CN117545502A

CN117545502A - 诱导针对严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(sars-cov-2)有关变种的免疫应答的方法

Info

Publication number: CN117545502A
Application number: CN202280037915.2A
Authority: CN
Inventors: 特雷弗·史密斯; 斯蒂芬妮·拉莫斯; 维维亚娜·马查多·德·梅洛·安德拉德
Original assignee: Inovio Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Inovio Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2021-04-13
Filing date: 2022-04-13
Publication date: 2024-02-09

Abstract

本文公开了编码SEQ ID NO:1的残基19‑1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55‑3837的质粒、pGX9501、INO‑4800药品、或其生物仿制药的施用方法和用途，以诱导针对严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS‑CoV‑2)变种B.1.351、SARS‑CoV‑2变种B.1.1.7、SARS‑CoV‑2变种P.1、SARS‑CoV‑2变种B.1.617.1、SARS‑CoV‑2变种B.1.617.2或SARS‑CoV‑2变种B.1.1.529的免疫应答。

Description

诱导针对严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-COV-2) 有关变种的免疫应答的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求以下申请的权益：2021年4月13日提交的美国临时申请号63/174,375；2021年6月25日提交的美国临时申请号63/215,172；2021年9月23日提交的美国临时申请号63/247,707；2022年2月11日提交的美国临时申请号63/309,387；以及2022年2月25日提交的美国临时申请号63/314,074。这些申请中的每一项均通过引用整体并入本文。

序列表

本申请含有已经以ASCII格式电子提交的序列表，并且在此通过引用整体并入本文。创建于2022年4月13日的所述ASCII副本命名为104409_000679_SL.txt并且大小为25,862字节。

技术领域

本发明涉及施用编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物的方法，以诱导针对严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529的免疫应答。

背景技术

SARS-CoV-2是COVID-19大流行的病原体，继续造成前所未有的死亡率和社会经济负担。令人担忧的是，病毒监测显示新型SARS-CoV-2变种在全球范围内传播，这些变种更具传染性，并且表现出增加的传播性和病理学特征[Chen,R.E.等人，Resistance of SARS-CoV-2variants to neutralization by monoclonal and serum-derived polyclonalantibodies.Nat Med,2021；Davies,N.G.等人，Increased mortality in community-tested cases of SARS-CoV-2lineage B.1.1.7.Nature,2021；Davies,N.G.等人，Estimated transmissibility and impact of SARS-CoV-2lineage B.1.1.7inEngland.Science,2021.372(6538)。]。这些有关变种(VOC)中的一些含有在刺突蛋白受体结合结构域(RBD)中的突变，该区与宿主ACE2受体相互作用，也是许多SARS-CoV-2中和抗体所靶向的区。B.1.1.7谱系是英国报告的第一个新兴VOC，含有在RBD和/或S1区中的N501Y和D614G突变以及del69-70，已证明了增加的传播性和病理学特征，但似乎没有显著逃避由当前已批准使用的疫苗产生的中和抗体应答[Wu,K.等人，mRNA-1273vaccine inducesneutralizing antibodies against spike mutants from global SARS-CoV-2variants.bioRxiv,2021；Xie,X.等人，Neutralization of SARS-CoV-2spike 69/70deletion,E484K and N501Y variants by BNT162b2 vaccine-elicited sera.NatMed,2021。]。B.1.351(南非变种)和P.1(巴西变种)谱系具有另外的突变，包括在RBD区中的E484K[Wibmer,C.K.等人，SARS-CoV-2501Y.V2 escapes neutralization by SouthAfrican COVID-19donor plasma.bioRxiv,2021；Wang,Z.等人，mRNA vaccine-elicitedantibodies to SARS-CoV-2and circulating variants.Nature,2021；Garcia-Beltran,W.F.等人，Multiple SARS-CoV-2variants escape neutralization by vaccine-inducedhumoral immunity.Cell,2021。]。印度出现了已经与增加的传播性和对中和的抗性相关联的多种VOC，包括双突变体B.1.617.1和德尔塔(δ)变种B.1.617.2。

值得注意的是，从暴露于野生型(WT)刺突蛋白序列(来自GenBank RefSeq序列NC_045512.2)的恢复期个体和疫苗接种者分离的血清已显示出针对B.1.351和P.1变种的显著较低的中和活性水平[Garcia-Beltran,W.F.等人，Multiple SARS-CoV-2variants escapeneutralization by vaccine-induced humoral immunity.Cell,2021；Wang,P.等人，Increased Resistance of SARS-CoV-2Variants B.1.351and B.1.1.7to AntibodyNeutralization.bioRxiv,2021；Edara,V.V.等人，Reduced binding and neutralizationof infection-and vaccine-induced antibodies to the B.1.351(South African)SARS-CoV-2variant.bioRxiv,2021；Madhi,S.A.等人，Efficacy of the ChAdOx1 nCoV-19Covid-19Vaccine against the B.1.351Variant.N Engl J Med,2021；Mahase,E.,Covid-19:Novavax vaccine efficacy is 86％against UK variant and 60％againstSouth African variant.2021.372:p.n296。]。

发明内容

本文提供通过向有此需要的受试者施用有效量的编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物来在该受试者中诱导针对严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529的免疫应答的方法。本文还提供保护有此需要的受试者免受SARS-CoV-2变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529感染的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物。进一步提供在有此需要的受试者中治疗SARS-CoV-2变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529感染的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的编码SEQ IDNO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物。本文还提供通过向受试者施用有效量的编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物来治疗或保护该受试者免受与SARS-CoV-2变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529感染相关联的疾病或病症的方法。在一些实施例中，与受SARS-CoV-2变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529感染相关联的疾病或病症为2019冠状病毒病(COVID-19)、成人多系统炎症综合征(MIS-A)或儿童多系统炎症综合征(MIS-C)。在这些方法中的任何方法中，所述施用可以包含电穿孔和注射中的至少一者。根据一些实施例，所述施用包括肠胃外施用，例如通过皮内、肌内或皮下注射，任选地然后是电穿孔。在所公开方法的一些实施例中，向受试者施用约0.5mg至约2.0mg编码SEQ IDNO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物的初始剂量，任选地该初始剂量为0.5mg、1.0mg或2.0mg编码SEQ IDNO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物。该方法可进一步涉及在初始剂量之后约四周，向受试者施用约0.5mg至约2.0mg编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物的后续剂量，任选地其中该后续剂量为0.5mg、1.0mg或2.0mg编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒，包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物。在更进一步的实施例中，该方法涉及在初始剂量之后至少十二周，向受试者施用约0.5mg至约2.0mg编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物的一个或多个进一步后续剂量，任选地其中该进一步后续剂量为0.5mg、1.0mg或2.0mg编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物。

本文提供编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物在一种在有此需要的受试者中诱导针对SARS-CoV-2变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529的免疫应答的方法中的用途。本文还提供编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物在一种保护有此需要的受试者免受SARS-CoV-2变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529感染的方法中的用途。还提供编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物在一种在有此需要的受试者中治疗SARS-CoV-2变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529感染的方法中的用途。本文还提供编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物在一种治疗或保护受试者免受与受SARS-CoV-2变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529感染相关联的疾病或病症的方法中的用途。在一些实施例中，与受SARS-CoV-2变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529感染相关联的疾病或病症为2019冠状病毒病(COVID-19)、成人多系统炎症综合征(MIS-A)或儿童多系统炎症综合征(MIS-C)。根据这些用途中的任一者，可以通过电穿孔和注射中的至少一者向受试者施用编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物。在一些实施例中，经胃肠外，例如通过皮内、肌肉内或皮下注射，任选地然后进行电穿孔来向受试者施用编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物。在所公开用途的一些实施例中，向受试者施用约0.5mg至约2.0mg编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物的初始剂量，任选地该初始剂量为0.5mg、1.0mg或2.0mg INO-4800或其生物类似物。该用途可进一步涉及在初始剂量之后约四周，向受试者约0.5mg至约2.0mg编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物的后续剂量，任选地其中该后续剂量为0.5mg、1.0mg或2.0mg编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒，包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物。在更进一步的实施例中，该用途涉及在初始剂量之后至少十二周，向受试者施用约0.5mg至约2.0mg编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物的一个或多个进一步后续剂量，任选地其中该进一步后续剂量为0.5mg、1.0mg或2.0mg编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ IDNO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物。

本文进一步提供编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物在制备药物中的用途，该药物用于针对SARS-CoV-2变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529感染进行治疗或保护。在一些实施例中，该药物用于针对与受SARS-CoV-2变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529感染相关联的疾病或病症进行治疗或保护。在一些实施例中，与受SARS-CoV-2变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529感染相关联的疾病或病症为2019冠状病毒病(COVID-19)、成人多系统炎症综合征(MIS-A)或儿童多系统炎症综合征(MIS-C)。

附图说明

图1A和1B显示针对SARS-CoV-2变种的体液抗体交叉反应性应答。在图1A中，通过ELISA评估1期INO-4800疫苗接种者的血清的IgG与WT、B.1.1.7、B.1.351和P.1变种刺突蛋白(S1和S2)的结合。数据点指示单个研究样品变种的端点滴度(n＝4，0.5mg疫苗剂量；n＝5，1.0mg；n＝11，2.0mg)，并计算为表现出高于基线的OD 3SD的的滴度。图1B显示来自13或12名1期INO-4800疫苗接种者的血清样品的SARS-CoV-2假病毒中和ID50滴度，将WT与B.1.1.7、B.1.351、P.1和B.1.617.2进行比较。每个数据点代表每个个体的技术重复的平均值(n＝1，0.5mg疫苗剂量；n＝4，1.0mg；n＝8，2.0mg)。虚线指示检测限为16。ns-不显著，*P<0.05，***P<0.0001(Wilcoxon符号秩检验)。

图2显示针对SARS-CoV-2变种的INO-4800细胞免疫应答。在接受INO-4800的第二剂量之后8周，收集来自10名1期受试者的PBMC(n＝5，1.0mg；n＝5，2.0mg)。用跨越WT、B.1.1.7、B.1.351或P.1变种的整个刺突蛋白的肽池处理PBMC，并通过IFNγELISpot测定来测量细胞应答。平均值±s.e.m。显示了一式三份实验的IFNγSFU/百万PBMC。ns-不显著(Wilcoxon符号秩检验)。

图3A至3C显示SARS-CoV-2刺突蛋白的示意图和分子建模。图3A提供刺突蛋白图，其主要特征标记为：N末端结构域(NTD)、受体结合结构域(RBD)、融合肽(FP)、七肽重复序列1和2(HR1和HR2)、跨膜区(TM)、C末端结构域(CT)。图3B提供带有针对B.1.1.7、B.1.351和P.1变种指示的突变的刺突蛋白的分子模型。描绘了三聚体模型，其中一个亚基作为Ca迹线且与图3A中的图相同地着色，为了清楚起见，概述了两个亚基。未建模的大环由虚线指示，并且分子的茎和跨膜部分用圆柱体指示。图3C提供刺突蛋白的图，其中标记了主要特征并针对B.1.1.7、B.1.351、P.1和B.1.617.2变种指示了突变。

图4显示针对SARS-CoV-2变种的交叉中和抗体应答。来自12名2期INO-4800疫苗接种者的血清样品的SARS-CoV-2假病毒中和ID50滴度，将WT与B.1.617.1进行比较。每个数据点代表每个个体的技术重复的平均值。虚线指示检测限为16。***P<0.0001(Wilcoxon符号秩检验)。

图5显示针对B.1.617.2德尔塔变种的INO-4800细胞免疫应答。在接受INO-4800的第二剂量之后8周，收集来自10名1期受试者的PBMC。用跨越WT或B.1.617.2变种的整个刺突蛋白的肽池处理PBMC，并通过IFNγELISpot测定来测量细胞应答。平均值±s.e.m。显示了一式三份实验的IFNγSFU/百万PBMC。ns-不显著(Wilcoxon符号秩检验)。

图6A至6D示出在用INO-4800初免的恒河猴中体液免疫应答的研究设计和持久性。图6A提供描绘初次免疫接种时间表和样品收集时间点的示意图。注：1mg剂量组的NHP的纵向收集在第35周结束，而2mg剂量组的NHP的纵向收集在第52周结束。图6B显示在第0周和第4周用1或2mg INO-4800进行疫苗接种的恒河猴的纵向血清IgG结合滴度。测量了血清中针对野生型SARS-CoV-2刺突蛋白抗原的抗体滴度。还测量了血清中针对SARS-CoV-2S1、SARS-CoV-2S2和RBD蛋白抗体的滴度(图6D)。图6C显示在用INO-4800初免的NHP中的纵向假病毒中和活性(ID₅₀)，针对祖先(野生型)SARS-CoV-2以及阿尔法(α)(B.1.1.7)、贝塔(β)(B.1.351)和伽马(γ)(P.1)假病毒的SARS-CoV-2假型病毒种群进行测量。

图7A至7D示出在INO-4800初免的恒河猴中同源加强后的体液免疫应答。在加强当天(第0周)以及在加强之后第2周和第4周，测量用1mg INO-4800加强的动物的抗体应答。实线代表几何平均滴度(GMT)或几何平均抑制(GMI)。图7A提供了带有各自动物ID的加强时间表的示意图。图7B显示针对祖先、贝塔、德尔塔、伽马和奥密克戎(ο)刺突蛋白测量的血清IgG结合滴度。图7C示出针对祖先、贝塔、德尔塔、伽马和奥密克戎假病毒血清假病毒测量的中和活性。图7D显示针对祖先、贝塔、德尔塔和伽马刺突蛋白测量的血清中的ACE2阻断活性。

图8A至8F示出在INO-4800初免的恒河猴中同源加强后的细胞免疫应答。在加强当天(第0周)以及在加强之后第2周，测量用1mg INO-4800加强的动物的T细胞应答。图8A至8C显示在INO-4800增强的动物中的针对祖先或贝塔衍生肽池的CD4 T细胞应答，而图8D至8F显示CD8 T细胞应答。IFNγ、IL-2和TNF应答的总和显示在图8C和8F中。条表示中值。

图9A至9C显示INO-4800细胞介导的针对SARS-CoV-2奥密克戎变种的免疫。在图9A中，在接受INO-4800的第二剂量之后8周，收集来自13名1期受试者的PBMC(0.5mg，n＝4；1.0mg，n＝4；2.0mg，n＝5)。使用跨越祖先(WT)和奥密克戎变种的整个刺突蛋白的肽大池处理PBMC，并通过IFNγELISpot测定来测量细胞应答。图将单个受试者应答描述为IFNγSFU/百万PBMC。在图9B中，通过流式细胞术针对由CD4和CD8 T细胞进行的SARS-CoV-2刺突特异性细胞因子产生对来自11名1期受试者的PBMC(选自用于IFNγELISpot测定的子集)进行评估。图描绘了在用WT或奥密克戎大池刺激之后产生的单个细胞因子的频率。图9C示出产生细胞因子的中枢记忆(CM)、效应记忆(EM)或效应(E)T细胞的功能概况，针对所有可评估受试者在饼图中描绘。对所有配对的数据集t进行统计分析。ns：不显著；*：P<0.05(Wilcoxon符号秩检验)。

