CN117462524A - 异阿魏酸在制备治疗银屑病的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及中医药技术领域，具体为一种异阿魏酸在制备治疗银屑病的药物中的应用。经药理实验发现，异阿魏酸可明显改善小鼠银屑病样皮损，减少炎性细胞浸润、表皮细胞的过度增殖和异常分化以及皮损中CCL20mRNA的表达。并通过体外实验表明，异阿魏酸可抑制IL‑17诱导的HaCaT细胞增殖，抑制促炎因子IL‑6、IL‑8和趋化因子CCL20的产生和分泌，对STAT3信号通路磷酸化有良好的抑制作用。采用异阿魏酸用于制备治疗银屑病的药物，开拓了异阿魏酸新的应用领域。
Description
技术领域
本发明涉及中医药技术领域，特别是涉及一种异阿魏酸在制备治疗银屑病的药物中的应用。
背景技术
银屑病是一种遗传与环境共同作用诱发的免疫介导的慢性、复发性、炎症性、系统性疾病，典型的临床表现皮肤以境界清楚的红色斑块和银白色鳞屑为主，也可以有脓疱及全身红皮病表现，同时患者可以有多系统受累，如关节、甲、眼睛、心血管、胃肠道等。
银屑病发病以青壮年为主，且病程迁延，目前尚无根治方法，对患者、家庭和社会都造成了严重影响。银屑病发病机制尚不清晰，但角质形成细胞与免疫细胞特别是T细胞之间相互作用的免疫-炎症环路是其发病的关键。
因此，研发治疗银屑病的相关药物成为了本领域的技术难题之一。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种异阿魏酸在制备治疗银屑病的药物中的应用。
异阿魏酸(Isoferulic acid，IFA)是从毛茛科的升麻中提取的主要活性成分，具有抗炎、抗病毒、抗氧化和抗糖尿病作用。有研究表明，IFA可以通过抑制Akt/mTOR信号通路来抑制白血病细胞生长，IFA还通过维持HUVEC细胞中的一氧化氮稳态来调节内皮功能。然而，尚不清楚异阿魏酸是否对银屑病有治疗作用。本发明基于前期网络药理学和分子对接技术预测的IFA作用靶标，使用IL-17A刺激的HaCaT细胞作为细胞模型，以及IMQ诱导的银屑病样小鼠模型来验证异阿魏酸是否具有抗银屑病的作用，并探索其作用的分子机制。在发掘银屑病治疗潜在新药的同时，又能拓宽异阿魏酸的医疗用途及应用领域，具有重要的临床及科研意义。
具体而言，本申请提供了如下技术方案：
异阿魏酸作为唯一活性成分在制备治疗银屑病的药物中的应用。
其中，所述异阿魏酸可减少炎性细胞浸润、表皮细胞的过度增殖和异常分化以及皮损中CCL20 mRNA的表达。
进一步的，所述异阿魏酸可抑制IL-17诱导的HaCaT细胞增殖。
进一步的，所述异阿魏酸可抑制促炎因子IL-6、IL-8和趋化因子CCL20的产生和分泌。
进一步的，所述异阿魏酸可抑制STAT3信号通路磷酸化。
异阿魏酸作为唯一活性成分在制备治疗银屑病的药物时，所述异阿魏酸的用量为25～100mg/kg。
与现有技术相比，本发明的异阿魏酸在制备治疗银屑病的药物中的应用至少具有以下有益效果：
现有技术中，异阿魏酸临床多用于治疗糖尿病、糖尿病肾病、肾癌疾病，相关基础实验亦大多围绕抗炎、抗病毒、抗氧化等方面展开，尚无有关异阿魏酸治疗银屑病的临床及基础研究。
本发明经药理试验发现，IFA可明显改善小鼠银屑病样皮损，减少炎性细胞浸润、表皮细胞的过度增殖和异常分化。体外实验表明，异阿魏酸抑制IL-17诱导的HaCaT细胞增殖，抑制促炎因子IL-6、IL-8和趋化因子CCL20的表达与分泌，这些作用是通过影响STAT3的磷酸化来实现的。
本发明是应用异阿魏酸治疗银屑病的首次尝试，既能为银屑病治疗提供新的潜在药物，又可开拓异阿魏酸新的医疗用途及应用领域，具有重要的临床及科研价值。
下面结合附图对本发明的异阿魏酸在制备治疗银屑病的药物中的应用作进一步说明。
附图说明
