CN117517630A - 生物传感器及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于评估流体样品中的分析物与固定化在生物传感器的传感器表面上的配体之间的相互作用的方法，其包括以下步骤：提供(101)多个流体样品，它们均包含已知浓度的分析物，提供(102)多个针和多个传感器表面或检测点，传感器表面或检测点中的至少一些具有固定化在其上的已知量的配体，并且各个针构造成将流体样品注射至传感器表面或检测点，将所述多个流体样品分成(103)至少两组，将所述组中的第一组的流体样品借助于针注射(104)至传感器表面或检测点，以容许分析物至配体的缔合，监测(104)各个传感器表面或检测点并且收集结合数据，以及重复(105)注射流体样品和监测检测点以及收集针对各组流体样品的结合数据的步骤，其中以上步骤按序地执行，而没有中间再生或固定化配体的更新。本发明还涉及用于评估流体样品中的分析物与固定化在传感器表面上的配体之间的相互作用的生物传感器系统、用于执行方法的步骤的软件，以及用于储存所述软件的计算机可读介质。

Description

生物传感器及其用途

技术领域

本发明涉及用于评估流体样品中的分析物与固定化在生物传感器的传感器表面上的配体之间的相互作用的方法和系统，并且涉及用于执行方法的步骤的软件以及用于储存所述软件的计算机可读介质。

背景技术

可实时监测分子(如生物分子)之间的相互作用的分析传感器系统获得越来越多的兴趣。这些系统经常基于光学生物传感器，并且通常被称为相互作用分析传感器或生物特异性相互作用分析传感器。代表性的此类生物传感器系统为由GE Healthcare出售的仪器，其使用表面等离子体共振(SPR)用于检测样品中的分子与固定化在传感表面上的分子结构之间的相互作用。在样品在传感器表面之上经过时，结合的进程直接地反映了发生相互作用的速率。样品的注射后接缓冲液流，在此期间，检测器响应反映了复合物在表面上解离的速率。来自/>系统的典型输出为描述分子间相互作用随时间推移的进程的曲线图或曲线(包括缔合阶段部分和解离阶段部分)。通常显示在计算机屏幕上的该曲线图或曲线经常被称为结合曲线或“传感曲线图”。

关于系统(和类似的传感器系统)，因此可能的是确定用作配体和分析物的分子的多个相互作用参数。这些参数包括针对分子相互作用中的结合(缔合)和解离的动力学速率常数，以及针对表面相互作用的亲和力。缔合速率常数(k_a)和解离速率常数(k_d)可通过将针对许多不同样品分析物浓度的所得的动力学数据拟合为以微分方程的形式的相互作用模型的数学描述来获得。亲和力(表达为亲和常数K_A或解离常数K_D)可从缔合和解离速率常数计算。

然而，在生物传感器系统可用于分析相互作用之前，经常必要的是确定分子的性质，以便提高结果的质量。这些性质为适于实现期望的结合曲线的分析物浓度区间，和待安装在传感器板上的配体的量，等。如果分析物的浓度太低或太高，则所得的结合曲线难以分析，并且可不产生相互作用参数的正确确定。类似地，如果配体的量太小，则传感器响应也将如此，并且如果配体的量太高，则分析物可难以按预期与其结合。为了克服这些问题，预先执行计算和分析，经常花费若干天或周以便确定最可能提供令人满意结果的操作参数。包括具有在区间内的不同浓度的分析物的流体样品的稀释系列大体用于产生多个结合曲线，希望可使用它们中的至少一些。

这些制备大体上为耗时的，并且获得稀释系列中的每个样品的结合曲线也如此，因为在样品之间经常需要传感器板的再生。寻找有用的再生条件本身可为花费数小时或甚至数周的过程。

因此，关于使用生物传感器之前所需的制备以及随后实验的时间消耗两者，存在对该领域内的改进的需要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于评估流体样品中的分析物与固定化在生物传感器的传感器表面上的配体之间的相互作用的新方法和生物传感器系统，该方法和生物传感器系统克服了现有技术的一个或更多个缺点。这由如独立权利要求中限定的方法和生物传感器系统实现。