图10A和10B显示针对SARS-CoV-2奥密克戎变种的体液抗体交叉反应性应答。在图10A中，针对IgG与WT和奥密克戎变种全长刺突蛋白(S1和S2三聚体)和RBD蛋白的结合，通过ELISA对来自1期和2期INO-4800疫苗接种者的血清进行评估。数据点代表单个研究参与者(疫苗剂量：1.0mg，n＝3；2.0mg，n＝7)。在图10B中，针对来自12名1期和2期INO-4800疫苗接种者的血清样品的SARS-CoV-2假病毒中和ID₅₀滴度，将WT与奥密克戎进行比较。每个数据点代表每个个体的技术重复的平均值(疫苗剂量：0.5mg，n＝1；1.0mg，n＝3；2.0mg，n＝8)。虚线指示检测限为8。ns：不显著，**：P<0.001(Wilcoxon符号秩检验)。

具体实施方式

定义

除非另有定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语具有与本领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。在有冲突的情况下，将以本文件(包含定义)为准。虽然以下描述了优选的方法和材料，但是与本文所描述的那些类似或相当的方法和材料可以用于本发明的实施或测试中。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用以其整体并入本文。本文所公开的材料、方法和实例仅是说明性的，而不旨在是限制性的。

术语“包含”旨在包括由术语“基本上由……组成”和“由……组成”涵盖的实例；类似地，术语“基本上由……组成”旨在包括由术语“由……组成”涵盖的实例。本公开还设想了“包括”本文所呈现的实施例或元件、“由本文所呈现的实施例或元件组成”和“基本上由本文所呈现的实施例或元件组成”的其他实施例，无论是否明确地阐述。

应理解，为了清楚起见，本文在单独的实施例的上下文中描述的所公开的材料和方法的某些特征还可以在单一实施例中组合提供。相反，为了简洁起见，文中在单个实施例的上下描述的所公开的材料和方法的各种特征还可以单独提供或以任何子组合提供。

单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指代，除非上下文另有明确说明。

术语“约”在参考数字范围、临界值或特定值使用时用于指示所叙述的值可能与所列值相差多达10％。因此，术语“约”用于涵盖与规定值相差±10％或更小的变化、±5％或更小的变化、±1％或更小的变化、±0.5％或更小的变化或±0.1％或更小的变化。在通过使用先行词“约”将值表达为近似值时，应理解，特定值形成另一个实施例。除非上下文另有明确规定，否则对特定数值的引用至少包含所述特定值。

如本文所用，“佐剂”意指添加到本文所描述的疫苗中以增强抗原的免疫原性的任何分子。

如本文所用，“抗体”意指IgG、IgM、IgA、IgD或IgE类的抗体或片段、其片段或衍生物，包含Fab、F(ab′)2、Fd和单链抗体、双抗体、双特异性抗体、双功能抗体及其衍生物。所述抗体可以是从哺乳动物的血清样品中分离的抗体，多克隆抗体，亲合纯化的抗体或其混合物，所述抗体或其混合物对期望的表位或由其衍生的序列表现出足够的结合特异性。

术语“生物仿制药”(经批准的参考产品/生物药物，即参考上市药物)是指与参考产品高度相似的生物产品，尽管临床非活性组分存在微小差异，但生物仿制药与参考产品在安全性、纯度和效力方面没有临床上有意义的差异，其数据基于(a)分析研究得到的数据，证明生物产品与参考产品高度相似，尽管临床非活性组分存在微小差异；(b)动物研究(包括毒性的评估)；和/或(c)一项或多项临床研究(包括免疫原性和药代动力学或药效学的评估)，其足以证明在一种或多种适当的使用条件下的安全性、纯度和效力，对于所述条件，参考产品被许可并意欲使用，且该生物仿制药正在申请许可。生物仿制药可以是可替换的产品，其可以在药房代替参考产品，而无需处方保健专业人员的干预。为了满足“可互换性”的附加标准，预期生物仿制药在任何给定患者中产生与参考产品相同的临床结果，并且如果生物仿制药向个体施用多于一次，则在使用生物仿制药和参考产品之间交替或转换的安全性或效力降低方面的风险不大于使用参考产品而没有这种交替或转换的风险。生物仿制药对于所提出的使用条件利用相同的作用机制，达到对于参考产品已知的机制的程度。生物仿制药标签中规定、推荐或建议的一种或多种使用条件之前已批准用于参考产品。生物仿制药的施用途径、剂型和/或强度与参考产品的相同，并且生物仿制药是在符合标准的设施中生产、加工、包装或保存的，该标准旨在确保该生物仿制药持续安全、纯净和有效。当与参考产品相比时，生物仿制药可以包括氨基酸序列中的微小修饰，例如N-或C-末端截短，其预期不会改变生物仿制药的性能。

本文所用的“编码序列”或“编码核酸”是指包含编码蛋白质的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。编码序列可以进一步包括与调节元件可操作连接的起始和终止信号，该调节元件包括能够指导在施用核酸的个体或哺乳动物的细胞中表达的启动子和聚腺苷酸化信号。

如本文所用，“共有”或“共有序列”可以意指基于对特定抗原的多个亚型的比对分析而构建的合成核酸序列或对应的多肽序列。所述序列可以用于针对特定抗原的多种亚型、血清型或毒株诱导广泛的免疫力。合成抗原，如融合蛋白，可以被操纵以产生共有序列(或共有抗原)。

如本文可互换使用的“电穿孔”、“电渗透”或“动电增强”(“EP”)意指使用跨膜电场脉冲在生物膜中诱导微观路径(孔)；它们的存在允许生物分子(如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物、离子和水)从细胞膜的一侧传递到另一侧。

如本文所用，“免疫应答”意指响应于抗原的引入而激活宿主的免疫系统，例如哺乳动物的免疫系统。免疫应答可以是细胞或体液应答或两者的形式。

INO-4800药品(或INO-4800疫苗)在1X SSC缓冲液(150mM氯化钠和15mM柠檬酸钠)中含有10mg/mL DNA质粒pGX9501(SEQ ID NO:3)。

如本文所用，“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核酸分子”意指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描述也定义了互补链的序列。因此，核酸也包括所描述的单链的互补链。核酸的许多变体可用于与给定核酸相同的目的。因此，核酸也包括基本上相同的核酸及其互补物。单链提供可以在严格杂交条件下与靶序列杂交的探针。因此，核酸也包括在严格杂交条件下杂交的探针。

核酸可以是单链或双链的，或者可以含有双链和单链序列的部分。核酸可以是DNA(基因组和cDNA)、RNA或杂交体，其中核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及碱基的组合，包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤。核酸可以通过化学合成方法或通过重组方法获得。

本文所用的“可操作地连接”是指基因的表达受与其空间连接的启动子的控制。启动子可以定位于在其控制下的基因的5'(上游)或3'(下游)处。启动子和基因之间的距离可以与启动子和它在启动子来源的基因中控制的基因之间的距离大致相同。如本领域已知的，可以调节该距离的变化而不损失启动子功能。

本文所用的“肽”、“蛋白质”或“多肽”可以指连接的氨基酸序列，并且可以是天然的、合成的，或天然和合成的修饰或组合。

本文所用的“启动子”是指能够赋予、激活或增强核酸在细胞中表达的合成或天然来源的分子。启动子可以包含一个或多个特异性转录调节序列以进一步增强其表达和/或改变其空间表达和/或时间表达。启动子还可以包含远端增强子或阻抑物元件，其可以位于距转录起始位点多达几千个碱基对处。启动子可以来自包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物的来源。启动子可以相对于发生表达的细胞、组织或器官，或相对于发生表达的发育阶段，或响应外部刺激如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂，而组成型或差异地调节基因组分的表达。启动子的代表性实例包含噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、lac操纵子启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子和CMV IE启动子。

“信号肽”和“前导序列”在本文中可互换使用并且是指可以在本文阐述的SARS-CoV-2蛋白质的氨基末端处连接的氨基酸序列。信号肽/前导序列通常指导蛋白质的定位。本文使用的信号肽/前导序列优选地促使蛋白质从产生所述蛋白质的细胞中分泌。信号肽/前导序列通常在从细胞分泌时从蛋白质的其余部分(通常称为成熟蛋白质)裂解。信号肽/前导序列在蛋白质的N端处连接。

如本文所用，“受试者”可以意指想要或需要用本文所描述的免疫原性组合物或疫苗免疫的哺乳动物。哺乳动物可以是人、黑猩猩、豚鼠、狗、猫、马、牛、小鼠、兔或大鼠。

如本文所用，“治疗”或“处理”可以意指通过预防、抑制、阻遏或完全消除疾病的方式来保护动物免受疾病。预防疾病涉及在疾病发作之前向动物施用本发明的免疫原性组合物或疫苗。抑制疾病涉及在诱导疾病之后但在疾病的临床表现之前向动物施用本发明的免疫原性组合物或疫苗。阻遏疾病涉及在疾病的临床表现之后向动物施用本发明的免疫原性组合物或疫苗。

如本文所用，除非另有说明，否则术语“临床证明的”(独立使用或修饰术语“安全的”和/或“有效的”)应意指已通过临床试验证明，其中临床试验已满足美国食品和药品管理局、EMA或相应的国家监管机构的批准标准。例如，证明可以由本文提供的实例中描述的临床试验提供。

术语“在临床上被证明是安全的”，因为它涉及使用SARS-CoV-2抗原(例如，作为编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、或INO-4800、或其生物仿制药施用的SARS-CoV-2刺突抗原)的剂量、给药方案、治疗或方法，是指与标准护理或其它比较者相比具有可接受的频率和/或可接受的治疗出现的不良事件(被称为AE或TEAE)严重程度的有利风险:收益比。不良事件是施用药物产品的患者出现的不良医疗事件。

本文在剂量、给药方案、治疗或方法的上下文中使用的术语“临床证明的功效”和“临床证明有效”是指特定剂量、给药或治疗方案的有效性。功效可以基于对本发明药剂的反应的病程变化来测量。例如，以足以诱导至少一种反映正在治疗的疾病的严重程度的指标改善、优选持续改善的量和时间向患者施用SARS-CoV-2抗原(例如，作为编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、或INO-4800、或其生物类似物施用的SARS-CoV-2刺突抗原)。可以评估反映受试者的疾患、疾病或病状的程度的各种指标以确定治疗的量和时间是否足够。此类指标包括，例如，临床上公认的疾病严重程度、症状或所述病症表现的指标。改善的程度通常由医生确定，医生可以基于体征、症状、活检或其它测试结果做出这种确定，并且医生还可以使用对受试者进行的问卷，例如针对给定疾病开发的生活质量问卷。例如，可以施用SARS-CoV-2抗原(例如，作为编码SEQID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、或INO-4800、或其生物类似物施用的SARS-CoV-2刺突抗原)以实现与SARS-CoV-2感染相关的患者病状的改善。改善可以通过疾病活性指数的改善，通过临床症状的改善或通过疾病活性的任何其它量度来指示。

本文所用的“载体”是指含有复制起点的核酸序列。载体可以是病毒载体、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自我复制的染色体外载体，并且优选地为DNA质粒。

对于本文中数值范围的列举，明确地设想了在其之间具有相同的精确程度的每个中间数字。例如，对于6-9的范围，除了6和9之外，设想了数字7和8；并且对于范围6.0-7.0，明确考虑了数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。

本文提供通过向有此需要的受试者施用编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物来在该受试者中治疗、保护以免受、和/或预防严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)501Y.V2(也称为B.1.351；南非；或贝塔变种)、SARS-CoV-2 20I/501Y.V1(也称为VOC202012/01；B.1.1.7；英国；或阿尔法变种)、SARS-CoV-2变种P.1(也称为巴西或伽马变种)、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2(也称为德尔塔变种)或SARS-CoV-2变种B.1.1.529(也称为奥密克戎变种)感染。向受试者施用编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物可以诱导或引发该受试者的免疫应答。免疫应答可以是细胞免疫应答、体液免疫应答或两者。本文还提供通过向受试者施用编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物来治疗或保护受试者免受与受SARS-CoV-2变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529感染相关联的疾病或病症的方法。在一些实施例中，与受SARS-CoV-2变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529感染相关联的疾病或病症为2019冠状病毒病(COVID-19)、成人多系统炎症综合征(MIS-A)或儿童多系统炎症综合征(MIS-C)。

进一步提供通过向有此需要的受试者施用有效量的编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物来在该受试者中诱导针对SARS-CoV-2变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529的免疫应答的方法。免疫应答可以是细胞免疫应答、体液免疫应答或两者。

在这些方法中的任何方法中，所述施用可以包含电穿孔和注射中的至少一者。根据一些实施例，所述施用包括肠胃外施用，例如通过皮内、肌内或皮下注射，任选地然后是电穿孔。在所公开方法的一些实施例中，向受试者施用约0.5mg至约2.0mg编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物的初始剂量，任选地该初始剂量为0.5mg、1.0mg或2.0mg编码SEQ IDNO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物。该方法可进一步涉及在初始剂量之后约四周，向受试者施用约0.5mg至约2.0mg编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物的后续剂量，任选地其中该后续剂量为0.5mg、1.0mg或2.0mg编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒，包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物。在更进一步的实施例中，该方法涉及在初始剂量之后至少十二周，向受试者施用约0.5mg至约2.0mg编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物的一个或多个进一步后续剂量，任选地其中该进一步后续剂量为0.5mg、1.0mg或2.0mg编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物。

本文提供编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物在一种在有此需要的受试者中诱导针对SARS-CoV-2变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529的免疫应答的方法中的用途。本文还提供编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物在一种保护有此需要的受试者免受SARS-CoV-2变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529感染的方法中的用途。还提供编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物在一种在有此需要的受试者中治疗SARS-CoV-2变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529感染的方法中的用途。本文还提供编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物在一种治疗或保护受试者免受与受SARS-CoV-2变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529感染相关联的疾病或病症的方法中的用途。在一些实施例中，与受SARS-CoV-2变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529感染相关联的疾病或病症为2019冠状病毒病(COVID-19)、成人多系统炎症综合征(MIS-A)或儿童多系统炎症综合征(MIS-C)。根据这些用途中的任一者，可以通过电穿孔和注射中的至少一者向受试者施用编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物。在一些实施例中，经胃肠外，例如通过皮内、肌肉内或皮下注射，任选地然后进行电穿孔来向受试者施用编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物。在所公开的用途的一些实施例中，向受试者施用约0.5mg至约2.0mg编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物的初始剂量，任选地该初始剂量为0.5mg、1.0mg或2.0mg编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物。该用途可进一步涉及在初始剂量之后约四周，向受试者施用约0.5mg至约2.0mg编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物的后续剂量，任选地其中该后续剂量为0.5mg、1.0mg或2.0mg编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物。在更进一步的实施例中，该用途涉及在初始剂量之后至少十二周，向受试者施用约0.5mg至约2.0mg编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物的一个或多个进一步后续剂量，任选地其中该进一步后续剂量为0.5mg、1.0mg或2.0mg编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物。

