CN117467644A - 一种通过改变离子来降低CRISPR-Cas12a特异切割靶标核酸脱靶率的方法 - Google Patents

一种通过改变离子来降低CRISPR-Cas12a特异切割靶标核酸脱靶率的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN117467644A
CN117467644A CN202210871862.6A CN202210871862A CN117467644A CN 117467644 A CN117467644 A CN 117467644A CN 202210871862 A CN202210871862 A CN 202210871862A CN 117467644 A CN117467644 A CN 117467644A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cas
nucleic acid
protein
target nucleic
less
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210871862.6A
Other languages
English (en)
Inventor
尹蕾
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Tolo Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Shanghai Tolo Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Tolo Biotechnology Co ltd filed Critical Shanghai Tolo Biotechnology Co ltd
Priority to CN202210871862.6A priority Critical patent/CN117467644A/zh
Priority to PCT/CN2023/086002 priority patent/WO2024016730A1/zh
Publication of CN117467644A publication Critical patent/CN117467644A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种通过改变离子或离子浓度来降低CRISPR‑Cas12a特异切割靶标核酸脱靶率的方法，具体地，本发明提供了一种含有二价金属离子的溶液、Cas蛋白和向导RNA的反应体系，所述二价金属离子包括Ca2+和Mg2+，并且所述溶液中的Ca2+的终浓度为0.1mM‑200mM，较佳地0.1mM‑50mM，更佳地0.1mM‑10mM，Mg2+的终浓度低于Ca2+的终浓度，Mg2+和Ca2+的终浓度比≤99％，较佳地，≤50％，更佳地，≤30％，更佳地，≤0.1％，更佳地为0；本发明的反应体系可显著降低Cas蛋白的反式切割活性但是不影响或增强其顺式切割活性，并且可降低特异切割靶标核酸的脱靶率。

Description

一种通过改变离子来降低CRISPR-Cas12a特异切割靶标核酸 脱靶率的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及一种通过改变离子来降低CRISPR-Cas12a特异切割靶标核酸脱靶率的方法。
背景技术
基因编辑是指对DNA序列进行删除、插入或替换等操作，广泛应用于基因功能研究、疾病模型建立、疾病治疗以及转基因动植物工程等等。第一代基因编辑技术基于锌指核酸酶(Zinc Finger Nuclease，ZFN)，ZFN含有一个能够特异性识别序列的DNA锌指结合域，通过改造这个区域可以实现靶向不同的DNA序列。一个DNA锌指结合域一般由多个锌指结构组成，每个锌指结构识别3个碱基，因此ZNF的靶序列必须是3的倍数。由于ZNF的识别结构域存在上下文依赖效应，其设计和筛选的难度非常大，应用范围受到限制，并且该技术还存在成本高、劳动量大、耗时长、成功率低、易脱靶、细胞毒性大等缺陷。第二代基因编辑技术基于转录激活样效用因子核酸酶(TALEN，Transcription Activator-like effectorNuclease)，其识别靶位点DNA特异性的单位模块是间隔32个恒定氨基酸残基的二联氨基酸，不同的二联氨基酸能够与AGTC四个核苷酸碱基一一对应。根据靶标DNA的序列反推出对应的二联氨基酸序列，从而构成TALEN靶点识别模块。该模块进行组装需要大量的分子克隆和测序操作，从而限制了该技术的推广。
第三基因编辑技术是基于Cas酶的CRISPR技术，该技术通过guide RNA实现特异性识别靶标DNA序列，guide RNA的设计和合成工作量远小于TALEN和ZFN技术的DNA识别模块构建过程。Guide RNA能够结合具有核酸酶活性的Cas蛋白，并引导其对靶标DNA进行切割。Cas9是目前在基因编辑方面应用范围最为广泛的Cas蛋白。
然而目前的Cas蛋白，比如Cas9和Cas12a都存在一定程度的脱靶率。当Cas蛋白(比如Cas12a)与guide RNA和靶标DNA形成三元复合体后，不仅对靶标DNA具有顺式(cis)切割活性，还对体系中存在的单链DNA具有非特异的反式(trans)切割活性。当DNA处于复制或转录状态时，双链DNA会解链成单链DNA，此时Cas蛋白(比如Cas12a)的反式切割活性可能会导致这些DNA被切割，因而导致脱靶产生，并且引起细胞毒问题。因此需要消除Cas蛋白(比如Cas12a)的反式切割活性以解决脱靶引起的细胞毒问题。
因此，本领域迫切需要开发一种能够消除Cas蛋白(比如Cas12a)的反式切割活性以降低其在特异切割靶标核酸过程中的脱靶率的新方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够消除Cas蛋白，比如Cas12a的反式活性以降低其在特异切割靶标核酸过程中的脱靶率的新方法。
本发明第一方面提供了一种CRISPR-Cas的反应体系，包括：
(a)含有二价金属离子的溶液，所述二价金属离子包括Ca2+和Mg2+，并且所述溶液中的Ca2+的终浓度为0.1mM-200mM，较佳地，0.1mM-50mM，更佳地，0.1mM-10mM，Mg2+的终浓度低于Ca2+的终浓度，Mg2+和Ca2+的终浓度比≤99％，较佳地，≤50％，更佳地，≤30％，更佳地，≤0.1％，更佳地为0；
(b)Cas蛋白，所述Cas蛋白为V型CRISPR-Cas效应蛋白；和
(c)向导RNA，所述向导RNA引导Cas蛋白特异性地结合于靶标核酸分子。
在另一优选例中，所述Cas蛋白选自下组：V-A型CRISPR-Cas效应蛋白、V-B型CRISPR-Cas效应蛋白、V-E型CRISPR-Cas效应蛋白、V-F型CRISPR-Cas效应蛋白或其组合。
在另一优选例中，所述Cas蛋白包括Cas 12。
在另一优选例中，所述Cas蛋白选自下组：Cas12a、Cas12b、Cas12e、Cas12f或其组合。
另一优选例中，所述Cas12a选自下组：FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a、Lb4Cas12a、CeCas12a、PrCas12a、CsbCas12a、BhCas12a、SsCas12a、Lb3Cas12a、BpCas12a、PdCas12a、BfCas12a、PcCas12a、cMtCas12a、PeCas12a、LiCas12a、Lb2Cas12a、PmCas12a、MbCas12a、EeCas12a、CsbCas12a、ErCas12a、ArCas12a、BsCas12a、AbCas12a或其组合。