图1为不同剂量IFA对IMQ诱导的银屑病样小鼠皮损的影响；
图2为各组小鼠PASI评分变化趋势；
图3为各组小鼠HE染色后显示的皮损病理学改变及表皮厚度测量；**P<0.01,vsIMQ group.##P<0.01,vs Ctrl group。
图4为各组小鼠皮损CD3+T表达情况及统计；**P<0.01,vs IMQ group.##P<0.01,vs Ctrl group。
图5为小鼠皮损Ki67、Involucrin免疫荧光染色及统计分析；**P<0.01,vs IMQgroup.##P<0.01,vs Ctrl group。
图6为IFA对HaCaT细胞活性的影响；**P<0.01,vs IL-17A group。
图7为IFA抑制IL-17A诱导的角质形成细胞增殖；*P<0.05,**P<0.01,vs IL-17Agroup.##P<0.01,vs Ctrl group。
图8为IFA抑制IL-17A诱导的STAT3磷酸化，但不抑制HaCaT中的JNK信号通路；*P<0.05,**P<0.01,vs Model group。
图9和图10为IFA抑制IL-17A诱导的角质形成细胞CCL20、IL-6和IL-8mRNA表达水平以及细胞上清中CCL20、IL-6和IL-8的分泌；*P<0.05,**P<0.01,vs IL-17Agroup.##P<0.01,vs Ctrl group。
图11为小鼠皮损CCL20免疫荧光染色及统计分析；**P<0.01,vs IMQ group.##P<0.01,vs Ctrl group。
图12为不同浓度的IFA和CTS对IL-17A诱导的HaCaT细胞的影响；*P<0.05,**P<0.01,vs IL-17Agroup.##P<0.01,vs Ctrl group。
图13为不同浓度的IFA以及CTS对IL-17A诱导的HaCaT细胞中STAT3及JNK通路磷酸化的影响；*P<0.05,**P<0.01,vs Model group。
图14为不同浓度的IFA以及CTS对IL-17A诱导的HaCaT细胞中p38及JAK2通路磷酸化的影响；*P<0.05,**P<0.01,vs Model group.##P<0.01,vs Ctrl group。
图15为不同浓度的IFA以及CTS对IL-17A诱导的HaCaT细胞中ERK1/2通路磷酸化的影响；*P<0.05,**P<0.01,vs Model group.##P<0.01,vs Ctrl group。
图16为不同浓度的IFA以及CTS对IL-17A诱导的HaCaT细胞中NF-κB及TYK2通路磷酸化的影响；*P<0.05,**P<0.01,vs Model group.##P<0.01,vs Ctrl group。
图17为STAT3与Isoferulic acid的浓度梯度结合曲线。
具体实施方式
1材料
1.1动物
36只BALB/c雄性小鼠，6～8周龄，体重20～22g，购于北京华阜康生物科技有限公司(合格证号：SCXK-Jing 2019-0008)，饲养在北京中医药研究所SPF级动物实验中心(SYXK-Jing2018-0006)，每只小鼠单笼饲养，温度保持在20-24℃，湿度保持在40％-70％，昼夜节律交替各12h，自由进食饮水。该实验已获得所在机构动物伦理委员批准。
1.2药物与试剂