本文进一步提供编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物在制备药物中的用途，该药物用于针对SARS-CoV-2变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529感染进行治疗或保护。在一些实施例中，提供编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物在制备药物中的用途，该药物用于针对与受SARS-CoV-2变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529感染相关联的疾病或病症进行治疗或预防。在一些实施例中，与受SARS-CoV-2变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529感染相关联的疾病或病症为2019冠状病毒病(COVID-19)、成人多系统炎症综合征(MIS-A)或儿童多系统炎症综合征(MIS-C)。

根据本文所述的方法和用途，诱导的免疫应答可包括诱导的体液免疫应答、诱导的细胞免疫应答或两者。可以诱导约1.5倍至约16倍、约2倍至约12倍或约3倍至约10倍的体液免疫应答。经诱导的体液免疫应答可以包含对抗原具有反应性的IgG抗体和/或中和抗体。诱导的细胞免疫应答可包括CD8+T细胞应答，其被诱导约2倍至约30倍、约3倍至约25倍或约4倍至约20倍。

所公开的编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物的方法和用途可引发体液和细胞免疫应答两者，该免疫应答靶向受体受试者(施用编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物的受试者)中的SARS-CoV-2抗原。例如，编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物可引发中和抗体和免疫球蛋白G(IgG)抗体，这些抗体与SARS-CoV-2变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529的刺突蛋白具有反应性。编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ IDNO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物也可引发CD8+和CD4+T细胞应答，这些细胞应答对SARS-CoV-2变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529的刺突抗原有反应并且产生干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-2(IL-2)或其任何组合。

编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物可以在受体受试者中诱导体液免疫应答。诱导的体液免疫应答可具有对SARS-CoV-2变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529的刺突抗原的特异性。诱导的体液免疫应答可具有与SARS-CoV-2变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529的刺突抗原的反应性。可以在受体受试者中诱导约1.5倍至约16倍、约2倍至约12倍或约3倍至约10倍的体液免疫应答。可以在受体受试者中诱导至少约1.5倍、至少约2.0倍、至少约2.5倍、至少约3.0倍、至少约3.5倍、至少约4.0倍、至少约4.5倍、至少约5.0倍、至少约5.5倍、至少约6.0倍、至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍、至少约10.0倍、至少约10.5倍、至少约11.0倍、至少约11.5倍、至少约12.0倍、至少约12.5倍、至少约13.0倍、至少约13.5倍、至少约14.0倍、至少约14.5倍、至少约15.0倍、至少约15.5倍或至少约16.0倍的体液免疫应答。

与非受体受试者(未施用编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ IDNO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物的受试者)相比，由编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物诱导的体液免疫应答可包括增加的与施用编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物的受试者相关联的中和抗体水平。中和抗体可具有对SARS-CoV-2变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529的刺突抗原的特异性。中和抗体可具有与SARS-CoV-2变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529的刺突抗原的反应性。中和抗体可在受体受试者中提供针对SARS-CoV-2变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529以及相关病理学的保护和/或治疗。

与非受体受试者相比，由编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ IDNO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物诱导的体液免疫应答可包括增加的与受体受试者相关联的IgG抗体水平。这些IgG抗体可具有对SARS-CoV-2变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529的刺突抗原的特异性。这些IgG抗体可具有与SARS-CoV-2变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529的刺突抗原的反应性。与未施用编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物的受试者相比，与施用编码SEQID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物的受试者相关联的IgG抗体水平可增加约1.5倍至约16倍、约2倍至约12倍或约3倍至约10倍。与未施用编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ IDNO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物的受试者相比，与施用编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物的受试者相关联的IgG抗体水平可以增加至少约1.5倍、至少约2.0倍、至少约2.5倍、至少约3.0倍、至少约3.5倍、至少约4.0倍、至少约4.5倍、至少约5.0倍、至少约5.5倍、至少约6.0倍、至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍、至少约10.0倍、至少约10.5倍、至少约11.0倍、至少约11.5倍、至少约12.0倍、至少约12.5倍、至少约13.0倍、至少约13.5倍、至少约14.0倍、至少约14.5倍、至少约15.0倍、至少约15.5倍或至少约16.0倍。

编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物可以在受体受试者中诱导细胞免疫应答。诱导的细胞免疫应答可具有对SARS-CoV-2变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529的刺突抗原的特异性。诱导的细胞免疫应答可对SARS-CoV-2变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529的刺突抗原有反应。经诱导的细胞免疫应答可以包含引发CD8+T细胞应答。引发的CD8+T细胞应答可具有与SARS-CoV-2变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529的刺突抗原的反应性。经引发的CD8+T细胞应答可以是多功能的。诱导的细胞免疫应答可以包含初免CD8+T细胞应答，其中CD8+T细胞产生干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-2(IL-2)或其任何组合。

与非受体受试者相比，诱导的细胞免疫应答可包括增加的与施用编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品或其生物类似物的受试者相关联的CD8+T细胞应答。与未施用编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物的受试者相比，与施用编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ IDNO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物的受试者相关联的CD8+T细胞应答可增加约2倍至约30倍、约3倍至约25倍或约4倍至约20倍。与未施用编码SEQID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物的受试者相比，与施用编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物的受试者相关联的CD8+T细胞应答可以增加至少约1.5倍、至少约2.0倍、至少约3.0倍、至少约4.0倍、至少约5.0倍、至少约6.0倍、至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍、至少约10.0倍、至少约10.5倍、至少约11.0倍、至少约11.5倍、至少约12.0倍、至少约12.5倍、至少约13.0倍、至少约13.5倍、至少约14.0倍、至少约14.5倍、至少约15.0倍、至少约16.0倍、至少约17.0倍、至少约18.0倍、至少约19.0倍、至少约20.0倍、至少约21.0倍、至少约22.0倍、至少约23.0倍、至少约24.0倍、至少约25.0倍、至少约26.0倍、至少约27.0倍、至少约28.0倍、至少约29.0倍或至少约30.0倍。

诱导的细胞免疫应答可包括产生IFN-γ的CD3+CD8+T细胞的增加的频率。与未施用编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物的受试者相比，与施用编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物的受试者相关联的CD3+CD8+IFN-γ+T细胞的频率可增加至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍或20倍。

诱导的细胞免疫应答可包括产生TNF-α的CD3+CD8+T细胞的增加的频率。与未施用编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物的受试者相比，与施用编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物的受试者相关联的CD3+CD8+TNF-α+T细胞的频率可增加至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍或14倍。

诱导的细胞免疫应答可包括产生IL-2的CD3+CD8+T细胞的增加的频率。与未施用编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物的受试者相比，与施用编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物的受试者相关联的CD3+CD8+IL-2+T细胞的频率可增加至少约0.5倍、1.0倍、1.5倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍或5.0倍。

诱导的细胞免疫应答可包括产生IFN-γ和肿瘤坏死因子α(TNF-α)两者的CD3+CD8+T细胞的频率增加。与未施用编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物的受试者相比，与施用编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物的受试者相关联的CD3+CD8+IFN-γ+TNF-α+T细胞的频率可增加至少约25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、100倍、110倍、120倍、130倍、140倍、150倍、160倍、170倍或180倍。

由免疫原性组合物诱导的细胞免疫应答可包括引发CD4+T细胞应答。引发的CD4+T细胞应答可具有与SARS-CoV-2变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529的刺突抗原的反应性。经引发的CD4+T细胞应答可以是多功能的。诱导的细胞免疫应答可包括引发CD4+T细胞应答，其中CD4+T细胞产生IFN-γ、TNF-α、IL-2或其任何组合。

诱导的细胞免疫应答可包括产生IFN-γ的CD3+CD4+T细胞的增加的频率。与未施用免疫原性组合物的受试者相比，与施用该免疫原性组合物的受试者相关联的CD3+CD4+IFN-γ+T细胞的频率可以增加至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍或20倍。

诱导的细胞免疫应答可包括产生TNF-α的CD3+CD4+T细胞的增加的频率。与未施用编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物的受试者相比，与施用编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物的受试者相关联的CD3+CD4+TNF-α+T细胞的频率可增加至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍或22倍。

诱导的细胞免疫应答可包括产生IL-2的CD3+CD4+T细胞的增加的频率。与未施用编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物的受试者相比，与施用编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物的受试者相关联的CD3+CD4+IL-2+T细胞的频率可增加至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍、35倍、36倍、37倍、38倍、39倍、40倍、45倍、50倍、55倍或60倍。

诱导的细胞免疫应答可包括产生IFN-γ和TNF-α两者的CD3+CD4+T细胞的增加的频率。与未施用pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物的受试者相比，与施用编码SEQ IDNO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物的受试者相关联的CD3+CD4+IFN-γ+TNF-α+的频率可以增加至少约2倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5.0倍、5.5倍、6.0倍、6.5倍、7.0倍、7.5倍、8.0倍、8.5倍、9.0倍、9.5倍、10.0倍、10.5倍、11.0倍、11.5倍、12.0倍、12.5倍、13.0倍、13.5倍、14.0倍、14.5倍、15.0倍、15.5倍、16.0倍、16.5倍、17.0倍、17.5倍、18.0倍、18.5倍、19.0倍、19.5倍、20.0倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍或35倍。

根据本文所提供的方法和用途施用的编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物的剂量可以是1μg至10mg活性组分/kg体重/次，并且可以是20μg至10mg组分/kg体重/次。可以每21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或更多天或者每3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多周施用一次。用于有效治疗的剂量数可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个。

根据本文所公开的方法和用途，编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物可以例如在一次、两次、三次、四次或更多次注射中施用。在一些实施例中，向受试者施用约0.5mg至约2.0mg核酸分子的初始剂量。初始剂量可以一次、两次、三次或更多次注射施用。在紧接前一个剂量之后约一周、二周、三周、四周、五周、六周、七周、八周、十周、十二周或更多个周，初始剂量之后可以施用约0.5mg至约2.0mg核酸分子的一、二、三、四或更多个后续剂量。每个后续剂量可以一次、两次、三次或更多次注射施用。在一些实施例中，在另外的药剂之前、同时或之后，向给受试者施用编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物。在一些实施例中，施用不同的用于治疗SARS-CoV-2感染或者治疗或预防与SARS-CoV-2感染相关联的疾病或病症的药剂后，施用编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物作为加强剂。

受试者可以是哺乳动物，诸如人、马、非人灵长类动物、牛、猪、绵羊、猫、狗、豚鼠、兔、大鼠或小鼠。

根据本文所提供的方法和用途，可施用编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、或pGX9501作为免疫原性组合物，该免疫原性组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可以是媒剂、载体、缓冲剂或稀释剂。如本文所用。“缓冲液”是指通过其酸-碱缀合物组分的作用抵抗pH变化的缓冲溶液。缓冲液通常具有约4.0至约8.0，例如约5.0至约7.0的pH。在一些实施例中，缓冲液是盐水-柠檬酸钠(SSC)缓冲液。在一些实施例中，免疫原性组合物包含在缓冲液中、优选地在SSC缓冲液中的10mg/mL编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、或DNA质粒pGX9501。

编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物可以通过多种途径递送。典型的递送途径包括肠胃外施用，例如皮内、肌肉内或皮下递送，任选地然后进行电穿孔，如本文所述。

电穿孔可以例如通过美国专利第7,664,545号中描述的方法，其内容通过引用并入本文。电穿孔可以通过在美国专利号6,302,874、5,676,646、6,241,701、6,233,482、6,216,034、6,208,893、6,192,270、6,181,964、6,150,148、6,120,493、6,096,020、6,068,650和5,702,359中所述的方法和/或设备进行，其内容以全文引用的方式并入本文中。电穿孔可以通过微创器械进行。

微创电穿孔器械(“MID”)可以是用于将上述疫苗和相关流体注射到身体组织中的设备。该器械可以包含中空针、DNA盒和流体递送装置，其中该器械适于在使用中致动流体递送装置，以便在将针插入身体组织期间同时(例如，自动地)将DNA注射到所述身体组织中。这具有这样的优点，即在针插入的同时逐渐注射DNA和相关流体的能力导致流体通过身体组织的更均匀分布。由于被注射的DNA分布在较大的区域上，在注射期间经历的疼痛可以减轻。

MID可以不使用针将疫苗注射到组织中。MID可以用这样的力以小流或射流的形式注射疫苗，使得疫苗刺穿组织的表面并进入下面的组织和/或肌肉。小流或射流后面的力可以由压缩气体(如二氧化碳)在几分之一秒内通过微孔的膨胀提供。在公开的美国专利申请第20080234655号；美国专利6,520,950、7,171,264、6,208,893、6,009,347、6,120,493、7,245,963、7,328,064和6,763,264中，其中每篇的内容通过引用并入本文。

MID可以包含产生无痛刺穿组织的高速液体射流的注射器。这种无针注射器在市场上可以买到。可以在本文中使用的无针注射器的实例包括在美国专利号3,805,783、4,447,223、5,505,697和4,342,310中，其中每篇专利的内容通过引用并入本文。

适合于直接或间接电转运形式的所需疫苗可以使用无针注射器引入(例如，注射)到待治疗的组织中，通常通过使组织表面与注射器接触以致动药剂射流的递送，用足够的力使疫苗穿透到组织中。例如，如果待治疗的组织是粘膜、皮肤或肌肉，则用足够的力将药剂向粘膜或皮肤表面投射，以使药剂分别穿透角质层并进入真皮层，或进入下面的组织和肌肉。

无针注射器非常适合将疫苗递送到所有类型的组织，特别是皮肤和粘膜。在一些实施例中，可以使用无针注射器将含有疫苗的液体推进到表面并进入受试者的皮肤或粘膜。可以使用本发明方法治疗的各种类型组织的代表性实例包括胰腺、喉、鼻咽、下咽、口咽、唇、咽喉、肺、心脏、肾、肌肉、乳房、结肠、前列腺、胸腺、睾丸、皮肤、粘膜组织、卵巢、血管或其任何组合。

MID可以具有使组织电穿孔的针电极。通过在多电极阵列中的多对电极之间产生脉冲，例如以矩形或正方形图案设置，提供了比在一对电极之间产生脉冲的结果更好的结果。例如，公开于题为《用于药物和基因的介导递送的针电极(Needle Electrodes forMediated Delivery of Drugs and Genes)》的美国专利第5,702,359号是针阵列，其中多对针可以在治疗性治疗期间产生脉冲。在该申请中，针被设置成圆形阵列，但具有能够在相对的针电极对之间产生脉冲的连接器和开关设备锁，该申请通过引用并入本文，就像完全阐述一样。可以使用一对针电极将重组表达载体递送到细胞。此类器械和系统在美国专利第6,763,264号中有所描述，其内容通过引用并入本文。替代地，可以使用单针器械，其允许用类似于普通注射针的单针注射DNA和电穿孔，并施加比目前使用的器械传递的电压更低的电压脉冲，从而减少患者经历的电感觉。

