CN117440796A - 水凝胶支架及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及水凝胶支架及其用途。在具体实施方案中，水凝胶支架包含甲基丙烯酰化明胶(GelMA)、藻酸盐和果胶以及一种或更多种细胞类型。在另一实施方案中，一种或更多种细胞类型包含干细胞和/或祖细胞。干细胞是脂肪来源干细胞(ADSC)或间充质干细胞。本发明还涉及制造水凝胶支架的方法以及用水凝胶支架进行成肌分化的方法。
Description
对相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年4月20日提交的第10202104006R号新加坡专利申请的优先权权益，据此，出于所有目的，通过引用并入该申请的全部内容。
技术领域
本发明大体上涉及生物技术领域。特别地，本发明涉及水凝胶支架及其用途。
背景技术
支架用于支持细胞生长或细胞分化或其组合。目前常见的是，利用支架扩大细胞生产规模，用于不同应用，包括生产人造食品，以实现可持续且更健康的食品来源。目前，大多数支架都包含合成聚合物等人工成分，它们对细胞封装和生长的生物相容性较低，因此在不同应用(例如基于细胞的研究、食品生产、医疗或化妆品应用)中的使用受到限制。此外，支架在生产过程中容易断裂，导致支架的生产效率低下。
此外，目前的支架需要使用昂贵且复杂的细胞培养基以使细胞生长，该培养基由生长因子或分化诱导因子等化学和生物成分组成。这些细胞培养方法非常昂贵，导致对任何基于细胞的应用的投资回报都很低。
鉴于上述问题，有必要提供在生产过程中不易断裂，并能支持细胞生长和/或分化的替选支架，特别是水凝胶支架。此外，还有必要提供制造支架的替选方法。
发明内容
一方面，提供了水凝胶支架，其包含：
-约3.0-10.0w/v％的甲基丙烯酰化明胶(GelMA)；
-约0.5-2.0w/v％的藻酸盐；
-约0.5-2.0w/v％的果胶；以及
-一种或更多种细胞类型。
另一方面，提供了成肌分化(myogenic differentation)的方法，其包括在细胞培养基中培养本文公开的水凝胶支架中的一种或更多种细胞类型，其中细胞培养基包含基础培养基和血清。
另一方面，提供了制造水凝胶支架的方法，该方法包括：
a)制备包含藻酸盐和果胶的溶液；
b)将步骤a)的溶液处理至约4-120℃的温度；
c)将甲基丙烯酰化明胶(GelMA)添加到步骤b)的经热处理的溶液中；
d)将一种或更多种细胞类型添加到步骤c)的溶液中；
e)设置约0.1-2.0ml/分钟(min)的注射速率；
f)对水凝胶支架进行湿法纺丝。
附图说明
结合非限制性实例和附图，参考具体实施方式，将会更好地理解本发明，在附图中：
图1示出了来自猪脂肪组织的pADSC的形态的照片。pADSC在75cm2的培养瓶上以6,000个细胞/cm2的接种密度接种(A)3天、(B)6天和(C)8天后贴壁并扩增。比例尺＝200μm。图1示出pADSC具有成纤维细胞样形态。
图2是示出了从猪脂肪组织收获的pADSC的生长动力学的图。图2显示，pADSC在后期传代(P6-P7)中的倍增时间较长。
图3是示出了聚合物溶液黏度的测量结果的柱状图。(A)分别在不同温度(20℃和37℃)测量的不同聚合物溶液(P1、P2和P3)的黏度。(B)在热处理(不处理；80℃2小时；120℃20分钟)前后，在37℃测量不同聚合物溶液(P1、P2和P3)的黏度。P1：1％藻酸盐A+1％果胶+3％GelMA；P2：1％藻酸盐B+1％果胶+3％GelMA；1％藻酸盐C+1％果胶+3％GelMA。图3显示，热处理降低了聚合物混合物的黏度。
图4是示出了在较短(6分钟)或较长(10分钟)的紫外(UV)光暴露持续时间下，经热处理的聚合物溶液的黏弹性测量结果的柱状图。所形成的水凝胶的储能模量(G’)和损耗模量(G”)是在PBS洗涤后在37℃测量的。Gel-P1H：P1聚合物溶液经80℃热处理2小时后形成的UV交联水凝胶；Gel-P2H：P2聚合物溶液经80℃热处理2小时后形成的UV交联水凝胶；Gel-P3H：P3聚合物溶液经80℃热处理2小时后形成的UV交联水凝胶。图4示出了较长的紫外(UV)光暴露时间增加了聚合物混合物的应力和损耗模量。
图5是湿法纺丝和UV交联的示例性实验装置的示意图。
图6示出了水凝胶支架中的pADSC和C2C12在不同时间点(第1天、第3天、第5天和第9天)的相差图像。图6显示细胞能够在水凝胶支架中扩散和增殖。
图7示出了扫描电子显微(SEM)图像Gel-P1H和Gel-P3H，它们分别是由P1和P3聚合物溶液制成的UV交联水凝胶支架。上图中的图像：湿法纺丝后用去离子水(DI)洗涤支架；下图中的图像：湿法纺丝后用PBS洗涤支架。图7示出了由不同聚合物溶液制成的不同水凝胶支架的差异。
图8示出了培养9天后水凝胶支架的荧光显微图像。Gel-P1H和Gel-P3H分别是由经热处理的P1和P3聚合物制成的UV交联水凝胶支架。强钙黄绿素-AM阳性信号表明，水凝胶支架内的大部分细胞是活的，而溴乙啡锭二聚体1(EthD-1)阴性信号意味着水凝胶支架中存在可忽略不计的死细胞。图8显示细胞在水凝胶支架中仍然存活。
图9示出了在水凝胶支架中培养的pADSC和C2C12在培养9天后的SEM图像。Gel-P1H和Gel-P3H：分别由经热处理的P1和P3聚合物溶液制成的水凝胶支架。图9示出了细胞在由不同聚合物溶液制成的不同水凝胶支架上封装和培养时的形态差异。
图10示出了在水凝胶支架中封装的细胞(C2C12和pADSC)在培养9天后的F-肌动蛋白染色的荧光显微图像。图10显示，在水凝胶支架上封装和培养的细胞形成了管状结构。
图11示出了在水凝胶支架中封装的细胞(C2C12和pADSC)在培养9天后的抗肌球蛋白染色的荧光显微图像。比例尺＝100μm。图11显示，在水凝胶支架上封装和培养的细胞表达骨骼肌标志物。
图12示出了在水凝胶支架中封装的pADSC在培养9天后的抗YAP染色的荧光显微图像。图12显示，在水凝胶支架上封装和培养的细胞发生成肌分化时，YAP在细胞质中表达。
图13示出了在经热处理的聚合物(左)和未经热处理的聚合物(右)中封装并用钙黄绿素AM染色的C2C12细胞在第3天(上)和第9天(下)的荧光显微图像。图13显示，在经热处理的水凝胶支架上封装和培养的细胞发生了扩散。比例尺＝200μm。
图14示出了在经热处理的聚合物中封装并在生长培养基中培养9天的C2C12(上)和pADSC(下)的钙黄绿素AM染色图像。比例尺＝100μm。图14显示，在经热处理的水凝胶支架上封装和培养的细胞在培养9天后存活。
图15示出了用经不同纺丝前处理的聚合物溶液进行湿法纺丝得到的水凝胶支架的图像，以示出14天内的溶胀差异。左栏：聚合物在80℃处理1小时，然后4℃孵育过夜。右栏：聚合物在80℃处理1小时。图15显示，当聚合物在4℃孵育过夜时，水凝胶支架的溶胀较小。比例尺＝100μm。
图16示出了经历脂肪生成、软骨形成和骨生成的pADSC的图像。左上：白色虚线圈出的区域代表油红O溶液染色的细胞，其代表经历了脂肪生成的细胞。右上：白色虚线圈出的区域代表甲苯胺蓝O溶液染色的细胞，其代表经历了软骨形成的细胞。底部：虚线圈出的区域代表茜素红S溶液染色的细胞，其代表经历了骨成生的细胞。图16显示pADSC具有多能性，其能够分化为成脂肪谱系、成软骨谱系和成骨谱系。比例尺＝100μm。
具体实施方式
水凝胶支架通常用于为细胞黏附和生长提供结构支持。近年来，还开发了不同的用于干细胞研究的水凝胶支架，以使干细胞保持干性或促进干细胞分化成不同的谱系。这使得水凝胶支架在不同技术领域有了广泛的应用，例如食品生产、基于细胞的研究、医疗应用或化妆品应用。
在全球范围内，开发了不同技术以使用水凝胶支架来持续扩大细胞生产规模，例如通过创造出能够有助于调节例如细胞行为、细胞生长、干细胞分化的水凝胶支架。一种这样的方法包括，使用支架以使不同的细胞在复杂细胞培养基中生长，但这会导致成本增加，因为其包括昂贵的化学成分和生物成分(例如生长因子或分化诱导因子)的使用，这限制了如人造食品或医疗产品等终产品的商业化。此外，目前的支架使用方法还包括化学处理和生物处理的密集使用，这可能带来食品或医疗安全问题。
近年来，已经开发出了使用植物来源成分的支架，但这些植物来源的支架在生产过程中易于断裂。此外，封装在这些植物来源的支架中的细胞生长状况不佳，这使得难以扩大由这些细胞生长和生产人造食品的规模。
鉴于上述问题，本发明人已经开发了能够在简单的细胞培养基中支持细胞生长并允许细胞分化的水凝胶支架。该水凝胶支架在生产过程中也不易断裂。
在一个实例中，本公开的水凝胶支架包含：
-约3.0-10.0w/v％的甲基丙烯酰化明胶(GelMA)；
-约0.5-2.0w/v％的藻酸盐；
-约0.5-2.0w/v％的果胶；以及
-一种或更多种细胞类型。
具有上述组成的水凝胶支架在生产过程中显示出增强的抗断裂性，从而提高了此类支架的生产效率，减少了起始材料的浪费。抗断裂性的增强还可用于不同的下游应用，例如食品生产、基于细胞的研究、医疗应用或化妆品应用。
本文所用的术语“水凝胶”是指能够保留大量水分的交联聚合网络。用于形成水凝胶的聚合物可以是天然的、合成的或其组合。随后使水凝胶经历制造方法，例如但不限于湿法纺丝、干法纺丝、3D打印、溶液浇注、冷冻干燥等，以形成水凝胶支架。
本文所用术语“水凝胶支架”是指已经经历了制造方法(例如但不限于湿法纺丝、干法纺丝或3D打印)的水凝胶。水凝胶支架包括明确定义的三维(3D)分层结构，例如但不限于纤维状结构或片状结构。水凝胶支架的直径为约250-600μm。在一个实例中，水凝胶支架的直径为但不限于约250-450μm、约400-600μm、约250-350μm、约300-400μm、约350-450μm、约400-500μm、约450-550μm、约500-600μm，或约250μm、约300μm、约350μm、约400μm、约450μm、约500μm、约550μm或约600μm。