在另一优选例中，所述Cas蛋白的来源选自下组：纤毛菌属、李斯特菌属、棒状杆菌属、萨特氏菌属、军团菌属、密螺旋体属、产线菌属、真细菌属、链球菌属、乳酸菌属、支原体属、拟杆菌属、Flaviivola、黄杆菌属、固氮螺菌属、Sphaerochaeta、葡糖醋杆菌属、奈瑟氏菌属、罗氏菌属、Parvibaculum、葡萄球菌属、Nitratifractor、支原体属、弯曲杆菌属、毛螺菌属、或其组合。
在另一优选例中，所述Cas蛋白的来源选自下组：图拉弗朗西斯菌(Francisellatularensis)(FnCas12a)、氨基酸球菌属BV3L6(Acidaminococcus sp.BV3L6)(AsCas12a)、毛螺菌科细菌ND2006(Lachnospiraceae bacterium ND2006)(LbCas12a)、毛螺菌科细菌NC2008(Lachnospiraceae bacterium NC2008)(Lb5Cas12a)、孔氏创伤球菌(Helcococcussp kunzii)(HkCas12a)、Oribacterium sp.NK2B42(OsCas12a)、Thiomicrospira sp.XS5(TsCas12a)、拟杆菌KA00251(Bacteroidales bacterium KA00251)(BbCas12a)、口腔拟杆菌(Bacteroidetes oral taxon 274)(BoCas12a)、毛螺菌科细菌MC2017(Lachnospiraceaebacterium MC2017)(Lb4Cas12a)、规则粪球菌(Coprococcus eutactus)(CeCas12a)、栖瘤胃普氏菌(Prevotella ruminicola strain BPI-34)(PrCas12a)、CandidatusSaccharibacteria bacterium(CsbCas12a)、亨氏丁酸弧菌(Butyrivibrio hungateistrain MB2003)(BhCas12a)、史密斯氏菌SC_K08D17(Smithella sp.SC_K08D17)(SsCas12a)、毛螺菌科细菌MC2017(Lachnospiraceae bacterium MC2017)(Lb3Cas12a)、瘤胃溶纤维丁酸弧菌(Bytyrivibrio proteoclasticus)(BpCas12a)、普氏杆菌(Prevotelladisens)(PdCas12a)、溶纤维丁酸弧菌MD2001(Butyrivibrio fibrisolvens MD2001)(BfCas12a)、狗口腔卟啉单胞菌(Porphyromonas crevioricanis)PcCas12a、CandidatusMethanoplasma termitum(CMtCas12a)、异域菌门细菌(Peregrinibacteria bacterium)(PeCas12a)、Leptospira inadaiserovar Lyme(LiCas12a)、毛螺菌科细菌MA2020(Lachnospiraceae bacterium MA2020)(Lb2Cas12a)、猕猴卟啉单胞菌(Porphyromonasmacaca)(PmCas12a)、牛莫拉氏菌(Moraxella bovoculi 237)(MbCas12a)、挑剔真杆菌(Eubacterium eligens)(EeCas12a)、Candidatus Saccharibacteria bacterium(CsbCas12a)、直肠真杆菌(Eubacte riumrectale)(ErCas12a)、直肠酵母菌(Agathobacterrectalisstrain)(ArCas12a)、丁酸弧菌NC3005(Butyrivibrio sp.NC3005)(BsCas12a)、布氏弓形杆菌(Arcobacter butzleri)(AbCas12a)或其组合。
在另一优选例中，所述反应体系用于降低Cas蛋白的反式切割活性。
在另一优选例中，所述降低指所述Cas蛋白的反式切割活性降低≥10％，较佳地≥50％，更佳地，≥80％或90％，最佳的100％。
在另一优选例中，所述反应体系中Cas蛋白的顺式切割活性增强或者活性保留≥50％，更佳地，≥80％或90％，最佳的100％。
在另一优选例中，所述反应体系用于基因编辑、分子克隆、靶标核酸检测、DNA片段拼接、和/或基因合成。
在另一优选例中，所述基因编辑包括体内基因编辑和体外基因编辑。
在另一优选例中，所述反应体系用于降低基因编辑的脱靶率。
在另一优选例中，所述反应体系包括靶标核酸分子。
在另一优选例中，所述反应体系用于提高分子克隆的效率和阳性率。
在另一优选例中，所述反应体系包括非靶标核酸分子。
在另一优选例中，所述溶液为Cas蛋白的反应缓冲液。
在另一优选例中，所述溶液中Cas蛋白的顺式切割活性增强或者活性保留≥50％，更佳地，≥80％或90％，最佳的100％。
在另一优选例中，所述溶液中Cas蛋白的反式切割活性降低≥10％，较佳地≥50％，更佳地，≥80％或90％，最佳的100％。
在另一优选例中，所述Cas蛋白的反应缓冲液是使Cas蛋白发挥顺式切割活性的缓冲液。
在另一优选例中，所述溶液包括HOLMES缓冲液、HOLMES Ca2+缓冲液、NEBuffer1.1、NEBuffer 2.1、NEBuffer 3.1、CutSmart、NEBuffer r1.1、NEBuffer r2.1、NEBufferr3.1、NEBuffer r3.1、rCutSmart缓冲液。
在另一优选例中，所述二价金属离子的来源包括氯化钙、硫酸钙、硝酸钙、碳酸钙、碳酸氢钙、磷酸钙、磷酸氢钙、乙酸钙、氯化镁、硫酸镁、硝酸镁、碳酸镁、碳酸氢镁、磷酸镁、磷酸氢镁、乙酸镁。
在另一优选例中，所述Mg2+和Ca2+的终浓度比为0-99％，较佳地，0-50％，更佳地，0-30％，更佳地，0-0.1％。
在另一优选例中，靶标核酸分子包括靶标DNA。
在另一优选例中，所述的靶标DNA包括基于RNA反转录形成的DNA。
在另一优选例中，所述的靶标DNA包括cDNA。
在另一优选例中，所述的靶标DNA选自下组：单链DNA、双链DNA、或其组合。
在另一优选例中，所述靶标核酸分子包括来源于选自下组的靶标核酸分子：植物、动物、昆虫、微生物、病毒、或其组合。
在另一优选例中，所述的靶标DNA是人工合成或天然存在的DNA。
在另一优选例中，所述的靶标DNA包括野生型或突变型的DNA。
在另一优选例中，所述的靶标DNA包括由RNA逆转录或扩增而获得的DNA，如cDNA等。
在另一优选例中，所述非靶标核酸分子为单链DNA分子。
在另一优选例中，所述非靶标核酸分子带有可检测标记。
在另一优选例中，所述可检测标记包括荧光发光基团、荧光淬灭基团。
在另一优选例中，所述的荧光发光基团和荧光淬灭基团各自独立地位于所述非靶标核酸分子的5'端、3'端。
在另一优选例中，所述的非靶标核酸分子的长度为3-300nt，较佳地5-100nt，更佳地6-50nt，更佳地6-20nt。
在另一优选例中，所述的向导RNA的长度为16-200nt，较佳地20-150nt，更佳地30-140nt。
在另一优选例中，所述的反应体系还含有：
(e1)用于扩增靶标核酸分子的聚合酶；
(e2)任选的用于反转录的反转录酶；
(e3)用于扩增反应和/或反转录反应的dNTP。
在另一优选例中，所述的靶标核酸分子在所述反应体系中的终浓度为0.1pM-100μM，较佳地，1nM-1μM，更佳地，1nM-300nM。