MID可以包含一个或多个电极阵列。阵列可以包含两个或更多个相同直径或不同直径的针。针可以均匀地或不均匀地间隔开。这些针可以在0.005英寸与0.03英寸之间，在0.01英寸与0.025英寸之间；或在0.015英寸和0.020英寸之间。针的直径可以是0.0175英寸。针可以间隔0.5mm、1.0mm、1.5mm、2.0mm、2.5mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm或更大。

MID可以由脉冲发生器和双针或多针疫苗注射器组成，它们在单个步骤中递送疫苗和电穿孔脉冲。脉冲发生器可以允许通过闪存卡操作的个人计算机灵活地编程脉冲和注射参数，以及全面地记录和存储电穿孔和患者数据。脉冲发生器可以在短时间内递送各种电压脉冲。例如，脉冲发生器可以递送三个持续时间为100ms的15伏脉冲。这种MID的一个实例是Inovio生物医学公司的Elgen 1000系统，其描述于美国专利第7,328,064号中有所描述，其内容通过引用并入本文。

MID可以是(Inovio制药公司，Blue Bell Pa.)器械和系统，其为模块化电极系统，有助于将大分子(诸如DNA)引入到身体或植株中的选定组织的细胞中。该模块化电极系统可以包含多个针电极；皮下注射针；电连接器，其提供从可编程恒流脉冲控制器到多个针电极的导电链路；以及电源。操作者可以抓住安装在支撑结构上的多个针电极，并将它们牢固地插入身体或植物中的选定组织中。然后通过皮下注射针将大分子递送到选定的组织中。启动可编程恒流脉冲控制器，并向多个针电极施加恒流电脉冲。所施加的恒流电脉冲有助于大分子在多个电极之间引入细胞。由于细胞过热而导致的细胞死亡通过借助于恒流脉冲限制组织中的功率耗散而最小化。/>装置和系统描述于美国专利第7,245,963号中有所描述，其内容通过引用并入本文。/>器械可以是CELLECTRA/>器械或/>3PSP器械。/>2000由制造商配置为支持ID(皮内)或IM(肌肉内)施用。/>2000包括/>脉冲发生器、适当的施源器、一次性无菌阵列和一次性鞘管(仅ID)。DNA质粒在电穿孔处理之前立即通过针和注射器注射分别递送到由电极限定的区域中。

MID可以是Elgen 1000系统(Inovio制药公司)。Elgen 1000系统可包括提供中空针的器械；以及流体递送装置，其中设备适于在使用中致动流体递送装置，以便在将针插入身体组织期间同时(例如，自动地)将流体(本文所述的疫苗)注射到身体组织中。优点是当针插入时逐渐注射流体的能力导致流体通过身体组织的更均匀的分布。还据信，由于被注射的流体体积分布在较大区域上，在注射期间经历的疼痛减轻。

另外，流体的自动注射便于自动监测和记录注射的流体的实际剂量。如果需要，该数据可以由控制单元存储用于文件记录的目的。

应当理解，注射速率可以是线性的或非线性的，并且注射可以在针已经被插入通过待治疗受试者的皮肤之后并且当它们被进一步插入身体组织中时进行。

可通过本发明的设备将流体注射到其中的合适组织包括肿瘤组织、皮肤或肝组织，但可以是肌肉组织。

该设备进一步包含用于引导针插入身体组织的针插入装置。流体注射的速率由针插入速率控制。这具有这样的优点，即针的插入和流体的注射都可以被控制，使得插入速率可以与所希望的注射速率相匹配。这也使得用户更容易操作该设备。如果需要，可以提供用于将针自动插入身体组织的装置。

用户可以选择何时开始注入流体。然而，理想地，当针的尖端已经到达肌肉组织时开始注射，并且该设备可以包括用于感测何时针已经插入到足够深度以开始注射流体的装置。这意味着当针到达所需深度(通常是肌肉组织开始的深度)时，可以促使流体的注射自动开始。肌肉组织开始的深度例如可以取为预设的针插入深度，如4mm的值，其被认为足以使针穿过皮肤层。

感测装置可以包含超声探头。感测装置可以包含用于感测阻抗或电阻变化的装置。在这种情况下，该装置可以不这样记录针在身体组织中的深度，而是适合于当针从不同类型的身体组织移动到肌肉中时检测阻抗或电阻的变化。这些替代方案中的任何一个都提供了一种相对和简单的检测注射开始的操作装置。如果需要，可以进一步记录针的插入深度，并且可以用于控制流体的注射，使得当记录针插入深度时确定待注射的流体的体积。

该设备可以进一步包含：用于支撑针的基座；以及用于在其中容纳基座的壳体，其中基座可相对于壳体移动，使得当基座处于相对于壳体的第一向后位置时，针缩回到壳体内，并且当基座处于壳体内的第二向前位置时，针伸出壳体。这对于使用者是有利的，因为壳体可以在患者的皮肤上对齐，并且然后可以通过相对于基座移动壳体而将针插入患者的皮肤中。

如上所述，希望实现流体注射的受控速率，使得流体在针插入皮肤时均匀地分布在针的长度上。流体递送装置可以包含适于以受控速率注射流体的活塞驱动装置。活塞驱动装置例如可以由伺服马达致动。然而，活塞驱动装置可以通过基座相对于壳体在轴向方向上移动来致动。应当理解，可以提供用于流体递送的替代装置。因此，例如，可以挤压以受控或非受控速率递送流体的封闭容器可以代替注射器和活塞系统。

上述设备可用于任何类型的注射。然而，设想它在电穿孔领域特别有用，因此它可以进一步包含用于向针施加电压的装置。这允许针不仅用于注射，而且在电穿孔期间用作电极。这是特别有利的，因为这意味着电场施加到与注射流体相同的区域。传统上存在电穿孔的问题，即很难将电极与先前注射的流体精确对准，因此使用者倾向于在较大面积上注射比所需更大量的流体，并在较大面积上施加电场以试图保证注射物质和电场之间的重叠。使用本发明，可以减小注射的流体的体积和施加的电场的大小，同时实现电场和流体之间的良好配合。

组合使用

在一些实施例中，本发明提供一种通过施用编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物与一种或多种用于治疗SARS-CoV-2感染或者治疗或预防与SARS-CoV-2感染相关联的疾病或病症的另外的药剂组合来在有此需要的受试者中治疗SARS-CoV-2变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529感染，或者治疗、保护以免受、和/或预防与此类SARS-CoV-2感染相关联的疾病或病症的方法。在一些实施例中，与SARS-CoV-2感染相关联的疾病或病症为2019冠状病毒病(COVID-19)、成人多系统炎症综合征(MIS-A)或儿童多系统炎症综合征(MIS-C)。

可使用任何合适的方法施用编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ IDNO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物和另外的药剂，使得组合的编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物和另外的药剂两者都存在于该受试者中。在一个实施例中，该方法可以包括施用包含用于治疗SARS-CoV-2感染或者治疗或预防与SARS-CoV-2感染相关联的疾病或病症的药剂的第一组合物，以及在施用包含用于治疗SARS-CoV-2感染或者治疗或预防与SARS-CoV-2感染相关联的疾病或病症的药剂的第一组合物后少于1天、少于2天、少于3天、少于4天、少于5天、少于6天、少于7天、少于8天、少于9天或少于10天，施用编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物。在一个实施例中，该方法可包括施用编码SEQID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物，以及在施用编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQID NO:2的核苷酸55-3837的质粒天、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物后少于1天、少于2天、少于3天、少于4天、少于5天、少于6天、少于7天、少于8天、少于9天或少于10天，施用包含用于治疗SARS-CoV-2感染或者治疗或预防与SARS-CoV-2感染相关联的疾病或病症的药剂的第二组合物。在一个实施例中，该方法可包括同时施用包含用于治疗SARS-CoV-2感染或者治疗或预防与SARS-CoV-2感染相关联的疾病或病症的药剂的第一组合物以及编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物。在一个实施例中，该方法可包括施用单一组合物，该组合物包含用于治疗SARS-CoV-2感染或者治疗或预防与SARS-CoV-2感染相关联的疾病或病症的药剂和编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物。

在一些实施例中，用于治疗SARS-CoV-2感染或者治疗或预防与SARS-CoV-2感染相关联的疾病或病症的药剂为治疗剂。在一个实施例中，治疗剂是抗病毒剂。在一个实施例中，治疗剂是抗生素剂。

可与编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物组合使用的抗生素的非限制性实例包括氨基糖苷类(例如，庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素)、喹诺酮类(例如，环丙沙星、左氧氟沙星)、头孢菌素类(例如，头孢他啶、头孢吡肟、头孢哌酮、头孢匹罗、头孢吡普)、抗假单胞菌青霉素类：羧基青霉素类(例如，羧苄青霉素和替卡西林)和脲青霉素类(例如，美洛西林、阿洛西林和哌拉西林)、碳青霉烯类(例如，美罗培南、亚胺培南、多利培南)、多粘菌素(例如，多粘菌素B和粘菌素)和单环内酰胺类(例如，氨曲南)。

作为加强剂施用

在一个实施例中，在施用初始药剂或另一种用于治疗SARS-CoV-2感染或治疗或预防与SARS-CoV-2感染相关联的疾病或病症(包括但不限于COVID-19、成人多系统炎症综合征(MIS-A)或儿童多系统炎症综合征(MIS-C))的疫苗后，施用编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物作为加强疫苗。在一个实施例中，在施用初始药剂或其他用于治疗SARS-CoV-2感染或者治疗或预防与SARS-CoV-2感染相关联的疾病或病症(包含但不限于COVID-19、成人多系统炎症综合征(MIS-A)或儿童多系统炎症综合征(MIS-C))的疫苗后，将编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品、或其生物类似物作为加强疫苗施用至少一次、至少两次、至少3次、至少4次或至少5次。在一个实施例中，在施用初始药剂或其他用于治疗SARS-CoV-2感染或者治疗或预防与SARS-CoV-2感染相关联的疾病或病症(包括但不限于COVID-19、成人多系统炎症综合征(MIS-A)或儿童多系统炎症综合征(MIS-C))的疫苗后至少8小时、至少12小时、至少16小时、至少20小时、至少24小时、至少36小时、至少48小时、至少60小时、至少72小时、至少4天，至少5天、至少6天、至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少1年或超过1年，施用编码SEQ ID NO:1的残基19-1279的质粒、包含SEQ ID NO:2的核苷酸55-3837的质粒、pGX9501、INO-4800药品或、其生物类似物作为加强疫苗。

本发明具有多个方面，通过下列非限制性实例示出。

实例

实例1在针对SARS-CoV-2VOC B.1.1.7、B.1.351和P.1的INO-4800疫苗接种之后引发的体液和T细胞应答

INO-4800是一种基于SARS-CoV-2刺突DNA的疫苗，其经皮内递送然后使用2000器械进行电穿孔(EP)，目前正在进行临床开发。在一项1期临床试验中，INO-4800疫苗接种在接种疫苗的受试者中诱导以功能性抗体和T细胞应答两者为特征的平衡的免疫应答[Tebas,P.等人，Safety and immunogenicity of INO-4800DNAvaccine against SARS-CoV-2:A preliminary report of an open-label,Phase1clinical trial.EClinicalMedicine,2021.31:p.100689。]。体液和细胞免疫应答两者已被证明是针对β冠状病毒进行保护的重要组成部分[Channappanavar,R.,J.Zhao和S.Perlman,Tcell-mediated immune response to respiratory coronaviruses.ImmunolRes,2014.59(1-3):p.118-28；Sariol,A.和S.Perlman,Lessons for COVID-19Immunityfrom Other Coronavirus Infections.Immunity,2020.53(2):p.248-263；McMahan,K.等人，Correlates of protection against SARS-CoV-2in rhesus macaques.Nature,2021.590(7847):p.630-634。]

在本研究中，已经评定在针对SARS-CoV-2VOC B.1.1.7、B.1.351和P.1的INO-4800疫苗接种之后引发的体液和T细胞应答(图3A)。

方法

临床试验受试者样品：血清和外周血单核细胞(PBMC)样品采集自先前描述的I期INO-4800临床试验(NCT04336410)的参与者[Tebas,P.等人，Safety and immunogenicityof INO-4800DNA vaccine against SARS-CoV-2:A preliminary report of an open-label,Phase 1clinical trial.EClinicalMedicine,2021.31:p.100689。]。此后，该试验已扩展到除了包括最初的18-50岁年龄组之外，还包括51-64岁和64岁以上的参与者作为单独的组。还添加了0.5mg剂量组。选择来自总计120名研究参与者中的20名受试者的血清进行变种刺突蛋白结合ELISA和变种假病毒中和测定的分析。通过假病毒中和测定分析的样品是在INO-4800的第三剂量之后两周从受试者中收集的，而用于其他ELISA和ELISpot的样品是在两个剂量之后收集的。

抗原结合ELISA：如先前所述进行结合ELISA[Planas,D.等人，Sensitivity ofinfectious SARS-CoV-2B.1.1.7and B.1.351variants to neutralizingantibodies.2021:p.2021.02.12.430472。]，但使用SARS-CoV-2S1+S2蛋白的不同变体进行板包被。S1+S2野生型刺突蛋白(Acro Biosystems#SPN-C52H8)包含完整刺突蛋白(登录#QHD43416.1)的氨基酸16-1213，具有R683A和R685A突变，以消除弗林蛋白酶切割位点。B.1.1.7、B.1.351和P.1S1+S2变种蛋白(分别为Acro Biosystems#SPN-C52Hc、#SPN-C52H6和#SPN-C52Hg)另外地含有用于三聚体蛋白稳定化的下列脯氨酸取代：F817P、A892P、A899P、A942P、K986P和V987P。B.1.1.7蛋白含有下列变种特异性氨基酸取代：HV69-70del、Y144del、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A、D1118H；B.1.351蛋白含有下列取代：L18F、D80A、D215G、R246I、K417N、E484K、N501Y、D614G、A701V；并且P.1蛋白含有下列：L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、E484K、N501Y、D614G、H655Y、T1027I、V1176F。使用100μL 2μg/mL蛋白质包被测定板。

SARS-CoV-2假病毒产生：使用经Lipofectamine 3000(ThermoFisher)转染的HEK293T细胞，使用经pNL4-3.Luc.R-E-质粒(NIH AIDS试剂)共转染的IgE-SARS-CoV-2S质粒变种(Genscript)，以1:8的比率产生编码WT、B.1.1.7、B.1.351或P.1刺突蛋白的SARS-CoV-2假病毒种群。转染后72小时，收集上清液，无菌过滤(Millipore Sigma)，并且等分储存于-80℃。