水凝胶支架的硬挺度(stiffness)和强度取决于所用成分的类型和浓度。本文公开的水凝胶支架的一种成分是甲基丙烯酰化明胶(GelMA)。GelMA是通过明胶与甲基丙烯酸酐的反应生成的，其中明胶中的多个氨基被甲基丙烯酰基取代。由于甲基丙烯酰基的存在，添加光引发剂后，GelMA溶液可以在UV下发生共价交联。由于GelMA是由天然聚合物明胶改性而成，它保留了明胶含有的促进细胞黏附的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)三氨基酸序列以及基质金属蛋白酶(MMP)序列。GelMA具有多孔的微结构，这种微结构为封装细胞的生长提供了最佳环境，因为它允许在培养基和封装的细胞之间进行养分氧的扩散和废物交换。GelMA还是可生物降解的。GelMA与明胶类似，因为其固液转变受温度调节。此外，可以灵活调整GelMA水凝胶的物理和化学特性，以满足各种应用的要求，因此，其可用作水凝胶支架的材料。在一个实例中，水凝胶支架包含约3.0-10.0w/v％的GelMA。在另一个实例中，水凝胶支架包含但不限于约3.0-6.0w/v％的GelMA、约5.0-8.0w/v％的GelMA、约7.0-10.0w/v％的GelMA或约3.0w/v％的GelMA、约4.0w/v％的GelMA、约5.0w/v％的GelMA、约6.0w/v％的GelMA、约7.0w/v％的GelMA、约8.0w/v％的GelMA、约9.0w/v％的GelMA或约10.0w/v％的GelMA。在优选的实例中，水凝胶支架包含约3.0w/v％的GelMA。
除了甲基丙烯酰化明胶(GelMA)之外，水凝胶支架还包含藻酸盐。藻酸盐是天然存在的阴离子聚合物，通常从海洋植物中获得，由于藻酸盐的生物相容性、低毒性、相对较低的成本以及通过添加二价阳离子(例如Ca2+)快速凝胶化，已对其进行研究并将其用于许多生物医学应用。在一个实例中，水凝胶支架包含约0.5-2.0w/v％的藻酸盐。在另一个实例中，水凝胶支架包含但不限于约0.5-1.5w/v％的藻酸盐、约1.0-2.0w/v％的藻酸盐、或约0.5w/v％的藻酸盐、约0.6w/v％的藻酸盐、约0.7w/v％的藻酸盐、约0.8w/v％的藻酸盐、约0.9w/v％的藻酸盐、约1.0w/v％的藻酸盐、约1.1w/v％的藻酸盐、约1.2w/v％的藻酸盐、约1.3w/v％的藻酸盐、约1.4w/v％的藻酸盐、约1.5w/v％的藻酸盐、约1.6w/v％的藻酸盐、约1.7w/v％的藻酸盐、约1.8w/v％的藻酸盐、约1.9w/v％的藻酸盐或约2.0w/v％的藻酸盐。在优选的实例中，水凝胶支架包含约1.0w/v％的藻酸盐。
水凝胶支架还进一步包含果胶。果胶是植物细胞壁的天然成分，具有高分子量和亲水性，使其成为水凝胶形成和随后的3D生物打印的理想候选材料。在这项工作中，选择藻酸盐来暂时保持在Ca2+溶液中纺成的水凝胶支架的(rigidity)。果胶因其特性而被认为是多种食品的天然胶凝剂和增稠剂。在一个实例中，水凝胶支架包含约0.5-2.0w/v％的果胶。在另一个实例中，水凝胶支架包含但不限于约0.5-1.5w/v％的果胶、约1.0-2.0w/v％的果胶，或约0.5w/v％的果胶、约0.6w/v％的果胶、约0.7w/v％的果胶、约0.8w/v％的果胶、约0.9w/v％的果胶、约1.0w/v％的果胶、约1.1w/v％的果胶、约1.2w/v％的果胶、约1.3w/v％的果胶、约1.4w/v％的果胶、约1.5w/v％的果胶、约1.6w/v％的果胶、约1.7w/v％的果胶、约1.8w/v％的果胶、约1.9w/v％的果胶或约2.0w/v％的果胶。在优选的实例中，水凝胶支架包含约1.0w/v％的果胶。
还可以通过调整GelMA的不同参数，例如GelMA的甲基丙烯酰基的取代度(DS)，来改变本文公开的水凝胶支架。本文所用术语“取代度”、“甲基丙烯酰基的取代度”或“DS”是指每个碱基单元所连接的取代基的数量，在这种情况中，是指能够与光引发剂交联剂(碱基单元)例如Irgacure2959或苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)次膦酸锂(LAP)交联的可用的可交联甲基丙烯酰基(取代基)的数量。甲基丙烯酰取代度越高，表明可用于与光引发剂交联剂交联的可交联甲基丙烯酰基越多。这使得UV辐照后交联密度更高，从而使水凝胶支架更硬、更强，从而在生产过程中提供抗断裂性。
在一个实例中，水凝胶支架的GelMA的甲基丙烯酰基取代度(DS)为约25-99％。在另一个实例中，水凝胶支架的GelMA的甲基丙烯酰基取代度(DS)可以为但不限于约25％-50％、约45％-70％、约65％-99％，或约25％-35％、约35％-45％、约45％-55％、约55％-65％、约65％-75％、约75％-85％、约85％-95％、约90％-99％。在另一个实例中，水凝胶支架的GelMA的甲基丙烯酰基取代度(DS)可以为但不限于约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％。在优选的实例中，水凝胶支架的GelMA的甲基丙烯酰基取代度(DS)为约50％。
GelMA的甲基丙烯酰取代度(DS)越高，导致水凝胶支架越硬。例如，DS为约90％的GelMA比DS为约40％的GelMA硬。硬挺度可以通过储能模量来测量。本文所用术语“储能模量”是指为使材料变形而需投入材料中的能量的量的度量。储能模量提供了固体材料硬挺度的指示。储能模量越高，表明材料越硬。在一个实例中，水凝胶支架的储能模量为约1-7kPa(千帕)。在另一个实例中，水凝胶支架的储能模量可以为但不限于约1-1.5kPa、约1.5-2kPa、约2-2.5kPa、约2.5-3kPa、约3-3.5kPa、约3.5-4kPa、约4-4.5kPa、约5-5.5kPa、约5.5-6kPa、约6-6.5kPa、约6.5-7kPa，或约1kPa、约1.5kPa、约2kPa、约2.5kPa、约3kPa、约3.5kPa、约4kPa、约4.5kPa、约5kPa、约5.5kPa、约6kPa、约6.5kPa或约7kPa。在优选的实例中，水凝胶支架的储能模量为约6kPa。
硬挺度可以通过损耗模量来测量。本文所用术语“损耗模量”是指使材料变形时能量耗散的量的度量。损耗模量也可以提供固体材料硬挺度的指示。损耗模量越低，表明材料越硬。在一个实例中，水凝胶支架的储能模量为约50-650Pa。在另一个实例中，水凝胶支架的损耗模量可以为但不限于约50-100Pa、约100-150Pa、约150-250Pa、约250-300Pa、约300-350Pa、约350-400Pa、约400-450Pa、约500-550Pa、约550-600Pa、约600-650Pa，或约50Pa、约100Pa、约150Pa、约200Pa、约250Pa、约300Pa、约350Pa、约400Pa、约450Pa、约500Pa、约550Pa、约600Pa或约650Pa。在优选的实例中，水凝胶支架的储能模量为约600Pa。
可以理解的是，本文公开的水凝胶支架可通过组合本文公开的不同参数进行调整。这种可调整的特性允许水凝胶支架在生成过程中承受住断裂，并满足使用水凝胶支架的应用的要求。此外，还可以调整水凝胶支架，以创造出适合于要在水凝胶支架中封装的细胞类型的环境。
水凝胶支架可以包含一种或更多种细胞类型。在一个实例中，一种或更多种细胞类型包含干细胞和/或祖细胞。
本文所用术语“干细胞”是指能够分化成多种类型的细胞且能够无限增殖以产生更多相同干细胞的未分化或部分分化的细胞。在一个实例中，水凝胶支架的干细胞密度为但不限于约5x105个细胞/ml至5x106个细胞/ml、约5x105个细胞/ml至9x105个细胞/ml、约8x105个细胞/ml至2x106个细胞/ml、约1x106个细胞/ml至5x106个细胞/ml，或约5.0x105个细胞/ml、约5.5x105个细胞/ml、约6.0x105个细胞/ml、约6.5x105个细胞/ml、约7.0x105个细胞/ml、约7.5x105个细胞/ml、约8.0x105个细胞/ml、约8.5x105个细胞/ml、约9.0x105个细胞/ml、约9.5x105个细胞/ml、约1.0x106个细胞/ml、约1.5x106个细胞/ml、约2.0x106个细胞/ml、约2.5x106个细胞/ml、约3.0x106个细胞/ml、约3.5x106个细胞/ml、约4.0x106个细胞/ml、约4.5x106个细胞/ml、约5.0x106个细胞/ml。在另一个实例中，水凝胶支架包含5x105个细胞/ml至2x106个细胞/ml的干细胞。在另一个实例中，水凝胶支架包含1x106个细胞/ml的干细胞。
在一个实例中，干细胞是脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cell,ADSC)或间充质干细胞。在一个实例中，水凝胶支架的脂肪来源干细胞(ADSC)或间充质干细胞密度为但不限于约5x105个细胞/ml至5x106个细胞/ml、约5x105个细胞/ml至9x105个细胞/ml、约8x105个细胞/ml至2x106个细胞/ml、约1x106个细胞/ml至5x106个细胞/ml，或约5.0x105个细胞/ml、约5.5x105个细胞/ml、约6.0x105个细胞/ml、约6.5x105个细胞/ml、约7.0x105个细胞/ml、约7.5x105个细胞/ml、约8.0x105个细胞/ml、约8.5x105个细胞/ml、约9.0x105个细胞/ml、约9.5x105个细胞/ml、约1.0x106个细胞/ml、约1.5x106个细胞/ml、约2.0x106个细胞/ml、约2.5x106个细胞/ml、约3.0x106个细胞/ml、约3.5x106个细胞/ml、约4.0x106个细胞/ml、约4.5x106个细胞/ml、约5.0x106个细胞/ml。在另一个实例中，水凝胶支架包含5x105个细胞/ml至2x106个细胞/ml的脂肪来源干细胞(ADSC)或间充质干细胞。在另一个实例中，水凝胶支架包含1x106个细胞/ml的脂肪来源干细胞(ADSC)或间充质干细胞。