由于本发明，分析物与配体之间的大量相互作用可被观察，储存，分析和显示，给出了良好的结果，而不需要预先计算和实验。此外，由于分析按序地执行，而没有中间再生或固定化配体的更新，故相互作用在比先前已知的方法和系统短的时间期间发生，进一步节省了时间和努力，同时仍获得良好的结果。

包含分析物的流体样品可为稀释系列，其中各个样品具有不同于所有其它样品的分析物浓度，以最大化执行的不同相互作用的数量，或者可备选地为稀释系列，其中至少两个样品具有相同的浓度，以进一步提高结果的质量并且有助于消除污染、暂时性干扰或其它故障。

获得的结合数据可组合成形成结合曲线(用于生物传感器系统的各个针的结合曲线)，并且优选一起显示在单个曲线图中，以给予使用者结果的快速概观，并且便于不适于进一步分析的结合曲线的识别。此类结合曲线可在视觉检查之后由使用者移除，或者由构造成使用一些标准的软件移除，如针对整个曲线上的响应增加的总体响应值或预定值，等。在此类结合曲线的移除之后，所得的结合曲线优选地一起显示，并且用于进一步分析，以获得动力学参数或关于分析物与配体之间的相互作用的其它数据。

固定化在生物传感器系统的传感器表面上的配体的量可变化，允许空间效应和质量传递性质的确定。

鉴于以下详细描述，本发明的许多附加益处将对本领域技术人员而言变得容易显而易见。

附图说明

本发明现在将参照附图更详细地描述，其中：

图1为基于SPR的生物传感器系统的示意性侧视图；

图2为代表性的传感图，其中结合曲线具有可见的缔合和解离阶段；

图3公开了单循环分析，其中包含不同浓度下的分析物的多个流体样品被注射而没有再生；

图4示出了根据本发明的优选实施例的方法的步骤；

图5示出具有用于保持流体样品的井孔的板、具有平行针的生物传感器系统的部分，以及描述配体与分析物之间的相互作用的所得曲线图；

图6示出适于与本发明一起使用的稀释系列；以及

图7示出关于针对每一列的不同程度的固定化配体的稀释系列。

具体实施方式

如以上提及的，本发明涉及用于评估流体样品中的分析物与固定化在生物传感器的传感器表面上的配体之间的相互作用的方法和生物传感器系统。

典型地，实验结合数据由基于传感器的技术获得，该基于传感器的技术研究分子间相互作用，并且在相互作用进行时实时呈现结果。然而，在更详细地描述本发明之前，将描述其中旨在使用本发明的通用背景。

除非另外限定，本文中使用的所有技术和科学用语具有与本发明所涉及的领域的技术人员通常理解的相同的含义。此外，单数形式"一"、"一个"和"该"意在包括复数参照，除非另外指出。

本文中提及的所有出版物、专利申请、专利以及其它参考文献通过引用以它们的整体并入。

化学传感器或生物传感器典型地基于无标记技术，检测传感器表面的性质(如例如质量、折射率或针对固定化层的厚度)的变化，但是还存在依赖于某种标记的传感器。典型的传感器检测技术包括但不限于质量检测方法，如光学、热光学以及压电或声波方法(包括例如表面声波(SAW)和石英晶体微量天平(QCM)方法)，以及电化学方法，如电位滴定法、电导法、安培法以及电容/阻抗法。关于光学检测方法，代表性的方法包括检测质量表面浓度的这些方法，如反射光学方法，其包括外部反射方法和内部反射方法两者，它们为角度、波长、偏振或相位分辨，例如渐逝波椭圆偏振法和渐逝波光谱学(EWS或内部反射光谱学)，两者可包括经由表面等离子体共振(SPR)的渐逝场增强、布鲁斯特角折射术、临界角折射率测定法、受抑全反射(FTR)、散射全内反射(STIR)(其可包括散射增强标记)、光波导传感器；外部反射成像、如临界角分辨成像的渐逝波基成像、布鲁斯特角分辨成像、SPR角分辨成像等。此外，基于例如表面增强拉曼光谱学(SERS)、表面增强共振拉曼光谱学(SERRS)、渐逝波荧光(TIRF)和磷光的光学测定和成像/显微镜方法(“本身”或与反射方法结合)，以及波导干涉仪(例如，如由实施的生物层干涉测量法)、波导泄漏模式光谱仪、反射干涉光谱仪(RIfS)、透射干涉仪、全息光谱仪以及原子力显微镜(AFR)可被提到。