SARS-CoV-2假病毒中和测定：使用稳定表达ACE2的CHO细胞(ACE2-CHO)作为靶细胞，以10,000个细胞/孔铺板。在72小时的感染之后，SARS-CoV-2假病毒的滴度达到仅细胞对照相对发光单位(RLU)的30倍以上。将来自13名经INO-4800疫苗接种的受试者的血清热灭活，并且以1:16稀释度开始连续稀释两倍。将血清与SARS-CoV-2假病毒在室温一起孵育90分钟。孵育之后，将血清-假病毒混合物添加至ACE2-CHO中，并且在标准培养箱(37％湿度，5％CO2)中孵育72小时。72小时后，使用Bright-Glo^TM荧光素酶测定(Promega)来裂解细胞，并且使用自动发光计来测量RLU。中和滴度(ID50)使用GraphPad Prism 8计算，并且定义为在减去细胞对照孔中的背景RLU之后，与病毒对照孔中的RLU相比，RLU降低50％的倒数血清稀释度。

SARS-CoV-2刺突ELISpot测定：用跨越所示变种全长刺突蛋白序列的15聚体肽(11个氨基酸重叠)在体外刺激外周单核细胞(PBMC)。变种肽池(JPT Pepmix^TM)包括下列改变以匹配每个变种中已发布的缺失/突变：B.1.1.7变种(Δ69-70、Δ144、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A、D1118H)；B.1.351变种(L18F、D80A、D215G、Δ242-244、R246I、K417N、E484K、N501Y、D614G、A701V)；P.1变种(L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、E484K、N501Y、D614G、H655Y、T1027I、V1176F)。在预包被的ELISpot板(MabTech，人类IFNγELISpotPlus)中，将细胞与浓度为每种肽1μg/ml的肽池一起孵育过夜。然后洗掉细胞，并经由生物素化的抗IFN-γ检测抗体，然后通过链霉亲和素-酶缀合物对板进行显影，产生可见的斑点。对板进行显影后，使用带有ImmunoCapture和ImmunoSpot软件的CTL S6微量分析仪(CTL)对斑点进行扫描和定量。值显示为所测量的三次重复在减去背景后的平均值。ELISpot测定先决条件确定，12个斑点形成单位为检测下限。因此，任何高于该截止信号者都是抗原特异性细胞应答。

统计方法：使用GraphPad Prism 8.1.2(GraphPad Software,San Diego,USA)对数据集进行图形和统计分析。P值<0.05被认为在统计学上显著。非参数双尾学生t检验Wilcoxon符号秩检验用于评定图1和图2中的统计学显著性。

结果：

刺突IgG结合ELISA：在经INO-4800疫苗接种的受试者中，通过ELISA，使用对B.1.1.7、B.1.351和P.1变种具有特异性的蛋白质来评估血清IgG抗体对SARS-CoV-2全长刺突蛋白的结合滴度(图1A和3A)。在WT与B.1.1.7或B.1.351变种之间，IgG结合滴度没有受到负面影响。在接受INO-4800的两个剂量之后第8周测试的受试者中，针对P.1变种观察到平均1.9倍降低(图1A)。

SARS-CoV-2假中和测定：使用在施用0.5mg、1mg或2mg INO-4800的第三剂量之后两周从十三名受试者收集的血清进行SARS-CoV-2假病毒中和测定(表1)。在测试的十三个血清样品中检测到针对WT以及变种B.1.1.7、B.1.351和P.1的中和活性(图1B)。

对于WT、B.1.1.7、B.1.351和P.1，平均ID50滴度分别为643、295、105和664(表1)。与WT相比，B.1.1.7和B.1.351分别降低2.1倍和6.9倍，而WT与P.1变种之间没有差异。引人注目的是，P.1菌株呈现出与B.1.351相似的RBD突变[Wang,P.等人，Increased Resistanceof SARS-CoV-2Variant P.1to Antibody Neutralization.2021:p.2021.03.01.433466；Dejnirattisai,W.等人，Antibody evasion by the Brazilian P.1strain of SARS-CoV-2.2021:p.2021.03.12.435194]，与WT菌株相比，在经INO-4800疫苗接种的个体中未观察到中和活性的降低。

表1

比较了INO-4800疫苗接种引发的对WT和SARS-CoV-2刺突变种的细胞免疫应答。用WT、B.1.1.7、B.1.351、P.1(实例1)或B.1.617.2(实例2)刺激在接受其INO-4800的第二剂量之后第8周从十名受试者分离的外周血单核细胞(PBMC)。通过IFNγELISpot测定来测量刺突肽和细胞应答。有趣的是，观察到相似的对WT(中位数＝82.2IFNγ斑点形成单位[SFU]/10⁶PBMC，IQR＝58.9-205.3)、B.1.1.7(中位数＝79.4，IQR＝38.9-179.7)、B.1.351(中位数＝80.0，IQR＝40.0-208.6)和P.1(中位数＝78.3，IQR＝53.1-177.8)刺突肽的细胞应答(图2)。在WT与B.1.617.2之间，中位IFNγ斑点形成单位[SFU]/10⁶PBMC分别为123.3IQR＝54.4-245.6和124.4，IQR＝46.4-195.0(实例2；图5)。值得注意的是，INO-4800疫苗接种产生的T细胞应答在WT与SARS-CoV-2变种B.1.1.7、B.1.351和P.1之间始终保持不变。用针对这些变种的肽来刺激细胞产生IFNγ应答以及与CD8+细胞毒性T细胞应答相关联的细胞因子(数据未显示)。

这些结果显示了在经INO-4800疫苗接种的受试者中测量到的针对首次在英国、南非和巴西检测到的新出现的SARS-CoV-2变种的中和抗体和T细胞活性。INO-4800SARS-CoV-2刺突DNA疫苗针对B.1.351和B.1.1.7的中和水平与之前接受编码WT刺突蛋白疫苗的受试者的报告一致[Wang,Z.等人，mRNA vaccine-elicited antibodies to SARS-CoV-2andcirculating variants.Nature,2021；Stephenson,K.E.等人，Immunogenicity of theAd26.COV2.S Vaccine for COVID-19.Jama,2021。]。令人惊讶的是，尽管最近的报告显示针对P.1变种的中和活性的降低[Garcia-Beltran,W.F.等人，Multiple SARS-CoV-2variants escape neutralization by vaccine-induced humoral immunity.Cell,2021；Wang,P.等人，Increased Resistance of SARS-CoV-2Variant P.1to AntibodyNeutralization.2021:p.2021.03.01.433466。]，但INO-4800产生了针对该变种的强效中和抗体，其水平与针对WT菌株的水平相当。结合显示T细胞活性维持的数据，本研究中报告的结果提供对于经INO-4800疫苗接种的个体针对SARS-CoV-2变种的交叉反应性细胞和体液免疫应答的全面概述，这可能对预防SARS-CoV-2变异株很重要。

实例2在针对SARS-CoV-2VOC B.1.617.1和B.1.617.2的INO-4800疫苗接种之后引发的体液和T细胞应答

方法

SARS-CoV-2假病毒产生：使用经Lipofectamine 3000(ThermoFisher)转染的HEK293T细胞，使用经pNL4-3.Luc.R-E-质粒(NIH AIDS试剂)共转染的IgE-SARS-CoV-2刺突质粒变种(Genscript)，以1:8的比率产生编码WT或B.1.617.1刺突蛋白的SARS-CoV-2假病毒种群。转染后72小时，收集上清液，无菌过滤(Millipore Sigma)，并且等分储存于-80℃。

SARS-CoV-2假病毒中和测定：使用稳定表达ACE2的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(ACE2-CHO)作为靶细胞，以10,000个细胞/孔铺板。在72小时的感染之后，SARS-CoV-2假病毒的滴度达到仅细胞对照相对发光单位(RLU)的30倍以上。将来自12名经INO-4800疫苗接种的受试者的血清热灭活，并且以1:16稀释度开始连续稀释两倍。将血清与SARS-CoV-2假病毒在室温一起孵育90分钟。孵育之后，将血清-假病毒混合物添加至ACE2-CHO中，并且在标准培养箱(37％湿度，5％CO₂)中孵育72小时。72小时后，使用Bright-Glo^TM荧光素酶测定(Promega)来裂解细胞，并且使用自动发光计来测量RLU。中和滴度(ID50)使用GraphPadPrism 8计算，并且定义为在减去细胞对照孔中的背景RLU之后，与病毒对照孔中的RLU相比，RLU降低50％的倒数血清稀释度。

针对B.1.617.2的SARS-CoV-2刺突ELISpot测定：用跨越所示变种全长刺突蛋白序列的15聚体肽(9个氨基酸重叠)在体外刺激外周单核细胞(PBMC)。B.1.617.2变种肽池包括下列改变以匹配已发布的缺失/突变：T19R、(G142D)、Δ156、Δ157、R158G、L452R、T478K、D614G、P681R、D950N。在预包被的ELISpot板(MabTech，人类IFNγELISpot Plus)中，将细胞与浓度为每种肽1μg/ml的肽池一起孵育过夜。然后洗掉细胞，并经由生物素化的抗IFN-γ检测抗体，然后通过链霉亲和素-酶缀合物对板进行显影，产生可见的斑点。对板进行显影后，使用带有ImmunoCapture和ImmunoSpot软件的CTL S6微量分析仪(CTL)对斑点进行扫描和定量。值显示为所测量的三次重复在减去背景后的平均值。ELISpot测定先决条件确定，12个斑点形成单位为检测下限。因此，任何高于该截止信号者都是抗原特异性细胞应答。

统计方法：使用GraphPad Prism 8.1.2(GraphPad Software,San Diego,USA)对数据集进行图形和统计分析。P值<0.05被认为在统计学上显著。非参数双尾学生t检验Wilcoxon符号秩检验用于评定图4和图5中的统计学显著性。

结果

使用在施用INO-4800的第二剂量之后两周(在第一次免疫后6周)从十二名受试者收集的血清进行SARS-CoV-2假病毒中和测定。在所有测试样品中均检测到针对WT假病毒的中和活性。对于B.1.617.1变种，12个样品中有7个显示出交叉中和活性，与WT假病毒相比，中和作用降低6倍(图4)。对于WT和B.1.617.1，平均ID50滴度分别为1304和217。对于B.1.617.2，十二个样品中有七个显示出高于LOD的交叉中和活性(图1B)。在WT与B.1.617.2之间，平均ID50滴度分别为1251和162。对于B.1.617.2，与WT相比降低了7.7倍。

比较了INO-4800疫苗接种引发的对WT和SARS-CoV-2刺突变种的细胞免疫应答。用WT或B.1.617.2刺突肽刺激在接受其INO-4800的第二剂量之后第8周从十名受试者分离的外周血单核细胞(PBMC)，并通过IFNγELISpot测定测量细胞应答。与对WT的细胞应答惊人地相似(中位数＝123.3IFNγ斑点形成单位[SFU]/10⁶PBMC，IQR＝54.4-245.6)和B.1.617.2(中位数＝124.4，IQR＝46.4-195.0)刺突肽(图5)进行观察。在WT与B.1.617.2变种之间，T细胞应答始终保持不变。

实例3在非人灵长类动物中进行同源初免-加强疫苗接种后增强的对所关注的SARS-CoV-2变种的免疫力

本实例评估初免-加强方案在非人灵长类动物中的免疫原性。恒河猴接受用INO-4800进行的初次免疫，INO-4800是一种与原始毒株的SARS-CoV-2刺突蛋白相匹配的第一代DNA疫苗，目前正处于临床开发阶段。一年后，将免疫的动物随机分组并接受用INO-4800进行的同源加强。加强后，所有动物均表现出显著提高的针对多种SARS-CoV-2VOC的中和以及ACE2阻断活性的功能性抗体应答水平。这些数据指示，INO-4800DNA疫苗的同源初免-加强策略增强针对新出现的SARS-CoV-2变种的广泛体液应答。

材料和方法

动物和免疫。所有恒河猴实验均得到Bioqual机构动物护理和使用委员会(马里兰州罗克维尔)的批准，Bioqual是实验动物护理评估和认证协会(AAALAC)国际认可的机构。在注射前将九只中国恒河猴(五只雄性和四只雌性，年龄约为4岁，体重范围为4.48kg至8.50kg)随机分组，并且在第0周和第4周，使用配备3P阵列的CELLECTRA自适应恒流电穿孔器械(伊诺维奥制药公司(Inovio Pharmaceuticals))，通过微创皮内电穿孔(ID-EP)施用来用SARS-CoV-2DNA疫苗INO-4800药品的一次或两次1mg注射进行免疫。初次免疫后大约一年，四只研究动物的随机分组子集接受通过ID-EP施用以1mg每剂量的INO-4800药品进行的加强免疫。在每个时间点收集的血清样品用于评估结合滴度、假病毒中和、细胞内细胞因子染色(ICS)和ACE2阻断活性，并且用于分离外周血单核细胞(PBMC)和血清。

外周血单核细胞分离和IFN-γ酶联免疫斑点(ELISpot)

将每只研究动物的血液收集到柠檬酸钠细胞制备管(CPT，BD Biosciences)中。根据制造商的方案，将试管离心以分离血浆和淋巴细胞。在当天将来自初次免疫的样品通过冷包装从Bioqual运送到Wistar研究所，并且将加强样品连夜运送到伊诺维奥制药公司进行PBMC分离。洗涤PBMC，并且使用氯化铵钾(ACK)裂解缓冲液去除残留的红细胞。使用ViCell计数器(Beckman Coulter)对细胞进行计数，并且重悬于补充有10％胎牛血清(Seradigm)和1％青霉素/链霉素(Gibco)的RPMI 1640(Corning)中。然后将新鲜细胞铺板进行IFNγELISpot测定以检测细胞应答。

根据制造商的方案，制备猴IFN-γELISpotPro板(Mabtech，瑞典，目录号3421M-2APW-10)。在1)SARS-CoV-2特异性肽池、2)含DMSO的R10(阴性对照)，或3)抗CD3阳性对照(Mabtech，1:1000稀释)的存在下将新鲜分离的PBMC以200,000个细胞每孔添加到每个孔中，一式三份。将板在37℃、5％CO₂下孵育过夜，然后在至少孵育18小时之后，根据制造商的方案对板进行显影。使用CTL免疫斑点读板仪对斑点成像，并通过从用肽池刺激的孔中减去R10-DMSO阴性对照孔来确定抗原特异性应答。