本文所用术语“祖细胞”是指可分化成特定类型细胞的细胞。祖细胞比干细胞更特化(specific)，因为它们处于比干细胞更进一步的分化阶段。在一个实例中，水凝胶支架的祖细胞密度为但不限于约5x105个细胞/ml至5x106个细胞/ml、约5x105个细胞/ml至9x105个细胞/ml、约8x105个细胞/ml至2x106个细胞/ml、约1x106个细胞/ml至5x106个细胞/ml、或约5.0x105个细胞/ml、约5.5x105个细胞/ml、约6.0x105个细胞/ml、约6.5x105个细胞/ml、约7.0x105个细胞/ml、约7.5x105个细胞/ml、约8.0x105个细胞/ml、约8.5x105个细胞/ml、约9.0x105个细胞/ml、约9.5x105个细胞/ml、约1.0x106个细胞/ml、约1.5x106个细胞/ml、约2.0x106个细胞/ml、约2.5x106个细胞/ml、约3.0x106个细胞/ml、约3.5x106个细胞/ml、约4.0x106个细胞/ml、约4.5x106个细胞/ml、约5.0x106个细胞/ml。在另一个实例中，水凝胶支架包含5x105个细胞/ml至2x106个细胞/ml的祖细胞。在另一个实例中，水凝胶支架包含1x106个细胞/ml的祖细胞。
在一个实例中，祖细胞是成肌细胞或肌卫星细胞。本文所用术语“肌卫星细胞”是指一种肌肉祖细胞。肌卫星细胞在未被激活时通常是静止的，不会经历细胞增殖或细胞分化。当肌卫星细胞被外部因子(例如机械刺激)激活时，肌卫星细胞被激活并经历细胞增殖和/或细胞分化。肌卫星细胞可以根据其在基底膜与肌纤维肌膜之间的解剖学位置来鉴别。肌卫星细胞还可以根据标志物的表达来鉴别，标志物例如但不限于神经细胞黏附分子(NCAM)、CD56、Pax 3或Pax 7。在一个实例中，水凝胶支架的肌卫星细胞密度为但不限于约5x105个细胞/ml至5x106个细胞/ml、约5x105个细胞/ml至9x105个细胞/ml、约8x105个细胞/ml至2x106个细胞/ml、约1x106个细胞/ml至5x106个细胞/ml，或约5.0x105个细胞/ml、约5.5x105个细胞/ml、约6.0x105个细胞/ml、约6.5x105个细胞/ml、约7.0x105个细胞/ml、约7.5x105个细胞/ml、约8.0x105个细胞/ml、约8.5x105个细胞/ml、约9.0x105个细胞/ml、约9.5x105个细胞/ml、约1.0x106个细胞/ml、约1.5x106个细胞/ml、约2.0x106个细胞/ml、约2.5x106个细胞/ml、约3.0x106个细胞/ml、约3.5x106个细胞/ml、约4.0x106个细胞/ml、约4.5x106个细胞/ml、约5.0x106个细胞/ml。在另一个实例中，水凝胶支架包含5x105个细胞/ml至2x106个细胞/ml的肌卫星细胞。在另一个实例中，水凝胶支架包含1x106个细胞/ml的肌卫星细胞。
本文所用术语“成肌细胞”是指为肌卫星细胞的后代的细胞。成肌细胞也是一种肌肉祖细胞，但比肌卫星细胞处于更进一步的分化阶段。成肌细胞可以增殖并进一步分化成肌纤维。成肌细胞可以根据标志物的表达来鉴别，标志物例如但不限于Pax7、MyoD或myf-5。在一个实例中，水凝胶支架的成肌细胞密度为但不限于约5x105个细胞/ml至5x106个细胞/ml、约5x105个细胞/ml至9x105个细胞/ml、约8x105个细胞/ml至2x106个细胞/ml、约1x106个细胞/ml至5x106个细胞/ml，或约5.0x105个细胞/ml、约5.5x105个细胞/ml、约6.0x105个细胞/ml、约6.5x105个细胞/ml、约7.0x105个细胞/ml、约7.5x105个细胞/ml、约8.0x105个细胞/ml、约8.5x105个细胞/ml、约9.0x105个细胞/ml、约9.5x105个细胞/ml、约1.0x106个细胞/ml、约1.5x106个细胞/ml、约2.0x106个细胞/ml、约2.5x106个细胞/ml、约3.0x106个细胞/ml、约3.5x106个细胞/ml、约4.0x106个细胞/ml、约4.5x106个细胞/ml、约5.0x106个细胞/ml。在另一个实例中，水凝胶支架包含5x105个细胞/ml至2x106个细胞/ml的成肌细胞。在另一个实例中，水凝胶支架包含1x106个细胞/ml的成肌细胞。
本申请的水凝胶支架提供了更高的抗断裂性，这可由图4所示的损耗模量或储能模量明显看出。水凝胶支架可以具有下述示例性组合。在一个实例中，水凝胶支架包含：约3.0w/v％的甲基丙烯酰化明胶(GelMA)；约1.0w/v％的藻酸盐；约1.0w/v％的果胶；以及一种或更多种细胞类型。在另一个实例中，水凝胶支架包含：约3.0w/v％的甲基丙烯酰化明胶(GelMA)；约1.0w/v％的藻酸盐；约1.0w/v％的果胶；以及一种或更多种细胞类型，其中甲基丙烯酰化明胶(GelMA)的甲基丙烯酰基取代度(DS)为约50％。在另一个实例中，水凝胶支架包含：约3.0w/v％的甲基丙烯酰化明胶(GelMA)；约1.0w/v％的藻酸盐；约1.0w/v％的果胶；一种或更多种细胞类型；以及约6kPa的储能模量。在另一个实例中，水凝胶支架包含：约3.0w/v％的甲基丙烯酰化明胶(GelMA)；约1.0w/v％的藻酸盐；约1.0w/v％的果胶；一种或更多种细胞类型；以及约600Pa的损耗模量。
在另一个实例中，水凝胶支架包含：约3.0w/v％的甲基丙烯酰化明胶(GelMA)；约1.0w/v％的藻酸盐；约1.0w/v％的果胶；以及脂肪来源干细胞(ADSC)。在另一个实例中，水凝胶支架包含：约3.0w/v％甲基丙烯酰化明胶(GelMA)；约1.0w/v％藻酸盐；约1.0w/v％的果胶；以及脂肪来源干细胞(ADSC)，其中甲基丙烯酰化明胶(GelMA)的甲基丙烯酰基取代度(DS)为约50％。在另一个实例中，水凝胶支架包含：约3.0w/v％的甲基丙烯酰化明胶(GelMA)；约1.0w/v％的藻酸盐；约1.0w/v％的果胶；脂肪来源干细胞(ADSC)；以及约6kPa的储能模量。在另一个实例中，水凝胶支架包含：约3.0w/v％甲基丙烯酰化明胶(GelMA)；约1.0w/v％的藻酸盐；约1.0w/v％的果胶；脂肪来源干细胞(ADSC)；以及约600Pa的损耗模量。
通过微调不同的水凝胶配制物，本文公开的水凝胶支架具有用于不同应用的可调特性。通过定制本文所述的水凝胶支架配制物，可根据应用需要实现不同的机械强度。可以在细胞培养基中培养本申请的水凝胶支架。在一个实例中，细胞培养基可以包含一种或更多种生长因子。在另一个实例中，细胞培养基可以不含任何生长因子。本文所用术语“生长因子”是指刺激多种细胞过程的蛋白质，包括但不限于细胞增殖、分化、迁移或存活。生长因子的实例包括成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、转化生长因子(transforming growth factor,TGF)、胰岛素生长因子(insulin growth factor,IGF)。生长因子还可分为更具体的亚类，用于更具体的用途。例如，分化诱导因子(differentiation-inducing factor,DIF)就是这样一个具体的亚类，是指一类抑制细胞生长并促进细胞分化的效应分子。分化诱导因子的一些实例可能与生长因子重叠。分化诱导因子的实例包括成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子(TGF)、胰岛素生长因子(IGF)。在一个实例中，本文请求保护的方法不需要DIF。因此，在一个实例中，该方法和组合物不包含DIF。在一个实例中，该方法和组合物不包含本文例举和上文列出的一种或更多种或所有DIF。
本文公开的水凝胶支架的一个应用实例是，允许一种或更多种细胞增殖和/或分化成特定谱系，特别是促进成肌分化。目前促进成肌分化的方法包括使用昂贵的分化培养基，这增加了成本。例如，先前的研究表明，脂肪来源干细胞(ADSC)的成肌分化需要非常特殊的培养基，该培养基包括不同或分化诱导因子的组合。此外，使用现有方法进行成肌分化的效率可能较低。
鉴于上述问题，本发明人还开发了利用本文公开的水凝胶支架进行成肌分化的方法，其中不需要其中需要不同分化诱导因子和补充剂的复杂细胞培养基。在一个实例中，本公开提供了成肌分化的方法，包括在细胞培养基中培养本文公开的水凝胶支架中的一种或更多种细胞类型，其中细胞培养基包含基础培养基和血清。在一个实例中，本公开提供了成肌分化的方法，包括在细胞培养基中培养本文公开的水凝胶支架中的一种或更多种细胞类型，其中细胞培养基包含基础培养基和血清，其中细胞培养基不包含分化诱导因子。本文所用术语“基础培养基”是指细胞存活和生长所必需的配制物。基础培养基在本领域中是已知的，是包含氨基酸、葡萄糖和离子(例如但不限于钙、镁、钾、钠和磷酸盐)的培养基。已知基础培养基不含生长因子和/或分化诱导因子。基础培养基可以包括但不限于Dulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium,DMEM)、高级Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)/Ham’s F12、DMEM/Ham’s F12、极限必需培养基(Minimal Essential Medium，MEM)、敲除-DMEM(Knockout-DMEM，KO-DMEM)、Glasgow极限必需培养基(Glasgow MinimalEssential Medium,G-MEM)、基础Eagle培养基(Basal Medium Eagle,BME)、Iscove改良Dulbecco培养基和极限必需培养基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium andMinimal Essential Medium(MEM))、Ham’s F-10、Ham’s F-12、培养基199(Medium 199)以及RPMI 1640培养基(RPMI 1640Medium)。在另一个实例中，本公开提供了成肌分化的方法，包括在存在血清的情况下，培养本文公开的水凝胶支架中的一种或更多种细胞类型。在一个实例中，血清是胎牛血清(FBS)或马血清。在优选的实例中，细胞培养基包含Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)和胎牛血清(FBS)。