在另一优选例中，所述的非靶标核酸分子在所述反应体系中的终浓度为0.1nM-2μM，较佳地，100nM-500nM。
本发明第二方面提供了一种制备本发明第一方面所述的反应体系的方法，包括：
将Cas蛋白，向导RNA与含有二价金属离子的溶液孵育，其中所述Cas蛋白为V型CRISPR-Cas效应蛋白，所述向导RNA引导Cas蛋白特异性结合于靶标核酸分子，所述二价金属离子包括Ca2+和Mg2+，并且所述溶液中的Ca2+的终浓度为0.1mM-200mM，较佳地，0.1mM-50mM，更佳地，0.1mM-10mM，Mg2+的终浓度低于Ca2+的终浓度，Mg2+和Ca2+的终浓度比≤99％，较佳地，≤50％，更佳地，≤30％，更佳地，≤0.1％，更佳地为0。
本发明第三方面提供了一种本发明第一方面所述的反应体系的用途，用于制备一试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒用于基因编辑、分子克隆、靶标核酸检测、DNA片段拼接、和/或基因合成。
在另一优选例中，所述基因编辑包括体内基因编辑、体外基因编辑。
在另一优选例中，所述靶标核酸检测包括体内靶标核酸检测、体外靶标核酸检测。
在另一优选例中，所述试剂或试剂盒还用于降低基因编辑的脱靶率。
在另一优选例中，所述试剂或试剂盒还用于提高分子克隆的效率和阳性率。
本发明第四方面提供了一种用于特异切割靶标核酸的试剂盒，所述试剂盒包括：
i)第一容器以及位于第一容器内的Cas蛋白，所述Cas蛋白为V型CRISPR-Cas效应蛋白；
ii)任选的第二容器以及位于第二容器内的靶标核酸分子；
iii)任选的第三容器以及位于第三容器内的向导RNA，所述向导RNA引导所述Cas蛋白特异性结合于靶标核酸分子；
iv)任选的第四容器及位于第四容器内的非靶标核酸分子；
v)第五容器以及位于第五容器内的含有二价金属离子的溶液，所述二价金属离子包括Ca2+和Mg2+，并且所述溶液中的Ca2+的终浓度为0.1mM-200mM，较佳地，0.1mM-50mM，更佳地，0.1mM-10mM，Mg2+的终浓度低于Ca2+的终浓度，Mg2+和Ca2+的终浓度比≤99％，较佳地，≤50％，更佳地，≤30％，更佳地，≤0.1％，更佳地为0。
在另一优选例中，所述试剂盒用于降低Cas蛋白的反式切割活性。
在另一优选例中，所述降低指所述Cas蛋白的反式切割活性降低≥10％，较佳地≥50％，更佳地，≥80％或90％，更佳地为100％。
在另一优选例中，所述试剂盒中的Cas蛋白的顺式切割活性增强或者活性保留≥50％，更佳地，≥80％或90％，最佳的100％。
在另一优选例中，所述的第一容器、第二容器、第三容器、第四容器和第五容器中的任何二个、三个、或四个或五个(或全部)可以是相同(或同一)或不同容器，例如，第一容器、第五容器是相同容器；或第一容器、第二容器、第五容器是相同容器；或第一容器、第三容器、第五容器是相同容器；或第一容器、第二容器、第三容器、第五容器是相同容器。
在另一优选例中，所述第一容器、第二容器、第三容器、第四容器和第五容器为相同(或同一)或不同的容器。
在另一优选例中，所述非靶标核酸分子带有可检测标记。
在另一优选例中，所述可检测标记包括荧光发光基团、荧光淬灭基团。
在另一优选例中，所述的荧光基团和淬灭基团各自独立地位于所述非靶标核酸分子的5'端、3'端。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括：
v)第六容器以及位于第六容器内的用于扩增靶标DNA的聚合酶；
vi)任选的第七容器以及位于第七容器内的用于反转录的反转录酶；
vii)第八容器以及位于第八容器内的用于扩增反应和/或反转录反应的dNTP。
在另一优选例中，所述第六容器、第七容器和第八容器是相同容器。
在另一优选例中，所述第六容器和第八容器是相同容器。
在另一优选例中，所述第一容器至第八容器中的二个、多个或全部可以是相同(或同一)容器或不同容器(例如，第一容器、第五容器、第六容器、第七容器、第八容器是相同容器；第一容器、第二容器、第五容器、第六容器、第七容器、第八容器是相同容器；第一容器、第三容器、第五容器、第六容器、第七容器、第八容器是相同容器；第一容器、第二容器、第三容器、第五容器、第六容器、第七容器、第八容器是相同容器)。
本发明第五方面提供了一种特异切割靶标核酸的方法，包括以下步骤：
将本发明第一方面所述的反应体系与含有靶标核酸分子的样本混合，从而对所述样本中的靶标核酸分子进行切割。
在另一优选例中，所述样本包括未经扩增(或核酸扩增)的样本以及经过扩增(或核酸扩增)的样本。
在另一优选例中，所述样本是经过扩增而获得的样本。
在另一优选例中，所述样本来源于选自下组的培养方法获得的样本：细胞培养、细菌培养、病毒培养、真菌培养、微生物培养、类器官培养、动物体内富集培养和植物培养。
在另一优选例中，所述样本是经过核酸扩增而获得的样本。
在另一优选例中，所述样本是经过反转录结合(或不结合)核酸扩增而获得的样本。
在另一优选例中，所述靶标核酸是DNA分子或经过反转录而获得的cDNA分子。
在另一优选例中，所述靶标核酸是由DNA(或cDNA)经过核酸扩增而获得的DNA分子。
在另一优选例中，所述核酸扩增的方法选自下组：PCR扩增、LAMP扩增、RPA扩增、连接酶链式反应、分支DNA扩增、NASBA、SDA、转录介导扩增、滚环扩增、HDA、SPIA、NEAR、TMA和SMAP2。
在另一优选例中，所述的PCR包括高温PCR、常温PCR和低温PCR。
在另一优选例中，所述靶标核酸分子位于细胞中。
在另一优选例中，所述细胞为体外的细胞。
在另一优选例中，所述细胞是原核细胞或真核细胞或人工合成细胞或含有靶标核酸的类细胞。
在另一优选例中，所述细胞是哺乳动物细胞。
在另一优选例中，所述哺乳动物细胞是非人类哺乳动物，例如灵长类动物、牛、羊、猪类、犬、啮齿动物、兔科，例如猴、母牛、绵羊、猪、狗、兔、大鼠或小鼠的细胞。
在另一优选例中，所述细胞是非哺乳动物真核细胞例如家禽鸟类(例如鸡)、脊椎动物鱼(例如鲑鱼)或甲壳类动物(例如牡蛎、蛤、龙虾、虾)的细胞。
在另一优选例中，所述细胞是植物细胞。
在另一优选例中，所述植物细胞是单子叶植物或双子叶植物具有的细胞或栽培植物或粮食植物例如木薯、玉米、高粱、大豆、小麦、燕麦或稻具有的细胞。
在另一优选例中，所述植物细胞是藻类、树或生产植物、果实或蔬菜(例如，树类例如柑橘树，例如桔子树、葡萄柚树或柠檬树；桃树或油桃树；苹果树或梨树；坚果树例如杏树或核桃树或阿月浑子树；茄属植物；芸苔属植物；莴苣属植物；菠菜属植物；辣椒属植物；棉花、烟草、芦笋、胡萝卜、甘蓝、西兰花、花椰菜、番茄、茄子、胡椒、莴苣、菠菜、草莓、蓝莓、覆盆子、黑莓、葡萄、咖啡、可可等)具有的细胞。
在另一优选例中，所述方法还可提高靶标核酸切割的精准性。
在另一优选例中，所述提高靶标核酸切割的精准性有利于进行基因编辑。
在另一优选例中，所述方法还可降低基因编辑的脱靶率。
在另一优选例中，所述的靶标核酸切割反应在体外反应体系中进行。
在另一优选例中，所述的方法是体外方法。
在另一优选例中，所述的方法是非诊断性和非治疗性的。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1是第I组实验的反式切割反应的荧光信号变化图。
图2是第II组实验的顺式切割产物的电泳图。
图3是第II组实验的反式切割反应的荧光信号变化图。
图4是第III组实验的顺式切割产物的电泳图。
图5是第III组实验的反式切割反应的荧光信号变化图。
图6是第IV组实验的顺式切割产物的电泳图。
图7是第V组实验的反式切割反应的荧光信号变化图。
图8是第VI组实验的顺式切割产物的电泳图之一。
