtacactttc 480
ggtgagccaa gatccggtaa ccaggctttt gcttcttaca tgaacgacgc tttccaggtg 540
tcctctccag agactactca gtacttcaga gttacccact ccaacgacgg tatcccaaat 600
ttgccaccag ctgaacaagg ttacgctcat ggtggtgttg aatactggtc tgttgaccca 660
tactccgctc agaacacttt cgtctgtact ggtgacgagg ttcagtgttg tgaagctcaa 720
ggtggacaag gtgttaacga cgctcacact acttacttcg gtatgacttc cggtgcttgt 780
acttgggcgg ccgc 794
<210> 2
<211> 260
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 黑曲霉阿魏酸酯酶基因（AnFAE）的合成基因的蛋白序列
<400> 2
Ala Ser Thr Gln Gly Ile Ser Glu Asp Leu Tyr Asn Arg Leu Val Glu
1 5 10 15
Met Ala Thr Ile Ser Gln Ala Ala Tyr Ala Asp Leu Cys Asn Ile Pro
20 25 30
Ser Thr Ile Ile Lys Gly Glu Lys Ile Tyr Asn Ala Gln Thr Asp Ile
35 40 45
Asn Gly Trp Ile Leu Arg Asp Asp Thr Ser Lys Glu Ile Ile Thr Val
50 55 60
Phe Arg Gly Thr Gly Ser Asp Thr Asn Leu Gln Leu Asp Thr Asn Tyr
65 70 75 80
Thr Leu Thr Pro Phe Asp Thr Leu Pro Gln Cys Asn Asp Cys Glu Val
85 90 95
His Gly Gly Tyr Tyr Ile Gly Trp Ile Ser Val Gln Asp Gln Val Glu
100 105 110
Ser Leu Val Lys Gln Gln Ala Ser Gln Tyr Pro Asp Tyr Ala Leu Thr
115 120 125
Val Thr Gly His Ser Leu Gly Ala Ser Met Ala Ala Leu Thr Ala Ala
130 135 140
Gln Leu Ser Ala Thr Tyr Asp Asn Val Arg Leu Tyr Thr Phe Gly Glu
145 150 155 160
Pro Arg Ser Gly Asn Gln Ala Phe Ala Ser Tyr Met Asn Asp Ala Phe
165 170 175
Gln Val Ser Ser Pro Glu Thr Thr Gln Tyr Phe Arg Val Thr His Ser
180 185 190
Asn Asp Gly Ile Pro Asn Leu Pro Pro Ala Glu Gln Gly Tyr Ala His
195 200 205
Gly Gly Val Glu Tyr Trp Ser Val Asp Pro Tyr Ser Ala Gln Asn Thr
210 215 220
Phe Val Cys Thr Gly Asp Glu Val Gln Cys Cys Glu Ala Gln Gly Gly
225 230 235 240
Gln Gly Val Asn Asp Ala His Thr Thr Tyr Phe Gly Met Thr Ser Gly
245 250 255
Ala Cys Thr Trp
260
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> WIC1P2336（用于16S rRNA分析的通用引物）
<400> 3
cctacgggag gcagcag 17
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> WIC1P2337（用于16S rRNA分析的通用引物）
<400> 4
ggactachvg ggtwtctaat 20

Claims (11)

1.一种从糠麸中获得阿魏酸，随后对所述糠麸进行后续发酵的方法，所述方法包括：
a.将所述糠麸、水和酶合并以获得混合物，其中所述酶水解(半)纤维素；
b.在孵育步骤中孵育步骤a的所述混合物；
c.将步骤b的所述混合物分离成液相和固相；
d.分离步骤c中获得的所述液相并从所述液相中获得阿魏酸；
e.用发酵糠麸的微生物接种步骤c获得的固相；
f.在发酵步骤中孵育步骤e的接种的固相；从而获得发酵的糠麸。
2.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述微生物选自由芽孢杆菌属的种(Bacillus spp.)、乳杆菌属的种(Lactobacillus spp.)和曲霉属的种(Aspergillusspp.)组成的组。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述微生物是芽孢杆菌属菌株DSM33837。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述酶是木聚糖酶和/或阿魏酸酯酶。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用选自由以下组成的组的方法获得步骤d中的所述阿魏酸：蒸馏、真空蒸馏、分批蒸馏、连续蒸馏、溶剂萃取和固相萃取。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用选自由以下组成的组的方法进行步骤c中固相和液相的分离：离心、过滤和沉降。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤d的从所述液相获得所述阿魏酸之后，将剩余的液相添加至步骤a。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中以每克糠麸0.4mg阿魏酸至每克糠麸6mg阿魏酸的产量获得步骤d的来自所述液相的阿魏酸。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述发酵步骤是固态发酵(SSF)步骤。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤f中获得的发酵的糠麸用作动物饲料成分。
11.根据权利要求11所述的方法，其中所述糠麸选自由小麦、玉蜀黍、稻米、脱脂稻米、高粱、大麦、黑麦和燕麦组成的组。
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