CN117482289A - 一种具有抗菌和药物序贯释放能力的双网络多功能水凝胶的制备方法 - Google Patents
一种具有抗菌和药物序贯释放能力的双网络多功能水凝胶的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种具有抗菌和药物序贯释放能力的双网络多功能水凝胶的制备方法，属于生物角膜技术领域。所述制备方法的步骤包括：将甲基丙烯酸酯丝素蛋白、甲基丙烯酸缩水甘油酯官能化的季铵化壳聚糖、多聚脱氧核糖核苷酸、苯基(2,4,6‑三甲基苯甲酰基)磷酸锂和载药胶束混合，然后在紫外光照射下交联，构建得到具有抗菌和药物序贯释放能力的双网络多功能水凝胶。本发明制备的双网络多功能水凝胶表现出与天然角膜相似的透明度和机械强度，同时具有极强的黏附强度，并且能够在角膜感染修复的不同阶段分别实现抗菌、抗炎、增殖和重构的功能，实现可控的药物时空序贯给药。
Description
技术领域
本发明属于生物角膜技术领域，具体涉及一种具有抗菌和药物序贯释放能力的双网络多功能水凝胶的制备方法。
背景技术
感染性角膜炎是因致病性病原微生物侵入角膜引发的角膜炎症性病变，全球约有20％的盲人是因角膜感染所致，已成为世界性的常见致盲眼病之一。抗生素药物治疗是感染性角膜炎临床治疗的一线疗法，然而在出现耐药菌感染的情况下，药物治疗并不能达到理想的治疗效果。如果药物治疗无效，选择性替代病变角膜组织被认为是控制感染、恢复角膜组织透明的最有效手段，但角膜移植需要供体角膜、先进的手术技能和专门的设备等条件。此外，完全切除受感染的组织后需要移植一个大的供体角膜，有很高的排斥和失败的风险因此亟待开发供体角膜替代品。
水凝胶是一种具有保水能力的三维网络，具有良好的亲水性、透明度和生物相容性，以及促进细胞活性和代谢物运输的三维(3D)多孔结构，适用于受损角膜组织的再生和修复。赵等人设计了一种基于GelMA和氧化葡聚糖(ODEX)的双网状水凝胶，该水凝胶具有优异的机械强度和粘合力，可以和受体角膜床之间形成紧密的结合。李等人将负载I型胶原蛋白(COL I)的Pluronic F127diacrylate(F127DA)纳米胶束与GelMA结合，提高水凝胶模量并赋予水凝胶优异的组织黏附能力。然而，感染性角膜炎的生理环境更加复杂，需要水凝胶角膜具有抗菌、消炎、促增殖和抗瘢痕的多重功能，但目前所报道的水凝胶角膜多只关注于调节角膜再生功能，无法满足感染性角膜炎进行角膜移植的需求。
发明内容
为了解决目前基于水凝胶的角膜替代品主要是为了促进角膜再生的单一阶段，不足以满足严重IK的临床管理需求，包括角膜创面愈合的多阶段的问题，本发明提供了一种具有抗菌和药物序贯释放能力的双网络多功能水凝胶(SQPV)的制备方法。通过以丝素蛋白(SF)和壳聚糖(CS)为主要原料制备多功能混合水凝胶，该多功能混合水凝胶具有药物释放的时空特性，能够在角膜感染修复的不同阶段分别实现抗菌、抗炎、增殖和重构的功能，实现可控的药物时空序贯给药。此外，SQPV还具有类似于天然角膜的机械强度和透明度。体外和体内研究也证实了本发明提供的SQPV能够有效消除残留细菌，减轻炎症，促进角膜上皮和基质的再生，防止角膜瘢痕形成，并最终加速伤口愈合。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
本发明技术方案之一：提供一种具有抗菌和药物序贯释放能力的双网络多功能水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
将甲基丙烯酸酯丝素蛋白(SFMA)、甲基丙烯酸缩水甘油酯官能化的季铵化壳聚糖(QCSG)、多聚脱氧核糖核苷酸(PDRN)、苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂(LAP)和载药胶束混合，然后在紫外光照射下交联，构建得到具有抗菌和药物序贯释放能力的双网络多功能水凝胶；
所述载药胶束的制备步骤包括：
(1)先将4-(4-羟甲基-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)丁酸(NBA)、叔丁氧羰基-聚乙二醇-氨基(BOC-NH-PEG-NH2)、和1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐(PyBOP)在溶剂中混合，然后加入三氟乙酸(TFA)，反应后浓缩，在预冷的乙醚中析出沉淀(NB-PEG-NH2)；
(2)将步骤(1)所得沉淀复溶，再与D/L-丙交酯、甘脲和异辛酸亚锡[Sn(Oct)2]混合，反应后浓缩，在预冷的乙醚中析出沉淀(PLGA-PEG-NB)；
(3)将步骤(2)所得沉淀与药物共混于溶剂中，搅拌，得到载药胶束。
本发明中的SFMA及QCSG均按照现有技术已公开的方式制备，具体如下：
SFMA的制备(合成路线图见图1)
从蚕茧中提取SF，在0.02M碳酸钠中煮沸30min，去除丝胶；将脱胶的SF在9.3M溴化锂溶液中溶解1h；将甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)引入混合物中，60℃搅拌8h。将反应混合物在蒸馏水中透析5天，得到所需的SFMA。
QCSG的制备(合成路线图见图2)
0.5g壳聚糖溶解在20mL的去离子水中，滴加2当量的缩水甘油三甲基氯化铵(GTMAC)，55℃搅拌18h；将GMA加入到反应混合物中，55℃搅拌15h；最后，通过预冷丙酮沉淀、蒸馏水透析和冻干得到QCSG。
优选地，所述甲基丙烯酸酯丝素蛋白与所述甲基丙烯酸缩水甘油酯官能化的季铵化壳聚糖的质量比为5:1；所述多聚脱氧核糖核苷酸的加入量为甲基丙烯酸酯丝素蛋白与甲基丙烯酸缩水甘油酯官能化的季铵化壳聚糖质量总和的0.01％；所述苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂的加入量为甲基丙烯酸酯丝素蛋白与甲基丙烯酸缩水甘油酯官能化的季铵化壳聚糖质量总和的0.2％；所述载药胶束的加入量不超过甲基丙烯酸酯丝素蛋白与甲基丙烯酸缩水甘油酯官能化的季铵化壳聚糖质量总和的1％。
优选地，所述紫外光的波长为405nm，功率为3W。
优选地，所述载药胶束的制备步骤中，各原料的质量比为：4-(4-羟甲基-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)丁酸:叔丁氧羰基-聚乙二醇-氨基:1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐:三氟乙酸:D/L-丙交酯:甘脲:异辛酸亚锡＝0.25:5:1.5:0.15:0.2:0.05:0.005。
优选地，所述载药胶束的制备步骤中，步骤(2)所得沉淀与药物的质量比为5:1。
优选地，所述载药胶束的制备步骤中，步骤(1)中的反应时间为1h；步骤(2)中的反应温度为130℃，时间为12h。
本发明技术方案之二：提供一种根据上述具有抗菌和药物序贯释放能力的双网络多功能水凝胶的制备方法制得的具有抗菌和药物序贯释放能力的双网络多功能水凝胶。
本发明技术方案之三：提供一种上述具有抗菌和药物序贯释放能力的双网络多功能水凝胶在生物角膜中的应用。
本发明的有益技术效果如下：
本发明提供了一种具有抗菌和药物序贯释放能力的双网络多功能水凝胶的制备方法，这种双网络制备方法显著提高了水凝胶的理化性质，使其成为角膜移植的理想替代材料。本发明制备的双网络多功能水凝胶表现出与天然角膜相似的透明度和机械强度，同时具有极强的黏附强度，并且能够在角膜感染修复的不同阶段分别实现抗菌、抗炎、增殖和重构的功能，实现可控的药物时空序贯给药。本发明提供的双网络多功能水凝胶在严重细菌性角膜炎的角膜修复和再生中具有巨大的应用潜力。
附图说明
图1为SFMA的合成路线图。
图2为QCSG的合成路线图。
图3为PLGA-PEG-NB的合成路线图。
图4为实施例1制备的SQPV水凝胶及中间产物的理化性质表征图，其中，A为PLGA-PEG-NB胶束的临界胶束浓度测定结果；B为载药胶束的TEM图；C为载药胶束的尺寸分布图；D为紫外光照射下SQPV水凝胶形成的宏观观察图；E为不同聚合物和胶束浓度下的SQPV水凝胶的力学性能；F为不同胶束浓度下SQPV水凝胶的一般透明度观察；G为SQPV水凝胶的SEM图像；H为基于扫描电镜数据的SQPV水凝胶的孔隙率和孔径直方图；I为PDRN和维替泊芬在37℃时在PBS中的累积释放量。
图5为SQPV水凝胶、SQP水凝胶和SQ水凝胶抗菌特性图，其中，A为SQ、SQP和SQPV水凝胶在LB琼脂平板上的菌落图像；B为相应的细菌存活率的定量统计直方图；C为MRSA和MRPA与SQ、SQP和SQPV水凝胶共培养后的活/死染色图；D为MRSA和MRPA与SQ、SQP和SQPV水凝胶共培养后的SEM图。
图6为SQPV水凝胶、SQP水凝胶和SQ水凝胶处理的巨噬细胞细胞骨架染色图。
图7为SQPV水凝胶、SQP水凝胶和SQ水凝胶的体内生物相容性评价结果，其中，A为用SQ、SQP和SQPV水凝胶浸出液处理24小时后HCEC和HCSC细胞的活/死染色图像；B为不同水凝胶处理的HCEC细胞的细胞活力；C为不同水凝胶处理的HCSC细胞的细胞活力；D为培养3天后封装在不同水凝胶中的HCSC细胞的CLSM图像。
图8为SQPV水凝胶、SQP水凝胶和SQ水凝胶的纤维化衰减能力考察结果，其中，A为CLSM分析结果；B为YAP1的RT-PCR分析结果；C为COL-IA的RT-PCR分析结果；D为α-SMA的RT-PCR分析结果。
图9为SQPV水凝胶、SQP水凝胶和SQ水凝胶的体内角膜伤口愈合评估结果，其中，A为角膜移植第1天至第28天的裂隙灯照片和钴蓝色荧光染色；B为AS-OCT图像。
图10为SQPV水凝胶、SQP水凝胶和SQ水凝胶的体内角膜伤口愈合评估结果，其中，A为28天后手术兔角膜上皮和角膜间质共聚焦显微图；B为术后第28天，经不同水凝胶处理后的角膜的H&E染色图像。
图11为角膜缺损时SQPV水凝胶、SQP水凝胶和SQ水凝胶的抗感染能力评价结果，其中，A为水凝胶处理1天后的角膜组织在LB琼脂平板上的菌落照片；B为存活细菌的相应定量结果。
图12为角膜缺损时SQPV水凝胶、SQP水凝胶和SQ水凝胶的抗炎能力评价结果，其中，A为术后4天角膜组织中的CD86、CD206；B为术后4天角膜组织中的IL-1β、IL-10；。
图13为角膜缺损时SQPV水凝胶、SQP水凝胶和SQ水凝胶对生长因子表达水平的影响，A为第7天角膜中TGF-β1和PDGF的免疫荧光染色图；B为TGF-β1的RT-PCR分析结果；C为PDGF的RT-PCR分析结果。
图14为角膜缺损时SQPV水凝胶、SQP水凝胶和SQ水凝胶调节角膜创面愈合能力的评价结果，其中，A为治疗后第28天角膜中α-SMA、YAP1、COL-I和COL-III的免疫荧光染色图像；B为α-SMA的RT-PCR分析结果；C为YAP1的RT-PCR分析结果；D为COL-I的RT-PCR分析结果；E为COL-III的RT-PCR分析结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。
另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
SQPV水凝胶的制备：
(1)SFMA的制备：从蚕茧中提取SF，在0.02M碳酸钠中煮沸30min，去除丝胶；将脱胶的SF在9.3M溴化锂溶液中溶解1h；将GMA引入混合物中，60℃搅拌8h。将反应混合物在蒸馏水中透析5天，得到所需的SFMA。
(2)QCSG的制备：0.5g壳聚糖溶解在20mL的去离子水中，滴加2当量的GTMAC，55℃搅拌18h；将GMA加入到反应混合物中，55℃搅拌15h；最后，通过预冷丙酮沉淀、蒸馏水透析和冻干得到QCSG。
(3)载药胶束的制备：
1、将0.25gNBA加入含有BOC-NH-PEG-NH2(5g)和PyBOP(1.5g)的三氯甲烷溶液中，室温搅拌30min，TFA(0.15g)滴加到反应混合物中，室温搅拌1h后，混合物蒸发沉淀到预冷乙醚中，得到NB-PEG-NH2；
2、NB-PEG-NH2室温下溶于无水甲苯中，在上述溶液中加入0.2gD/L-丙交酯、0.05g甘脲和0.005g的Sn(Oct)2，130℃搅拌12h；然后在真空中浓缩，在预冷的乙醚中沉淀，得到产物PLGA-PEG-NB；
3、所述负载维替泊芬胶束的制备：将10mg PLGA-PEG-NB和2mg维替泊芬溶于1mLDMF中，避光搅拌1h，加入水(4mL)，剧烈搅拌30min，将得到的溶液用去离子水透析，并通过微孔膜过滤，得到载药胶束。
(4)SQPV水凝胶的合成：将SFMA和QCSG按5:1的质量比完全溶解在去离子水中配制成9％的混合溶液，加入SFMA和QCSG总质量0.01％的PDRN，再加入SFMA和QCSG总质量5％的载药胶束和SFMA和QCSG总质量0.2％的LAP，然后在紫外光(405nm，3W)下照射，得到SQPV水凝胶。
为了证明双网络水凝胶应用于角膜伤口缺损的可行性，本发明对实施例1制备好的SQPV水凝胶(包括调整制备条件制备的SQPV水凝胶)及中间产物进行了一系列的表征，具体结果见图4，图4中A为PLGA-PEG-NB胶束的临界胶束浓度测定结果，由尼罗河红荧光探针测定，结果为14.09μg/mL，表明了两亲性共聚物的胶束形成能力；图4中B为载药胶束的TEM图(比例尺为500nm)，显示PLGA-PEG-NB/维替泊芬胶束具有均匀的球形形状；图4中C为载药胶束的尺寸分布图，测定方法为水动力直径测量，胶束的溶解于pH7.4的PBS溶液中，测得的平均粒径为79.9nm；图4中D为紫外光照射下SQPV水凝胶形成的宏观观察图，在光诱导亚胺交联机制的指导下，PLGA-PEG-NB胶束中转化的邻硝基苯甲基与QCSG和SFMA中的氨基反应，形成了双网络水凝胶SQPV；图4中E为不同聚合物和胶束浓度下的SQPV水凝胶的力学性能，显示提高QCSG/SFMA聚合物和PLGA-PEG-NB胶束水平显著提高了水凝胶的存储模量；图4中F为不同胶束浓度下SQPV水凝胶的一般透明度观察，透光率分析显示，当PLGA-PEG-NB胶束的浓度达到1wt％时，1mm厚的SQPV水凝胶片变得不透明，值得注意的是，由9％QCSG/SFMA聚合物和0.5％PLGA-PEG-NB胶束组成的SQPV水凝胶的存储模量为4KPa，存储模量近似于原生角膜，满足角膜修复的透明度标准，证明了是最佳的角膜替代品；图4中G为SQPV水凝胶的SEM图像(比例尺为10μm)，显示出SQPV水凝胶显示出相互连接的多孔微观结构，平均孔径为41.03±0.21μm，这种多孔和相互连接的结构不仅有利于调节细胞的生长、附着和增殖，而且还有力地支持了ECM的分泌，此外，SQPV水凝胶的多孔特性还能够促进由不同的药物传递机制导致的双阶段药物释放模式，具体来说，亲水药物PDRN分散在SQPV水凝胶骨架中，而疏水药物维泊芬仍被包裹在PLGA-PEG-NB胶束中；图4中H为基于扫描电镜数据的SQPV水凝胶的孔隙率和孔径直方图，n＝3，显示了游离PDRN具有更大的亲水性，比维替泊芬释放速度更快；图4中I为PDRN和维替泊芬在37℃时在PBS中的累积释放量，曲线显示几乎所有封装的PDRN都在7天内被释放了，相比之下，维替泊芬从SQPV水凝胶中获得的释放速度明显较慢，在孵育28天后仅释放72％，这表明SQPV水凝胶能够通过时空和顺序控制药物递送，这是角膜修复的一个关键优势。
对比例1
SQP水凝胶的制备：
与实施例1相比，区别仅在于，省略维替泊芬的加入。
对比例2
SQ水凝胶的制备：
与实施例1相比，区别仅在于，省略PDRN和维替泊芬的加入。
实施例2
对实施例1制备的SQPV水凝胶及对比例1制备的SQP水凝胶和对比例2制备的SQ水凝胶的抗菌特性进行考察，评价了SQPV水凝胶对革兰阳性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和革兰阴性耐多药铜绿假单胞菌(MRPA)的抗菌效果性。
通过在Luria-Bertani(LB)琼脂平板上的菌落计数进行定量，细菌接种量为1*107CFU/ml，水凝胶加入量为200μL，对照组为未加水凝胶。
结果见图5，图5中A为SQ、SQP和SQPV水凝胶在LB琼脂平板上的菌落图像，与对照组相比，SQ、SQP和SQPV水凝胶处理组的菌落很少；图5中B为相应的细菌存活率的定量统计直方图(数据表示平均±SD，n＝3，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)，细菌菌落数的定量分析证实，超过99％的MRSA和MRPA被基于QCSG的水凝胶根除，这归因于QCSG在水凝胶中的阳离子效应；图5中C为MRSA和MRPA与SQ、SQP和SQPV水凝胶共培养后的活/死染色图(比例尺60μm)，活/死染色试验结果显示，对照组的细菌显示绿色荧光，而水凝胶处理的细菌显示明显的红色荧光，绿色荧光可忽略不计，表明基于QCSG水凝胶具有显著的杀菌效果；图5中D为MRSA和MRPA与SQ、SQP和SQPV水凝胶共培养后的SEM图(比例尺为200nm)，SEM图像显示基于QCSG的水凝胶处理后MRSA和MRPA的形态学变化，对照组的细菌保持了其光滑和未受损的细胞膜，相比之下，用QCSG水凝胶处理的细菌对其细胞壁和细胞膜有明显的损伤，证明了QCSG水凝胶有很强的抗菌能力。
实施例3
对实施例1制备的SQPV水凝胶及对比例1制备的SQP水凝胶和对比例2制备的SQ水凝胶的抗炎特性进行考察。
角膜移植术后炎症反应的复杂病理生理学显著影响术后微环境。因此，调节炎症反应已成为开发理想角膜替代品的关键焦点。巨噬细胞是移植后伤口部位的主要免疫细胞，表现出异质性和可塑性，极化为M1促炎或M2抗炎表型。
本发明首先将Raw264.7细胞接种于6孔板上24h，然后用LPS(100ng/mL)和IFN-γ(20ng/mL)刺激24h，诱导M1极化。随后，加入新鲜的水凝胶浸出液，24h后用CLSM进行细胞骨架染色，观察巨噬细胞的形态变化。
通过巨噬细胞细胞骨架染色证明PDRN促进巨噬细胞有M1向M2转化，结果见图6，SQP和SQPV水凝胶处理的巨噬细胞由具有多个伪足的纺锤形变为圆形，表明M1表型巨噬细胞中M2极化激活。
实施例4
对实施例1制备的SQPV水凝胶及对比例1制备的SQP水凝胶和对比例2制备的SQ水凝胶的体内生物相容性进行评价。
生物相容性是SQPV水凝胶促进细胞增殖和迁移，从而加快角膜创面愈合的关键因素。为了证明SQPV水凝胶有良好的细胞相容性，极小的生物毒性，本发明对角膜上皮细胞和角膜基质细胞进行了细胞死活染色。
方法：将HCEC或HCSC细胞接种于1×105个每孔密度的24孔培养板中，在37℃、5％二氧化碳气氛中孵育24小时。随后，用新鲜的水凝胶浸出液代替原培养液。孵育24h后，细胞用钙黄绿素-AM/PI染料染色，并用荧光显微镜成像。
结果见图7，图7中A为用SQ、SQP和SQPV水凝胶浸出液处理24小时后HCEC和HCSC细胞的活/死染色图像(比例尺为100μm)，显示SQ、SQP和SQPV水凝胶处理24h后，在HCEC和HCSC细胞中观察到强烈的绿色荧光和可忽略的红色荧光，证实了所制备的水凝胶具有良好的生物相容性；使用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)对SQPV水凝胶处理的HCEC和HCSC细胞进行细胞毒性评估；图7中B为不同水凝胶处理的HCEC细胞的细胞活力；图7中C为不同水凝胶处理的HCSC细胞的细胞活力，结果表明SQP和SQPV水凝胶处理组都比对照组和SQ水凝胶组表现出更高的细胞活力，这表明SQPV水凝胶的细胞毒性可以忽略不计；图7中D为培养3天后封装在不同水凝胶中的HCSC细胞的CLSM图像(比例尺为500μm)，采用3D培养模式研究了SQPV水凝胶对HCSC的增殖效应，从共聚焦显微镜观察到，随着孵育时间的增加，HCSC在水凝胶中的持续增殖。
实施例5
对实施例1制备的SQPV水凝胶及对比例1制备的SQP水凝胶和对比例2制备的SQ水凝胶的纤维化衰减能力进行考察。
采用免疫荧光法检测HCSC中YAP1、α-SMA和COL-IA的表达水平。首先，将HCSC细胞与不同的水凝胶提取物共培养24h，使细胞粘附在细胞壁上。然后用PBS洗涤细胞2次，4％多聚甲醛固定，0.1％Triton通透，5％BSA密封。然后，将细胞与一抗一起孵育，然后与相应的二抗和DAPI一起孵育，最后在显微镜下观察。在RT-PCR分析中，使用核旋RNA试剂盒提取HCSC中的总RNA，然后使用HiScript III RT SuperMix试剂盒逆转录成cDNA。定量PCR采用SYBR Green试剂进行。循环条件为95C10s，然后是40个两步循环(95℃15s，60℃30s)。采用序列检测系统软件对以β-actin作为内对照的定量数据进行分析。
为了证明SQPV水凝胶的抗菌能力，本发明做了角膜基质细胞的免疫荧光染色，结果见图8，图8中A为CLSM分析结果(比例尺为60μm)，显示与对照组、SQ组和SQP处理组相比，SQPV水凝胶处理的HCSC细胞的YAP1表达水平降低，HCSC细胞周围的阿尔法平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和IA型胶原蛋白(COL-IA)染色减少，证实了纤维化的成功减弱。图8中B为YAP1的RT-PCR分析结果(n＝3)，图8中C为COL-IA的RT-PCR分析结果(n＝3)，图8中D为α-SMA的RT-PCR分析结果(n＝3)；RT-PCR结果显示，SQPV水凝胶处理组中YAP1、COL-IA和α-SMA的表达水平降低，这与CLSM分析一致。
实施例6
对实施例1制备的SQPV水凝胶及对比例1制备的SQP水凝胶和对比例2制备的SQ水凝胶进行体内角膜伤口愈合评估。
为评价SQPV水凝胶对角膜创面综合愈合的体内疗效，建立了新西兰兔板层角膜切除术角膜创面感染模型。动物模型建立步骤如下：选用体重3公斤的新西兰大白兔30只。家兔一般采用静脉注射2％戊巴比妥钠(40～50mg/kg)，局部注射0.5％盐酸丙哌卡因眼液麻醉。随后，用3.5mm的角膜环钻(约为角膜深度的1/3)在每只兔的右眼角膜中央进行部分环钻(切割)。将无菌棉签浸入制备的1×108铜绿假单胞菌细菌负荷中，均匀滴于兔眼角膜缺损伤口。然后用微移液管将10μL的水凝胶消毒预聚物溶液注入缺陷部位，用可见光凝胶化1min。仅接受角膜缺损手术的兔眼涂上未放置水凝胶的细菌作为对照组。术后立即(第0天)使用裂隙灯显微镜和前段光学相干断层扫描对兔眼进行评估。板层移植模型就此建成。
裂隙灯照片、钴蓝色荧光染色和AS-OCT图像结果见图9，其中，A为角膜移植第1天至第28天的裂隙灯照片和钴蓝色荧光染色，B为AS-OCT图像。裂隙灯图像显示，SQ、SQP、SQPV水凝胶处理组与对照组相比，几乎没有细菌感染，验证了水凝胶的体内抗菌效果。SQP和SQPV水凝胶处理的伤口在4天内完全再上皮化，而对照组的上皮缺陷甚至在28天后仍然存在，这表明SQP和SQPV水凝胶可以加速伤口再上皮化。第28天拍摄的AS-OCT图像显示，与对照组相比，所有水凝胶处理组的间质组织和新形成的角膜上皮均为密集。
第28天的CLSM分析结果及H&E染色图像见图10，其中，A为28天后手术兔角膜上皮和角膜间质共聚焦显微图(比例尺50μm)，B为术后第28天，经不同水凝胶处理后的角膜的H&E染色图像(比例尺50μm)。CLSM图像显示，与对照组相比，水凝胶处理组再生的上皮细胞和基质排列更有组织性(图10中A)，进一步显示了SQPV水凝胶促进角膜创面愈合的优越功能。H&E染色进行的组织病理学评估,SQPV治疗的角膜在治疗28天后表现出与原生角膜相似的光学反射率和结构特征，而其他组的角膜在瞳孔区域显示出可见的瘢痕(图10中B)。
对角膜缺损时实施例1制备的SQPV水凝胶及对比例1制备的SQP水凝胶和对比例2制备的SQ水凝胶的抗感染、抗炎、增殖和重塑阶段综合评估。
为评估水凝胶抗菌功能，本发明收集了用水凝胶处理1天后的角膜组织，其在LB琼脂平板上的菌落照片见图11中A，不同处理后角膜中存活细菌的相应定量结果见图11中B，细菌定量检测结果显示，水凝胶处理组的CFU明显少于对照组，这是因为QCSG在水凝胶中表现出的正电荷效应，表明水凝胶在体内具有强大的抗菌效果。
为评估SQPV水凝胶对这一阶段的调节影响，本发明在家兔术后4天通过免疫组化染色分析了创面巨噬细胞的极化。结果见图12，其中，A为术后4天角膜组织中的CD86、CD206(比例尺20μm)；B为术后4天角膜组织中的IL-1β、IL-10(比例尺60μm)；C为CD86的PCR定量结果；D为CD206的PCR定量结果；E为IL-1β的PCR定量结果；F为IL-10的PCR定量结果。
结果所示，SQP和SQPV水凝胶治疗后CD86(M1表型)表达显著降低，CD206(M2表型)，CD206(M2表型)表达显著增加，表明这些水凝胶促进了促炎M1巨噬细胞转化为抗炎M2巨噬细胞(图12中A)。促炎因子IL-1β和抗炎因子IL-10表达的一致趋势进一步证实了这些结果，这可能是由于SQP和SQPV水凝胶处理组中PDRN的释放所致(图12中B)。RT-PCR检测M1细胞因子(CD86、IL-1β)和M2细胞因子(CD206、IL-10)的mRNA水平。在PDRN负载水凝胶处理组中，可以明显地观察到M1细胞因子mRNA水平下调，M2细胞因子mRNA水平上调(图12中C-F)。
生长因子在细胞增殖阶段起着关键作用，驱动诸如角膜基质角质细胞活化、肌分化和ECM形成等过程。本发明对转化生长因子(TGF-β1)和血小板源性生长因子(PDGF)进行免疫组化染色，以评估术后7天生长因子的表达。
结果见图13，其中，A为第7天角膜中TGF-β1和PDGF的免疫荧光染色图(比例尺20μm)；B为TGF-β1的RT-PCR分析结果；C为PDGF的RT-PCR分析结果。图13表明，与SQ组和对照组相比，SQPV和SQP处理组对所有类型的生长因子的表达水平最为显著。定量分析进一步显示，SQPV和SQP处理组中TGF-β1和PDGF的相对表达水平均高于SQ处理组和对照组。
在角膜伤口愈合的重塑阶段，疤痕的形成可能会对最终的视力结果产生不利的影响。因此，本发明评估了SQPV水凝胶调节角膜创面愈合重塑阶段的能力。
免疫荧光染色和RT-PCR结果见图14，其中，A为治疗后第28天角膜中α-SMA、YAP1、COL-I和COL-III的免疫荧光染色图像(比例尺60μm)；B为α-SMA的RT-PCR分析结果(n＝3)；C为YAP1的RT-PCR分析结果(n＝3)；D为COL-I的RT-PCR分析结果(n＝3)；E为COL-III的RT-PCR分析结果(n＝3)。图14显示，与其他三组相比，SQPV水凝胶处理的基质中α-SMA、YAP、COL-I和COL-III的表达水平显著降低(图14A-E)，提示SQPV水凝胶可减少胶原沉积和组织纤维化，从而减少瘢痕形成。
以上结果表明，本发明提供了一种具有抗菌和药物序贯释放能力的双网络多功能水凝胶的制备方法，这种双网络制备方法显著提高了水凝胶的理化性质，使其成为角膜移植的理想替代材料。本发明制备的双网络多功能水凝胶表现出与天然角膜相似的透明度和机械强度，同时具有极强的黏附强度，并且能够在角膜感染修复的不同阶段分别实现抗菌、抗炎、增殖和重构的功能，实现可控的药物时空序贯给药。本发明提供的双网络多功能水凝胶在严重细菌性角膜炎的角膜修复和再生中具有巨大的应用潜力。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (8)
1.一种具有抗菌和药物序贯释放能力的双网络多功能水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将甲基丙烯酸酯丝素蛋白、甲基丙烯酸缩水甘油酯官能化的季铵化壳聚糖、多聚脱氧核糖核苷酸、苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂和载药胶束混合，然后在紫外光照射下交联，构建得到具有抗菌和药物序贯释放能力的双网络多功能水凝胶；
所述载药胶束的制备步骤包括：
(1)先将4-(4-羟甲基-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)丁酸、叔丁氧羰基-聚乙二醇-氨基、和1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐在溶剂中混合，然后加入三氟乙酸，反应后浓缩，在预冷的乙醚中析出沉淀；
(2)将步骤(1)所得沉淀复溶，再与D/L-丙交酯、甘脲和异辛酸亚锡混合，反应后浓缩，在预冷的乙醚中析出沉淀；
(3)将步骤(2)所得沉淀与药物共混于溶剂中，搅拌，得到载药胶束。
2.根据权利要求1所述的具有抗菌和药物序贯释放能力的双网络多功能水凝胶的制备方法，其特征在于，所述甲基丙烯酸酯丝素蛋白与所述甲基丙烯酸缩水甘油酯官能化的季铵化壳聚糖的质量比为5:1；所述多聚脱氧核糖核苷酸的加入量为甲基丙烯酸酯丝素蛋白与甲基丙烯酸缩水甘油酯官能化的季铵化壳聚糖质量总和的0.01％；所述苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂的加入量为甲基丙烯酸酯丝素蛋白与甲基丙烯酸缩水甘油酯官能化的季铵化壳聚糖质量总和的0.2％；所述载药胶束的加入量不超过甲基丙烯酸酯丝素蛋白与甲基丙烯酸缩水甘油酯官能化的季铵化壳聚糖质量总和的1％。
3.根据权利要求1所述的具有抗菌和药物序贯释放能力的双网络多功能水凝胶的制备方法，其特征在于，所述紫外光的波长为405nm，功率为3W。
4.根据权利要求1所述的具有抗菌和药物序贯释放能力的双网络多功能水凝胶的制备方法，其特征在于，所述载药胶束的制备步骤中，各原料的质量比为：4-(4-羟甲基-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)丁酸:叔丁氧羰基-聚乙二醇-氨基:1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐:三氟乙酸:D/L-丙交酯:甘脲:异辛酸亚锡＝0.25:5:1.5:0.15:0.2:0.05:0.005。
5.根据权利要求1所述的具有抗菌和药物序贯释放能力的双网络多功能水凝胶的制备方法，其特征在于，所述载药胶束的制备步骤中，步骤(2)所得沉淀与药物的质量比为5:1。
6.根据权利要求1所述的具有抗菌和药物序贯释放能力的双网络多功能水凝胶的制备方法，其特征在于，所述载药胶束的制备步骤中，步骤(1)中的反应时间为1h；步骤(2)中的反应温度为130℃，时间为12h。
7.一种根据权利要求1～6任一项所述具有抗菌和药物序贯释放能力的双网络多功能水凝胶的制备方法制得的具有抗菌和药物序贯释放能力的双网络多功能水凝胶。
8.一种权利要求7所述具有抗菌和药物序贯释放能力的双网络多功能水凝胶在生物角膜中的应用。
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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