图9是第VI组实验的顺式切割产物的电泳图之二。
图10是第VII组实验的反式切割反应的荧光信号变化图。
图11是第VIII组实验中Cas14在NEB 1.1、NEB 1.1Ca2+、负对照中的顺式切割反应的荧光信号变化图。
图12是第VIII组实验中Cas14在NEB 2.1、NEB 2.1Ca2+、负对照中的顺式切割反应的荧光信号变化图。
图13是第VIII组实验中Cas14在NEB 3.1、NEB 3.1Ca2+、负对照中的顺式切割反应的荧光信号变化图。
图14是第VIII组实验中Cas14在Cutsmart、Cutsmart Ca2+、负对照中的顺式切割反应的荧光信号变化图。
图15是第VIII组实验中Cas14在HOLMES、HOLMES Ca2+、负对照中的顺式切割反应的荧光信号变化图。
图16是第VIII组实验中Cas14在NEB 1.1、NEB 1.1Ca2+、负对照中的反式切割反应的荧光信号变化图。
图17是第VIII组实验中Cas14在NEB2.1、NEB2.1 Ca2+、负对照中的反式切割反应的荧光信号变化图。
图18是第VIII组实验中Cas14在NEB3.1、NEB3.1 Ca2+、负对照中的反式切割反应的荧光信号变化图。
图19是第VIII组实验中Cas14在Cutsmart、Cutsmart Ca2+、负对照中的反式切割反应的荧光信号变化图。
图20是第VIII组实验中Cas14在HOLMES、HOLMES Ca2+、负对照中的反式切割反应的荧光信号变化图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，通过调整反应体系中的Mg2+和Ca2+的终浓度及其比例，比如反应体系中的Ca2+的终浓度为0.1mM-200mM，较佳地，0.1mM-50mM，更佳地，0.1mM-10mM，Mg2+的终浓度低于Ca2+的终浓度，Mg2+和Ca2+的终浓度比≤99％，较佳地，≤50％，更佳地，≤30％，更佳地，≤0.1％，更佳地为0，可显著降低Cas12a的反式切割活性但是不影响或增强其顺式切割活性，并且可降低特异切割靶标核酸的脱靶率，并且本发明的方法可定量检测，具有高准确性。在此基础上，本发明人完成了本发明。
术语“向导RNA”或“gRNA”或“sgRNA”是指引导Cas蛋白(如Cas12a蛋白)特异性结合靶标核酸分子(比如靶标DNA序列)的RNA。
术语“CRISPR”是指成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats)，该序列是许多原核生物的免疫系统。
术语“Cas蛋白”是指CRISPR-associated蛋白，它是CRISPR系统中的相关蛋白。
术语“Cas12a”(旧称“Cpf1”)是指crRNA依赖的内切酶，它是CRISPR系统分类中V-A型的酶。
术语“PCR”是指“聚合酶链式反应”，用于大量扩增目的DNA片段的一种方法。
如本文所用“二价阳离子”是指原子失去2个电子，而产生的带正电荷的稳定结构。常见的二价阳离子有镁离子、钙离子、亚铁离子、铜离子、锰离子、锌离子、钴离子、钡离子、镍离子。
在本发明中，NEBuffer 1.1(简称NEB 1.1)、NEBuffer 2.1(简称NEB 2.1)、NEBuffer 3.1(简称NEB 3.1)、CutSmart Buffer(简称CutSmart)、NEBuffer r1.1、NEBuffer r2.1、NEBuffer r3.1、NEBuffer r3.1、rCutSmart Buffer均为市售缓冲液，均购自New England Biolabs。NEBuffer r1.1、NEBuffer r2.1、NEBuffer r3.1、NEBufferr3.1、rCutSmart Buffer为NEBuffer 1.1、NEBuffer 2.1、NEBuffer 3.1、CutSmart Buffer的升级款，均可以用于本发明。
HOLMES缓冲液的成分如表3所示；HOLMES缓冲液，在本发明中有时候也用HOLMESMg2+表示。NEB 1.1在本发明中有时候也用NEB 1.1Mg2+表示。NEB 2.1在本发明中有时候也用NEB2.1 Mg2+表示。NEB 3.1在本发明中有时候也用NEB 3.1Mg2+表示。CutSmart在本发明中有时候也用CutSmart Mg2+表示。
HOLMES Ca2+缓冲液的成分与HOLMES缓冲液的成分区别仅在于，将表3中的MgCl2替换为同样浓度的CaCl2。NEB 1.1Ca2+缓冲液与NEB 1.1缓冲液的区别在于将Mg2+替换为同样浓度的Ca2+。NEB 2.1Ca2+缓冲液与NEB 2.1缓冲液的区别在于将Mg2+替换为同样浓度的Ca2+。NEB 3.1Ca2+缓冲液与NEB 3.1缓冲液的区别在于将Mg2+替换为同样浓度的Ca2+。CutSmartCa2+缓冲液与CutSmart缓冲液的区别在于将Mg2+替换为同样浓度的Ca2+，其他成分以及含量不变。
Cas蛋白
本文所述“Cas蛋白”是指CRISPR-associated蛋白，优选V型CRISPR-CAS效应蛋白，其一旦与靶序列结合(即形成Cas蛋白-gRNA-靶序列的三元复合物)，就可以诱发其反式切割活性，即随机切割非靶标核酸序列。
本发明所述的Cas蛋白具有顺式和反式切割活性的蛋白。所述的顺式切割活性是指Cas蛋白对靶标核酸分子的特异切割活性。
本发明所述的Cas蛋白为V型CRISPR-Cas效应蛋白；所述Cas蛋白选自以下组：V-A型CRISPR-Cas效应蛋白、V-B型CRISPR-Cas效应蛋白、V-E型CRISPR-Cas效应蛋白、V-F型CRISPR-Cas效应蛋白或其组合；本发明所述的Cas蛋白包括Cas12，例如Cas12a、Cas12b、Cas12e、Cas12f。在实施方式中，本文所称的Cas蛋白，如Cas12，也涵盖Cas蛋白的功能变体或其同源物或直系同源物。如本文所用的蛋白的“功能变体”是指至少部分保留该蛋白的活性的这样的蛋白的变体。功能变体可以包括突变体(其可以是插入、缺失或替换突变体)，包括多晶型物等。功能变体中还包括这样的蛋白与另一种通常不相关的核酸、蛋白质、多肽或肽的融合产物。功能变体可以是天然存在的或可以是人造的。有利的实施方式可以涉及工程化或非天然存在的V型DNA靶向效应蛋白。
在一个实施方式中，V型CRISPR-Cas效应蛋白或其直系同源物或同源物可以包含一个或多个突变(并且因此编码其的核酸分子可以具有一个或多个突变。突变可以是人工引入的突变并且可以包括但不限于催化结构域中的一个或多个突变。
在一个实施方式中，V型CRISPR-Cas效应蛋白可以来自：纤毛菌属、李斯特菌属、棒状杆菌属、萨特氏菌属、军团菌属、密螺旋体属、产线菌属、真细菌属、链球菌属、乳酸菌属、支原体属、拟杆菌属、Flaviivola、黄杆菌属、固氮螺菌属、Sphaerochaeta、葡糖醋杆菌属、奈瑟氏菌属、罗氏菌属、Parvibaculum、葡萄球菌属、Nitratifractor、支原体属、弯曲杆菌属、毛螺菌属。
gRNA
如本文所用，所述的“gRNA”又称为guide RNA或导向RNA，并且具有本领域技术人员通常理解的含义。一般而言，导向RNA可以包含同向(direct)重复序列和导向序列(guidesequence)，或者基本上由或由同向重复序列和导向序列(在内源性CRISPR系统背景下也称为间隔序列(spacer))组成。gRNA在不同的CRISPR系统中，依据其所依赖的Cas蛋白的不同，可以包括crRNA和tracrRNA，也可以只含有crRNA。crRNA和tracrRNA可以经过人工改造融合形成single guide RNA(sgRNA)。在某些情况下，导向序列是与靶序列(本发明中所述特征序列)具有足够互补性从而与所述靶序列杂交并引导CRISPR/Cas复合物与所述靶序列的特异性结合的任何多核苷酸序列，通常具有12-25nt的序列长度。所述的同向重复序列可折叠形成特定结构(如茎环结构)供Cas蛋白识别，以形成复合物。所述的导向序列不需要与特征序列(靶序列)100％互补。所述的导向序列不与非靶标核酸分子互补。