异阿魏酸购自成都瑞芬思有限公司；5％咪喹莫特乳膏购自四川明欣药业有限责任公司；甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)购自上海上药信谊药厂有限公司；兔来源抗Ki-67、CD3、involucrin抗体购自英国abcam公司；柠檬酸盐抗原修复缓冲液、封闭用羊血清、通用二步法检测试剂盒(兔增强聚合物法检测系统)、DAB显色液、荧光封片剂(含DAPI)购自北京中杉金桥生物技术有限公司；驴抗兔488荧光二抗购自北京冠兴祥宇公司；CCK-8试剂盒购自日本Dojindo公司；人源IL-6、IL-8、CCL20ELISA试剂盒购自莱兹生物有限公司；Tyk2、phospho-Tyk2、Jak2、phospho-Tyk2、STAT3、phospho-STAT3、NF-κB、phospho-NF-KB、p38MAPK、phospho-p38MAPK、p44/42MAPK、phospho-p44/42MAPK、SAPK/JNK、phospho-SAPK/JNK抗体购自Cell Signaling Technology公司。
1.3实验仪器
组织脱水机、石蜡包埋机、全自动轮转式切片机、烤片机、HE全自动染色仪购自德国Leica，型号分别为ASP6025、EG1150HC、RM2255、HI1220、AUTOSTAINER XL；全自动切片扫描仪及Image Scope图像分析系统购自德国Leica，型号Asperio CS2；正置荧光显微镜及ZEN图像分析系统购自德国Zeiss，型号Axio Imager M2。
2方法
2.1实验分组、造模及给药
IFA(99.61％HPLC纯度)溶于0.5％羧甲基纤维素钠中。BALB/c小鼠腹腔注射阿佛丁(0.2mL/10g)进行麻醉后背部剃毛2×3cm大小，随机分为对照组(Ctrl组)、模型组(IMQ组)、阳性药物对照组(MTX组)和IFA高、中、低剂量组(IH、IM和IL组)，每组6只。Ctrl组背部备皮区域内每日涂抹凡士林62.5mg；余各组小鼠每日于背部备皮区域内涂抹等量5％咪喹莫特。造模同时灌胃给药，抹药前先进行灌胃，每日1次，每只0.2mL，连续5天。Ctrl组和IMQ组给予.5％羧甲基纤维素钠，MTX组给予MTX溶液(1mg/kg，0.5％羧甲基纤维素钠溶解)。IFA组(IH，IM和IL组)给予不同浓度的IFA溶液灌胃7天(100mg/kg/day，50mg/kg/day和25mg/kg/day)。每天记录皮损红斑、鳞屑和浸润的变化情况，并使用银屑病区域严重程度指数(PASI)对严重程度进行评分。
2.2标本采集
实验第6天进行取材，小鼠称重，阿佛丁麻醉后，眼眶静脉丛取血，3000r/min离心15min取血清备用。处死后快速取小鼠背部皮损组织、脾脏，并称取脾脏质量。
2.3观察指标及检测方法
2.3.1小鼠银屑病样皮损表现及疾病严重程度指数(PASI)评分
每日观察小鼠皮损动态变化并拍照记录，根据PASI评分标准，按0～4分对红斑、鳞屑、浸润3项进行评分。其中0分＝无，皮损表面无可见鳞屑和红斑，与正常皮肤平齐；1分＝轻微，皮损覆有散在细碎鳞屑，皮肤淡红色，皮损轻微高于正常皮肤；2分＝中度，大部分皮损覆有鳞屑，呈片状，有隆起或斑块，呈红色；3分＝重度，全部皮损覆有较厚鳞屑，皮损肥厚，有明显隆起和深红色斑块；4分＝极严重，皮肤全部为皮损表现。3项评分相加为总分，绘制PASI评分趋势图。
2.3.2小鼠皮损HE染色和免疫组化、免疫荧光染色及测量
背部皮损组织于10％甲醛溶液固定，经脱水、石蜡包埋后切片。对皮肤组织切片进行HE染色，并在电子显微镜下观察病理变化。使用Aperio ImageScope软件精确测量表皮厚度。免疫组化及免疫荧光染色根据制造商的说明书使用，使用抗体货号及稀释比例如下：抗CD3抗体(ab16669，1：100)、Ki67抗体(ab15580，1：400)，involucrin抗体(28462-1-AP，1：200)和CCL20抗体(26527-1-AP，1：400)。
2.4细胞培养
HaCaT细胞购自细胞资源中心，培养基为含10％ FBS和1％抗生素(100U/ml链霉素和100U/ml青霉素)的DMEM培养基，在37℃，5％ CO2的加湿培养箱中培养。细胞生长融合至90％时，用1ml PBS轻柔冲洗细胞3次后，加入0.25％胰酶消化8min，镜下观察到细胞大片脱落后立即加入6倍体积完全培养基中止消化，随后放入离心机，1000rpm 5min离心。弃除上清后加入1min完全培养基重新混悬细胞，计数后接种到培养板中，用于后续实验。
2.5CCK-8法评估细胞活力
IFA对细胞活力的影响由CCK-8试剂盒评估。根据说明书，将CCK-8试剂加入每个孔中并孵育1小时之后，使用酶标仪在450nm处测量吸光度。
2.6酶联免疫吸附法
取对数生长期的HaCaT细胞，以10000个/孔的数量接种于96孔板，分别加入IL-17A以及不同浓度的IFA，37℃培养24h后，使用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒测定细胞培养基上清中IL-6，IL-8和CCL20的水平。使用不同稀释度的纯化标准品测定标准曲线，并根据说明计算相应的细胞因子水平。
2.7实时荧光定量PCR
各组细胞施加不同干预措施培养8h后，使用超纯RNA提取试剂盒从样品中提取总RNA，并使用ND-2000测定RNA浓度和纯度。根据产品说明，使用HiScript III第一链cDNA合成试剂盒进行cDNA逆转录。实时荧光定量PCR扩增由ABI 7500实时荧光定量PCR系统进行。分别对各样品的靶基因和内参进行实时荧光定量PCR反应，采用2-△△CT法计算基因表达的相对定量。
引物如SEQ ID NO：1-8所示，见下表1，由中国北京的Invitrogen合成。
表1
2.8Western blot法检测小鼠皮损中通路蛋白表达水平
使用含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解细胞样品，并使用BCA试剂盒进行蛋白定量。蛋白质变性、制胶、电泳、电转、封闭等步骤同前。用抗体稀释液配置一抗，一抗详细信息及稀释比例如下：Tyk2(134kD，1：1000)；phospho-Tyk2(134kD，1：1000)；Jak2(125kD，1：1000)；phospho-Jak2(125kD，1：1000)；STAT3(79/86kD，1：1000)；phospho-STAT3(79/86kD，1：1000)；NF-KB(65kD，1：1000)；phospho-NF-KB(79/86kD，1：1000，)；p 38MAPK(38kD，1：1000)，phospho-p38MAPK(38kD，1：1000)，p44/42MAPK(44/42kD，1：1000)，phospho-p44/42MAPK(44/42kD，1：1000)，SAPK/JNK(46/54kD，1：1000)，phospho-SAPK/JNK(46/54kD，1：1000)，Tubulin(55kD，1：5000)，GAPDH(35kD，1：5000)。将PVDF膜与配置好的一抗在4℃条件下孵育过夜。第二天在膜与二抗孵育后，使用ECL化学发光试剂盒对其进行可视化分析。
2.9.STAT3与Isoferulic acid之间的的相互作用分析
基于OpenSPRTM生物分子相互作用分析仪检测测定配体蛋白STAT3与Isoferulicacid之间的的相互作用情况。此部分由上海达吉特药业科技有限公司完成。首先按照OpenSPRTM仪器标准操作程序安装COOH芯片，以PBS和异丙醇校准仪器，在信号达到基线后，缓冲液冲洗样本环，调整缓冲液流速到20μL/min。随后上样200μL稀释后的配体运行4min(20μL/min)，再上样200μL Blocking溶液(20μL/min，4min)，待基线稳定后，将分析物用缓冲液换成1％DMSO PBS(pH 7.4)倍比稀释，并以20μL/min上样，蛋白与配体结合时间均为240s；自然解离360s。使用Trace Drawer软件分析实验结果。
2.10统计学处理
采用SPSS24.0及GraphPad Prism 8.0对实验数据进行统计分析和绘图。并用均值±标准差(SD)表示。若符合正态分布，组间两两比较方差齐时采用LSD检验，方差不齐则采用Dunnett’sT3检验；两组以上的数据采用单因素方差分析(ANOVA)。若数据不符合正态分布，则采用采用Kruskal-Wallis单因素ANOVA分析。差异有统计学意义定义为P＜0.05，P＜0.01表示差异有显著统计学意义。
3结果
3.1IFA对IMQ诱导的小鼠银屑病样皮损的的影响
如图1所示，各组以预定的方式干预7天后，空白对照组小鼠背部皮肤粉红光滑，而模型组背部出现了类似银屑病样的皮损表现，包括红斑、脱屑和局部浸润增厚。高、中、低剂量IFA(IH、IM和IL组)以及MTX治疗均能不同程度的缓解这些症状，表现为皮肤更光滑，红斑更少，鳞屑稀疏。PASI评分显示出与这些变化相同的趋势(图2)。HE染色显示模型组出现明显的表皮明显增厚，并伴有角化不全、棘层肥厚以及真皮层大量淋巴细胞浸润等银屑病样皮损改变。相比之下，IFA能够改善这些病理特征(图3)，特别是在IH和IM组中，表皮厚度统计分析提示它们能够显著减少表皮增厚。这些结果表明，IFA可以改善IMQ诱导的小鼠的银屑病样皮损表现，高剂量和中剂量的IFA能够达到更好的改善效果。
3.2IFA对IMQ诱导皮损中的炎症浸润和角质形成细胞异常细胞增殖、分化的影响
T细胞过度活化导致的免疫异常是银屑病的重要发病机制之一，CD3是T淋巴细胞的表面标志。免疫组织化学染色显示，模型组CD3+T细胞数量显著增加，但在IFA处理组中，特别是在IH组中，CD3+T数量明显减少(图4)。
此外，角化过度和角化不全同样是银屑病的基本病理特征。Ki67是一种与细胞增殖相关的核抗原。如图5(左)所示，Ki67+细胞核(绿色荧光标记)仅在Ctrl组小鼠的皮肤基底层中少量表达，并呈单层线性排列。模型组中Ki67+细胞胞核明显增多，约有3-4层。与模型组相比，IH、IM、IL和MTX组阳性细胞数显著减少，三个治疗组中以IH组效果最好。Involucrin是角质形成细胞分化的早期标志，免疫荧光中Involucrin主要在细胞质中表达。如图5(右)所示，Involucrin主要表达于表皮中的棘层上层。在模型组中，Involucrin表达明显增强，分布于除基底细胞层和角质层外整个表皮。IH、IM和MTX处理后，Involucrin表达明显降低，分布趋向正常。以上结果表明，IFA能很好地改善银屑病的特征性T细胞浸润，特别是对角质形成细胞的异常增殖和分化具有极好的作用，其疗效呈剂量依赖。
3.3IFA对IL-17诱导的HaCaT细胞增殖作用的影响
用DMEM连续倍比稀得到的IFA溶液干预HaCaT细胞24小时，采用CCK-8法检测筛选IFA对细胞活性无影响浓度。如图6所示，低于1.28mM的IFA对细胞的活力没有影响。因此，选择1mM，500μM和250μM进行后续体外实验。选择IL-17A 100ng刺激HaCaT细胞模仿银屑病患者角质形成细胞的状态。如图7所示，IL-17A能够显著诱导HaCaT的增殖，而IFA能够以剂量依赖性方式抑制IL-17A诱导的HaCaT细胞增殖。
3.4IFA对HaCaT细胞模型中CCL20 mRNA表达以及细胞上清中CCL20分泌的影响
对IFA参与反应的银屑病中关键信号通路进行验证。如图8所示，Western Blot结果提示IFA对STAT3信号通路的磷酸化有显著的抑制作用。作为炎症和免疫反应的中枢调节因子，STAT3在角质形成细胞对炎症性T细胞因子的病理反应中起核心作用。角质形成细胞受到初始触发因素的刺激后能够产生多种趋化因子，其中CCL20是CCR6+Th17细胞和3组先天淋巴样细胞(ILC3)招募的关键趋化因子。此外，还有多种促炎基因(IL-1β、IL-6和IL-8等)参与放大IL-23/IL-17A轴并产生“前反馈”炎症回路。
因此，采用实时荧光定量PCR法检测了IFA对IL-6、IL-8和CCl20 mRNA表达的影响。同时，采用ELISA检测培养基中趋化因子CCL20以及炎症因子IL-6和IL-8的表达。结果表明，IFA处理能够剂量依赖性地抑制IL-6、IL-8和CCl20 mRNA的表达。同样，IFA也抑制IL-17A诱导HaCaT细胞中IL-6，IL-8和CCL20的分泌，如图9-10所示。
3.5IFA抑制银屑病小鼠模型中CCL20的表达
IL-17A诱导的CCL20其相关细胞因子的表达在银屑病的发病机制中起关键作用。为了进一步阐明IFA是否可以抑制体内CCL20的产生，检测了银屑病样小鼠模型中皮损处CCL20表达情况。图11免疫荧光染色结果提示，IMQ组中CCL20表达显著上调，IFA处理能够显著降低皮损中CCL20阳性细胞。这与先前的体外研究结果一致。
3.6IFA抑制IL-17诱导的角质形成细胞增殖以及与STAT3信号通路相关的炎症和趋化因子的产生
为了进一步阐明IFA对STAT3信号通路的调控作用，引入了一种常见的STAT3信号通路抑制剂隐丹参酮(CTS)。如图12所示，首先验证了CTS能够显著抑制IL-17A诱导的HaCaT细胞增殖，并与IFA联合使用时具有协同作用。
STAT3通过被受体相关JAK激酶(主要是JAK1、JAK2和TYK215)操纵的保守酪氨酸残基的磷酸化激活。因此，采用Western Blot法检测了JAK2/TYK2/STAT3信号通路，MAPK信号通路(ERK1/2，p38和JNK)和NF-KB信号通路的蛋白表达情况。结果如图13-16所示。可以看出，IFA 1mM对STAT3信号通路的磷酸化表现出良好的抑制作用，甚至优于CTS，并且对上游TYK2和JAK2信号通路也表现出部分抑制作用。此外，IFA还对ERK1/2信号通路和NF-KB信号通路的磷酸化有较好的抑制作用，对p38信号通路磷酸化有一定的抑制作用，但对抑制JNK通路磷酸化效果不佳。
3.7HSPR法检测STAT3与IFA之间的的相互作用情况
进一步采用HSPR法验证IFA是否能与STAT3蛋白直接结合。结果见图17以及表2。可以看到STAT3与IFA在蛋白与小分子的结合实验中有结合，亲和力为6.80e-4M。
表2动力学及亲和力参数
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (6)
1.异阿魏酸作为唯一活性成分在制备治疗银屑病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的异阿魏酸作为唯一活性成分在制备治疗银屑病的药物中的应用，其特征在于：所述异阿魏酸可减少炎性细胞浸润、表皮细胞的过度增殖和异常分化以及皮损中CCL20 mRNA的表达。
3.根据权利要求1所述的异阿魏酸作为唯一活性成分在制备治疗银屑病的药物中的应用，其特征在于：所述异阿魏酸可抑制IL-17诱导的HaCaT细胞增殖。
4.根据权利要求1所述的异阿魏酸作为唯一活性成分在制备治疗银屑病的药物中的应用，其特征在于：所述异阿魏酸可抑制促炎因子IL-6、IL-8和趋化因子CCL20的产生和分泌。
5.根据权利要求1所述的异阿魏酸作为唯一活性成分在制备治疗银屑病的药物中的应用，其特征在于：所述异阿魏酸可抑制STAT3信号通路磷酸化。
6.根据权利要求5所述的异阿魏酸作为唯一活性成分在制备治疗银屑病的药物中的应用，其特征在于：所述异阿魏酸的用量为25～100mg/kg。
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