市场上可买到的生物传感器包括由GE Healthcare制造和销售的之前提到的系统仪器，其基于表面等离子体共振(SPR)并且容许结合配体与感兴趣分析物之间的表面结合相互作用的实时监测。在该背景下，“配体”为针对给定分析物具有已知或未知亲和力并且包括固定化在表面上的任何捕获剂或捕捉剂的分子，而“分析物”包括其任何特定结合配偶体。

虽然在详细的描述中，本发明在SPR光谱学(以及更具体而言，系统)背景下示出，但是将理解的是，本发明不限于该检测方法。相反地，可采用其中分析物结合于固定化在传感表面上的配体的任何基于亲和力的检测方法，假如可测量传感表面处的变化，其定量指示分析物至其上的固定化配体的结合。

SPR现象为众所周知的，足以说明当光线在不同折射率的两种介质之间的界面处在某些条件下反射，并且界面由金属膜(典型为银或金)涂覆时，SPR产生。在仪器中，介质为样品和传感器芯片的玻璃，其由微射流流动系统与样品接触。金属膜为芯片表面上的薄金层。SPR引起特定反射角处的反射光的强度的降低。在/>系统的样品侧中，最小反射光强度的该角度随着靠近与反射光相对的一侧上的表面的折射率而变化。

系统的示意图在图1中示出。传感器芯片1具有金膜2，其支承捕获分子(配体)3，例如，暴露于具有分析物4(例如，穿过流通道5的抗原)的样品流的抗体。来自光源7(LED)的单色p偏振光6由棱镜8耦合于其中光被全反射的玻璃/金属界面9。反射光束10的强度由光学检测单元11(光电检测器阵列)检测。

仪器的技术方面和SPR现象的详细论述可在美国专利NO.5,313,264中找到。关于用于生物传感器传感表面的基质涂层的更详细的信息在例如美国专利NO.5,242,828和5,436,161中给出。此外，与/>仪器有关的使用的生物传感器芯片的技术方面的详细论述可在美国专利NO.5,492,840中找到。

当样品中的分子结合于传感器芯片表面上的捕获分子时，浓度以及因此表面处的折射率改变，并且SPR响应被检测。绘制相对于相互作用的过程期间的时间的响应将提供相互作用的进程的定量度量。此类绘图或动态或曲线(结合等温线)通常称为结合曲线或传感曲线图，在本领域中有时也被称为“亲和迹线”或“亲和曲线图”。在系统中，SPR响应值以共振单位(RU)表达。一个RU表示最小反射光强度的角度的0.0001°的变化，其对于大多数蛋白质和其它生物分子而言，对应于传感器表面上大约1pg/mm^{^}的浓度的变化。在包含分析物的样品接触传感器表面时，结合于传感器表面的捕获分子(配体)以被称为“缔合”的步骤与分析物相互作用。该步骤在样品最初与传感器表面接触时在结合曲线中通过RU的增加来指示。相反地，“解离”一般在样品流由例如缓冲液流代替时发生。该步骤在分析物与表面结合的配体解离时随着时间的推移在结合曲线中由RU的下降来指示。用于传感器芯片表面处的可逆相互作用的代表性结合曲线(传感曲线图)在图2中呈现，传感表面具有固定化的捕获分子或配体(例如，抗体)，其与样品中的因此的结合配偶体或分析物相互作用。基于以上提到的其它检测原理的由生物传感器系统产生的结合曲线将具有相似的外观。垂直轴线(y轴)指示响应(此处，以共振单位，RU为单位)，并且水平轴线(x轴)指示时间(此处，以秒为单位)。在水平轴线下方，示意性地公开了用于获取结合曲线的采集周期，其划分成其中传感器表面与不同流体接触的不同时间段。最初，从至t2，缓冲液(B)在传感表面之上经过，在结合曲线中给出基线响应I。接着，在从t2至t3期间，传感器表面与包含浓度Ci下的分析物的样品接触，由此信号的增加由于分析物的结合而被观察到。结合曲线的该部分II通常被称为“缔合阶段”。最终，稳定状态条件在缔合阶段结束时或接近缔合阶段结束时达到，其中共振信号平稳状态在III处(然而，该状态可不总是被实现)。将注意的是，本文中的用语“稳定状态”与用语“平衡”同义地使用(在其它情况下，可保留用语“平衡”，以描述理想的相互作用模型，因为在实践中，结合可随着时间的推移恒定，即使系统不平衡)。在缔合阶段结束时，在t3处，样品经常用连续的缓冲液流(B)来代替，并且信号的减少反映了分析物从表面的解离或释放。结合曲线的该部分IV通常被称为“解离阶段”。分析可选地以再生步骤在t4处结束，其中能够在(理想地)维持配体的活性时从表面(R)移除结合的分析物的溶液注射在传感器表面之上。这在传感曲线图的部分V中指示。此时，注射缓冲液(B)使基线I恢复，并且表面现在准备用于新的分析。在一些情形下，省略再生步骤V并且开始新的注射循环而没有再生可为方便的。此类情形的实例包括相同分析物的浓度系列，筛选具有足够高的解离速率以允许基本上完全解离的分析物等。