在某些实施方案中，当最佳比对时，导向序列与其相应靶序列之间的互补程度(匹配度)为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％。确定最佳比对在本领域的普通技术人员的能力范围内。例如，存在公开和可商购的比对算法和程序，诸如但不限于ClustalW、matlab中的史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman)、Bowtie、Geneious、Biopython以及SeqMan。
本发明所述的gRNA可以是天然的，也可以是经过人工改造或设计合成的。
术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸分子”和“核酸”可以互换使用，包括DNA、RNA或者其杂交体，可以是双链或单链的。
术语“同源性”或“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在两个序列之间的该位置上是同一的。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，氨基酸序列的同一性可以通过常规方法，参考例如Smith and Waterman,1981,Adv.Appl.Math.2:482Pearson&Lipman,1988,Pro.Natl.Acad.Sci.USA85:244,Thompson etal.,1994,Nucleic Acids Res22:467380等的教导，通过计算机化运行运算法则(Wisconsin Genetics软件包中的GAP,BESTFIT,FASTA,和TFASTA,Genetics Computer Group)来确定。也可使用可从美国国立生物技术信息中心(NCBI www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得的BLAST运算法则，使用默认参数确定。
反应体系
本发明提供了一种切割靶标核酸分子的反应体系，包括：
(a)含有二价金属离子的溶液，所述二价金属离子包括Ca2+和Mg2+，并且所述溶液中的Ca2+的终浓度为0.1mM-200mM，较佳地，0.1mM-50mM，更佳地，0.1mM-10mM(请补充)，Mg2+的终浓度低于Ca2+的终浓度，Mg2+和Ca2+的终浓度比≤99％，较佳地，≤50％，更佳地，≤30％，更佳地，≤0.1％，更佳地为0；
(b)Cas蛋白，所述Cas蛋白为V型CRISPR-Cas效应蛋白；和
(c)向导RNA，所述向导RNA引导Cas蛋白特异性结合于靶标核酸分子。
本案发明人首次发现，将Cas蛋白与含有特定终浓度以及特定比例的二价金属离子的溶液(包括Ca2+和Mg2+，并且所述溶液中的Ca2+的终浓度为0.1mM-200mM，较佳地，0.1mM-50mM，更佳地，0.1mM-10mM，Mg2+的终浓度低于Ca2+的终浓度，Mg2+和Ca2+的终浓度比≤99％，较佳地，≤50％，更佳地，≤30％，更佳地，≤0.1％，更佳地为0)孵育，可有效切割靶标核酸分子，还可降低Cas蛋白的反式切割活性，并且不影响或增强Cas蛋白的顺式切割活性。
顺式(cis)切割活性
在本发明中，顺式切割活性是指Cas蛋白对靶标核酸分子的切割活性。
反式(trans)切割活性
在本发明中，反式切割活性是指Cas蛋白对非靶标核酸分子的切割活性。
当DNA处于复制或转录状态时，双链DNA(dsDNA)会解链成单链DNA(ssDNA)，此时Cas蛋白(比如Cas12a)的反式切割活性可能会导致这些单链状态的DNA被非特异性切断，从而造成脱靶切割。同样地，在利用Cas蛋白进行体外靶标双链DNA切割时，其切割产物含有粘性末端(即突出的单链DNA分子)，容易被Cas蛋白(比如Cas12a)的反式切割活性切碎，从而改变产物的末端序列，影响后续的基因克隆等实验操作。同样地，在利用Cas蛋白进行体外靶标ssDNA切割时，其反式切割活性会非特异地切割体系中其他ssDNA分子，从而产生不均一的ssDNA切割产物，影响后续的DNA拼接、DNA杂交等实验操作。因此，降低Cas蛋白的反式切割活性等同于降低Cas蛋白切割靶标核酸时的脱靶率，从而提升Cas蛋白切割靶标核酸的精准率。
靶标核酸切割的方法
本发明提供了一种切割靶标核酸的方法，包括以下步骤：
将本发明第一方面所述的反应体系与含有靶标核酸分子的样本混合，从而对所述样本中的靶标核酸分子进行特异切割。
在另一优选例中，所述方法还可降低特异切割靶标核酸的脱靶率。
本发明的方法可显著降低Cas12a的反式切割活性但是不影响或增强其顺式切割活性，并且可降低特异切割靶标核酸的脱靶率，因此本发明的方法可以用于植物品种改良、菌种改良等方面。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明首次发现，通过调整反应体系中的二价离子(如Mg2+和Ca2+)的终浓度及其比例，比如反应体系中的Ca2+的终浓度为0.1mM-200mM，较佳地，0.1mM-50mM，更佳地，0.1mM-10mM，Mg2+的终浓度低于Ca2+的终浓度，Mg2+和Ca2+的终浓度比≤99％，较佳地，≤50％，更佳地，≤30％，更佳地，≤0.1％，更佳地为0，可显著降低Cas12a的反式切割活性但是不影响或增强其顺式切割活性，并且可降低靶标核酸切割切割的脱靶率，提升靶标核酸切割的精准性，应用于基因编辑、分子克隆、核酸检测、DNA片段拼接、基因合成等领域，并且本发明的方法可对靶标核酸进行定量精准检测。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
如无特别说明，则本发明实施例中所用的材料和试剂均为市售产品。
材料与方法
1.靶标dsDNA序列的制备：
以AMED16s-F/R(序列AMED16s-F:gtgaactaagccagtagagc,AMED16s-R:ctttcgctcctcagcgtcag，生工生物工程(上海)股份有限公司合成)为底物，地中海拟无枝酸菌U32基因组(INSDC号为CP002000.1)为模板进行PCR扩增。靶标dsDNA片段的PCR扩增体系见表1。PCR反应程序为：95℃预变性10min，95℃变性15s，57℃退火15s，72℃延伸30s(1min可扩增2kb)，32个循环，最后，75℃延伸5min。1.5％(w/v)琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小，扩增产物为正确单一的DNA片段，采用柱回收方法回收目的片段，柱回收用Promega公司的Wizard SV Gel and PCR clean-up system试剂盒。
表1靶标dsDNA片段的PCR扩增体系
2.顺式切割反应实验：
表2顺式切割反应体系
*本具体实施方式中Cas12a是LbCas12a、BoCas12a、FnCas12a、AsCas12a、OsCas12a、ErCas12a、EvCas12a、HkCas12a、WsCas12a、BbCas12a。
表3 10×HOLMES缓冲液成分
成分 10×浓度(mM或％)
Spermidine 25
Tris 400