抗原结合ELISA。用1ug/mL重组SARS-CoV-2S1+S2刺突蛋白包被Nunc板，并在减去用模拟载体进行疫苗接种的动物的背景之后测定结合滴度。对于初次免疫样品，将九十六孔免疫吸附板(NUNC)用1μg/mL重组SARS-CoV-2S1+S2 ECD蛋白(Sino Biological 40589-V08B1)、S1蛋白(Sino Biological 40591-V08H)、S2蛋白(Sino Biological40590-V08B)或受体结合结构域(RBD)蛋白(Sino Biological 40595-V05H)在PBS中于4℃包被过夜。对于加强样品，将ELISA半区板用1μg/mL重组刺突野生型刺突蛋白、阿尔法(B.1.1.7)、贝塔(B.1.351)、伽马(P.1)、德尔塔(B.1.617.2)和奥密克戎(B.1.1.529)全长刺突变异蛋白(分别为Acro Biosystems#SPN-C52H8、#SPN-C52Hc、#SPN-C52Hg、#SPN-C52He和#SPN-C52Hz)包被。二抗包括1:50,000稀释度的IgG(Bethyl#A140-202P)、IgG2A(Abcam#ab98698)和1:10,000稀释度的IgG1(Abcam#ab98693)。将板用PBS+0.05％Tween20(PBS-T)洗涤三次并在室温(RT)用PBS-T中的3％FBS阻断2小时。将来自接种疫苗的猕猴的血清在PBS-T+1％FBS中连续稀释，添加到经洗涤的ELISA板中，并且然后在RT孵育2小时。然后洗涤板并与缀合至辣根过氧化物酶的抗猴IgG(Bethyl A140-202P)一起在RT孵育1小时。在显影30分钟内，使用Biotek Synergy2读板仪在450nm处读板。

假病毒中和测定

使用经Lipofectamine 3000(ThermoFisher)转染的HEK 293T细胞，使用与pNL4-3.Luc.R-E-质粒(NIH AIDS试剂)共转染的IgE-SARS-CoV-2S质粒变种(Genscript)，产生编码野生型(WT)、阿尔法(B.1.1.7)、贝塔(P.1)、伽马(B.1.351)、德尔塔(B.1.617.2)或奥密克戎(B.1.1.529)刺突蛋白的SARS-CoV-2假病毒种群。为了评定血清抗体的中和活性，将稳定表达ACE2的CHO细胞(ACE2-CHO-Creative Biolabs)以10,000个细胞/孔作为靶细胞。在与不同的SARS-CoV-2变种假病毒一起孵育之前，将血清热灭活并连续稀释。孵育90分钟之后，将血清-假病毒混合物添加到ACE2-CHO中，然后在72小时后，使用Bright-Glo^TM荧光素酶测定(Promega)裂解细胞，并且使用自动光度计测量RLU。使用GraphPad Prism 8计算中和滴度(ID₅₀)，并且将其定义为与感染的对照孔中的信号相比降低50％的倒数血清稀释度。

Meso Scale Discovery ACE2阻断测定

还基于对于ACE2对SARS-CoV-2刺突蛋白(和VOC刺突蛋白)的阻断的抑制来评定功能性抗体应答。对于这些测定，根据制造商的说明，将Meso Scale Discovery(MSD)V-PLEXSARS-CoV-2ACE2中和试剂盒(第5组和第14组)与MSD Sector S 600仪器一起使用。简而言之，将含有SARS-CoV-2刺突蛋白(野生型、B.1.1.7、B.1.351、P.1和B.1.617.2)的MSD板阻断、洗涤，并且与来自接种疫苗的动物的1:27稀释度血清一起孵育。然后将板清洗并与SULFO-TAG ACE2一起孵育，并且根据制造商的方案进行显影。功能性抗体活性以SULFO-TAGACE2与刺突蛋白的结合的％抑制来测量。

外周血单核细胞(PBMC)分离和细胞内细胞因子染色(ICS)

将每只研究动物的血液收集到柠檬酸钠细胞制备管(CPT，BD Biosciences)中。根据制造商的方案，将试管离心以分离血浆和淋巴细胞。在当天将来自初次免疫的样品通过冷包装从Bioqual运送到Wistar研究所，并且将加强样品连夜运送到伊诺维奥制药公司进行PBMC分离。洗涤PBMC，并且使用氯化铵钾(ACK)裂解缓冲液去除残留的红细胞。使用ViCell计数器(Beckman Coulter)对细胞进行计数，并且冷冻保存在90％胎牛血清(FBS)/10％二甲亚砜(DMSO)中。对于ICS测定，将细胞在RPMI 1640(Corning)中解冻，用10％胎牛血清(Seradigm)和1％青霉素/链霉素(Gibco)进行补充。

对于ICS，在37℃静置过夜后，将PBMC(1x10⁶/样品)添加到每个孔中，并且在GolgiStop^TM和GolgiPlug^TM(Invitrogen)以及抗CD28/CD49d的存在下，用1)SARS-CoV-2特异性肽池、2)含DMSO的R10(阴性对照)，或3)含有佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)和离子霉素(Invitrogen，1:1000稀释)的eBioscience细胞对混合物进行刺激。将板在37℃、5％CO₂下孵育6小时，洗涤，并且然后使用含有抗CD3 APC-Cy7、抗CD4PerCP-Cy5.5、抗CD8BV786和LIVE/DEAD可固定水性死细胞染色剂(Invitrogen)的抗体混合液(cocktail)进行染色。然后将细胞固定、透化(eBioscience Foxp3/转录因子固定/透化试剂盒；ThermoFisher)，并且使用含有抗IFNγBV605、抗IL-2BV650和抗TNFαAPC-R700的抗体混合液对细胞内细胞因子进行染色。然后将细胞洗涤，重悬并且在BD FACS Celesta上采集。使用FlowJo^TMv10.7软件(BD Life Sciences)分析数据。

结果

INO-4800初次免疫后的持久性。初步研究调查了用INO-4800进行初免的非人灵长类动物(NHP)中免疫应答的持久性。在第0周和第4周，用1mg或2mg剂量的INO-4800对NHP进行免疫，并且历经一年的进程收集血液(图6A)。应该指出的是，对于图6A至6D，最初按照交错的时间表来治疗NHP，并且因此来自研究的初次免疫部分的数据显示，对于NHP ID#7544、7545、7546、7548、7550，收集的数据点在第35周终止；而对于其他NHP ID#7514、7520、7523、7524，收集的数据点在第52周终止。使用酶联免疫吸附测定(ELISA)来测量血清中结合抗体的水平。在第二次免疫后两周，在第6周观察到抗体滴度峰值，几何平均端点滴度为258,032(图6B)。在研究持续期间，血清中持续存在可检测的结合抗体水平，并且在加强之前的最后时间点，1mg剂量组对于S1+S2 ECD的几何平均端点滴度为11143。2mg剂量组对于S1+S2 ECD的几何平均端点滴度为4525。在针对SARS-CoV-2S1、SARS-CoV-2S2和RBD蛋白的结合抗体水平中，也观察到类似的趋势(图6D)。

在针对在这一时间段期间处于循环中的SARS-CoV-2祖先、阿尔法、贝塔和伽马变种(VOC)的假病毒中和测定中测量功能性抗体应答。用INO-4800免疫导致诱导中和抗体，对于所有VOC，中和抗体均相对于基线增加(图6C)。SARS-CoV-2VOC中和抗体应答是持久的，并且在最后收集的时间点保持高于基线，其中1mg剂量组针对祖先SARS-CoV-2的几何平均滴度(GMT)为301，针对阿尔法为349，针对贝塔为158，并且针对伽马为317。NHP#7545在第14周显示出降低的针对贝塔的中和活性，这归因于铺板期间的采样误差。2mg剂量组针对野生型变种的GMT为174.6，针对阿尔法为58.2，针对贝塔为100.3，并且针对伽马为164.2。总之，这些数据表明，初次INO-4800疫苗接种时间表诱导具有中和活性的SARS-CoV-2特异性抗体，该抗体在35至52周的时间段维持。

INO-4800递送后的体液应答。将INO-4800作为加强疫苗进行评估。最初用INO-4800进行初免的相同恒河猴中的四只用与原始疫苗同源的INO-4800进行加强。恒河猴#7545、7546和7550在初次疫苗接种之后43周进行加强，而NHP#7523在初次疫苗接种之后64周进行加强(图7A)。

INO-4800的同源加强导致在加强后两周诱导抗体滴度，该滴度比加强前的水平增加(图7B)。结合抗体水平的增加显示了针对祖先、贝塔、德尔塔、伽马和奥密克戎刺突蛋白的相似模式，其中GMT在加强前分别为87、43、342、43和43，而在加强后分别为3077、2338、21044、3077和3077。在第2周或第4周，在INO-4800加强的动物之间，针对任何变种的结合滴度没有显著差异。

通过假病毒中和测定评定针对祖先、贝塔、德尔塔、伽马和奥密克戎变种的中和活性，表明了在用INO-4800加强的动物中增加的针对所有SARS-CoV-2变种的中和抗体应答(图7C)。对于在同源INO-4800加强之后的NHP，在第2周，针对祖先、贝塔、德尔塔、伽马和奥密克戎假病毒的GMT分别为2286.2、1199.3、785.6、1596.1和78.3。在第2周或第4周，INO-4800加强的动物在针对祖先、贝塔和奥密克戎假病毒的中和作用方面没有表现出显著差异。作为功能性抗体应答的另外读数，使用Meso Scale Discovery(MSD)测定通过将对于ACE2与一组变异SARS-CoV-2刺突蛋白结合的抑制水平定量来测量血清抗体的ACE2/SARS-CoV-2刺突相互作用阻断活性。与假病毒中和数据一致，所有动物在加强免疫后均显示它们的血清中功能性抗SARS-CoV-2抗体水平的增加(图7D)。

INO-4800诱导细胞应答。对用与祖先或贝塔SARS-CoV-2刺突蛋白匹配的肽刺激的外周血单核细胞(PBMC)进行细胞内细胞因子染色(ICS)，以评估用INO-4800增强的恒河猴的细胞应答。在用任一疫苗加强的动物中观察到抗原特异性CD4和CD8 T细胞应答(图8A至8F)。相对于加强前的水平，在加强后2周的细胞应答幅度通常更大，并且表明用INO-4800加强诱导了CD4 T细胞应答，这种应答跨祖先和贝塔变种维持(图8A至8C)。对在第2周时的CD4T细胞应答的表型分析显示了所有动物中的IFNγ分泌以及4只动物中的3只中的IL-2和TNF分泌(图8A、8B)。在第2周时在CD8区室中观察到类似的应答，该应答显示IFNγ的分泌(针对祖先，4只动物中的2只；而针对贝塔，4只动物中的4只)和IL-2(针对每种VOC，4只动物中的3只)(图8D至8F)。

实例4维持针对SARS-CoV-2奥密克戎变种的T细胞活性

方法：

临床试验受试者样品。血清和PBMC样品采集自先前描述的I期INO-4800临床试验(NCT04336410)的参与者(Tebas,P.等人，EClinicalMedicine,2021.31:p.100689)。该试验包括18-50岁年龄组、51-64岁年龄组和64岁以上年龄组的参与者。该试验还包括0.5mg、1mg或2mg的剂量组。还从评估INO-4800的双剂量方案(1mg或2mg)的II期临床试验(NCT04642638)的参与者采集血清样品(Mammen,M.P.等人，2021,medRxiv,2021.05.07.21256652)。选择来自总计120名研究参与者中的10名受试者的血清进行奥密克戎刺突和RBD蛋白结合ELISA和假病毒中和测定的分析。通过ELISA和假病毒中和测定来分析的样品是在INO-4800的两个剂量之后两周从受试者收集的。

抗原结合ELISA。如实例1中所述进行结合ELISA。S1+S2野生型刺突蛋白(AcroBiosystems#SPN-C52H9)包含完整刺突蛋白(登录#QHD43416.1)的氨基酸16-1213，具有R683A和R685A突变以消除弗林蛋白酶切割位点，并且含有用于三聚体蛋白的稳定化的下列脯氨酸取代：F817P、A892P、A899P、A942P、K986P和V987P。奥密克戎变种突刺蛋白(AcroBiosystems#SPN-C52Hz)含有相同的用于三聚体蛋白稳定化的氨基酸取代并且另外地含有下列奥密克戎特异性突变：A67V、HV69-70del、T95I、G142D、VYY143-145del、N211del、L212I、ins214EPE、G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y、Y505H、T547K、D614G、H655Y、N679K、P681H、N764K、D796Y、N856K、Q954H、N969K和L981F。奥密克戎RBD变种蛋白(Acro Biosystems#SPD-C522e r，Accession#QHD43416.1)含有带有下列奥密克戎特异性突变的氨基酸Arg 319-Lys 537：G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y和Y505H。测定板用100μL体积的0.2μg蛋白质包被。报告临床研究样品在450nm处的光密度(减去在OD₆₅₀处的背景)，该样品经1/100稀释以用于全刺突测定以及经1/20稀释以用于RBD测定。

SARS-CoV-2假病毒产生。使用经Lipofectamine 3000(ThermoFisher)转染的HEK293T细胞，使用经pNL4-3.Luc.R-E-质粒(NIH AIDS试剂)转染的IgE-SARS-CoV-2刺突质粒(Genscript)，以1:8的比率产生表达WT或奥密克戎刺突蛋白的SARS-CoV-2假病毒种群。在转染之后72小时，收集上清液，无菌过滤(Millipore Sigma)，并且等分储存于-80℃。

SARS-CoV-2假病毒中和测定。使用稳定表达ACE2的CHO细胞(ACE2-CHO)作为靶细胞，并且以7,000个细胞/孔铺板。在72小时的感染之后，对SARS-CoV-2假病毒进行滴定以得到与仅细胞对照相比>30倍的相对发光单位(RLU)。将来自10名经INO-4800疫苗接种的受试者的血清热灭活，并且以1:8稀释度开始连续稀释两倍。将血清与SARS-CoV-2假病毒在室温一起孵育90分钟。在孵育之后，将血清-假病毒混合物添加到ACE2-CHO中，并在标准培养箱(37％湿度，5％CO₂)中孵育72小时，然后使用Britelite plus报告基因(PerkinElmer^TM)测定来分析细胞，并且使用自动光度计来测量RLU。中和滴度(ID₅₀)使用GraphPad Prism 8计算，并且定义为在减去细胞对照孔中的背景RLU之后，与病毒对照孔中的RLU相比，RLU降低50％的倒数血清稀释度。

SARS-CoV-2刺突ELISpot测定。在体外用跨越分别针对祖先和奥密克戎变种的全长刺突蛋白序列的15聚体肽(10个氨基酸重叠)刺激外周血单核细胞(PBMC)，这些肽由拉霍亚免疫学研究所(La Jolla institute for Immunology)的Sette实验室以大池形式提供(Tarke,A.等人，2021:p.2021.12.28.474333)。在预包被的ELISpot板(MabTech，人类IFNγELISpot Plus)中，将细胞与终浓度为1μg/mL的肽大池一起孵育过夜。如前所述处理细胞并将板显影(Tebas,P.等人，EClinicalMedicine,2021.31:p.100689)。值显示为所测量的三次重复在减去背景后的平均值。ELISpot测定先决条件确定，12SFU/10⁶为检测下限；因此，任何高于这一截止值者都被认为是抗原特异性细胞应答。