多次注射可在同一个实验循环中按序地执行，而没有中间再生或更新固定化配体，并且在US2013/0065251A1中更详细地描述。图3中也示出了实例，其中包含不同浓度的分析物的多个流体样品被注射而没有再生。

分别从缔合和解离阶段II和IV的曲线，获得关于结合和解离动力学的信息，并且III处的结合曲线的高度代表亲和力(由相互作用引起的响应与表面上的质量浓度的变化有关)。

例如，使用一些生物传感器系统(如4000)，多个独立的流动池(均包含多个检测点)布置成同时执行多个分析。各个流动池具有其本身的针，实现至各个流动池的并行注射，并且允许多个配体各自与它们自身的分析物，或者实际上一个配体与包含不同浓度分析物的多个样品的组合。该类分析大体上被称为并行分析。

如提及的，本发明涉及用于评估流体样品中的分析物与固定化在生物传感器的传感器表面上的配体之间的相互作用的方法和生物传感器系统。生物传感器可基于任何类型的基于相互作用的检测方法，其中分析物结合于固定化在传感表面上的配体，假如可测量感测表面处的变化，其定量指示分析物至其上的固定化配体的结合。

图4公开了根据本发明的优选实施例的用于评估流体样品中的分析物与固定化在生物传感器的传感器表面上的配体之间的相互作用的方法的步骤。在第一步骤101中，提供多个流体样品，其均包含已知浓度的分析物。流体样品可基于包含给定浓度的分析物的流体，其分成较小的样品并且根据预定的稀释计划来稀释，如将在下面进一步描述的。

在第二步骤102中，提供多个针和多个传感器表面或检测点，传感器表面或检测点中的至少一些具有固定化在其上的已知量的配体，并且各个针构造成将流体样品注射至传感器表面或检测点。在该优选实施例中，使用具有并行布置的多个流动池的生物传感器系统，以实现大量流体样品的同时分析。在另一实施例中，将为可能的是，使用具有仅一个传感器表面但在所述传感器表面上具有多个检测点的生物传感器系统。

在第三步骤103中，多个流体样品分成至少两组，各个组具有与针的数量对应的流体样品的数量。流体样品可布置在板上的井孔中，如由图5示出的，以使一组样品沿着图中的水平轴线分布。组中的样品的数量因此选择成对应于生物传感器系统的针的数量，以允许组的每个流体样品被同时注射。

在第四步骤104中，所述组中的第一组的流体样品借助于针注射至传感器表面或检测点，以容许分析物至配体的缔合，并且在第五步骤中，各个传感器表面或检测点被监测，并且结合数据被收集。在包含分析物的流体样品被注射之后，添加了缓冲溶液，以制备用于分析物的下一次注射的传感器表面，但是不执行再生。