MgCl2 60
DTT 10
Glycine 400
Triton X-100 0.01％
PEG20000 4％
pH 8.4
crRNA序列：5'-AAUUUCUACUCUUGUAGAUGCCAGGGACGAAGCGCAAGUGACGGAAU-3'，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，HPLC纯化。
顺式切割反应方法如下：配置顺式切割反应体系，37℃反应40min，85℃灭活5min，加入终浓度为1×DNA loading。将全部反应产物上样，2％(w/v)琼脂糖凝胶电泳，140V电泳25min，EB泡染30min，凝胶成像仪检测电泳条带，顺式切割产物为525bp和300bp的两个DNA片段。另外，对照组(Control)的顺式切割体系中不添加Cas12a蛋白，其余与实验组保持一致。
3.反式切割活性检测实验
表4反式切割反应体系
*本具体实施方式中Cas12a是LbCas12a、BoCas12a、FnCas12a、AsCas12a、OsCas12a、ErCas12a、EvCas12a、HkCas12a、WsCas12a、BbCas12a。
HOLMES-P(FQ-reporter)(即非靶标核酸分子)，购自安徽吐露港生物科技有限公司，是一端为FAM荧光发光基团修饰另一端为BHQ1荧光淬灭基团修饰的短单链DNA片段(5'-TTTTTT-3')，当该短单链DNA片段完整时，该DNA探针不发出荧光，而只有当该单链DNA片段被切开后，淬灭基团与荧光基团分开，才能检测到FAM荧光发光基团的荧光信号。
配置好反式切割体系后立刻放入实时荧光定量PCR仪器中，于37℃反应条件下检测荧光信号，每隔一分钟采集一次荧光信号。该体系中除Cas12a蛋白外，其它成分均可先配置成混合体系。另外，对照组(Control)的反式切割体系不加入靶标dsDNA，其余与实验组保持一致。
结果与讨论
Cas12a是一种依赖二价金属离子的DNA酶，在Mg2+、Ca2+、Mn2+和Co2+的环境下，Cas12a具有一定程度的催化活性。Cas12a的顺式切割和反式切割是由同一个核酸酶活性中心催化，这导致较难通过蛋白改造的方法实现Cas12a只有顺式活性没有反式切割活性。
由于不同的金属离子对Cas12a的活性具有不同的作用，本发明通过筛选反应体系中的各种金属离子环境，来寻找一种能够抑制Cas12a的反式切割活性但是不影响其顺式活性的反应体系，包括在含有6mM的Mg2+的HOLMES缓冲液(成分见表3)体系的基础上分别加入不同终浓度的CaCl2(0mM、10mM、20mM、40mM、80mM、160mM、320mM)以及将HOLMES缓冲液中的Mg2+的替换为Ca2+(HOLMES Ca2+缓冲液)。同样地，在其它缓冲液中改变Ca2+的浓度或将其它缓冲液中的二价离子替换为Ca2+时，也能得到类似的结果，其它的缓冲液如NEBuffer 2.1(NEB货号#B7202)、NEBuffer 3.1(NEB货号#B7203)、CutSmart Buffer(NEB货号#B7204)等使Cas蛋白发挥顺式切割活性的Cas蛋白的反应缓冲液。
第I组实验包括Ca2+终浓度分别为0mM、1mM、2mM、4mM、8mM、16mM、32mM，Mg2+终浓度固定为6mM的反式切割活性检测实验，以及不存在Mg2+只存在Ca2+且终浓度为6mM的反式切割活性检测实验(即图中的HOLMES Ca2+)。如图1所示，显示钙离子对LbCas12a的反式切割活性具有抑制作用，该作用的强弱与Ca2+的剂量正相关。如图1所示，第I组实验中体系中只存在Mg2+且终浓度为6mM(即图中的0mMCa2+，Mg2+/Ca2+比例为∞)时，蛋白的反式切割活性最高；在此基础上逐渐增加Ca2+的终浓度，如图1所示，蛋白反式切割活性随着Ca2+终浓度增加而降低。当体系中Ca2+终浓度为1mM(Mg2+/Ca2+比例为85.7％)、2mM(Mg2+/Ca2+比例为75％)、4mM(Mg2+/Ca2+比例为60％)时，蛋白的反式切割活性降低约10％；当体系中Ca2+终浓度为8mM(Mg2+/Ca2+比例为42.8％)时，蛋白的反式切割活性降低约20％；当体系中Ca2+终浓度为16mM(Mg2+/Ca2+比例为27.3％)时，蛋白的反式切割活性降低约45％；当体系中Ca2+终浓度为32mM(Mg2+/Ca2+比例为15.7％)时，蛋白的反式切割活性降低约30％；当体系中只存在Ca2+且终浓度为6mM(即图中的HOLMES Ca2+，Mg2+/Ca2+比例为0)时，蛋白的反式切割活性降低100％，即蛋白反式切割活性被完全抑制)。即在以Ca2+为主要二价阳离子的缓冲液中，LbCas12a的反式切割活性被完全抑制。
第II组实验为比较LbCas12a在HOLMES缓冲液和HOLMES Ca2+缓冲液中顺式切割活性和反式切割活性的实验，结果表明LbCas12a在这两种缓冲液中的顺式活性无明显差异。如图2所示，泳道M为1Kb DNA Marker，泳道1为靶标双链DNA(对照组)，大小为825bp，泳道2为HOLMES缓冲液反应组(即终浓度为6mM的Mg2+)；泳道3为HOLMES Ca2+反应组(即终浓度为6mM的Ca2+)；泳道2和泳道3的结果均表明LbCas12a在以Ca2+、Mg2+离子为二价离子的缓冲液中均有顺式切割活性，切割产物为525bp和300bp的两个DNA片段。
见图3，第II组实验的的反式切割活性实验结果表明，在HOLMES缓冲液中LbCas12a蛋白具有较高的反式切割活性，而在HOLMES Ca2+缓冲液中LbCas12a蛋白的反式切割活性被完全抑制。如图3所示，LbCas12a在HOLMES缓冲液(Mg/2+Ca2+比例为∞)中，荧光信号随着反应时间延长而增强，说明LbCas12a蛋白的反式切割活性比较高；而在HOLMES Ca2+缓冲液中(Mg/2+Ca2+比例为0)中，反应体系的荧光信号随着反应时间延长而保持不变，并一直保持在很低的水平，该结果说明LbCas12a蛋白的反式切割活性在以Ca2+为主要二价离子的缓冲液中被抑制。Control为反式切割体系中不加靶标双链DNA分子。
第III组实验中，本案发明人还检测了其它物种来源的Cas12a在HOLMES和HOLMESCa2+缓冲液中的顺式与反式切割活性。如图4所示，这些Cas12a包括BoCas12a、FnCas12a和AsCas12a，其结果与LbCas12a一样，在HOLMES和HOLMES Ca2+缓冲液中均有顺式切割活性，且切割活性基本不受缓冲液中Mg2+和Ca2+的成分影响。对应地，如图5所示，在HOLMES缓冲液中，各类型Cas12a都有明显的反式切割活性。由于不同类型Cas12a蛋白的切割活力不同，导致不同类型Cas12a的荧光值增加速率(或者荧光曲线的斜率)存在不同，但是不同类型Cas12a的反应体系的荧光信号都随着反应时间的延长而增强，说明这些Cas12a蛋白在该种反应缓冲液中都有反式切割活性。而在HOLMES Ca2+缓冲液中，所有种类的Cas12a蛋白的反式切割活性都被完全抑制，即反应体系的荧光信号随着反应时间延长保持不变，且都保持在很低的水平。
第IV组实验是不同缓冲液对LbCas12a顺式切割活力的影响。如图6所示：泳道1-6是LbCas12a在HOLMES、NEB 2.1、NEB 3.1、Cutsmart、NEB 1.1缓冲液中顺式切割结果，泳道1为靶标双链DNA，大小为825bp，泳道2-6中LbCas12a发生顺式切割，切割产物大小为525bp和300bp。泳道7-13为LbCas12a在HOLMES Ca2+、NEB 2.1Ca2+、NEB 3.1Ca2+、Cutsmart Ca2+、NEB1.1Ca2+缓冲液(即Ca2+代替上述缓冲液中的Mg2+)中顺式切割结果。LbCas12a在不同的缓冲液及其对应的Ca2+缓冲液中均存在顺式切割活性。
