CN117487736A - 一种使用全自动提取仪提取外泌体的方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及外泌体提取的技术领域，公开一种使用全自动提取仪提取外泌体的方法，其包括以下步骤，S1实验准备，将样本和物料承载介质放置在全自动提取仪的物料准备区；S2过滤分离，通过物料转移机构将物料承载介质转移到样本加样区，再通过物料转移机构将样本移至物料承载介质中；再通过物料转移机构将装载有样本的物料承载介质移至加压过滤区；加压组件向装载有样本的物料承载介质内充气加压，使样本过滤并得到滤液A；S3提取操作，通过物料转移机构更换物料承载介质，并向滤液A加入反应试剂进行反应，再经若干次加压过滤，最终得到滤液E；所述滤液E为外泌体。本申请的使用全自动提取仪提取外泌体的方法具有提升提取效率，降低人为误差的效果。

Description

一种使用全自动提取仪提取外泌体的方法

技术领域

本申请涉及外泌体提取的技术领域，尤其是涉及一种使用全自动提取仪提取外泌体的方法。

背景技术

外泌体是由各种活体细胞分泌的大小约为30～150nm之间，密度在1.13～1.19g/ml之间的脂质双层膜囊泡状结构小体，与质膜融合后，以胞吐形式释放到细胞外环境中。当外泌体与靶细胞接触后，外泌体及其携带的生物分子(如功能性的脂类、蛋白质，信使RNAs(mRNAs)、microRNAs等分子)以胞吞的形式被接收并发挥作用。

目前，外泌体的提取方法主要有差速离心法、超滤法和沉淀试剂盒法。差速离心法主要通过低速离心、高速离心交替进行，实现外泌体的提取，该方法虽然操作简单，获得的囊泡数量较多而广受欢迎，但过程比较费时，且回收率不稳定，纯度也受到质疑，此外，重复离心操作还有可能对囊泡造成损害，从而降低其质量。超滤法为膜过滤和离心相结合，方法简单高效也不影响外泌体的生物活性，但同样存在纯度偏低的问题。沉淀试剂盒法主要通过沉淀剂与疏水性蛋白和脂质分子结合形成共沉淀，实现外泌体的提取，该方法虽然操作比较简单、成本较低，但是专一性不高，因其能够同时沉淀高丰度和低丰度的蛋白质，导致低丰度的蛋白质损失，进而降低外泌体的提取效率。

上述提取方法，不仅需要配合相应的设备进行，而且对操作人员的专业性要求较高，与此同时人工参与的步骤不少，不仅效率较低，还容易引入人为误差。因此需要一种能够实现全自动的提取工艺，以降低人为误差和提升提取效率和准确性。

发明内容

为了改善现有外泌体提取方法步骤繁多导致的提取效率低，准确率低的缺陷，本申请提供一种使用全自动提取仪提取外泌体的方法。

本申请提供的一种使用全自动提取仪提取外泌体的方法，采用如下的技术方案：包括以下步骤：

S1实验准备，将样本和物料承载介质放置在全自动提取仪的物料准备区；

S2过滤分离，通过物料转移机构将物料承载介质转移到样本加样区，再通过物料转移机构将样本移至物料承载介质中；再通过物料转移机构将装载有样本的物料承载介质移至加压过滤区；加压组件向装载有样本的物料承载介质内充气加压，使样本过滤，得到滤液A；

S3提取操作，通过物料转移机构更换物料承载介质，并向滤液A加入反应试剂进行若干次反应处理，再经若干次加压过滤，最终得到滤液F；所述滤液F为外泌体。

通过采用上述技术方案，除样本和承载物料准备外，其他提取过程全部采用全自动机械化，没有人工的参与，既提高了效率，又保证了提取过程的卫生，降低了样本交叉感染风险和人为误差，同时保证样本提取结果的一致性。

可选的，步骤 S1中实验准备步骤包括：组装物料承载介质，所述物料承载介质包括过滤件和收集件，将所述过滤件套接在收集件中。

通过采用上述技术方案，在手动提取外泌体时，每次过滤均需要更换漏斗、滤膜和接收器，操作繁琐并且容易混淆；通过过滤件和收集件组合形成物料承载介质，能够降低操作误差，提升过滤提取效率。

可选的，所述过滤件和收集件上各自布置有若干孔穴，其中过滤件上的孔穴和收集件上的孔穴一一对应；所述过滤件孔穴底部设有过滤膜；在加压组件的气压压力作用下，过滤孔穴内的液体能够通过过滤膜过滤并转移到收集件的孔穴内。

通过采用上述技术方案，由于过滤件和收集件上各自布置有若干孔穴，并且过滤件的孔穴与收集件的一一对应，因此一个物料承载介质可以同时供多个不同样本进行提取操作，进一步提升过滤提取效率。

可选的，所述步骤S4提取操作具体包括第一次提取、第二次提取、第三次提取和第四次提取；每次提取操作具体包括以下步骤：通过物料转移机构更换过滤件和/或收集件；通过物料转移机构转移上一次滤液至过滤件；通过物料转移机构添加反应试剂；通过物料转移机构转移物料承载介质至加压过滤区；通过压力组件对物料承载介质内部加压使样本过滤分离。

通过采用上述技术方案，系统通过控制物料转移机构代替人工操作，减少重复操作带来的人为误差；物料转移机构实现更换物料承载介质、添加不同试剂、推送物料承载介质加压过滤，所有操作整合在一个仪器中有条不紊的进行。

可选的，所述步骤S2和步骤S3中使用的物料转移机构包括介质夹取组件和取样组件，所述介质夹取组件用于转移物料承载介质，所述取样组件用于转移样本；所述取样组件装卸有移液Tip头，每次转移不同的液体前需要更换不同的移液Tip头。

通过采用上述技术方案，物料转移机构由介质夹取组件和取样组件组成，通过系统控制介质夹取组件和取样组件独立作业，使整个提取过程更加顺畅；其中取样组件可拆卸连接有移液Tip头，可以实现在转移不同液体时，保证提取过程的卫生，降低了交叉感染风险，从而提升样本提取结果准确性。

可选的，所述样本放置在物料准备区前，需要对样本信息进行采集处理，所述全自动提取仪的数控系统获取样本的数据来源，用于后续样本数据进行归集处理。

通过采用上述技术方案，在处理样本前，通过对样本的基本信息进行采集处理，可以定性每个样本的来源，便于后续每个提取步骤可以进行相应微调整，提高样本的提取适应性；对样本进行标记有利于后续数据的采集对应，减少数据校对成本，进一步提升自动提取仪提取样本外泌体的智能化。

可选的，在进行步骤S2之前还包括样本液位检测步骤，通过液位自动检测机构对样本的液位进行检测并将数据采集反馈至全自动提取仪的数控系统。

自动提取仪采样时是依据预设的容量参数和行程参数指令进行，以保证每个样本的取样量一致性，样本初始量不一致则意味着液位高度不一致，若不及时调整物料转移机构的行程参数，会导致采样量不足；通过采用上述技术方案，在采样前对样本液位数据进行检测采集，数据系统自适应调整行程参数，从而实现采样的一致性。

可选的，在所述加压过滤步骤中，还包括对所述加压组件进行消毒处理步骤。

样本过滤提取过程中，需要进行充气加压操作，难免会导致一些样本飞溅到加压组件上，长期以往会滋生细菌而污染样本，进而影响外泌体的提取质量。通过采用上述技术方案，每次在过滤分离前后对加压组件进行消毒处理，从而降低对后续样本的污染。

可选的，所述加样区包括第一取样区和第二取样区，在所述步骤S2和步骤S3中，物料转移机构能够使物料承载介质在第一取样区和第二取样区之间切换。

由于提取过程中需要更换物料承载介质，通过采用上述技术方案，加样区包括第一取样区和第二取样区，可提供一个行程空间保证不同的物料承载介质更换操作的合理性和顺畅性。

可选的，所述第一取样区和加压过滤区设置在同一个滑台上，在过滤分离步骤前后滑台供物料承载介质在第一取样区和加压过滤区之间切换。

通过上述技术方案，第一取样区和加压过滤区设置在一个滑台上，因此可以控制物料承载介质在滑台上滑移切换，减少物料转移装置的行程设置，提升操作便利性的同时降低自动提取仪设计的复杂性。

综上所述，本申请包括以下至少一种有益技术效果：

1、样本外泌体的提取全流程通过全自动提取仪完成，提升提取效率的同时降低人为误差，进而提升提取效果的一致性。

2、通过具有多孔穴的过滤件与收集件集成，实现批量样本同步提取，降低交叉污染，同时进一步提升提取效率。

附图说明

图1是本申请实施例中全自动提取仪立体结构示意图。

附图标记说明： 1、基座； 2、放置平台；21、物料准备区；22、加样区；221、第一取样区；222、第二取样区；23、加压过滤区；24、滑台；3、液位自动检测机构；4、物料转移机构；41、介质夹取组件；42、取样组件；5、消毒过滤机构；51、加压组件；52、消毒组件；6、耗材回收机构；7、物料承载介质；71、过滤件；72、收集件。

具体实施方式

以下结合附图1对本申请作进一步详细说明。参照图1，全自动提取仪包括基座1，基座1上设置有放置平台2、液位自动检测机构3、物料转移机构4、消毒过滤机构5和耗材回收机构6。其中，放置平台2上设置有物料准备区21、加样区22和加压过滤区23。物料准备区21用于放置装有待处理样本的样本管、物料承载介质、试剂及移液Tip头；加样区22用于进行样本采集及提取操作；加压过滤区23用于对放置有样本及反应试剂的物料承载介质进行过滤分离操作。液位自动检测机构3用于检测样本的初始分层液位高度。

物料转移机构4包括介质夹取组件41和取样组件42；介质夹取组件41用于转移物料承载介质，取样组件42用于转移样本和添加试剂。

消毒过滤机构5包括加压组件51和消毒组件52；加压组件51用于对装载有待过滤样本的物料承载介质充气加压和保压，实现样本过滤分离纯化的目的；消毒组件52用于对加压组件51进行消毒处理，降低加压组件51对样本的污染。

其中，物料承载介质包括过滤件71和收集件72，过滤件71套接于收集件72上，过滤件71和收集件72各自设有孔穴，过滤件71的孔穴用作盛放样本、试剂并作为反应腔室；收集件72的孔穴用于接收过滤分离后的目标样本。具体的，试剂包括试剂A、试剂B和试剂C，本领域技术人员根据相关技术可以知道上述试剂具体为何种试剂，此处不再赘述。

移液Tip头用于吸取样本以及外泌体提取过程中用到的各种试剂。

耗材回收机构6用于接收使用后的移液Tip头和过滤件71，以提升设备使用整洁度。

本申请实施例公开一种使用全自动提取仪提取外泌体的方法。包括以下步骤：

S1实验准备，将样本、试剂和物料承载介质放置在放置平台2的物料准备区21；

S2过滤分离，对样本进行初步过滤除去杂质，启动物料转移机构4先将物料承载介质移至加样区22；物料转移机构4再吸取样本并转移到物料承载介质中；随后物料转移机构4将装载有样本的物料承载介质转移至加压过滤区23，加压组件51对物料承载介质充气加压，使样本过滤，得到滤液A；

S3提取操作，对除去杂质的滤液A进行提取操作，先通过物料转移机构4更换物料承载介质，再将滤液A转移到新的物料承载介质，然后向滤液A加入反应试剂进行反应，再经若干次加压过滤，最终得到滤液F；所述滤液F为外泌体。

为了降低试验中耗材相互组合繁琐性，在步骤S1试验准备中，将过滤件71和收集件72组装成物料承载介质，便于后续对整体物料承载介质的移动。

为了实现同时对多个不同样本进行提取作业，具体的，过滤件71和收集件72各自开设有多个孔穴，过滤件71的孔穴和收集件72的孔穴一一对应，以降低不同样本之间发生交叉污染的几率。过滤件71的孔穴底部设置有过滤膜，过滤膜用于拦截非目标物质或收集目标物质，在压力组件的气压压力作用下，样本中目标提取物可以通过过滤膜进入收集件72的孔穴中，或截留在过滤膜上；在本实施例中过滤膜为超滤膜。

为了提升采样提取操作的顺畅性，加样区22包括并排设置的第一取样区221和第二取样区222；物料转移机构能够使物料承载介质在第一取样区221和第二取样区222切换。而第一取样区221和加压过滤区23相邻并排设置在放置平台2上的一个滑台24上，该滑台24能够在放置平台2上进行水平滑动，进而使物料承载介质可以在第一取样区221和加压过滤区23自由切换。

具体的，在步骤S2过滤分离中，介质夹取组件41将组装好的物料承载介质从物料准备区21转移到第一取样区221；取样组件42安装移液Tip头，从样本管中吸取样本并转移到过滤件71的孔穴中，每取一个样本，需要更换移液Tip头，至所有样本转移至过滤件71中不同的孔穴中。随后滑台24带着装有样本的物料承载介质从第一取样区221切换到加压过滤区23；启动加压组件51，使加压组件51的盖板与过滤件71上表面紧密抵接，加压组件51向过滤件71充气加压，最后使样本中的杂质截留在过滤件71中，样本完成粗滤，得到滤液A。

具体的，步骤S3提取操作中，包括第一次提取、第二次提取、第三次提取和第四次提取。每次提取中还包括以下步骤：更换过滤件71和/或收集件72、转移上一次滤液、添加试剂、加压过滤，最终得到滤液E，即目标提取物外泌体。

为了便于自动提取仪识别不同的样本，并有利于后续的数据归集，在试验准备步骤S1时，先对样本管外的信息码进行扫描，数据系统录入样本的基础信息并建立对应的样本ID，具体的信息码可以是条形码、二维码等信息条码。

取样组件42吸取样本是依据既定的实验参数指令进行，为了提升设备的适应性，在样本信息录入后，液位自动检测机构3对每个样本的初始液位进行检测并录入实际数据，数控系统再依据实际液位数据自动调整取样组件对相应的样本的行程参数以适配样本的取样高度，确保取样的一致性。

样本在加压处理过程中，由于充气的原因，难免会有部分样本残留在加压组件51的盖板上，若不进行处理，则容易滋生细菌并污染在后处理的样本。因此在步骤S2过滤分离和步骤S3提取操作的加压过滤分离前或后，需消毒组件52对加压组件51的盖板进行消毒处理，以减少盖板上残留细菌、病毒、细胞、细胞内物质等对样本的污染。

为了避免混淆不同步骤中的收集件72与过滤件71组成的物料转移介质，下文采用I、II、III、IV对不同步骤中采用的收集件72与过滤件71进行区分，并采用收集件与过滤件组件代表物料转移介质，特此说明。

具体的，采用自动提取仪提取外泌体的操作过程如下：

A1实验准备：开机，将扫码后的样本、移液Tip头、物料承载介质和试剂放置在放置平台2的物料准备区21。

A2液位检测：液位自动检测机构3夹取物料准备区21对应的样品旋转，并检测识别对应的样本血清和下层分层的位置，并将样本分层相应的竖直方向坐标反馈至数据系统。

A3启动介质夹取组件41夹取物料准备区21中收集件I与过滤件I组件，并放入第一取样区；取样组件42自动组装移液Tip头，吸取样本1到收集件I过滤件I组件的对应1号孔穴中；随后取样组件42移动到耗材回收机构6处卸掉移液Tip头；取样组件42更换新的Tip头，吸取样本2到收集件I与过滤件I组件的对应2号孔穴中，随后卸掉的TIP头至耗材回收机构6；如此重复，直至6个样本都转移进全部孔穴中。

A4启动消毒组件52，对加压组件51的盖板进行消毒处理。

A5粗滤，启动滑台24将装有样本的收集件I与过滤件I组件移动到加压过滤区23，加压组件51的盖板与过滤件I盖合抵接，加压组件51向过滤件I充气实现加压保压，使过滤件I中的样本过滤到收集件I对应的孔穴中，得到滤液A；再次启动滑台24，使装有滤液A的收集件I与过滤件I组件从加压过滤区23转移到第一取样区221。

A6第一次提取，更换物料承载介质；介质夹取组件41将装有滤液A的收集件I与过滤件I组件从第一取样区221转移到第二取样区222；介质夹取组件41从物料准备区21夹取收集件II与过滤件II组件到第一取样区221；介质夹取组件41夹取过滤件I并将过滤件I放入耗材回收机构6；随后取样组件42安装Tip头，吸取收集件I中1号孔的滤液A转移并到收集件II和过滤件II组件的1号孔中，转移完后将移液Tip头卸至耗材回收机构；如此重复，至收集件I所有孔穴的滤液A转移到收集件II和过滤件II的组件的对应孔穴中；介质夹取组件41将收集件I转移至物料准备区21。

添加试剂A，取样组件42组装新Tip头，从物料准备区21吸取试剂A，并将试剂A添加到收集件II与过滤件II组件的孔穴中，每加完一个孔，卸掉用过的Tip头，更换新Tip头加下一个孔，如次重复直到所有6个孔穴均添加了试剂A。

加压过滤，启动滑台24，将装有滤液A和试剂A混合液的收集件II与过滤件II组件移动至加压过滤区23，启动加压组件51对收集件II与过滤件II组件充气加压并保压，使过滤件II中的滤液A和试剂A混合液过滤至收集件II，得到滤液B。

A7第二次提取，启动滑台24使装有滤液B的收集件II与过滤件II组件从加压过滤区23移动至第一取样区221；取样组件42上的滴管向过滤件II对应的孔穴逐一添加试剂B；再次启动滑台24，将收集件II与过滤件II组件移动至加压过滤区23，启动加压组件51对收集件II与过滤件II组件充气加压并保压，使过滤件II中滤液B和试剂B混合液过滤至收集件II，得到滤液C；此时过滤件II隔离有提取物D。

A8第三次提取，启动滑台24使装有滤液C和提取物D的收集件II与过滤件II组件从加压过滤区23移动至第一取样区221；启动介质夹取组件41将收集件II与过滤件II组件移动至第二取样区222，并从物料准备区21夹取收集件III至第一取样区221；再将过滤件II转移至收集件III上组合成收集件III与过滤件II组件； 启动介质夹取组件41将装有滤液C的收集件II转移至物料准备区21。

取样组件42安装新的移液Tip头，并从物料准备区21吸取试剂C，加入至过滤件II孔穴中与提取物D混合；每加完一个孔，卸掉用过的Tip头，更换新Tip头加下一个孔，如次重复直到6个孔穴均加入试剂C。

启动滑台24，使收集件Ⅲ与过滤件Ⅱ组件转移至加压过滤区23，启动加压组件51向过滤件II充气加压并保压，使过滤件II中提取物D和试剂C混合液过滤到收集件III对应的孔穴中，得到滤液E。

A9第四次提取，滑台24将收集件III与过滤件II组件从加压过滤区23转移至第一取样区221。介质夹取组件41将收集件III与过滤件II组件转移至第二取样区222，并从物料准备区21夹取收集件IV至第一取样区221；介质夹取组件41转移过滤件II到收集件IV上组合成收集件IV和过滤件Ⅱ组件。取样组件42安装移液Tip头并吸取滤液E至收集件IV与过滤件Ⅱ组件对应的孔穴中，每加完一个孔穴，卸掉用过的Tip头，更换新Tip头加下一个孔穴，如次重复直到收集件IV的6个孔穴的滤液E转移完成；启动介质夹取组件41将收集件III转移至物料准备区21。

启动滑台24，将装有滤液E的收集件IV与过滤件Ⅱ组件转移至加压过滤区23，启动加压组件51对收集件IV与过滤件Ⅱ组件进行充气加压并保压，使滤液E从过滤件II中过滤至收集件IV，得到滤液F。启动滑台24将装有滤液F的收集件IV与过滤件Ⅱ组件转移至第一取样区221，介质夹取组件41再将装有滤液E的收集件IV与过滤件Ⅱ组件转移到第二取样区222，并将过滤件Ⅱ转移至耗材回收机构6。

A10 目标产物回收，取样组件42安装移液Tip头，吸取收集件IV中滤液F到物料准备区中的外泌体回收管，每取完一个孔穴，卸掉用过的Tip头，更换新Tip头加下一个孔，如次重复，直到收集件IV的6个孔穴中滤液F转移完成，得到目标提取物外泌体。

A11 关机，介质夹取组件41将收集件IV从第二取样区222转移至物料准备区21，最后启动的消毒组件52对加压组件51的盖板进行消毒处理，随后关闭电源。

以上均为本申请的较佳实施例，并非依此限制本申请的保护范围，故：凡依本申请的方法、原理所做的等效变化，均应涵盖于本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种使用全自动提取仪提取外泌体的方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1实验准备，将样本、试剂和物料承载介质放置在全自动提取仪的物料准备区(21)；

S2过滤分离，通过物料转移机构(4)将物料承载介质转移到样本加样区(22)，再通过物料转移机构(4)将样本移至物料承载介质中；再通过物料转移机构(4)将装载有样本的物料承载介质移至加压过滤区(23)；加压组件(51)向装载有样本的物料承载介质内充气加压，使样本过滤分离并得到滤液A；

S3提取操作，通过物料转移机构(4)更换物料承载介质，并向滤液A加入反应试剂进行若干次反应处理，再经过若干次加压过滤，最终得到滤液E；所述滤液E为外泌体。

2.根据权利要求1所述的提取外泌体的方法，其特征在于：步骤 S1中实验准备步骤包括：组装物料承载介质，所述物料承载介质包括过滤件(71)和收集件(72)，将所述过滤件(71)套接在收集件(72)中。

3.根据权利要求2所述的提取外泌体的方法，其特征在于：所述过滤件(71)和收集件(72)上各自布置有若干孔穴，其中过滤件(71)上的孔穴和收集件(72)上的孔穴一一对应；所述过滤件（71）孔穴底部设有过滤膜；在加压组件(51)的气压压力作用下，过滤孔穴内的液体能够通过过滤膜过滤并转移到收集件(72)的孔穴内。

4.根据权利要求2所述的提取外泌体的方法，其特征在于：所述步骤S3提取操作具体包括第一次提取、第二次提取、第三次提取和第四次提取；每次提取操作具体包括以下步骤：通过物料转移机构(4)更换过滤件(71)和/或收集件(72)；通过物料转移机构(4)转移上一次滤液至过滤件(71)；通过物料转移机构(4)添加反应试剂；通过物料转移机构(4)转移物料承载介质至加压过滤区(23)；通过加压组件（51）对物料承载介质内部加压使样本过滤分离。

5.根据权利要求2所述的提取外泌体的方法，其特征在于：所述步骤2和步骤3中使用的物料转移机构(4)包括介质夹取组件(41)和取样组件(42)，所述介质夹取组件(41)用于转移物料承载介质，所述取样组件(42)用于转移样本；所述取样组件(42)可装卸有移液Tip头，所述取样组件每次转移不同的液体前需要更换不同的移液Tip头。

6.根据权利要求1所述的提取外泌体的方法，其特征在于：所述样本放置在物料准备区前，需要对样本信息进行采集处理，所述全自动提取仪的数控系统获取样本的信息来源，用于对后续数据进行归集处理。

7.根据权利要求1所述的提取外泌体的方法，其特征在于：在进行步骤S2之前还包括样本液位检测步骤，通过液位自动检测机构(3)对样本的液位进行检测并将数据采集反馈至全自动提取仪的数控系统。

8.根据权利要求1所述的使用全自动提取仪提取外泌体的方法，其特征在于：在所述加压过滤步骤中，还包括对所述加压组件(51)进行消毒处理步骤。

9.根据权利要求1所述的使用全自动提取仪提取外泌体的方法，其特征在于：所述加样区(22)包括第一取样区(221)和第二取样区(222)，在所述步骤S2和步骤S3中，物料转移机构(4)能够使物料承载介质在第一取样区(221)和第二取样区(222)之间切换。

10.根据权利要求9所述的使用全自动提取仪提取外泌体的方法，其特征在于：所述第一取样区(221)和加压过滤区(23)设置在同一个滑台(24)上，在过滤分离步骤前后滑台(24)供物料承载介质在第一取样区(221)和加压过滤区(23)之间切换。