注射流体样品、监测各个传感器表面或检测点处的相互作用以及收集结合数据的步骤针对流体样品的各个随后组重复，直到所有样品被使用。为了便于这一切，各组的流体样品可成排布置在包括成列和排布置的多个井孔的板上。当使用另一组时，生物传感器系统的针和板可布置成相对于彼此移动，以使针定位在包含下一组的流体样品的井孔上方。

用于各个传感器表面或检测点处的相互作用的结合数据可组合成形成结合曲线，显示注射至该特定表面或点的所有流体样品。对于具有八个针的系统而言，实验的结果将接着为八个曲线图或曲线，如由图5示出且在下面描述的，并且从这些结合曲线，可确定动力学参数。

尤其有利的是，方法的步骤在没有保持配体的传感器表面的再生或配体本身的更新的情况下执行，因为与在包含分析物的流体样品的每次注射之间具有再生的多循环过程相比，这允许具有显著缩短分析时间的单循环过程。在一些实施例中，传感器表面或检测点中的一个或更多个可没有配体并且提供参照。

在所有流体样品被使用之后，可储存，分析和/或显示获得的样品结合曲线，允许系统的使用者概观不同浓度下配体与分析物之间的相互作用。样品结合曲线优选地还储存在计算机可读介质中。如本文中使用的用语计算机可读介质将理解为适于储存用于由计算机或类似工具访问的数据的任何介质，如RAM、记忆棒、光盘等。当显示样品结合曲线时，有利的是在一个图中示出所有曲线，以允许使用者比较曲线的形状并且移除那些被认为是低质量或不在相互作用的浓度范围内的曲线。

图5公开了多个针19，多个针19放置在具有成排布置的多个井孔13的板12上方，以使针19进入第一排14。包含流体样品的分析物的稀释系列可根据预定的模式分布，其中流体样品在第一排14的一个端部17处具有最高浓度，并且减小的浓度沿着该排分布。类似地，在下一排15中，具有最高浓度的流体样品可位于一个端部17处，并且最低浓度或实际上完全不含分析物的空白样品在另一端部18处。以该方式，稀释系列可简单且有效地创建。在根据本发明的方法的第四步骤104和第五步骤105期间，各组或排14,15,16的流体样品通过使用针19从井孔移除，并且注射至传感器表面或多个表面，以获得显示分析物与配体之间的相互作用的样品结合曲线。

来自传感器表面或多个表面上的配体与流体样品中的分析物之间的相互作用的样品结合曲线在图5中以曲线图20示出。此处，各个传感器表面或检测点处收集的结合数据组合成形成结合曲线。有利的是如果注射的流体样品从低浓度的分析物朝向较高浓度的分析物发展。示出的生物传感器系统具有八个针，允许第一组或排14中的八个流体样品，并且各个针因此沿着具有用于各个排14,15,16的一个井孔的一列移动。来自配体与一排流体样品中的分析物之间的相互作用的所得曲线图以标号21,22,23,24,25,26,27,28在图5中公开。取决于各个流体样品中的分析物的浓度，所得曲线图可示出太小或太大的传感器响应，并且使用者的目标因此在于识别曲线图，其适于进一步分析，以产生关于配体与分析物之间的相互作用的动力学性质的信息。

在图5中，第一曲线图21示出了配体与不具有分析物的空白样品之间的相互作用，给出了基本上水平的线，以允许参考减法，以改进结果。第二曲线图22和第三曲线图23示出了对使用的响应太小，而第四曲线图24、第五曲线图25以及第六曲线图26示出适于分析的曲线。第七曲线图27具有接近太高而不适于分析的极限的传感器响应。最后，第八曲线图28具有太大而不适于分析的传感器响应。对于面对这些曲线图的使用者而言，除了三个之外的所有都可被移除，以使只有示出最好结果的那些被留下并且可一起显示在全局曲线图20中。将注意的是，适于进一步分析的曲线图的该确定可由使用者或软件执行，该软件使用一些排除标准来确定哪些响应符合预期结果。用于确定传感曲线图的质量的标准可为针对整个曲线上的响应增加的总体响应或预定值，等。

在移除不适合的曲线图之后，其余的曲线因此允许随后的分析，以确定动力学参数，如更详细地描述配体与分析物之间的相互作用的缔合速率常数、解离速率常数。取决于在列的流体样品中使用的分析物的浓度给出了令人满意的结合曲线，还可能的是更接近地确定适于研究相互作用的浓度范围。因此，可执行单个循环的实验，以在比先前可能的更短的时间和更少的努力下产生期望的信息，而不是实验或执行繁琐的计算来建立讨论中的浓度范围。

图6示出了适于与本发明的方法和系统一起使用的、用于包含分析物的流体样品的稀释系列的一个实例。各个列对应于一个针(编号1-8)，并且稀释因子给予具有三排的板上的各个井孔。对于一个针而言，使用空白系列，并且对于其它针而言，沿着排的针对各个步骤的为5的稀释因子以及沿着各个列的为2的稀释因子用于提供宽范围的浓度。由于使用的宽范围，故与使用先前方法(其中较小浓度范围大体上被建立，并且仅少许样品的稀释系列被使用)的机会相比，令人满意的结果从仅一个实验获得的可能性为高的。

图7示出了本发明的另一实施例，其中配体的固定化水平对应于各个针或列在生物传感器的传感器板上变化。由此，空间效应和质量传递性质可被确定和处理，等。有利的是，选择最低水平的固定化配体以对应于最高浓度的分析物，以增加产生具有足够响应水平的结合曲线以得出令人满意的曲线图的机会。通过使用该实施例，优选地与以上描述的优选实施例结合，合适的固定化水平可以以与分析物的合适浓度区间相似的方式来确定，而没有预评估或繁琐的计算。

本文中使用的词语(多个)针不旨在为过度限制性的。本文中的“针”旨在表示中空元件，其形成流体路径，该流体路径优选具有与用作皮下注射器的尺寸类似的尺寸，例如，具有0.8mm²(1mm直径)或更小，但不一定为该尺寸的流体路径。具有流体路径的任何中空部件将足以作为用于本发明的“针”，该流体路径具有足够小的终端端部，以在表面张力之下将流体保持在适当位置。

本发明将不被视为由以上描述的实施例限制，而是可在所附权利要求的范围内变化，如本领域技术人员将容易理解的。例如，针和通道的数量可变化，检测点或流动池可被使用，内流动池参照构造可被使用，用于各个针的一个空白检测点可被使用，板格式可变化，不同的稀释因子和浓度水平可被使用，并且随机浓度变化或稀释系列以外的其它浓度可被使用。

Claims (7)

1.一种用于评估流体样品中的分析物与固定化在生物传感器的传感器表面上的配体之间的相互作用的方法，其包括以下步骤：

-提供(101)多个流体样品，所述多个流体样品均包含已知浓度的分析物

-提供(102)多个针和多个传感器表面或检测点，所述传感器表面或检测点中的至少一些具有固定化在其上的已知量的配体，并且各个针配置成将流体样品注射至传感器表面或检测点

-将所述多个流体样品分成(103)具有不同浓度的至少两组，各个组具有对应于针的数量的流体样品的数量

-将所述组中的第一组的所述数量的流体样品借助于所述针注射(104)至所述传感器表面或检测点，以容许所述分析物至所述配体的缔合

-监测(105)各个传感器表面或检测点并且收集结合数据，以及

-重复注射各个组中的所述数量的流体样品和监测检测点以及收集针对各个组流体样品的结合数据的所述步骤，

其中以上所述步骤按序地执行，而没有中间再生或所述固定化配体的更新，以及其中各个组中的所述数量的流体样品的注射从分析物的低浓度向分析物的高浓度发展。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多个流体样品形成稀释系列，其中各个样品具有不同于所有其它样品的分析物浓度。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多个流体样品形成稀释系列，其中至少两个样品具有相同浓度的分析物。

4.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其特征在于，在各个传感器表面或检测点处收集的所述结合数据被储存和/或一起显示为结合曲线。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，结合曲线的质量基于针对整个曲线上的响应增加的总体响应或预定值来确定。

6.根据权利要求4或权利要求5所述的方法，其特征在于，可移除一些样品结合曲线，使得其余的样品结合曲线可一起显示。

7.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其特征在于，固定化在一个传感器表面或检测点上的配体的量不同于固定化在另一传感器表面或检测点上的配体的量。