在另一个实例中，细胞培养基还可以包含类固醇或激素。在一个实例中，类固醇是地塞米松或氢化可的松。在一个实例中，激素是胰岛素。
通过在水凝胶支架的生产过程中将细胞封装在水凝胶中，从而为细胞提供物理触发机制(cue)，使得可以使用本文公开的细胞培养基，例如简单的基础培养基和血清。在不拘泥于理论的情况下，物理触发机制包括但不限于张力。在水凝胶支架的生产过程中封装在水凝胶中的细胞会经历拉伸，导致细胞经受张力。这种张力会产生无需使用包含不同分化诱导因子的分化培养基就能驱动细胞分化的3D机械力转导。因此，本文公开的水凝胶支架中的细胞能够通过培养水凝胶支架而经历成肌分化，其中细胞培养基包含基础培养基和血清。这种方法能够容易地扩大规模，并因此提高人造食品的生产。
为了能够生产水凝胶支架，制造水凝胶支架的方法具有高可调性、高可扩展性和高封装效率。制造水凝胶支架的示例性方法包括湿法纺丝。本文公开的制造水凝胶支架的方法包括例如：
a)制备包含藻酸盐和果胶的溶液；
b)将步骤a)的溶液处理至约4-120℃的温度；
c)将甲基丙烯酰化明胶(GelMA)添加到步骤b)的经热处理的溶液中；
d)将一种或更多种细胞类型添加到步骤c)的溶液中；
e)设置约0.1-2.0ml/分钟的注射速率；以及
f)对水凝胶支架进行湿法纺丝。
首先通过制备包含藻酸盐和果胶的溶液制造水凝胶支架。在一个实例中，步骤a)中的溶液包含约0.5-2.0w/v％的藻酸盐。在另一个实例中，步骤a)中的溶液包含但不限于约0.5-1.5w/v％的藻酸盐、约1.0-2.0w/v％的藻酸盐，或约0.5w/v％的藻酸盐、约0.6w/v％的藻酸盐、约0.7w/v％的藻酸盐、约0.8w/v％的藻酸盐、约0.9w/v％的藻酸盐、约1.0w/v％的藻酸盐、约1.1w/v％的藻酸盐、约1.2w/v％的藻酸盐、约1.3w/v％的藻酸盐、约1.4w/v％的藻酸盐、约1.5w/v％的藻酸盐、约1.6w/v％的藻酸盐、约1.7w/v％的藻酸盐、约1.8w/v％的藻酸盐、约1.9w/v％的藻酸盐或约2.0w/v％的藻酸盐。在优选的实例中，步骤a)中的溶液包含约1.0w/v％的藻酸盐。
在一个实例中，步骤a)中的溶液包含约0.5-2.0w/v％的果胶。在另一个实例中，步骤a)中的溶液包含但不限于约0.5-1.5w/v％的果胶、约1.0-2.0w/v％的果胶，或约0.5w/v％的果胶、约0.6w/v％的果胶、约0.7w/v％的果胶、约0.8w/v％的果胶、约0.9w/v％的果胶、约1.0w/v％的果胶、约1.1w/v％的果胶、约1.2w/v％的果胶、约1.3w/v％的果胶、约1.4w/v％的果胶、约1.5w/v％的果胶、约1.6w/v％的果胶、约1.7w/v％的果胶、约1.8w/v％的果胶、约1.9w/v％的果胶或约2.0w/v％的果胶。在优选的实例中，步骤a)中的溶液包含约1.0w/v％的果胶。
在步骤a)中制备溶液后，在设置温度下对溶液进行处理。在一个实例中，步骤b)中的温度为约4-120℃或约4-20℃、约20-40℃、约40-60℃、约60-80℃、约80-100℃、约100-120℃，或约4℃、约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃、约80℃、约85℃、约90℃、约95℃、约100℃、约105℃、约110℃、约115℃或约120℃。在优选的实例中，步骤b)中的温度为约80℃。
然后将步骤a)的溶液在设置温度下处理一段时间。在一个实例中，可以将步骤a)的溶液处理约20-200分钟或约20-60分钟、约50-90分钟、约80-120分钟、约110-150分钟、约140-180分钟、约170-200分钟，或约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约60分钟、约70分钟、约80分钟、约90分钟、约100分钟、约110分钟或约120分钟。在优选的实例中，将步骤a)的溶液在步骤b)中在约80℃的温度下处理约60分钟。
接着，将甲基丙烯酰化明胶(GelMA)添加到步骤b)的经热处理的溶液中。在一个实例中，步骤c)中的溶液包含约3.0-10.0w/v％的甲基丙烯酰化明胶(GelMA)。在另一个实例中，步骤c)中的溶液包含但不限于约3.0-6.0w/v％的GelMA、约5.0-8.0w/v％的GelMA、约7.0-10.0w/v％的GelMA，或约3.0w/v％的GelMA、约4.0w/v％的GelMA、约5.0w/v％的GelMA、约6.0w/v％的GelMA、约7.0w/v％的GelMA、约8.0w/v％的GelMA、约9.0w/v％的GelMA或约10.0w/v％的GelMA。在优选的实例中，步骤c)中的溶液包含约3.0w/v％的GelMA。
在一个实例中，步骤c)中溶液的GelMA的甲基丙烯酰基取代度(DS)为约25-99％。在另一个实例中，步骤c)中溶液的GelMA的甲基丙烯酰基取代度(DS)可以为但不限于约25％-50％、约45％-70％、约65％-99％，或约25％-35％、约35％-45％、约45％-55％、约55％-65％、约65％-75％、约75％-85％、约85％-95％、约90％-99％。在另一个实例中，步骤c)中溶液的GelMA的甲基丙烯酰基取代度(DS)可以为但不限于约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％。在优选的实例中，步骤c)中溶液的GelMA的甲基丙烯酰基取代度(DS)为约50％。
步骤c)的溶液在经历步骤d)之前可以经历进一步的处理。在一个实例中，在以下温度下，进一步孵育步骤c)的溶液：约4-30℃或约4-10℃、约10-20℃、约20-30℃，或约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃、约10℃、约11℃、约12℃、约13℃、约14℃、约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃。在优选的实例中，在约4℃的温度进一步孵育步骤c)的溶液。
将步骤c)的溶液进一步孵育过夜。在一个实例中，将步骤c)的溶液进一步孵育约12-24小时，或约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时或约24小时的时间段。在一个实例中，将步骤c)的溶液在约4℃的温度进一步孵育约12-24小时的时间段。在优选的实例中，将步骤c)的溶液在约4℃的温度进一步孵育约16小时的时间段。将步骤c)的溶液孵育过夜可使GelMA完全水合，从而防止制造的水凝胶支架溶胀。
在步骤d)中，将一种或更多种细胞类型添加到步骤c)的溶液中。在一个实例中，一种或更多种细胞类型包含干细胞和/或祖细胞。在一个实例中，以下述密度将干细胞加入到步骤c)的溶液中：密度为但不限于约5x105个细胞/ml至5x106个细胞/ml、约5x105个细胞/ml至9x105个细胞/ml、约8x105个细胞/ml至2x106个细胞/ml、约1x106个细胞/ml至5x106个细胞/ml，或约5.0x105个细胞/ml、约5.5x105个细胞/ml、约6.0x105个细胞/ml、约6.5x105个细胞/ml、约7.0x105个细胞/ml、约7.5x105个细胞/ml、约8.0x105个细胞/ml、约8.5x105个细胞/ml、约9.0x105个细胞/ml、约9.5x105个细胞/ml、约1.0x106个细胞/ml、约1.5x106个细胞/ml、约2.0x106个细胞/ml、约2.5x106个细胞/ml、约3.0x106个细胞/ml、约3.5x106个细胞/ml、约4.0x106个细胞/ml、约4.5x106个细胞/ml、约5.0x106个细胞/ml。在另一个实例中，以5x105个细胞/ml至2x106个细胞/ml的密度将干细胞添加到步骤c)的溶液中。在另一个实例中，以1x106个细胞/ml的密度将干细胞添加到步骤c)的溶液中。
在一个实例中，添加到步骤c)的溶液中的干细胞是脂肪来源干细胞(ADSC)或间充质干细胞。在一个实例中，以下述密度将脂肪来源干细胞(ADSC)或间充质干细胞添加到步骤c)的溶液中：密度为但不限于约5x105个细胞/ml至5x106个细胞/ml、约5x105个细胞/ml至9x105个细胞/ml、约8x105个细胞/ml至2x106个细胞/ml、约1x106个细胞/ml至5x106个细胞/ml，或约5.0x105个细胞/ml、约5.5x105个细胞/ml、约6.0x105个细胞/ml、约6.5x105个细胞/ml、约7.0x105个细胞/ml、约7.5x105个细胞/ml、约8.0x105个细胞/ml、约8.5x105个细胞/ml、约9.0x105个细胞/ml、约9.5x105个细胞/ml、约1.0x106个细胞/ml、约1.5x106个细胞/ml、约2.0x106个细胞/ml、约2.5x106个细胞/ml、约3.0x106个细胞/ml、约3.5x106个细胞/ml、约4.0x106个细胞/ml、约4.5x106个细胞/ml、约5.0x106个细胞/ml。在另一个实例中，以5x105个细胞/ml至2x106个细胞/ml的密度，将脂肪来源干细胞(ADSC)或间充质干细胞添加到步骤c)的溶液中。在另一个实例中，以1x106个细胞/ml的密度，将脂肪来源干细胞(ADSC)或间充质干细胞添加到步骤c)的溶液中。