第V组实验是不同缓冲液对LbCas12a反式切割活力的影响。如图7所示，在HOLMES、NEB 2.1、NEB 3.1、Cutsmart、NEB 1.1缓冲液中，LbCas12a存在反式切割活性，而在HOLMESCa2+、NEB 2.1Ca2+、NEB 3.1Ca2+、Cutsmart Ca2+、NEB 1.1Ca2+缓冲液，LbCas12a不存在反式切割活性。
第VI组实验是不同的Cas12a在HOLMES缓冲液中的顺式切割反应，以及不同的Cas12a在HOLMES Ca2+缓冲液中的顺式切割反应。如图8、图9所示，实验结果是不同的Cas12a在HOLMES缓冲液、HOLMES Ca2+缓冲液中均存在顺式切割活性。
第VII组实验是不同的Cas12a在HOLMES/HOLMES Ca2+缓冲液中的反式切割反应。如图10所示，Lb、Os、Er、Ev、Bo、As、Hk、Ws、Fn、BbCas12a在HOLMES Mg2+缓冲液中荧光信号随着反应时间延长信号逐渐增强。在Ca2+缓冲液中荧光信号始终保持不变，即Ca2+抑制Cas12a蛋白的反式切割活性。
第VIII组实验是以Cas14a1蛋白(购自安徽吐露港生物科技有限公司)做的顺式切割和反式切割实验，缓冲液分别采用NEB 1.1、NEB 2.1、NEB 3.1、Cutsmart、HOLMES及对应的NEB 1.1Ca2+、NEB 2.1Ca2+、NEB 3.1Ca2+、Cutsmart Ca2+、HOLMES Ca2+缓冲液。实验中采用的Cas14a1的tracRNA、crRNA、顺式反应的靶标探针、反式切割用的靶标ssDNA、反式切割的探针如下：
Cas14a1-tracRNA：
CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUC
Cas14a1-crRNA：AAGAACGCUGAAGCGCUGGGGGGUUGCAUUCCUUCAUUCCCUAUAGUGAGUCGUAUUA
Cas14a1-Target ssDNA-reporter:(顺式反应的靶标探针)
5‘FAM-TTCCGAAGAACGCTGAAGCGCTGGGGGCAA-BHQ1 3'
Cas14a1-Target ssDNA:(反式切割用的靶标ssDNA)
TTCCGAAGAACGCTGAAGCGCTGGGGGCAA
Cas14a1-nonTarget ssDNA-reporter(反式切割的探针)：
FAM-UUAUU-BHQ1
Cas14a1的tracRNA、crRNA、顺式反应的靶标探针、反式切割用的靶标ssDNA、反式切割的探针购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
第VIII组实验中，顺式切割反应实验和反式切割反应实验，除加入Cas14a1及对应加入Cas14a1的tracRNA、crRNA、顺式反应的靶标探针、反式切割用的靶标ssDNA、反式切割的探针外，其余均同上文所述的Cas12a的顺式切割反应实验和反式切割反应实验。
第VIII组实验结果见图11-图20，Cas14a1在NEB 1.1、NEB 2.1、NEB 3.1、Cutsmart、HOLEMES缓冲液中均有顺式切割活性，在NEB 1.1Ca2+、NEB 2.1Ca2+、NEB 3.1Ca2+、Cutsmart Ca2+、HOLEMES Ca2+中也有顺式切割活性，而且Ca2+对顺式切割活性的影响并不具有特别显著差异。Cas14a1在NEB 1.1、NEB 2.1、NEB 3.1、Cutsmart、HOLEMES缓冲液中均有反式切割活性，而在NEB 1.1Ca2+、NEB 2.1Ca2+、NEB 3.1Ca2+、Cutsmart Ca2+、HOLEMES Ca2+中反式切割活性被抑制。
以上各组实验中，负对照为未加缓冲液的实验。
综上所述，本案发明人发现了一种通过改变离子或离子浓度来调控Cas12a反式切割活性的方法。已有的Cas12a反应体系普遍采用Mg2+作为Cas12a催化活性所需的二价金属阳离子。但在Mg2+的环境下，Cas12a同时具有顺式切割活性和反式切割活性。反式切割活性可对单链DNA进行非特异的切割，这会破坏处于复制或转录状态的DNA结构。同样地，反式切割活性也会破坏经Cas蛋白切割或其它途径产生的ssDNA序列。如果该体系应用于基因编辑，会引起一定程度的脱靶效应。在本发明的方法中，反应体系中用Ca2+代替Mg2+，并调整Mg2 +和Ca2+的终浓度比，可抑制Cas12a的反式切割活性，同时保留了其顺式切割活性，从而克服了其反式切割活性引起的脱靶问题，使Cas12a在基因编辑、分子克隆、靶标核酸检测、DNA片段拼接、基因合成等方面的应用更加具有优势。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种CRISPR-Cas的反应体系，其特征在于，包括：
(a)含有二价金属离子的溶液，所述二价金属离子包括Ca2+和Mg2+，并且所述溶液中的Ca2+的终浓度为0.1mM-200mM，较佳地，0.1mM-50mM，更佳地，0.1mM-10mM，Mg2+的终浓度低于Ca2+的终浓度，Mg2+和Ca2+的终浓度比≤99％，较佳地，≤50％，更佳地，≤30％，更佳地，≤0.1％，更佳地为0；
(b)Cas蛋白，所述Cas蛋白为V型CRISPR-Cas效应蛋白；和
(c)向导RNA，所述向导RNA引导Cas蛋白特异性地结合于靶标核酸分子。
2.如权利要求1所述的反应体系，其特征在于，所述Cas蛋白选自下组：V-A型CRISPR-Cas效应蛋白、V-B型CRISPR-Cas效应蛋白、V-E型CRISPR-Cas效应蛋白、V-F型CRISPR-Cas效应蛋白或其组合。
3.如权利要求1所述的反应体系，其特征在于，所述Cas蛋白包括Cas 12。
4.如权利要求1所述的反应体系，其特征在于，所述反应体系用于降低Cas蛋白的反式切割活性。
5.如权利要求1所述的反应体系，其特征在于，所述溶液为Cas蛋白的反应缓冲液。
6.如权利要求5所述的反应体系，其特征在于，所述Cas蛋白的反应缓冲液是使Cas蛋白发挥顺式切割活性的缓冲液。
7.一种制备权利要求1所述的反应体系的方法，其特征在于，包括：
将Cas蛋白，向导RNA与含有二价金属离子的溶液孵育，其中所述Cas蛋白为V型CRISPR-Cas效应蛋白，所述向导RNA引导Cas蛋白特异性结合于靶标核酸分子，所述二价金属离子包括Ca2+和Mg2+，并且所述溶液中的Ca2+的终浓度为0.1mM-200mM，较佳地，0.1mM-50mM，更佳地，0.1mM-10mM，Mg2+的终浓度低于Ca2+的终浓度，Mg2+和Ca2+的终浓度比≤99％，较佳地，≤50％，更佳地，≤30％，更佳地，≤0.1％，更佳地为0。
8.一种权利要求1所述的反应体系的用途，其特征在于，用于制备试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒用于基因编辑、分子克隆、靶标核酸检测、DNA片段拼接、和/或基因合成。
9.一种用于特异切割靶标核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
i)第一容器以及位于第一容器内的Cas蛋白，所述Cas蛋白为V型CRISPR-Cas效应蛋白；
ii)任选的第二容器以及位于第二容器内的靶标核酸分子；
iii)任选的第三容器以及位于第三容器内的向导RNA，所述向导RNA引导所述Cas蛋白特异性结合于靶标核酸分子；