SARS-CoV-2刺突流式细胞术测定。PBMC还用于细胞内细胞因子染色(ICS)分析。将200mL完整RPMI培养基中的一百万个PBMC用DMSO(阴性对照)、PMA和离子霉素(阳性对照，分别为100ng/mL和2mg/mL)或用指定的肽大池(1μg/mL)刺激六小时(37℃，5％CO₂)。在第一小时的刺激之后，添加布雷菲德菌素A和莫能菌素(BD GolgiStop和GolgiPlug，分别为0.001％和0.0015％)以阻断所表达的细胞因子的分泌。然后将细胞移至4℃过夜，并且在次日按照先前所述执行染色(Tebas,P.等人，EClinicalMedicine,2021.31:p.100689)。使用FlowJo v10软件(BD)分析数据。

统计方法。使用GraphPad Prism 8.1.2(GraphPad Software,San Diego,USA)对数据集进行图形和统计学分析。P值<0.05被认为在统计学上显著。非参数双尾学生t检验Wilcoxon符号秩检验用于评定图1和图2中的统计学显著性。

结果：

通过检查在先前用INO-4800进行疫苗接种的十名受试者(1.0mg，n＝3；2.0mg，n＝7)中的结合抗体应答、在十二名受试者中的抗体应答(0.5mg，n＝1；1.0mg，n＝3；2.0mg，n＝8)和在十三名受试者中的T细胞应答(0.5mg，n＝4；1.0mg，n＝4；以及，2.0mg，n＝5)，评估针对奥密克戎变种诱导的体液和细胞免疫应答。用祖先(WT)或奥密克戎刺突肽刺激在其INO-4800的第二剂量之后8周(第12周)从十三名受试者分离的外周血单核细胞(PBMC)(Tarke,A.等人，SARS-CoV-2vaccination induces immunological memory able to cross-recognize variants from Alpha to Omicron.2021:p.2021.12.28.474333)，并且通过IFNγELISpot测定来测量细胞应答。观察到对WT(平均值＝92.3，IFNγ斑点形成单位[SFU]/10⁶PBMC，IQR＝40-80)和奥密克戎(平均值＝88.5，IQR＝30-90)刺突肽的类似的T细胞应答水平(图9A至9C)。

通过细胞内细胞因子染色和流式细胞术来评定奥密克戎变种对CD4和CD8 T细胞应答的影响。针对IFNγ、IL-2和TNFα产生，对经刺激的在疫苗接种之前(第0周)和在INO-4800的第二剂量之后6周(第12周)从十一名受试者(选自IFNγELISpot测定中的上述1期患者的子集)分离的PBMC进行测定。数据指示，在CD4和CD8 T细胞区室两者中诱导WT和奥密克戎特异性应答。虽然观察到类似的产生IFNγ-和TNFα-的CD4和CD8 T细胞的频率，但与WT相比，使用奥密克戎变种在CD4和CD8区室两者中观察到更高频率的IL-2特异性应答(平均奥密克戎应答：CD4+-0.051％和CD8+-0.062％；以及祖先：CD4+-0.012％和CD8+-0.003％)。对效应记忆(CCR7-CD45RA-)和中枢记忆(CCR7+CD45RA-)T细胞群的进一步分析表明，与WT肽相比，靶向奥密克戎的产生IL-2的CD4和CD8中枢记忆T细胞的比例更高。

通过ELISA评估与SARS-CoV-2奥密克戎全长刺突和RBD蛋白的血清IgG抗体结合滴度。与祖先全长刺突蛋白相比，在第6周，即INO-4800的第二剂量后两周，在所测试的受试者中观察到奥密克戎变种刺突蛋白降低2.6倍(图10A)。使用奥密克戎RBD蛋白，在相同受试者中观察到降低10倍(图10A)。在康复期受试者(在2020年初收集)的血清中观察到类似的倍数降低。使用在INO-4800的第二剂量之后两周从受试者收集的血清，在SARS-CoV-2假病毒中和测定中评定中和活性。在所有样品中均检测到针对WT的中和活性，而针对奥密克戎的中和活性低于检测限(图10B)。

结论。针对奥密克戎变种，观察到从接种疫苗的个体收集的血清中的中和活性和结合抗体水平的显著降低(图10A和10B)。相反，经INO-4800疫苗接种的受试者保持对奥密克戎的T细胞应答性，这可以通过与由祖先刺突蛋白引发的那些相比类似的功能性CD4+和CD8+T细胞水平来证明(图9A至9C)。数据显示，与祖先SARS-CoV-2相比，针对奥密克戎变种，中枢记忆T细胞的诱导表现出更高程度的IL-2产生。

应当理解，前述详细描述和所附实施例仅是说明性的，并且不应被视为对本发明范围的限制，本发明的范围仅由所附权利要求书及其等同物限定。

对公开的实施例的各种改变和修改对于本领域的技术人员来说将是显而易见的。可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下进行此类变化和修改，包含但不限于与本发明的化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成、组合物、调配物或使用方法有关的变化和修改。

序列

pGX9501的SARS-CoV-2共有刺突抗原氨基酸插入序列(SEQ ID NO:1)(IgE前导序列加下划线)：

pGX9501的DNA插入序列(SEQ ID NO:2)(IgE前导序列加下划线)：

/>

pGX9501的单链DNA序列(SEQ ID NO:3)：

/>

序列表

<110>艾诺奥医药品有限公司(INOVIO PHARMACEUTICALS, INC.)

<120> 诱导针对严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2 (SARS-COV-2)有关变种的免疫应答的方法

<130> 104409.000679

<140>

<141>

<150> 63/314,074

<151> 2022-02-25

<150> 63/309,387

<151> 2022-02-11

<150> 63/247,707

<151> 2021-09-23

<150> 63/215,172

<151> 2021-06-25

<150> 63/174,375

<151> 2021-04-13

<160> 3

<170> PatentIn 3.5版本

<210> 1

<211> 1279

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 1

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Ser Gln Cys Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro

20 25 30

Ala Tyr Thr Asn Ser Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val

35 40 45

Phe Arg Ser Ser Val Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe

50 55 60

Phe Ser Asn Val Thr Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn

65 70 75 80

Gly Thr Lys Arg Phe Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val

85 90 95

Tyr Phe Ala Ser Thr Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe

100 105 110

Gly Thr Thr Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn

115 120 125

Ala Thr Asn Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp

130 135 140

Pro Phe Leu Gly Val Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu

145 150 155 160

Ser Glu Phe Arg Val Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr

165 170 175

Val Ser Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe

180 185 190

Lys Asn Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys

195 200 205

Ile Tyr Ser Lys His Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln

210 215 220

Gly Phe Ser Ala Leu Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn

225 230 235 240

Ile Thr Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr

245 250 255

Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr

260 265 270

Val Gly Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn

275 280 285

Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu

290 295 300

Thr Lys Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln

305 310 315 320

Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro

325 330 335

Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg

340 345 350

Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val

355 360 365

Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys

370 375 380

Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn

385 390 395 400

Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile

405 410 415

Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro

420 425 430

Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp

435 440 445

Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys

450 455 460

Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln

465 470 475 480

Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe

485 490 495

Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln

500 505 510

Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala

515 520 525

Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys

530 535 540

Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu

545 550 555 560

Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala

565 570 575

Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp

580 585 590

Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr

595 600 605

Asn Thr Ser Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr

610 615 620

Glu Val Pro Val Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg

625 630 635 640

Val Tyr Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu

645 650 655

Ile Gly Ala Glu His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile

660 665 670

Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg

675 680 685

Arg Ala Arg Ser Val Ala Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser

690 695 700

Leu Gly Ala Glu Asn Ser Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile

705 710 715 720

Pro Thr Asn Phe Thr Ile Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser

725 730 735

Met Thr Lys Thr Ser Val Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser

740 745 750

Thr Glu Cys Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln

755 760 765

Leu Asn Arg Ala Leu Thr Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr

770 775 780

Gln Glu Val Phe Ala Gln Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile

785 790 795 800

Lys Asp Phe Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser

805 810 815

Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val

820 825 830

Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly

835 840 845

Asp Ile Ala Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu

850 855 860

Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr

865 870 875 880

Ser Ala Leu Leu Ala Gly Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala

885 890 895

Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe

900 905 910

Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu

915 920 925

Ile Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu

930 935 940

Ser Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln

945 950 955 960

Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe

965 970 975

Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys

980 985 990

Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln

995 1000 1005

Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu

1010 1015 1020

Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys

1025 1030 1035

Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr

1040 1045 1050

His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe

1055 1060 1065

Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr

1070 1075 1080

Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu

1085 1090 1095

Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg

1100 1105 1110

Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val

1115 1120 1125

Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val

1130 1135 1140

Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu

1145 1150 1155

Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly

1160 1165 1170

Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu

1175 1180 1185

Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu

1190 1195 1200

Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp

1205 1210 1215

Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile

1220 1225 1230

Val Met Val Thr Ile Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser

1235 1240 1245

Cys Leu Lys Gly Cys Cys Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp

1250 1255 1260

Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr

1265 1270 1275

Thr

<210> 2

<211> 3837

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 2

atggattgga cttggattct ctttctcgtt gctgcagcca cacgcgttca tagcagccag 60

tgtgtgaacc tgaccaccag aacacagctg cctcctgcct acaccaacag cttcaccaga 120

ggagtctact acccagacaa agtcttcaga agctctgtgc tgcacagcac ccaggacctg 180

ttcctgcctt tcttcagcaa cgtgacctgg ttccacgcca tccacgtgtc tggcaccaac 240

ggcaccaaga gatttgacaa ccctgttctt cctttcaatg atggcgtgta ctttgccagc 300

acagagaaga gcaacatcat ccgaggctgg atctttggca ccaccctgga cagcaaaacc 360

cagagcctgc tgatcgtgaa caacgccacc aacgtggtca tcaaggtgtg tgagttccag 420

ttctgcaatg accctttcct gggcgtgtac taccacaaga acaacaagtc ctggatggag 480

tctgagttca gagtctacag ctctgccaac aactgcacat ttgaatatgt gtcccagcct 540

ttcctgatgg acctggaggg caagcagggc aactttaaga acctgagaga atttgtgttc 600

aagaacatcg atggctactt caagatctac agcaagcaca cacccatcaa cctggtgaga 660

gacctgcctc agggcttctc tgccctggag cctctggtgg acctgcccat cggcatcaac 720

atcaccagat tccagaccct gctggccctg cacagaagct acctgacccc aggagacagc 780

agcagcggct ggacagctgg agctgctgcc tactacgtgg gctacctgca gcccaggacc 840

ttcctgctga agtacaacga aaatggcacc atcacagatg ctgttgactg tgccctggac 900

cctcttagcg agaccaagtg caccctgaag tccttcacag tggagaaagg catctaccag 960

accagcaact tccgagtgca gccaacagag agcatcgtga gatttccaaa catcaccaac 1020

ctgtgccctt ttggagaagt cttcaatgcc accagatttg cttctgtgta cgcctggaac 1080

agaaaaagaa tcagcaactg tgtggctgac tactctgtgc tgtacaactc tgcctccttc 1140

tccaccttca agtgctatgg agtctctcca accaagctga atgacctgtg cttcaccaac 1200

gtgtatgctg acagctttgt gatcagagga gatgaagtgc ggcagattgc tcctggccag 1260

acaggcaaga ttgctgacta caactacaag ctgcctgatg acttcacagg ctgtgtcatc 1320

gcctggaaca gcaacaacct ggacagcaag gtgggcggca actacaacta cctgtacaga 1380

cttttcagga agagcaacct gaagcctttt gaaagagaca tctccacaga gatctaccag 1440

gctggcagca caccctgcaa tggtgtggaa ggcttcaact gctacttccc tctgcagagc 1500

tacggcttcc agccaacaaa tggcgtgggc taccagcctt acagagtggt ggtgctgtcc 1560

tttgagctgc tgcacgcccc tgccacagtg tgtggcccca agaagagcac caacctggtg 1620

aagaacaaat gtgtgaactt caatttcaat ggcctgacag gcacaggagt gctgacagag 1680

agcaacaaga agtttcttcc tttccagcag tttggaagag acattgctga caccacagat 1740

gctgtgagag atcctcagac cctggagatc ctggatatca caccctgctc ctttggagga 1800

gtttctgtca tcacacctgg caccaatacc agcaaccaag tggctgtgct gtaccaagat 1860

gtgaattgca cagaagtgcc tgtggccatc cacgctgacc agctgacacc cacctggaga 1920

gtgtacagca caggcagcaa tgttttccag acaagagctg gctgcctgat tggagcagag 1980

cacgtgaaca acagctatga atgtgacatc cctattggag ctggcatctg tgccagctac 2040

cagacccaaa ccaacagccc aagaagagcc agatctgtgg ccagccagag catcatcgcc 2100

tacaccatga gcctgggagc tgagaactct gtggcctaca gcaacaacag catcgccatc 2160

cccaccaact tcaccatctc tgtgaccaca gagatcctgc ctgtgtccat gaccaagaca 2220

tctgtggact gcaccatgta catctgtgga gacagcacag aatgcagcaa cctgctgctg 2280

cagtacggct ccttctgcac ccagctgaac agagccctga caggcatcgc tgtggagcag 2340

gacaagaaca cacaggaagt gtttgcccag gtgaagcaga tctacaaaac accacccatc 2400

aaggactttg gaggcttcaa tttctcccaa atcctgcctg accccagcaa gccttccaag 2460

agaagcttca ttgaagacct gctgttcaac aaagtgaccc tggctgatgc tggcttcatc 2520

aagcagtatg gagactgcct gggagacatt gctgccagag acctgatctg tgcccagaag 2580

tttaatggcc tgactgtgct gcctcctctg ctgacagatg aaatgatcgc ccagtacaca 2640

tctgccctgc tggctggcac catcaccagt ggctggacat ttggagctgg agctgccctg 2700

cagatccctt ttgccatgca gatggcctac agatttaatg gcatcggcgt gacccagaac 2760

gtgctgtacg agaaccagaa gctgatcgcc aaccagttca actctgccat cggcaagatc 2820

caggacagcc tgagcagcac agcctctgcc ctgggcaagc tgcaggatgt ggtgaaccaa 2880

aacgcccagg ccctgaacac cctggtgaag cagctgagca gcaactttgg agccatctcc 2940

tctgtgctga atgacatcct gagccggctg gacaaggtgg aagcagaagt gcagatcgac 3000

agactcatca caggccgcct gcagagcctg cagacctacg tgacccagca gctgatcaga 3060

gctgctgaga tccgggcctc tgccaacctg gctgccacca agatgtcaga atgtgtgctg 3120

ggccagagca aaagagtgga cttctgtggc aaaggctacc acctgatgtc cttccctcag 3180

tctgctcctc acggcgtggt gttcctgcac gtgacctacg tgcctgccca ggagaagaac 3240

ttcaccacag ctcctgccat ctgccacgat ggcaaggccc acttcccaag agaaggtgtc 3300

tttgtgtcca atggcaccca ctggttcgtg acccagagaa acttctacga gcctcagatc 3360

atcaccacag acaacacatt tgtgtctggc aactgtgatg tggtcatcgg catcgtgaac 3420

aacacagttt atgaccctct gcagcctgag ctggacagct tcaaagaaga gctggacaag 3480

tacttcaaga accacacatc tccagatgtg gacctgggag acatctctgg catcaatgcc 3540

tctgtggtga acatccagaa ggaaattgac aggctgaacg aagtggccaa gaacctgaac 3600

gaaagcctca tcgacctgca ggagctgggc aagtacgagc agtacatcaa gtggccttgg 3660

tacatctggc tgggcttcat cgctggcctc atcgccatcg tgatggtgac catcatgctg 3720

tgctgcatga ccagctgctg ctcttgcctg aagggctgct gcagctgtgg cagctgctgc 3780

aagtttgatg aagatgactc tgagcctgtg ctgaagggcg tgaagctgca ctacaca 3837

<210> 3

<211> 6797

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 3

gctgcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta 60

atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 120

acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 180

aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 240

gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 300

ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360

atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 420

gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 480

tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540

aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 600

ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga 660

aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt 720

accgagctcg gatccgccac catggattgg acttggattc tctttctcgt tgctgcagcc 780

acacgcgttc atagcagcca gtgtgtgaac ctgaccacca gaacacagct gcctcctgcc 840

tacaccaaca gcttcaccag aggagtctac tacccagaca aagtcttcag aagctctgtg 900

ctgcacagca cccaggacct gttcctgcct ttcttcagca acgtgacctg gttccacgcc 960

atccacgtgt ctggcaccaa cggcaccaag agatttgaca accctgttct tcctttcaat 1020

gatggcgtgt actttgccag cacagagaag agcaacatca tccgaggctg gatctttggc 1080

accaccctgg acagcaaaac ccagagcctg ctgatcgtga acaacgccac caacgtggtc 1140

atcaaggtgt gtgagttcca gttctgcaat gaccctttcc tgggcgtgta ctaccacaag 1200

aacaacaagt cctggatgga gtctgagttc agagtctaca gctctgccaa caactgcaca 1260

tttgaatatg tgtcccagcc tttcctgatg gacctggagg gcaagcaggg caactttaag 1320

aacctgagag aatttgtgtt caagaacatc gatggctact tcaagatcta cagcaagcac 1380

acacccatca acctggtgag agacctgcct cagggcttct ctgccctgga gcctctggtg 1440

gacctgccca tcggcatcaa catcaccaga ttccagaccc tgctggccct gcacagaagc 1500

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gctgttgact gtgccctgga ccctcttagc gagaccaagt gcaccctgaa gtccttcaca 1680

gtggagaaag gcatctacca gaccagcaac ttccgagtgc agccaacaga gagcatcgtg 1740

agatttccaa acatcaccaa cctgtgccct tttggagaag tcttcaatgc caccagattt 1800

gcttctgtgt acgcctggaa cagaaaaaga atcagcaact gtgtggctga ctactctgtg 1860

ctgtacaact ctgcctcctt ctccaccttc aagtgctatg gagtctctcc aaccaagctg 1920

aatgacctgt gcttcaccaa cgtgtatgct gacagctttg tgatcagagg agatgaagtg 1980

cggcagattg ctcctggcca gacaggcaag attgctgact acaactacaa gctgcctgat 2040

gacttcacag gctgtgtcat cgcctggaac agcaacaacc tggacagcaa ggtgggcggc 2100

aactacaact acctgtacag acttttcagg aagagcaacc tgaagccttt tgaaagagac 2160

atctccacag agatctacca ggctggcagc acaccctgca atggtgtgga aggcttcaac 2220

tgctacttcc ctctgcagag ctacggcttc cagccaacaa atggcgtggg ctaccagcct 2280

tacagagtgg tggtgctgtc ctttgagctg ctgcacgccc ctgccacagt gtgtggcccc 2340

aagaagagca ccaacctggt gaagaacaaa tgtgtgaact tcaatttcaa tggcctgaca 2400

ggcacaggag tgctgacaga gagcaacaag aagtttcttc ctttccagca gtttggaaga 2460

gacattgctg acaccacaga tgctgtgaga gatcctcaga ccctggagat cctggatatc 2520

acaccctgct cctttggagg agtttctgtc atcacacctg gcaccaatac cagcaaccaa 2580

gtggctgtgc tgtaccaaga tgtgaattgc acagaagtgc ctgtggccat ccacgctgac 2640

cagctgacac ccacctggag agtgtacagc acaggcagca atgttttcca gacaagagct 2700

ggctgcctga ttggagcaga gcacgtgaac aacagctatg aatgtgacat ccctattgga 2760

gctggcatct gtgccagcta ccagacccaa accaacagcc caagaagagc cagatctgtg 2820

gccagccaga gcatcatcgc ctacaccatg agcctgggag ctgagaactc tgtggcctac 2880

agcaacaaca gcatcgccat ccccaccaac ttcaccatct ctgtgaccac agagatcctg 2940

cctgtgtcca tgaccaagac atctgtggac tgcaccatgt acatctgtgg agacagcaca 3000

gaatgcagca acctgctgct gcagtacggc tccttctgca cccagctgaa cagagccctg 3060

acaggcatcg ctgtggagca ggacaagaac acacaggaag tgtttgccca ggtgaagcag 3120

atctacaaaa caccacccat caaggacttt ggaggcttca atttctccca aatcctgcct 3180

gaccccagca agccttccaa gagaagcttc attgaagacc tgctgttcaa caaagtgacc 3240

ctggctgatg ctggcttcat caagcagtat ggagactgcc tgggagacat tgctgccaga 3300

gacctgatct gtgcccagaa gtttaatggc ctgactgtgc tgcctcctct gctgacagat 3360

gaaatgatcg cccagtacac atctgccctg ctggctggca ccatcaccag tggctggaca 3420

tttggagctg gagctgccct gcagatccct tttgccatgc agatggccta cagatttaat 3480

ggcatcggcg tgacccagaa cgtgctgtac gagaaccaga agctgatcgc caaccagttc 3540

aactctgcca tcggcaagat ccaggacagc ctgagcagca cagcctctgc cctgggcaag 3600

ctgcaggatg tggtgaacca aaacgcccag gccctgaaca ccctggtgaa gcagctgagc 3660

agcaactttg gagccatctc ctctgtgctg aatgacatcc tgagccggct ggacaaggtg 3720

gaagcagaag tgcagatcga cagactcatc acaggccgcc tgcagagcct gcagacctac 3780

gtgacccagc agctgatcag agctgctgag atccgggcct ctgccaacct ggctgccacc 3840

aagatgtcag aatgtgtgct gggccagagc aaaagagtgg acttctgtgg caaaggctac 3900

cacctgatgt ccttccctca gtctgctcct cacggcgtgg tgttcctgca cgtgacctac 3960

gtgcctgccc aggagaagaa cttcaccaca gctcctgcca tctgccacga tggcaaggcc 4020

cacttcccaa gagaaggtgt ctttgtgtcc aatggcaccc actggttcgt gacccagaga 4080

aacttctacg agcctcagat catcaccaca gacaacacat ttgtgtctgg caactgtgat 4140

gtggtcatcg gcatcgtgaa caacacagtt tatgaccctc tgcagcctga gctggacagc 4200

ttcaaagaag agctggacaa gtacttcaag aaccacacat ctccagatgt ggacctggga 4260

gacatctctg gcatcaatgc ctctgtggtg aacatccaga aggaaattga caggctgaac 4320

gaagtggcca agaacctgaa cgaaagcctc atcgacctgc aggagctggg caagtacgag 4380

cagtacatca agtggccttg gtacatctgg ctgggcttca tcgctggcct catcgccatc 4440

gtgatggtga ccatcatgct gtgctgcatg accagctgct gctcttgcct gaagggctgc 4500

tgcagctgtg gcagctgctg caagtttgat gaagatgact ctgagcctgt gctgaagggc 4560

gtgaagctgc actacacatg ataactcgag tctagagggc ccgtttaaac ccgctgatca 4620

gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc 4680

ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg 4740

cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg 4800

gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggcttctact 4860

gggcggtttt atggacagca agcgaaccgg aattgccagc tggggcgccc tctggtaagg 4920

ttgggaagcc ctgcaaagta aactggatgg ctttcttgcc gccaaggatc tgatggcgca 4980

ggggatcaag ctctgatcaa gagacaggat gaggatcgtt tcgcatgatt gaacaagatg 5040

gattgcacgc aggttctccg gccgcttggg tggagaggct attcggctat gactgggcac 5100

aacagacaat cggctgctct gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg 5160

ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga actgcaagac gaggcagcgc 5220

ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg 5280

aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc 5340

accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc 5400

ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta 5460

ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg 5520

cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg cgagcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg 5580

tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat 5640

tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg ttggctaccc 5700

gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta 5760

tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgaa 5820

ttattaacgc ttacaatttc ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt 5880

cacaccgcat caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt 5940

ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa 6000

taatagcacg tgctaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt 6060

gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc 6120

gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg 6180

caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact 6240

ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt tcttctagtg 6300

tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg 6360

ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac 6420

tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca 6480

cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga 6540

gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc 6600

ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct 6660

gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg 6720

agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct 6780

tttgctcaca tgttctt 6797

Claims

1.一种在有此需要的受试者中诱导针对严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的pGX9501、INO-4800药品、或其生物仿制药。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫应答为体液免疫应答、细胞免疫应答或两者。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中因此保护所述受试者免受SARS-CoV-2变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529感染。

4.根据任何前述权利要求所述的方法，其中因此针对与SARS-CoV-2变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529感染相关联的疾病或病症对所述受试者进行治疗。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述与SARS-CoV-2变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529感染相关联的疾病或病症为2019冠状病毒病(COVID-19)、成人多系统炎症综合征(MIS-A)或儿童多系统炎症综合征(MIS-C)。

6.一种保护有此需要的受试者免受严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的pGX9501、INO-4800药品、或其生物仿制药，其中所述受试者因此对SARS-CoV-2变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529中的一者或多者具有抗性。

7.根据任何前述权利要求所述的方法，其中施用包括电穿孔和肠胃外施用中的至少一者。

8.根据权利要求7所述的方法，其中施用包括肠胃外施用，然后进行电穿孔。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述肠胃外施用为皮下施用、皮内施用或肌内施用。

10.根据任何前述权利要求所述的方法，其中向所述受试者施用约0.5mg至约2.0mgpGX9501、或INO-4800的核酸组分、或其生物仿制药的初始剂量，任选地其中所述初始剂量为0.5mg、1.0mg或2.0mg pGX9501、或INO-4800的核酸组分、或其生物仿制药。

11.根据权利要求10所述的方法，其中在所述初始剂量之后约四周，向所述受试者施用约0.5mg至约2.0mg pGX9501、或INO-4800的核酸组分、或其生物仿制药的后续剂量，任选地其中所述后续剂量为0.5mg、1.0mg或2.0mg pGX9501、或INO-4800的核酸组分、或其生物仿制药。

12.根据权利要求11所述的方法，其中在所述初始剂量之后至少十二周，向所述受试者施用约0.5mg至约2.0mg pGX9501、或INO-4800的核酸组分、或其生物仿制药的一个或多个进一步后续剂量，任选地其中所述进一步后续剂量为0.5mg、1.0mg或2.0mg pGX9501、或INO-4800的核酸组分、或其生物仿制药。

13.根据任何前述权利要求所述的方法，进一步包括向所述受试者施用至少一种另外的药剂用于治疗SARS-CoV-2感染或者治疗或预防与SARS-CoV-2感染相关联的疾病或病症。

14.根据权利要求13所述的方法，其中在所述另外的药剂之前、同时或之后向所述受试者施用所述pGX9501、INO-4800药品、或其生物仿制药。

15.pGX9501、INO-4800药品、或其生物仿制药在一种在有此需要的受试者中诱导针对严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529的免疫应答的方法中的用途。

16.根据权利要求15所述的用途，其中因此保护所述受试者免受SARS-CoV-2变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529感染。

17.根据权利要求15或16所述的用途，其中因此针对与SARS-CoV-2变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529感染相关联的疾病或病症对所述受试者进行治疗。

18.根据权利要求17所述的用途，其中所述与SARS-CoV-2变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529感染相关联的疾病或病症为2019冠状病毒病(COVID-19)、成人多系统炎症综合征(MIS-A)或儿童多系统炎症综合征(MIS-C)。

19.pGX9501、INO-4800药品或其生物仿制药在一种保护有此需要的受试者免受严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529感染的方法中的用途。

20.根据权利要求15至19中任一项所述的用途，其中通过电穿孔、肠胃外施用或两者向所述受试者施用所述pGX9501、INO-4800药品、或其生物仿制药。

21.根据权利要求20所述的用途，其中通过肠胃外施用，然后进行电穿孔向所述受试者施用所述pGX9501、INO-4800药品、或其生物仿制药。

22.根据权利要求20或21所述的用途，其中所述肠胃外施用为皮下施用、皮内施用或肌内施用。

23.根据权利要求15至22中任一项所述的用途，其中向所述受试者施用约0.5mg至约2.0mg pGX9501、或INO-4800的核酸组分、或其生物仿制药的初始剂量，任选地其中所述初始剂量为0.5mg、1.0mg或2.0mg pGX9501、或INO-4800的核酸组分、或其生物仿制药。

24.根据权利要求23所述的用途，其中在所述初始剂量之后约四周，向所述受试者施用约0.5mg至约2.0mg pGX9501、或INO-4800的核酸组分、或其生物仿制药的后续剂量，任选地其中所述后续剂量为0.5mg、1.0mg或2.0mg pGX9501、或INO-4800的核酸组分、或其生物仿制药。

25.根据权利要求24所述的用途，其中在所述初始剂量之后至少十二周，向所述受试者施用约0.5mg至约2.0mg pGX9501、或INO-4800的核酸组分、或其生物仿制药的一个或多个进一步后续剂量，任选地其中所述进一步后续剂量为0.5mg、1.0mg或2.0mg pGX9501、或INO-4800的核酸组分、或其生物仿制药。

26.根据权利要求15至25中任一项所述的用途，与至少一种另外的药剂组合用于治疗SARS-CoV-2感染或者治疗或预防与SARS-CoV-2感染相关联的疾病或病症。

27.根据权利要求26所述的用途，其中在所述另外的药剂之前、同时或之后向所述受试者施用所述pGX9501、INO-4800药品、或其生物仿制药。

28.pGX9501在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或保护有此需要的受试者免受严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)变种B.1.351、SARS-CoV-2变种B.1.1.7、SARS-CoV-2变种P.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.1、SARS-CoV-2变种B.1.617.2或SARS-CoV-2变种B.1.1.529感染。