在一个实例中，以下述密度，将祖细胞添加到步骤c)的溶液中：密度为但不限于约5x105个细胞/ml至5x106个细胞/ml、约5x105个细胞/ml至9x105个细胞/ml、约8x105个细胞/ml至2x106个细胞/ml、约1x106个细胞/ml至5x106个细胞/ml，或约5.0x105个细胞/ml、约5.5x105个细胞/ml、约6.0x105个细胞/ml、约6.5x105个细胞/ml、约7.0x105个细胞/ml、约7.5x105个细胞/ml、约8.0x105个细胞/ml、约8.5x105个细胞/ml、约9.0x105个细胞/ml、约9.5x105个细胞/ml、约1.0x106个细胞/ml、约1.5x106个细胞/ml、约2.0x106个细胞/ml、约2.5x106个细胞/ml、约3.0x106个细胞/ml、约3.5x106个细胞/ml、约4.0x106个细胞/ml、约4.5x106个细胞/ml、约5.0x106个细胞/ml。在另一个实例中，以5x105个细胞/ml至2x106个细胞/ml的密度，将祖细胞添加到步骤c)的溶液中。在另一个实例中，以1x106个细胞/ml的密度，将祖细胞添加到步骤c)的溶液中。
在一个实例中，添加到步骤c)的溶液中的祖细胞是成肌细胞或肌卫星细胞。在一个实例中，以下述密度，将肌卫星细胞添加到步骤c)的溶液中：密度为但不限于约5x105个细胞/ml至5x106个细胞/ml、约5x105个细胞/ml至9x105个细胞/ml、约8x105个细胞/ml至2x106个细胞/ml、约1x106个细胞/ml至5x106个细胞/ml，或约5.0x105个细胞/ml、约5.5x105个细胞/ml、约6.0x105个细胞/ml、约6.5x105个细胞/ml、约7.0x105个细胞/ml、约7.5x105个细胞/ml、约8.0x105个细胞/ml、约8.5x105个细胞/ml、约9.0x105个细胞/ml、约9.5x105个细胞/ml、约1.0x106个细胞/ml、约1.5x106个细胞/ml、约2.0x106个细胞/ml、约2.5x106个细胞/ml、约3.0x106个细胞/ml、约3.5x106个细胞/ml、约4.0x106个细胞/ml、约4.5x106个细胞/ml、约5.0x106个细胞/ml。在另一个实例中，以5x105个细胞/ml至2x106个细胞/ml的密度，将肌卫星细胞添加到步骤c)的溶液中。在另一个实例中，以1x106个细胞/ml的密度，将肌卫星细胞添加到步骤c)的溶液中。
在一个实例中，以下述密度，将成肌细胞添加到步骤c)的溶液中：密度为但不限于约5x105个细胞/ml至5x106个细胞/ml、约5x105个细胞/ml至9x105个细胞/ml、约8x105个细胞/ml至2x106个细胞/ml、约1x106个细胞/ml至5x106个细胞/ml，或约5.0x105个细胞/ml、约5.5x105个细胞/ml、约6.0x105个细胞/ml、约6.5x105个细胞/ml、约7.0x105个细胞/ml、约7.5x105个细胞/ml、约8.0x105个细胞/ml、约8.5x105个细胞/ml、约9.0x105个细胞/ml、约9.5x105个细胞/ml、约1.0x106个细胞/ml、约1.5x106个细胞/ml、约2.0x106个细胞/ml、约2.5x106个细胞/ml、约3.0x106个细胞/ml、约3.5x106个细胞/ml、约4.0x106个细胞/ml、约4.5x106个细胞/ml、约5.0x106个细胞/ml。在另一个实例中，以5x105个细胞/ml至2x106个细胞/ml的密度，将成肌细胞添加到步骤c)的溶液中。在另一个实例中，以1x106个细胞/ml的密度，将成肌细胞添加到步骤c)的溶液中。
步骤d)的溶液还包含光引发剂。本文所用术语“光引发剂”是指当暴露于紫外线等辐射时会产生活性物质(例如但不限于自由基、阳离子或阴离子)的化合物。光引发剂用于在暴露于辐射时启动交联或聚合过程。光引发剂的实例包括但不限于Irgacure 2959或苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)次膦酸锂(LAP)。在优选的实例中，光引发剂是Irgacure 2959。在一个实例中，所包含的Irgacure 2959为约0.5-2.0w/v％或约0.5-1.5w/v％、约1.0-2.0w/v％，或约0.5w/v％、约0.6w/v％、约0.7w/v％、约0.8w/v％的果胶、约0.9w/v％、约1.0w/v％、约1.1w/v％、约1.2w/v％、约1.3w/v％、约1.4w/v％、约1.5w/v％、约1.6w/v％、约1.7w/v％、约1.8w/v％、约1.9w/v％或约2.0w/v％。
在步骤e)中，需要设置湿法纺丝的注射速率。在一个实例中，注射速率可以为但不限于约0.1-1.0ml/分钟、约1.0-2.0ml/分钟，或约0.1ml/分钟、约0.2ml/分钟、约0.3ml/分钟、约0.4ml/分钟、约0.5ml/分钟、约0.6ml/分钟、约0.7ml/分钟、0.8ml/分钟、约0.9ml/分钟、约1.0ml/分钟、约1.1ml/分钟、约1.2ml/分钟、约1.3ml/分钟、约1.4ml/分钟、约1.5ml/分钟、约1.6ml/分钟、约1.7ml/分钟,1.8ml/分钟、约1.9ml/分钟或约2.0ml/分钟。在优选的实例中，步骤e)中的注射速率为约0.1ml/分钟。
在步骤f)中，必须使用喷针来促进水凝胶支架的湿法纺丝。在一个实例中，喷针是25G的喷针，或22G的喷针，或16G的喷针，或18G的喷针。在优选的实例中，步骤f)使用25G的喷针。
制造水凝胶支架的方法还包括g)在凝固浴(coagulation bath)中收集水凝胶支架。凝固浴包含CaCl2。在一个实例中，CaCl2的浓度可以为0.5-2.0w/v％。在另一个实例中，CaCl2的浓度可以为但不限于约0.5-1.5w/v％、约1.0-2.0w/v％，或约0.5w/v％、约0.6w/v％、约0.7w/v％、约0.8w/v％、约0.9w/v％、约1.0w/v％、约1.1w/v％、约1.2w/v％、约1.3w/v％、约1.4w/v％、约1.5w/v％、约1.6w/v％、约1.7w/v％、约1.8w/v％、约1.9w/v％或约2.0w/v％。在优选的实例中，所包含的CaCl2的浓度为约1.0w/v％。
使水凝胶支架在凝固浴中停留约1-10分钟。在一个实例中，使水凝胶支架在凝固浴中停留约1-5分钟、5-10分钟，或约1分钟、约2分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟或约10分钟。在优选的实例中，使水凝胶支架在凝固浴中停留约3分钟。
在一个实例中，制造水凝胶支架的方法还包括h)将步骤g)中的水凝胶支架暴露于紫外光下。
在一个实例中，将步骤g)的水凝胶支架在紫外光下暴露约1-10分钟。在一个实例中，将步骤g)的水凝胶支架在紫外光下暴露约1-5分钟、5-10分钟，或约1分钟、约2分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟或约10分钟。在优选的实例中，将步骤g)的水凝胶支架在紫外光下暴露约5分钟。
在一个实例中，制造水凝胶支架的方法包括：
a)制备包含藻酸盐和果胶的溶液；
b)将步骤a)的溶液处理至约4-120℃的温度；
c)将甲基丙烯酰化明胶(GelMA)添加到步骤b)的经热处理的溶液中；
d)将一种或更多种细胞类型添加到步骤c)的溶液中；
e)设置约0.1-2.0ml/分钟的注射速率；
f)对水凝胶支架进行湿法纺丝；以及
g)在含有CaCl2的凝固浴中收集水凝胶支架。
在一个实例中，制造水凝胶支架的方法包括：
a)制备包含藻酸盐和果胶的溶液；
b)将步骤a)的溶液处理至约4-120℃的温度；
c)将甲基丙烯酰化明胶(GelMA)添加到步骤b)的经热处理的溶液中；
d)将一种或更多种细胞类型添加到步骤c)的溶液中；
e)设置约0.1-2.0ml/分钟的注射速率；
f)对水凝胶支架进行湿法纺丝；
g)在含有CaCl2的凝固浴中收集水凝胶支架；以及
h)将步骤g)的水凝胶支架暴露于紫外光下。
在另一个实例中，制造水凝胶支架的方法包括：
a)制备包含藻酸盐和果胶的溶液；
b)将步骤a)的溶液处理至约4-120℃的温度，持续约60分钟；
c)将约甲基丙烯酰化明胶(GelMA)添加到步骤b)的经热处理的溶液中；
其中，将步骤c)的溶液在约4℃的温度进一步孵育约12-24小时；
d)将一种或更多种细胞类型添加到步骤c)的溶液中；
其中，步骤d)的溶液还包含光引发剂；
e)设置约0.1-2.0ml/分钟的注射速率；
f)对水凝胶支架进行湿法纺丝，其中使用25G的喷针。
在另一个实例中，制造水凝胶支架的方法包括：
a)制备包含藻酸盐和果胶的溶液；
b)将步骤a)的溶液处理至约4-120℃的温度，持续约60分钟；
c)将约甲基丙烯酰化明胶(GelMA)添加到步骤b)的经热处理的溶液中；其中，将步骤c)的溶液在约4℃的温度进一步孵育约12-24小时；
d)将一种或更多种细胞类型添加到步骤c)的溶液中；
其中，步骤d)的溶液还包含光引发剂；
e)设置约0.1-2.0ml/分钟的注射速率；
f)对水凝胶支架进行湿法纺丝，其中使用25G的喷针；以及
g)在包含CaCl2的凝固浴中收集水凝胶支架。
在另一个实例中，制造水凝胶支架的方法包括：
a)制备包含藻酸盐和果胶的溶液；
b)将步骤a)的溶液处理至约4-120℃的温度，持续约60分钟；
c)将约甲基丙烯酰化明胶(GelMA)添加到步骤b)的经热处理的溶液中；
其中，将步骤c)的溶液在约4℃的温度进一步孵育约12-24小时；
d)将一种或更多种细胞类型添加到步骤c)的溶液中；
其中，步骤d)的溶液还包含光引发剂；
e)设置约0.1-2.0ml/分钟的注射速率；
f)对水凝胶支架进行湿法纺丝，其中使用25G的喷针；
g)在包含CaCl2的凝固浴中收集水凝胶支架；以及
h)将步骤g)的水凝胶支架暴露于紫外光下。
在另一个实例中，制造水凝胶支架的方法包括：
a)制备包含0.5-2.0w/v％的藻酸盐和0.5-2.0w/v％的果胶的溶液；
b)将步骤a)的溶液处理至约4-120℃的温度，持续约60分钟；
c)将约3.0-10.0w/v％的甲基丙烯酰化明胶(GelMA)添加到步骤b)的经热处理的溶液中；
d)将一种或更多种细胞类型添加到步骤c)的溶液中；
e)设置约0.1-2.0ml/分钟的注射速率；
f)对水凝胶支架进行湿法纺丝。
在另一个实例中，制造水凝胶支架的方法包括：
a)制备包含0.5-2.0w/v％的藻酸盐和0.5-2.0w/v％的果胶的溶液；
b)将步骤a)的溶液处理至约4-120℃的温度，持续约60分钟；
c)将约3.0-10.0w/v％的甲基丙烯酰化明胶(GelMA)添加到步骤b)的经热处理的溶液中；
d)将一种或更多种细胞类型添加到步骤c)的溶液中；
e)设置约0.1-2.0ml/分钟的注射速率；
f)对水凝胶支架进行湿法纺丝；以及
g)在包含CaCl2的凝固浴中收集水凝胶支架。
在另一个实例中，制造水凝胶支架的方法包括：
a)制备包含0.5-2.0w/v％的藻酸盐和0.5-2.0w/v％的果胶的溶液；
b)将步骤a)的溶液处理至约4-120℃的温度，持续约60分钟；
c)将约3.0-10.0w/v％的甲基丙烯酰化明胶(GelMA)添加到步骤b)的经热处理的溶液中；
d)将一种或更多种细胞类型添加到步骤c)的溶液中；
e)设置约0.1-2.0ml/分钟的注射速率；
f)对水凝胶支架进行湿法纺丝；
g)在包含CaCl2的凝固浴中收集水凝胶支架；以及
h)将步骤g)的水凝胶支架暴露于紫外光下。
在另一个实例中，制造水凝胶支架的方法包括：
a)制备包含1.0w/v％的藻酸盐和1.0w/v％的果胶的溶液；
b)将步骤a)的溶液处理至约80℃的温度，持续约60分钟；
c)将约3.0w/v％的甲基丙烯酰化明胶(GelMA)添加到步骤b)的经热处理的溶液中；
其中，将步骤c)的溶液在约4℃的温度进一步孵育约16小时；
d)将一种或更多种细胞类型添加到步骤c)的溶液中；
其中，步骤d)的溶液还包含光引发剂；
e)设置约0.1ml/分钟的注射速率；
f)对水凝胶支架进行湿法纺丝。
将制造的水凝胶支架收集、洗涤并转移到细胞培养物中。
本申请所用的无数量词修饰的名词包括多个所指代的名词，除非上下文另有明确规定。例如，术语“遗传标志物”包括多个遗传标志物，包括其混合物及其组合。
本文所用的术语“增加/提高”和“减少/降低”是指，在群体子集中所选性状或特征相较于整个群体中存在的相同性状或特征的相对改变。因此，增加/提高表示正向变化，而减少/降低表示负向变化。本文所用的术语“变化/改变”也表示孤立群体子集的所选性状或特征与整个种群的相同性状或特征之间的差异。不过，该术语并不对所观察到的差异进行估值。
本文所用的术语“约”，在物质浓度、物质尺寸、时间长度或其他规定值的上下文中，是指规定值的+/-5％，或规定值的+/-4％，或规定值的+/-3％，或规定值的+/-2％，或规定值的+/-1％，或规定值的+/-0.5％。
在整个本公开中，可能以范围格式公开了某些实施方案。应当理解的是，以范围格式进行描述只是为了方便和简洁，不应理解为对所披露范围的僵化限制。因此，对范围的描述应视为已具体公开了该范围内所有可能的子范围以及单个数值。例如，对例如1至6的范围的描述应视为已具体公开了该范围内的子范围，例如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单个数值，例如1、2、3、4、5和6。无论范围多大，这都适用。
本文说明性描述的本发明可以在没有本文未具体披露的任何一个或多个要素、一个或多个限制的情况下适当实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应作广义理解，不受限制。此外，本文所用的术语和表达方式作为描述而非限制性术语而使用，在使用这类术语和表达方式时无意排除所示和描述的特征或其部分的任何等同物，但应认识到在所要求保护的发明范围内可以进行各种修改。因此，应当理解的是，尽管已通过优选实施方案和可选特征具体公开了本发明，但本领域技术人员可以对本文公开的本发明所体现的发明进行修改和变型，且这种修改和变型视为在本发明的范围内。
本文对本发明进行了广义和上位的描述。落入上位公开范围内的每一个较窄的种类和次上位分组也构成本发明的一部分。这包括对本发明的上位描述，该上位描述具有将任何主题从上位概念中除去的附带条件或否定限制，无论本文是否具体叙述了删除的材料。
另一些实施方案落入下述权利要求和非限制性实例的范围内。此外，当以马库什组的形式描述本发明的特征或方面时，本领域技术人员应当认识到，据此，也以马库什组的任何个体成员或成员亚组的形式描述了本发明。
实验部分
材料和方法
本文公开了采用混合技术生产水凝胶支架的方法，该混合技术利用了湿法纺丝的支架和由物理触发机制引起的干细胞分化。选择用于制造支架的材料可以是来自植物的蛋白(大豆蛋白、玉米蛋白和麦麸(wheat gluten))、植物多糖(藻酸盐、纤维素、果胶和淀粉)或其他材料，例如哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、海洋动物和微生物。细胞来源可以是但不限于从猪、家禽、绵羊或牛获取的胚胎干(ES)细胞或成体干细胞。
干细胞制备
水凝胶支架中的细胞由猪脂肪来源干细胞分化而来。首先从动物脂肪组织收获干细胞，在表征后进行体外扩增和储存，表征包括多谱系分化能力、倍增时间和活力。脂肪组织是干细胞的重要来源，因为其在体内储量较大且容易获取。脂肪来源干细胞(ADSC)和骨髓来源干细胞(BMSC)是两种常见的用于成肌分化的成体干细胞，但ADSC的产量和增殖能力高于BMSC。虽然本方案中的干细胞是从猪脂肪组织收获的，但也可以从牛和鸡等其他物种的脂肪组织收获它们。
水凝胶支架材料的制备和配制物
在合成本文公开的水凝胶支架过程中选择聚合物组合时，考虑聚合物组合对干细胞增殖和干细胞成肌分化能力的影响非常重要。果胶用作增稠剂，以降低藻酸盐的浓度，其中，后者不利于细胞附着。GelMA用于调节通过光诱导共价交联纺成的水凝胶支架的降解率。对聚合物浓度进行了优化，以减少纺成的水凝胶支架的断裂和降解。
纺丝前，将2w/v％的藻酸钠和2w/v％的果胶(Sigma)于80℃在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中溶解1小时。另外地，将6w/v％、取代度为50％的冻干GelMA和1.0w/v％的Irgacure2959于37℃在PBS中溶解30分钟。然后将两种溶液按1:1的比例匀质化，并在4℃储存过夜。因此，水凝胶预溶液由1％w/v的藻酸钠、1％w/v的果胶、3％w/v的GelMA和0.5w/v％的Irgacure 2959组成。使用前，将预凝胶溶液在37℃解冻至少30分钟。
通过用0.22μm的注射过滤器过滤，对水凝胶预溶液灭菌。为了封装细胞，以1x 106个细胞/mL的浓度，将细胞重悬浮在水凝胶预溶液中。
在无菌环境中，将细胞溶液湿纺至氯化钙(1.0w/v％)凝固浴中。然后将获得的水凝胶支架(微纤维)放在UV灯(364nm)下进一步交联，然后用PBS冲洗三次并转移到孔板中进行培养。将水凝胶支架培养在生长培养基中，在第9天进行DAPI(Sigma)染色(细胞核染色)和单克隆抗肌球蛋白(Sigma)(骨骼肌细胞特异性标志物)染色。
采用湿法纺丝技术挤出水凝胶支架，以扩大生产规模。水凝胶支架应具备理想的物理和生物特性，例如足够的机械硬挺度、精确的表面微特征和表面配体排列。这些都是支架作为物理触发机制，以有效引导所封装的干细胞实现肌生成(myogenesis)所要考虑的关键因素。对水凝胶支架的物理特性，包括硬挺度、直径、表面形态和降解等进行表征。在一个实例中，水凝胶支架由干细胞与聚合物-植物蛋白(大豆蛋白、玉米蛋白和小麦麸质)、植物多糖(藻酸盐、纤维素、果胶和淀粉)以及GelMA的混合物制成。可以通过湿法纺丝或3D打印，然后用凝固缓冲液或紫外光进行交联来制造水凝胶支架。在一个实例中，水凝胶支架可包含微纤维，其可以通过电纺丝然后用凝固缓冲液或UV交联来制造。
水凝胶支架培养和表征
对水凝胶支架纺丝后，将其培养在细胞培养基中，以实现细胞增殖和分化。使用活/死染色测定、F-肌动蛋白染色和成肌蛋白标志物的免疫染色，对封装和培养在水凝胶支架中的细胞的细胞活力、形态和分化进行了表征。例如，为了探讨细胞微环境机械特性的影响，进一步评估了Yes相关蛋白1(YAP1，下文简称YAP)。
猪脂肪干细胞(pADSC)的提取、扩增和分化
细胞提取、扩增和储存
在麻醉和无菌操作程序后，通过外科手术从成体雄猪获得皮下脂肪组织。在当地屠宰场，从6个月到1岁的成熟雌性杂交家猪的腹背区域收获皮下脂肪(每头猪10g)，然后将其放入含有200U/ml青霉素和200μg/ml链霉素(P/S；Gibco)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM；Hyclone,Logan,Utah,USA)中冰冻运输。将组织细细地切碎，并用含P/S的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(dPBS；Gibco,Grand Island,N.Y.,USA)洗涤。在37℃下，在以45rpm旋转的振荡培养箱中，将每个样本用等体积的0.1％II型胶原酶(900单位胶原酶/1.5ml DMEM/g脂肪)在含有200U/ml青霉素和200μg/ml链霉素(P/S；Gibco)的DMEM中均质化不超过90分钟。添加等体积(等于消化培养基)含有DMEM/F12与10％胎牛血清(FBS)的培养基，以停止胶原酶消化。使含有经消化脂肪组织的消化培养基通过单层薄绸，进入250ml的清洁血清瓶中。可以用一对镊子压住薄绸的中部来为消化培养基提供导向通道，从而加快该过程。以700xg离心过滤后的消化培养基10分钟，收集基质-血管细胞的沉淀物。在不扰动沉淀物的情况下弃去上清液，以去除含有成熟脂肪细胞的顶层脂肪。向每个试管中添加10ml DMEM，通过用移液管吹吸并轻轻摇动试管来重悬沉淀物，然后以700x g离心6分钟，洗涤沉淀物。倾去上清液，向沉淀物中添加10ml ACK裂解缓冲液。通过移液管吹吸重悬浮沉淀物，并使其在室温下静置10分钟，裂解基质-血管级分中的红细胞。添加等量DMEM(10ml)，同时轻轻摇动试管，以停止反应，然后以700x g离心10分钟。弃去上清液，然后向每个试管中添加10mlDMEM。反复用移液管吹吸来重悬浮沉淀，然后以700x g离心6分钟。收集带有悬浮细胞的DMEM，并使其通过100μm的过滤器进入新锥形管中。用移液管吹吸培养基数次，然后在新的1.5ml Eppendorf管中，将20μl含细胞的培养基的等分试样与180μl0.4％的台盼蓝溶液(1:10稀释)混合。用血细胞计数器对细胞进行计数，然后将pADSC以6,000个细胞/cm2的密度接种到期望大小的带有培养基的培养皿或培养板上，培养基含有DMEM/F12、10％胎牛血清(FBS)以及200U/ml青霉素和200μg/ml链霉素(P/S；Gibco)。在37℃的培养箱中，在含5％CO2的空气中孵育培养板或培养皿，使细胞附着在培养板上。在第0代，10克脂肪组织平均产生7百万个细胞。将细胞培养扩增至P4，冷冻在含10％二甲基亚砜(DMSO；Sigma)的FBS溶液中，以便长期储存(1X106个细胞/小瓶，最终体积为1mL，温度-196℃)。对冷冻保存至少3个月、最长冷冻保存12个月的pADSC进行全部表征测定。
细胞表征
pADSC的多谱系分化
当70-90％汇合(克隆的第4次传代后)时，使细胞通过胰蛋白酶消化传代，并培养在诱导培养基中。在整个研究过程中，每3-4天更换一次培养基。
对于脂肪生成，将细胞在含有DMEM/F12(含1％青霉素-链霉素(P/S)抗生素)的脂肪细胞诱导培养基中培养3天，DMEM/F12含有10μg/ml胰岛素、1nM 3,3’,5-三碘-L-甲状腺原氨酸、10μg/ml转铁蛋白、1μM地塞米松和1μM罗格列酮，然后用脂肪细胞维持培养基替换诱导培养基，脂肪细胞维持培养基的添加物与诱导培养基相同，但省略了地塞米松。成熟的脂肪细胞在约9天内完成最终分化。这些脂肪细胞准备用于油红O染色。
对于软骨形成，在分化期间，将细胞沉淀物培养在15ml试管中的含αMEM的培养基中，αMEM含有1％FBS、6.25μg/ml胰岛素、50μg/ml抗坏血酸-2-磷酸和10ng/ml转化生长因子β1。软骨细胞诱导培养基每三天更换一次，但不去除底部的细胞。约14天后形成成熟的软骨细胞。这些软骨细胞准备用于甲苯胺蓝O染色。
对于骨生成，将细胞培养在含有DMEM的诱导培养基中，DMEM含有10％FBS、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素、10mMβ-甘油磷酸、50μg/ml抗坏血酸-2-磷酸和10μM地塞米松。骨细胞诱导培养基每三天更换一次。成熟的骨细胞将在分化14天后形成。这些骨细胞准备用于茜素红S染色。
脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞的染色
脂肪细胞的油红O染色
在第9天，除去脂肪细胞维持培养基，用PBS洗涤细胞。用双蒸水洗涤后，将脂肪细胞在4％多聚甲醛溶液中固定10分钟。用双蒸水洗涤后，向细胞中添加60％的异丙醇溶液并孵育5分钟。用经0.22μm注射器过滤的60％油红O溶液代替异丙醇，其中将油红O溶液溶于异丙醇并用去离子水稀释。将细胞在室温下孵育15分钟。除去油红O溶液，用双蒸水洗涤。脂肪细胞内染色的脂滴准备用于光学显微镜术观察(图16)。
骨细胞的茜素红S染色
在第14天，除去骨细胞诱导培养基，并用PBS冲洗细胞。用双蒸水洗涤后，将骨细胞在4％多聚甲醛溶液中固定10分钟。在轻微摇动的摇床(100rpm)上，用2％的茜素红S溶液(pH＝4.1-4.3)对细胞染色15分钟。用双蒸水洗涤后，向细胞中添加10％的福尔马林溶液。骨细胞准备用于光学显微镜术观察(图16)。
软骨细胞的甲苯胺蓝O染色
在第14天，用PBS洗涤细胞沉淀物，然后用4％多聚甲醛溶液固定10分钟。用双蒸水洗涤后，将细胞沉淀物包埋在最佳切割温度(OCT)化合物中，并用恒冷箱切片机以5-10μm的厚度进行切片。用甲苯胺蓝O溶液(0.1％，pH 4.1)对恒冷箱切片进行染色，然后用双蒸水洗涤两次。载玻片上的软骨细胞准备用于光学显微镜术观察(图16)。
实验结果
pADSC形态
将来自猪背部皮下脂肪的猪脂肪来源干细胞pADSC接种到培养瓶中，如图1所示。来自基质-血管级分的pADSC的形态与小鼠或人ADSC相似。在用6,000个细胞/cm2的接种密度接种后第3天，pADSC贴壁并具有成纤维细胞状膨大形态(图1A)。培养6天和8天后，pADSC在培养瓶表面增殖和扩散(图1B和图1C)。
pADSC增殖倍增时间
通过增殖倍增时间(doubling time,DT)测量，考察了pADSC的体外增殖率。确定研究细胞的DT值。利用公式DT＝T ln2/ln(Xe/Xb)来计算增殖倍增时间(proliferationdoubling time,PDT)，其中T是以小时计的孵育时间，Xb代表孵育时间开始时的细胞数，Xe对应于孵育时间结束时的细胞数(图2)。
实施例1-支架材料制备
为了制造用于干细胞培养的水凝胶支架，在选择聚合物时有几项要求，例如无菌性、可加工性和生物相容性。细胞培养需要无菌，以形成可封装细胞的水凝胶支架。因此，在聚合物溶液与细胞混合以进行湿法纺丝之前，要对聚合物溶液进行灭菌。
由于高压灭菌和辐照都可能影响聚合物的分子结构，因此，过滤是对聚合物溶液进行灭菌的最合适方法。但是，如果聚合物溶液太黏，则其无法通过过滤器图3A示出了不同聚合物溶液在不同温度下的黏度。据观察，当聚合物溶液的黏度超过150CP时，其难以通过过滤器。为了降低聚合物溶液的黏度，在将溶液与GelMA和细胞混合之前，对藻酸盐和果胶进行热处理。图3B示出了热处理对聚合物溶液黏度的影响。
发现两种热处理(80℃2小时和120℃20分钟)都降低了聚合物溶液的黏度，从而使它们(P1、P2和P3)通过了过滤器，以在37℃下灭菌。然而，热处理(120℃20分钟)后形成的水凝胶会快速降解，因此水凝胶的刚度在培养基中无法维持两周以上，而这是细胞培养的最低要求。热处理可降低聚合物溶液黏度的原因可能是热处理后聚合物分子构象的不可逆变化或降解。
还评估了上述聚合物溶液形成的水凝胶的机械性能。将这些聚合物溶液与0.5％Irgacure 2959混合，然后在1％CaCl2缓冲溶液中凝固3分钟，然后在UV下光交联6分钟或10分钟，随后用PBS洗涤，这与通过湿法纺丝形成纤维状支架的方法相同。结果如图4所示。
聚合物溶液(P1H、P2H和P3H)形成的水凝胶的G’和G”都会受到UV暴露时间的影响。长的暴露时间增加了水凝胶的储能模量(G’)和损耗模量(G”)。在2D培养系统中，基质硬挺度会促使培养在基质上的干细胞向特定谱系分化。弹性模量在8-17KPa之间的基质会诱导干细胞成肌分化。然而，3D培养系统则可能没这么简单，基质可塑性也会对细胞表现起到重要作用。
实施例2-封装有细胞的水凝胶支架的湿法纺丝
湿法纺丝工艺涉及将水凝胶支架挤出至溶液中。这种工艺不需要电压，可以生产出独立的、尺寸可控的水凝胶支架。由于湿法纺丝工艺是一种温和的工艺，因此对于生产无法熔融纺丝的水凝胶支架而言，采用较低的温度是优选方法。湿法纺丝工艺的优点是可以生产出各种截面形状和尺寸的水凝胶支架。在过去几年中，湿法纺丝已成功实现了更高的生产速度。该技术用于形成封装有细胞的水凝胶支架。
为了对水凝胶支架进行纺丝，将与干细胞混合的聚合物溶液装入带有25G喷针的注射器中，然后以能得到轮廓均匀的水凝胶支架的注射速率(0.2ml/分钟)将其注入凝固缓冲液中。图5示出了这种装置的实例。当在凝固缓冲液(1％CaCl2和0.5％Irgacure 2959)中对水凝胶支架进行纺丝时，藻酸盐和果胶发生交联，从而暂时保持水凝胶支架的形状。随后，将水凝胶支架在UV(λ＝365nm)下暴露6分钟，随后用PBS洗涤两次。最后，将水凝胶支架转移到带有培养基的培养板中进行细胞增殖和分化。
如图6所示，通过相差(phase contrast)显微术评估了带有细胞的纺丝水凝胶支架的形态。采用上述条件纺成的水凝胶支架的直径为400至600μm。这些水凝胶支架的几何形状和结构保持了9天的培养期。细胞在培养期开始时呈球形，其中一些细胞在水凝胶支架纺丝后的第3天开始扩散。
选择了两种类型的细胞(C2C12和pADSC)，将每种类型的细胞都与由P1或P3聚合物溶液制成的水凝胶支架混合。两种水凝胶支架中的细胞表现出相似的形态。与前几个时间点相比，在第9天，更多的细胞扩散开来。
此外，还使用扫描电子显微术(SEM)检查了水凝胶支架的表面形态，从而提供了有关水凝胶支架表面微观结构的更多信息。根据图7，在水凝胶支架表面发现了一些沉淀。推测这是PBS与Ca2+反应的结果。PBS可以除去藻酸凝胶中的Ca2+，从而在水凝胶支架上产生多孔表面。此外，无论用磷酸盐缓冲盐水(PBS)还是用去离子水(DI)洗涤，在水凝胶支架的表面都有对齐的微沟。
实施例3-在水凝胶支架中培养的细胞的表征
研究了封装在利用湿法纺丝纺成的水凝胶支架中的细胞的生长。此外，还评估了细胞形态、活力和对分化的影响。C2C12是能在高血清条件下快速增殖，也能在低血清条件下分化成肌管的小鼠永生成肌细胞系。C2C12细胞能在低血清条件下融合形成多核肌管，从而在肌生成过程中形成收缩性骨骼肌细胞的前体。这里用C2C12作为对照来评估pADSC的生长和分化。
评估了在水凝胶支架中培养的ADSC和C2C12的活力。使用钙黄绿素-AM和溴乙啡锭二聚体1(EthD-1)进行的活-死细胞染色显示，两种细胞在水凝胶支架中培养9天后仍然存活(图8)。
还使用扫描电子显微术(SEM)观察了在水凝胶支架中培养的ADSC和C2C12的形态(图9)。
还使用F-肌动蛋白染色检查了在水凝胶支架中培养的ADSC和C2C12细胞在培养9天后的细胞骨架形态，结果如图10所示。从这些图像中观察到，一些细胞“端对端”排列形成管状结构，但尚不确定它们是否融合形成多核肌管。此外，仍然有一些细胞呈球状形态。
还使用单克隆抗肌球蛋白(Skeletal,Slow)免疫染色评估了在水凝胶支架中培养的细胞(ADSC和C2C12)在培养9天后的成肌分化，结果如图11所示。单克隆抗肌球蛋白(Skeletal,Slow)识别位于人成体骨骼肌慢肌球蛋白重酶解肌球蛋白部分上的表位。它对成体骨骼肌的慢肌球蛋白重链具有高度特异性，因此用于检测肌球蛋白。
结果表明，已扩散的细胞的肌球蛋白染色呈阳性，并揭示ADSC和C2C12都致力于成肌分化。但是，没有显示条纹图案，因此表明分化尚未成熟。
yes相关蛋白(YAP)是可用于检测从剪切应力到细胞形状和细胞外基质刚度等多种机械触发机制，并将其转化为细胞特异性转录程序的机械转导因子。之前有报道称，当在硬基质上培养细胞时，YAP位于细胞核内。然而，在干细胞肌生成过程中，YAP的位置尚不清楚。因此，对pADSC进行YAP免疫染色，以了解干细胞肌生成过程中的YAP的位置(图12)。根据图12，在细胞成肌分化过程中，YAP仍然位于细胞质中。
为了在不断裂的情况下对材料进行纺丝，所用成分的范围为0.5-2.0w/v％的藻酸钠、0.5-2.0w/v％的果胶和3.0-10.0w/v％的GelMA(取代度为25-99％)。用于交联藻酸盐和果胶的凝固浴即氯化钙的范围为1.0-2.0w/v％。交联时间为1-10分钟。用于交联GelMa的UV波长为365nm，辐射时间为5-10分钟。注入凝固浴中的成分的流速为0.1-2.0mL/分钟。
为了生产示范性水凝胶，将终浓度为1.0w/v％的藻酸钠、1.0w/v％的果胶、3.0w/v％的GelMa(取代度50％)和0.5w/v％的Irgacure 2959以0.1mL/分钟的流速注入由1.0w/v％的CaCl2组成的凝固浴中。使材料在凝固浴中交联3分钟，随后在波长为365nm的UV灯下辐射5分钟，供GelMA交联，接着用PBS洗涤。
图13示出了封装在经历了热处理的聚合物内的C2C12细胞(左)和封装在未经历热处理的聚合物内的细胞(右)。观察到细胞被钙黄绿素AM染成绿色，表明细胞是活的，意味着该聚合物组成适合细胞存活。还观察到，封装在经热处理的聚合物中的细胞表现出扩散，而封装在未经热处理的聚合物中的细胞则保持圆形。
当将猪脂肪来源干细胞(pADSC)封装在经热处理的聚合物中时，与C2C12中观察到的现象类似，pADSC在培养9天后仍然存活，并且也表现出扩散(图14)。在进一步的实验中，也证实了这些表现出扩散的细胞表达了成肌标志物，表明它们正在经历成肌分化和/或肌生成。
封装在水凝胶中的pADSC的细胞密度的范围为5x105至5x106个细胞/ml。以4-120℃的多种温度和1-24小时的处理时间处理聚合物。
为了灭菌，使材料通过孔径为0.22μm的注射过滤器。发现黏度超过150cP的材料无法通过0.22μm的注射过滤器进行灭菌。
湿法纺丝的挤出速度为0.1mL/分钟至2.0mL/分钟，生产的湿纺水凝胶支架的直径为250-500μm。
最佳的是，在纺丝前将藻酸盐和果胶在80℃溶解并处理1小时，使聚合物链能够伸展和松弛。将GelMA在37℃溶解30分钟，使最终混合物在4℃放置过夜，以便GelMA和Irgacure 2959完全水合。在湿法纺丝前，将溶液加热至37℃。上文描述了获得表现最佳的凝胶的湿法纺丝工艺，获得的水凝胶支架的直径为约300μm。
当在PBS中洗涤水凝胶支架5分钟时，水凝胶支架表面上存在对齐的微沟。
在湿纺水凝胶支架中的猪脂肪来源干细胞的分化过程中，使用了正常生长培养基(DMEM+10％FBS+1％pen-strep(青霉素-链霉素))，而不是骨骼肌分化培养基。
为了研究湿法纺丝前聚合物溶液所需的最佳处理方法，进行了实验。如图3和图4所示，聚合物黏度随37℃-120℃的热处理而变化。因此，通过比较使用4℃孵育过夜和未4℃孵育过夜的聚合物溶液
的湿法纺丝形成的水凝胶支架，研究了将聚合物溶液在4℃孵育过夜的效果。观察到，与用4℃孵育的聚合物溶液纺成的水凝胶支架相比，用未在4℃孵育的聚合物溶液纺成的水凝胶支架在14天内显著溶胀(图15)。因此，在4℃孵育过夜对GelMA的完全水合至关重要。
本发明的商业应用
与其他含植物来源成分的水凝胶相比，本文公开的水凝胶支架在制造过程中不易断裂。此外，水凝胶支架允许封装的细胞在水凝胶中扩散，从而改善其生长。使用本文公开的水凝胶支架还允许干细胞或祖细胞进行成肌分化，只需使用简单的正常细胞培养基，例如DMEM和FBS，这与传统的分化方法不同，传统的分化方法依赖于使用特定的诱导培养基或分化培养基，这些培养基成本高昂，不适合用于扩大人造食品的生产规模。
此外，已知简单的细胞培养基无法实现ADSC的成肌分化。通过制造封装有ADSC的水凝胶支架，水凝胶支架中的ADSC经受了张力等物理触发机制，从而使水凝胶支架中的ADSC只需使用诸如DMEM和FBS等简单细胞培养基就能进行成肌分化。通过转换为不需要任何昂贵化学和/或生物成分的简单细胞培养基，这会使扩大细胞生产规模变得经济适用。
水凝胶支架可以用于不同的应用领域，例如但不限于食品生产、医疗应用和化妆品应用。
Claims (17)
1.一种水凝胶支架，其包含：
-约3.0-10.0w/v％的甲基丙烯酰化明胶(GelMA)；
-约0.5-2.0w/v％的藻酸盐；
-约0.5-2.0w/v％的果胶；以及
-一种或更多种细胞类型。
2.根据权利要求1所述的水凝胶支架，其中所包含的甲基丙烯酰化明胶(GelMA)为约3.0w/v％。
3.根据权利要求1或2所述的水凝胶支架，其中所包含的藻酸盐为约1.0w/v％。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的水凝胶支架，其中所包含的果胶为约1.0w/v％。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的水凝胶支架，其中所述一种或更多种细胞类型包含干细胞和/或祖细胞。
6.根据权利要求5所述的水凝胶支架，其中所述干细胞是脂肪来源干细胞(ADSC)或间充质干细胞。
7.根据权利要求5所述的水凝胶支架，其中所述祖细胞是成肌细胞或肌卫星细胞。
8.一种成肌分化方法，其包括在细胞培养基中培养权利要求1-7中任一项所述的水凝胶支架中的一种或更多种细胞类型，其中所述细胞培养基包含基础培养基和血清。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述基础培养基选自由以下组成的组：Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、高级Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)/Ham’s F12、DMEM/Ham’sF12、极限必需培养基(MEM)、敲除-DMEM(KO-DMEM)、Glasgow极限必需培养基(G-MEM)、基础Eagle培养基(BME)、Iscove改良Dulbecco培养基和极限必需培养基(MEM)、Ham’s F-10、Ham’s F-12、培养基199以及RPMI 1640培养基。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述血清为胎牛血清(FBS)或马血清。
11.根据权利要求8-10所述的方法，其中所述细胞培养基还包含类固醇或激素。
12.一种制造水凝胶支架的方法，所述方法包括：
a)制备包含藻酸盐和果胶的溶液；
b)将步骤a)的溶液处理至约4-120℃的温度；
c)将甲基丙烯酰化明胶(GelMA)添加到步骤b)的经热处理的溶液中；
d)将一种或更多种细胞类型添加到步骤c)的溶液中；
e)设置约0.1-2.0ml/分钟的注射速率；
f)对水凝胶支架进行湿法纺丝。
13.根据权利要求12所述的方法，其中步骤a)中的溶液包含约0.5-2.0w/v％的藻酸盐。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中步骤a)中的溶液包含约0.5-2.0w/v％的果胶。
15.根据权利要求12-14中任一项所述的方法，其中步骤b)中的温度为约80℃。
16.根据权利要求12-15中任一项所述的方法，其中步骤c)中的溶液包含约3.0-10.0w/v％的甲基丙烯酰化明胶(GelMA)。
17.根据权利要求12所述的方法，其中步骤e)中的注射速率为约0.1ml/分钟。
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