iv)任选的第四容器及位于第四容器内的非靶标核酸分子；
v)第五容器以及位于第五容器内的含有二价金属离子的溶液，所述二价金属离子包括Ca2+和Mg2+，并且所述溶液中的Ca2+的终浓度为0.1mM-200mM，较佳地，0.1mM-50mM，更佳地，0.1mM-10mM，Mg2+的终浓度低于Ca2+的终浓度，Mg2+和Ca2+的终浓度比≤99％，较佳地，≤50％，更佳地，≤30％，更佳地，≤0.1％，更佳地为0。
10.一种特异切割靶标核酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将权利要求1所述的反应体系与含有靶标核酸分子的样本混合，从而对所述样本中的靶标核酸分子进行切割。
CN202210871862.6A 2022-07-22 2022-07-22 一种通过改变离子来降低CRISPR-Cas12a特异切割靶标核酸脱靶率的方法 Pending CN117467644A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210871862.6A CN117467644A (zh) 2022-07-22 2022-07-22 一种通过改变离子来降低CRISPR-Cas12a特异切割靶标核酸脱靶率的方法
PCT/CN2023/086002 WO2024016730A1 (zh) 2022-07-22 2023-04-03 一种通过改变离子以降低CRISPR-Cas12a特异切割靶标核酸脱靶率的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210871862.6A CN117467644A (zh) 2022-07-22 2022-07-22 一种通过改变离子来降低CRISPR-Cas12a特异切割靶标核酸脱靶率的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117467644A true CN117467644A (zh) 2024-01-30

Family

ID=89616941

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210871862.6A Pending CN117467644A (zh) 2022-07-22 2022-07-22 一种通过改变离子来降低CRISPR-Cas12a特异切割靶标核酸脱靶率的方法

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN117467644A (zh)
WO (1) WO2024016730A1 (zh)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2998287A1 (en) * 2015-09-24 2017-04-20 Crispr Therapeutics Ag Novel family of rna-programmable endonucleases and their uses in genome editing and other applications
CN114507716A (zh) * 2020-11-16 2022-05-17 北京迅识科技有限公司 检测样品中靶核酸的方法
CN113373264B (zh) * 2021-06-10 2022-04-12 安徽医科大学 一种基于CRISPR/Cas系统的新型冠状病毒双靶标快速检测方法及试剂盒
CN114088952B (zh) * 2021-11-19 2024-04-16 南通大学 基于CRISPR-Cas12a传感系统的PPIs检测平台及检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2024016730A1 (zh) 2024-01-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111094588B (zh) 一种Cas蛋白的用途及靶标核酸分子的检测方法和试剂盒
EP3752647B1 (en) Cell data recorders and uses thereof
US20160053304A1 (en) Methods Of Depleting Target Sequences Using CRISPR
US11326209B2 (en) Cell-based genomic recorded accumulative memory
CN112543812A (zh) 基于crispr效应系统的扩增方法、系统和诊断
CN112105744A (zh) 方法
CN111662968A (zh) 一种基于crispr的无pam序列dna的检测方法及其应用
US20220033879A1 (en) Targeted enrichment by endonuclease protection
EP4028515A1 (en) Novel class 2 type ii and type v crispr-cas rna-guided endonucleases
Uyeno et al. Sequence-specific cleavage of small-subunit (SSU) rRNA with oligonucleotides and RNase H: a rapid and simple approach to SSU rRNA-based quantitative detection of microorganisms
US20210324378A1 (en) Multiplexed deterministic assembly of dna libraries
EP4240853A2 (en) Novel class 2 crispr-cas rna-guided endonucleases
CN111051522A (zh) 用于重组酶介导的选择性切割核酸的方法和组合物
CN115210370A (zh) 使用重编程tracrRNA的RNA检测和转录依赖性编辑
CN117467644A (zh) 一种通过改变离子来降低CRISPR-Cas12a特异切割靶标核酸脱靶率的方法
JP2022174281A (ja) シーケンシング用ライブラリの調製方法
AU2022335499A1 (en) Enzymes with ruvc domains
WO2023076952A1 (en) Enzymes with hepn domains
JP2023506631A (ja) 共有結合で閉端された核酸分子末端を使用したｎｇｓライブラリー調製
WO2020036181A1 (ja) 細胞を単離又は同定する方法及び細胞集団
JP7146839B2 (ja) シーケンシング用ライブラリの調製方法
EP1681358A1 (en) Identification of rare alleles by enzymatic enrichment of mismatched heteroduplexes
WO2023038020A1 (ja) 核酸配列改変用組成物および核酸配列の標的部位を改変する方法
US20230348877A1 (en) Base editing enzymes
EP4095254A2 (en) Fragmentation of dna

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination