CN117431265A

CN117431265A - 高活性DpnI酶突变体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN117431265A
Application number: CN202311406179.6A
Authority: CN
Inventors: 李升建; 赵昕妍; 杨小丽; 俞宏斌
Original assignee: Shanghai Beyotime Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Beyotime Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-10-27
Filing date: 2023-10-27
Publication date: 2024-01-23
Anticipated expiration: 2043-10-27
Also published as: CN117431265B

Abstract

本发明提供了一种高活性DpnI酶突变体及其制备方法和应用。鉴于DpnI酶活性有待提高的技术需求，揭示了一类酶切活性显著提高的突变型DpnI酶，其酶活性可以达到野生型的约1.5‑8倍。同时，鉴于本领域中难以重组表达DpnI酶的技术缺陷，揭示了一种经过重组改造的、可用于大量制备DpnI酶的大肠杆菌表达菌株，从而实现DpnI酶的高效表达。

Description

高活性DpnI酶突变体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种高活性DpnI酶突变体及其制备方法和应用。

背景技术

大肠杆菌DNA包括两种甲基化修饰碱基：6-甲基腺嘌呤和5-甲基胞嘧啶。大约有2％的腺嘌呤和1％胞嘧啶被进行了修饰。甲基化修饰由三种酶完成，这三种酶分别是DsD甲基化酶、Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶。

大肠杆菌DNA腺嘌呤甲基转移酶(DNA adenine methyltransferase,Dam)催化GATC序列中腺嘌呤外环氨基上的氮原子(N6)的甲基化(Gm6ATC)。Dam基因的同源序列在γ-变形菌中和很多它们的噬菌体中是高度保守的。GATC序列中DNA腺嘌呤甲基化在甲基化依赖性的细菌基因沉默、DNA复制和DNA错配修复中起着关键作用。多种受Dam依赖性调节的细胞功能紧随着DNA复制产生。特别地，由于Dam活性相对比较低，因此染色体复制与子染色体链的甲基化之间有延迟。这个延迟对后续的复制错配系统是非常重要的，因为甲基化直接修复染色体子链。另外，Dam甲基化也调控大肠杆菌特殊基因的表达等。

DpnI限制性内切酶分离自双球菌属(formerly Diplococcus)的肺炎双球菌(Streptococcus pneumoniae)，是一种常见的甲基化修饰依赖性的限制性内切酶，可以识别甲基化的腺嘌呤，但不能识别甲基化的胞嘧啶。在体内，DpnI保护细菌不受含Dam(Adenine-Specific DNA-Methyltransferase)基因的宿主体内繁殖的噬菌体的吞噬，这可能由于DpnI特异性识别Dam的甲基化产物Gm6ATC；在体外，DpnI可以有效切割被完全甲基化的GATC序列(如两条链)，而当酶浓度较高时，可以切割半甲基化的GATC序列。DpnI在识别序列的中间进行切割产生平末端，不像其他修饰依赖性的限制性内切酶是在距离识别序列较远的位置进行切割。

DpnI识别并酶切由Dam基因产物负责的DNA双链中腺嘌呤N6位甲基化(N6-methyladenine)的GATC序列(切割点位于GA与TC之间：GA^TC)；DpnI识别位点中两个腺嘌呤(GATC及其互补链上均有一个“A”)的N6位都甲基化时，呈现正常的酶活力；只有一个腺嘌呤的N6位甲基化时，酶切活力会降低约60倍。从dam⁺(Dam甲基化酶表达阳性)大肠杆菌菌株如DH5α等提取的质粒的GATC序列中腺嘌呤N6位被甲基化，从而可以被DpnI识别和酶切；而从Dam^-(Dam甲基化酶表达阴性)大肠杆菌菌株如JM110等提取的质粒的GATC序列中腺嘌呤N6位没有被甲基化，从而不能被DpnI识别和酶切。

DpnI常被用于基因的定点突变等生物技术中，通过设计基因定点突变的引物，结合PCR方法可以使得提取自大肠杆菌菌株如DH5α的质粒进行扩增。新扩增的含突变位点的环形质粒的GATC序列中腺嘌呤N6位没有发生甲基化，因而在使用DpnI进行消化的过程中可以保留下来，而提取自大肠杆菌菌株如DH5α的模板质粒因为GATC序列中腺嘌呤N6位的甲基化而被消化掉；最后将DpnI消化后的产物转化大肠杆菌如DH5α就可以筛选得到含突变位点的质粒。

BL21(DE3)是一种BL21被λ噬菌体DE3溶源化的衍生菌株，在lacUV5启动子控制下可表达噬菌体T7 RNA聚合酶(相关基因序列已经整合到细菌染色体中)。IPTG可以诱导BL21(DE3)菌株中T7 RNA聚合酶的高表达，因此BL21(DE3)菌株适合受T7启动子(T7 promoter)调控的目的基因通过IPTG诱导表达。常见的pET系列原核表达载体中目的基因的表达都是受T7启动子调控的，因此都适合用BL21(DE3)作为宿主菌。BL21(DE3)菌株基因型：F-ompThsdSB(rB^-mB^-)gal dcm(DE3)。

在使用普通BL21(DE3)菌株表达制备限制性内切酶DpnI的时候，DpnI会因酶切宿主基因组而表现出很大的毒性，导致表达量很低甚至几乎检测不到。本领域有使用表达DpnI的组成型表达载体pGEX-6p-1转化Dam^-(Dam甲基化酶表达阴性)的菌株JM110，然后进行限制性内切酶DpnI的表达制备。但JM110是通常用于基因质粒扩增的菌株，其扩增的质粒没有甲基化修饰。

DpnI重组表达的受限性极大困扰了生物技术领域对DpnI的生产和应用，急需一种有效可行的方式实现DpnI的批量制备。

在可实现重组表达的基础上，作为一种具有特别识别位点的限制性内切酶，DpnI酶活性的提高也是生物技术领域中亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高活性DpnI酶突变体及其制备方法和应用。

本发明的目的还在于提供一种制备DpnI酶的方法，包括利用甲基化酶基因Dam缺失的菌株进行重组表达，所述Dam缺失的菌株通过Red重组系统结合Cre-loxP系统介导的基因编辑技术将大肠杆菌的Dam基因进行基因敲除。

在本发明的第一方面，提供一种高效制备DpnI酶的方法，包括：(1)提供大肠杆菌表达菌株，所述菌株的甲基化酶基因Dam缺失；(2)将编码DpnI酶的DNA引入(1)的菌株中，培养该重组菌株，表达DpnI酶；其中，所述DpnI酶为突变型DpnI酶或野生型DpnI酶。

在一种或多种优选实施方式中，步骤(1)中，通过Red重组系统结合Cre-loxP系统介导的基因编辑技术将大肠杆菌的Dam基因进行基因敲除。

在一种或多种优选实施方式中，根据Dam基因的5’端设计重组臂5HR、3’端设计重组臂3HR，建立重组片段Dam-Loxp(较佳地还携带抗性筛选基因)；将编码Red重组酶的DNA引入大肠杆菌，获得表达Red重组酶的重组菌株，进一步引入所述Dam-Loxp，获得甲基化酶基因Dam缺失的大肠杆菌表达菌株。

在一种或多种优选实施方式中，所述DpnI酶为突变型DpnI酶，对应于野生型DpnI酶的氨基酸序列，具有以下突变：

A.选自(a)-(k)的突变或其组合：(a)第223位由N突变为Q；(b)第100位由T突变为W或F；(c)第71位由N突变为K；(d)第72位由F突变为W；(e)第206位由L突变为F；(f)第210位由Y突变为W；(g)第76位由I突变为F；(h)第13位由Y突变为L；(i)第16位由N突变为K；(j)第82位由A突变为K；(k)第245位由F突变为Y；

B.将A蛋白的氨基酸序列经过一个或多个(如1-15个；较佳地1-10个；更佳地1-5个，如4个，2个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有A蛋白功能的由A衍生的蛋白，但对应于A中(a)-(k)所限定的位点是保守的(氨基酸序列不变化)；

C.与A蛋白的氨基酸序列有80％以上(较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳95％以上，如98％，99％)同源性且具有A蛋白功能的由A衍生的蛋白，但对应于A中(a)-(k)所限定的位点是保守的(氨基酸序列不变化)。

在本发明的另一方面，提供一种突变型DpnI酶，对应于野生型DpnI酶的氨基酸序列，其具有：A.选自所述(a)-(k)的突变或其组合；B.将A蛋白的氨基酸序列经过一个或多个(如1-15个；较佳地1-10个；更佳地1-5个，如4个，2个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有A蛋白功能的由A衍生的蛋白，但对应于A中(a)-(k)所限定的位点是保守的(氨基酸序列不变化)；C.与A蛋白的氨基酸序列有80％以上(较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳95％以上，如98％，99％)同源性且具有A蛋白功能的由A衍生的蛋白，但对应于A中(a)-(k)所限定的位点是保守的(氨基酸序列不变化)。

在一种或多种优选实施方式中，所述的野生型DpnI酶具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

在本发明的另一方面，提供一种提高DpnI酶的酶活性的方法，所述方法通过点突变进行，包括：将DpnI酶进行突变改造，形成所述的突变型DpnI酶。

在本发明的另一方面，提供一种多核苷酸、含有该多核苷酸的载体或遗传工程化的宿主细胞，所述的多核苷酸编码所述的突变型DpnI酶；所述宿主细胞中含有所述载体或其基因组中整合有所述的多核苷酸。

在一种或多种优选实施方式中，所述宿主细胞为原核细胞；较佳地，所述原核宿主细胞包括大肠杆菌。

在一种或多种优选实施方式中，所述载体中，所述的多核苷酸的5’端，还包括信号肽、标签多肽、荧光蛋白和/或启动子。所述的多核苷酸的3’端，还包括标签多肽、荧光蛋白和/或终止子。

在一种或多种优选实施方式中，与野生型(SEQ ID NO:2所示氨基酸序列)DpnI酶相比，所述经改造的DpnI酶的酶活性提高50％以上；较佳地提高60％以上；更佳地提高80％以上；更佳地提高100％以上；更佳地提高150％以上；更佳地提高700％以上。

在本发明的另一方面，提供所述的突变型DpnI酶、表达该突变体的宿主细胞或其裂解产物的用途，用于作为限制性内切酶，识别和切割DNA双链中腺嘌呤N6位甲基化(N6-methyladenine)的GATC序列。

在本发明的另一方面，提供一种特异性识别和切割包含GATC位点且其中A发生N6位甲基化的核酸的方法，包括：利用所述的突变型DpnI酶、表达该突变体的宿主细胞或其裂解产物进行切割。

在一种或多种实施方式中，所述“甲基化”包括完全甲基化和部分甲基化，完全甲基化是指DpnI识别位点GATC中两个腺嘌呤的N6位都被甲基化，所述部分甲基化为GATC位点中只有一个腺嘌呤的N6位甲基化。

在一种或多种实施方式中，所述切割在适于反应的体系中进行。例如，所述适于反应的体系中例如包括：反应缓冲液，水。

在本发明的另一方面，提供一种用于识别和切割包含GATC位点且其中A发生N6位甲基化的核酸的反应体系或试剂盒，其中含有所述的突变型DpnI酶、表达该突变体的宿主细胞或其裂解产物；较佳地，所述试剂盒中含有DpnI酶突变体或编码其的多核苷酸的文库，所述文库包括1～12种(较佳地选自前述(a)至(k)所述DpnI酶突变体或编码其的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种用于制备DpnI酶的大肠杆菌表达菌株，所述菌株的甲基化酶基因Dam缺失；较佳地，所述菌株通过Red重组系统结合Cre-loxP系统介导的基因编辑技术将大肠杆菌的Dam基因进行基因敲除制备获得；更佳地，根据Dam基因的5’端设计重组臂5HR、3’端设计重组臂3HR，建立重组片段Dam-Loxp(较佳地还携带抗性筛选基因)；将编码Red重组酶的DNA引入大肠杆菌，获得表达Red重组酶的重组菌株，进一步引入所述Dam-Loxp，获得甲基化酶基因Dam缺失的大肠杆菌表达菌株。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、菌落PCR鉴定Dam基因是否敲除的结果图。

图2、BL21(DE3)和BL21(DE3)(Dam^-)的基因组经DpnI消化前后的对比图。泳道1：没有经过DpnI消化的BL21(DE3)的基因组为模板；泳道2：经过DpnI消化的BL21(DE3)的基因组为模板；泳道3：没有经过DpnI消化的BL21(DE3)(Dam^-)的基因组为模板；泳道4：经过DpnI消化的BL21(DE3)(Dam^-)的基因组为模板。

图3、分别用BL21(DE3)和BL21(DE3)(Dam^-)没有经过和经过DpnI消化的基因组(图2)为模板扩增目的基因片段。泳道1：没有经过DpnI消化的BL21(DE3)的基因组为模板；泳道2：经过DpnI消化的BL21(DE3)的基因组为模板；泳道3：没有经过DpnI消化的BL21(DE3)(Dam-)的基因组为模板；泳道4：经过DpnI消化的BL21(DE3)(Dam-)的基因组为模板。

图4、菌株BL21(DE3)在敲除Dam基因前后的序列对比图示。BL21(DE3)中“黑色正体”部分序列是Dam基因上下游序列，“黑色正体加下划线”部分序列是Dam-5HR-JD-F和Dam-3HR-JD-R引物序列，“黑色斜体加下划线”部分序列是Dam基因序列；BL21(DE3)(Dam^-)中“黑色正体”部分序列是Dam基因上下游序列，该序列与BL21(DE3)中的这部分序列是重叠的，“黑色正体加下划线”部分序列是Dam-5HR-JD-F和Dam-3HR-JD-R引物序列，“黑色斜体加下划线”部分序列是Dam基因敲除后的残留序列，即BL21(DE3)(Dam^-)基因序列与BL21(DE3)基因序列相比较，验证了Dam基因被有效敲除。

图5、菌株BL21(DE3)和Dam基因缺陷菌株BL21(DE3)(Dam^-)的生长曲线图。

图6、菌株BL21(DE3)-DpnI和BL21(DE3)(Dam^-)-DpnI表达DpnI的效果图。

图7、镍柱纯化DpnI的过程图。

图8、表达纯化所得的DpnI酶活性检测图。

图9、位于限制性内切酶DpnI N端的催化结构域细节展示图。

图10、位于限制性内切酶DpnI C端的底物特异性识别结合结构域细节展示图。

图11A、野生型和各DpnI突变体粗酶的酶活性检测对比图。

图11B、野生型和各DpnI突变体粗酶的酶活性检测对比柱状图。

图12、酶活性有显著增强的12种DpnI突变体/野生型DpnI表达纯化后的电泳图及相对活性柱状对比图。图12A为各DpnI样品的上样量均为1μg的蛋白电泳图。图12B为野生型DpnI与12种DpnI突变体的相对活性柱状对比图。

图13、酶活有显著改善的DpnI各突变位点三维结构预测与DpnI-WT结构对比与分析图。从多个不同的方向对DpnI各突变位点与DpnI-WT进行比较和展示。

图14、最优突变体M63(N223Q)与野生型DpnI活力检测及酶切后产物转化对比图。图14A为不同稀释倍数下野生型DpnI与最优突变体M63(N223Q)的酶切效果电泳检测图。图14B为对应稀释倍数下DpnI酶切后的产物转化效果图。

具体实施方式

鉴于本领域中难以重组表达DpnI酶的技术缺陷，本发明揭示了一种经过重组改造的、可用于大量/规模化制备DpnI酶的大肠杆菌表达菌株。

同时，鉴于DpnI酶活性有待提高的技术需求，本发明揭示了一类酶切活性显著提高的突变型DpnI酶，其酶活性可以达到野生型的约1.5-8倍。

术语

如本文所用，除非另外说明，所述的“DpnI酶突变体”、“突变型DpnI酶”可互换使用，是指对应于突变前的DpnI酶，在本发明人确定的一些与酶的酶活性具有相关性的位点发生突变后构成的酶(多肽/蛋白)。

若需要表示突变前的DpnI酶(野生型)，其可以为氨基酸序列如SEQ ID NO:2的酶。除非另外说明，本发明中各DpnI突变体的突变位点基于该SEQ ID NO:2所示的序列。

本发明中，除非另外说明，DpnI酶突变体的标识采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示DpnI酶突变体中突变的氨基酸，如N223Q，表示位置223位的氨基酸由出发酶的N替换为Q。

如本发明所用，“提高酶活性”是指与改造前的DpnI酶出发多肽相比，发生突变的DpnI酶的酶活性发生统计学意义的提高，或称为显著性的提高。例如，在同一种反应条件/环境下，酶活性提高的突变型DpnI酶在一定时间的反应后，酶活性比改造前的酶显著提高50％以上，60％以上，80％以上，100％以上，150％以上，700％以上等。

如本发明所用，“DpnI酶突变体或编码其的多核苷酸的文库”是指含有本发明提供的一系列突变型DpnI酶的多肽集合体或多核苷酸集合体。多条酶活性有不同的DpnI酶突变体或编码其的多核苷酸被组装于一个库中，有利于本领域技术人员根据其所需的反应条件，选择合适的DpnI酶或其编码核酸。

如本发明所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“基本上由……构成”、和“由……构成”。术语“基本上由……构成”指在组合物/反应体系/试剂盒中，除了含有必要成分或必要组份之外，还可含有少量的且不影响有效成分的次要成分和/或杂质。

如本发明所用，术语“有效量”是指可对本发明感兴趣的反应产生功能或酶活性、达到预期效果(准确的检测结果)的量。

适于制备DpnI酶的改造菌株

DpnI表达的受限性极大困扰了生物技术领域对DpnI的生产和应用。鉴于此，本发明提供了一种用于大量制备DpnI酶的大肠杆菌表达菌株，所述菌株的甲基化酶基因Dam缺失；较佳地，所述菌株通过Red重组系统结合Cre-loxP系统介导的基因编辑技术将大肠杆菌的Dam基因进行基因敲除制备获得；更佳地，根据Dam基因的5’端设计重组臂5HR、3’端设计重组臂3HR，建立重组片段Dam-Loxp(较佳地还携带抗性筛选基因)；将编码Red重组酶的DNA引入大肠杆菌，获得表达Red重组酶的重组菌株，进一步引入所述Dam-Loxp，获得甲基化酶基因Dam缺失的大肠杆菌表达菌株。

同时，本发明也提供了一种制备DpnI酶的方法，包括：(1)提供大肠杆菌表达菌株，所述菌株的甲基化酶基因Dam缺失；(2)将编码DpnI酶的DNA引入(1)的菌株中，培养该重组菌株，表达DpnI酶。

使用Red重组系统进行序列重组，可在染色体水平上进行遗传操作技术。同时，本发明中只需较短的同源序列，而不需要特定的限制性酶切位点，即可在生物体内完成重组过程。

DpnI酶突变体、其编码核酸、构建体及应用

本发明的DpnI酶突变体可以是化学合成的产物，或使用重组技术从宿主中产生。例如，本发明中优化了其表达宿主，优选地为大肠杆菌Dam基因敲除菌BL21(DE3)(Dam^-)。

本发明还包括所述DpnI酶突变体的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然DpnI酶突变体相同的生物学功能或酶活性的蛋白。本发明的蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。然而，需要满足的条件是：所述的DpnI酶突变体及其片段、衍生物和类似物的氨基酸序列中，必然存在至少一种本发明上面所特别指出的突变。

在本发明中，术语“DpnI酶突变体”还包括(但并不限于)：若干个(通常为1-20个，更佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个、1-3个、或1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括DpnI酶突变体的酶活性片段和酶活性衍生物。但是在这些变异形式中，肯定存在至少一个本发明上面所述的突变。

在本发明中，术语“DpnI酶突变体”还包括(但并不限于)：与所述的DpnI酶突变体的氨基酸序列具有80％以上，较佳地85％以上，更佳地90％以上，进一步更佳地95％以上，如98％以上、99％以上序列相同性的保留其蛋白酶活性的衍生的蛋白。同样地，这些衍生的蛋白中，肯定存在至少一个本发明上面所述的突变。

发明还提供所述DpnI酶突变体的类似物。这些类似物与所述DpnI酶突变体的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述例举的代表性的蛋白。

本发明还提供了编码本发明DpnI酶突变体或其保守性变异蛋白的多核苷酸序列。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

编码所述突变体的成熟蛋白的多核苷酸包括：只编码成熟蛋白的编码序列；成熟蛋白的编码序列和各种附加编码序列；成熟蛋白的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

“编码蛋白的多核苷酸”可以是包括编码此蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或DpnI酶突变体编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述突变的酶的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的DpnI酶突变体。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码DpnI酶突变体的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，DpnI酶突变体多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。只要能在宿主体内复制和稳定，多种质粒和载体是适用的。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、终止子和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含DpnI酶突变体编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

本发明的优选方式中，所述的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞。更优选地为大肠杆菌。在本发明的具体实施例中，以大肠杆菌作为宿主细胞。

本领域一般技术人员清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子。在本发明的优选方式中，所述表达载体转化的微生物宿主细胞为大肠杆菌。

在适合的反应条件下，DpnI酶可作为限制性内切酶，识别和切割包含GATC位点且其中A发生N6甲基化的核酸。

在获得了本发明的DpnI酶突变体酶后，根据本发明的提示，本领域人员可以方便地应用该酶来发挥限制性内切酶的作用。

DpnI酶可被用于点突变后去除未突变的模板。实验室使用的菌株通常是Dam+菌株，从这样的菌株繁殖的质粒通常含有多个DpnI的识别和切割位点即N6位甲基化的GATC序列，因此会被DpnI酶切降解。应用该原理，就能把点突变后的未突变模板去除。

例如，定点突变后为了实现原始DNA和突变DNA的区分，可以应用DpnI酶。由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌(如DH5α等)，是经Dam甲基化修饰的，对DpnI敏感而被切碎，而体外合成的带突变序列的核酸由于没有甲基化修饰而不被识别和酶切，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到带有突变序列的质粒的克隆。

本发明还提供了一种组合物，它含有有效量的本发明的DpnI酶突变体以及储存液或缓冲液。本领域技术人员可根据组合物的实际用途确定组合物中DpnI酶突变体的有效量。所述的组合物中还可添加进一步调节本发明的DpnI酶突变体酶活性或促进反应进程的其它物质。

为了便于扩大化应用或商业应用，本发明还提供了一种检测体系或检测试剂盒，其中包括：本发明的DpnI酶突变体，或含有其的组合物。

所述的检测试剂盒中，还可包括使用说明书，以指导人们以正确的方法应用本发明的试剂盒。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实验材料、试剂与仪器

大肠杆菌DH5α、大肠杆菌JM110、BL21(DE3)、BL21(DE3)(Dam^-Clone16)、基因定点突变试剂盒、内切酶DpnⅠ，LB培养基相关试剂、抗生素、诱导剂、质粒小量抽提试剂盒、Ni亲和层析柱填料、蛋白浓度检测试剂、96孔板等材料和试剂均为上海碧云天生物技术有限公司的商品化材料/试剂。

PCR仪购自Bio-Rad。

超声波细胞粉碎机购自宁波新芝生物科技股份有限公司。

高压细胞破碎仪购自安拓思纳米技术(苏州)有限公司。

Clinx凝胶成像仪购自上海勤翔科学仪器有限公司。

多功能酶标仪Varioskan LUX购自ThermoFisher。

实施例1、BL21(DE3)(Dam^-)克隆的制备和鉴定

BL21(DE3)(Dam^-)克隆的制备和鉴定过程包括：基因组测序，设计相应的引物并用于BL21(DE3)(Dam^-)和BL21(DE3)这两种菌株的分析和鉴定。步骤如下：

1.在Dam基因的5’端设计重组臂5HR、3’端设计重组臂3HR，以BL21(DE3)基因组为模板，PCR扩增重组片段Dam-Loxp-Kan，乙醇沉淀回收，定量200ng/μl以上；

5HR序列：AATTAGTTAGTCAGCATGAAGAAAAATCGCGCT(SEQ ID NO:3)；

3HR序列：GCTTCTCCTTGAGAATTATTTTTTCGCGGGTGA(SEQ ID NO:4)；

2.将Red重组酶质粒(pkd46)转化BL21(DE3)感受态，挑取克隆，30℃培养至OD＝0.3时加入诱导剂诱导Red重组酶表达，继续培养至OD为0.5时，制备BL21(DE3)-Red重组酶感受态细胞；

3.将适量的重组片段Dam-Loxp-Kan转入BL21(DE3)-Red重组酶(50ul)，加入1ml无抗性LB培养基，30℃复苏1h；

4.复苏后的菌液，3000rpm离心5min，去除大量上清，用少量剩余上清将菌体轻轻重悬，全部均匀涂布在卡那霉素的LB平板上(平板上预先涂布适量的诱导剂)，30℃倒置培养18h；

5.筛选阳性克隆，卡那霉素抗性中培养(命名Dam-Loxp-Kan-BL21(DE3))；

6.将Dam-Loxp-Kan-BL21(DE3)在37℃，卡那霉素抗性中传代培养，验证Amp抗性消失；

7.将Dam-Loxp-Kan-BL21(DE3)制备感受态；

8.将Cre重组酶质粒转入Dam-Loxp-Kan-BL21(DE3)(50μl)，加入1ml无抗性LB培养基，30℃复苏30min；

9.复苏后，取20μl转化产物涂布在Amp⁺LB平板上，30℃倒置培养18h；

10.通过菌落PCR鉴定阳性克隆：

(1)挑取单克隆至1.5ml离心管，加入10μl去离子水，吹打均匀；

(2)引物序列：

Dam-5HR-JD-F:5’-acgacaacctgaacggtt-3’(SEQ ID NO:7)；

Dam-3HR-JD-R:5’-caacatgctcggaggctt-3’(SEQ ID NO:8)；

(3)菌落PCR反应体系：

(4)菌落PCR：

(5)PCR反应结束后，取5μl反应产物，加入1μl DNA Loading Buffer(6X)，进行琼脂糖凝胶电泳(图1)。

10.分别挑BL21(DE3)与BL21(DE3)(Dam^-)的单克隆至1ml无抗性LB液体培养基，37℃220rpm培养过夜；使用基因组DNA小量抽提试剂盒(通用型，离心柱式)(D0063)分别提取菌株BL21(DE3)与BL21(DE3)(Dam^-)的基因组；随后用DpnI分别消化；

(1)DpnI消化反应体系：

(2)DpnI消化反应条件：37℃孵育1h；

(3)消化结束后，加入DNA Loading Buffer(6X)，进行琼脂糖凝胶电泳(图2)。

11.接着以DpnI消化后的BL21(DE3)与BL21(DE3)(Dam^-)基因组为模板，分别进行PCR验证；

(1)以大肠杆菌基因E.coli Exonuclease I为模板设计引物，引物序列为：

exo-1F:5’–GCCACGCCTGTTTGATTATCTCTTTACC-3’(SEQ ID NO:5)；

exo-1R:5’–TCTTCCGCGTACTGCCAAAGTGC-3’(SEQ ID NO:6)；

引物扩增的序列含有可以被Dam甲基化的GATC四碱基序列。

(2)PCR反应体系：

(3)PCR反应程序：

(4)产物进行电泳分析(图3)。

12.将图1筛选出的阳性克隆BL21(DE3)(Dam-)进行测序，测序结果如图4所示。

结论：

根据图1，BL21(DE3)为没有敲除Dam基因的野生型；BL21(DE3)(Dam^-)为敲除了Dam基因的突变体。以BL21(DE3)为模版扩增得到片段大小为1473bp，以BL21(DE3)(Dam^-)为模版扩增得到的片段大小为768bp。成功鉴定出Dam基因敲除的突变体BL21(DE3)(Dam^-)。

BL21(DE3)和BL21(DE3)(Dam-)的基因组分别经DpnI消化前后的对比，根据图2，BL21(DE3)的基因组可以被DpnI消化，而BL21(DE3)(Dam^-)的基因组则不能被DpnI消化，进一步证明了BL21(DE3)(Dam^-)可能成功敲除了Dam基因。

分别用BL21(DE3)和BL21(DE3)(Dam-)没有经过和经过DpnI消化的基因组为模板扩增目的基因片段，根据图3，BL21(DE3)基因组中的Dam基因没有被敲除，所以其经PCR扩增出了816bp的目的片段；而其经DpnI消化后，则不能扩增出目的片段(由于E.coliExonuclease I基因被Dam甲基化，进而被DpnI消化掉)；BL21(DE3)(Dam^-)菌株中Dam基因已被敲除，故DpnI无法消化其基因组，所以消化前后都可以扩增出目的条带。

通过测序进行菌株BL21(DE3)和BL21(DE3)(Dam-)在敲除Dam基因前后的序列对比。根据图4，鉴定得到的阳性克隆BL21(DE3)(Dam^-)基因组的Dam基因被敲除，Dam基因所在的位置被敲除过程中产生的参与序列所取代。

上述分析结果确定，BL21(DE3)菌株中Dam基因被敲除，获得了BL21(DE3)(Dam^-)菌株。

实施例2、基因缺陷菌株的生长速率分析

实施如下的操作步骤以进行BL21(DE3)与Dam基因缺陷菌株BL21(DE3)(Dam^-)的生长速率比较：

1.分别将菌株BL21(DE3)和Dam基因缺陷菌株BL21(DE3)(Dam^-)在无抗性LB固体平板进行划线，之后放置37℃培养箱培养过夜；

2.分别挑单克隆至10ml无抗性LB液体培养基，37℃220rpm培养过夜；

3.分别将过夜菌液按照1％接种至200ml无抗性LB液体培养基，然后37℃220rpm培养，每隔1h用分光光度计检测OD600，测8小时内的生长趋势，每个时间点三个重复；最后以时间为横坐标，以OD600为纵坐标，得到两种菌株的生长曲线图。

分析结果如图5所示，可见菌株BL21(DE3)和Dam基因缺陷菌株BL21(DE3)(Dam^-)的生长趋势无显著差异。

实施例3、DpnI表达菌株的构建以及DpnI的表达

1、BL21(DE3)和BL21(DE3)(Dam^-)的DpnI表达菌株的构建

进行如下操作以构建BL21(DE3)和BL21(DE3)(Dam^-)的DpnI表达菌株：

(1)通过基因合成的方法获得野生型DpnI基因(DNA序列参见SEQ ID NO:1；氨基酸序列参见SEQ ID NO:2)，并通过NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点克隆至pET22b表达载体，并在蛋白的C末端添加6X His纯化标签和终止密码子，即获得pET22b-DpnI质粒；

(2)将表达带有组氨酸标签的pET22b-DpnI质粒分别转化菌株BL21(DE3)和BL21(DE3)(Dam^-)，冰浴30分钟，42℃热击90s，冰浴2分钟，加入500μl LB液体培养基，37℃220rpm培养1小时，8000rpm离心3分钟，去掉上清500μl，将剩余的菌液重悬，分别涂布氨苄抗性平板，放置37℃培养箱培养过夜；

(3)获得的菌株分别命名为BL21(DE3)-DpnI和BL21(DE3)(Dam^-)-DpnI。

2、DpnI的诱导表达和纯化

对BL21(DE3)-DpnI和BL21(DE3)(Dam^-)-DpnI菌株分别进行DpnI的诱导表达和纯化，步骤如下：

(1)分别挑取菌株BL21(DE3)-DpnI和BL21(DE3)(Dam^-)-DpnI的单克隆至10ml LB液体培养基(含氨苄抗性)，37℃220rpm培养过夜；

(2)第二天，分别将两种过夜菌液按照1％接种至1L LB液体培养基(含氨苄抗性)，37℃220rpm培养3小时，取出500μl菌液作为诱导前样品；加入终浓度为1mM的IPTG，37℃诱导3小时，取出500μl菌液作为诱导后样品；

(3)分别将500μl诱导前菌液和500μl诱导后菌液离心10000rpm 5分钟，去掉上清，加入50μl 1X SDS Loading Buffer，沸水浴10分钟，12000rpm离心10分钟，之后分别取10μl进行SDS-PAGE电泳，得到两种菌株诱导DpnI表达前后的实验结果(图6)。

(4)将菌株BL21(DE3)(Dam^-)-DpnI表达组氨酸标签的DpnI的菌液离心6000rpm 10分钟4℃，收集菌体，去除上清培养基，使用预冷的裂解缓冲液1X PBS(135mM NaCl,4.7mMKCl,10mM Na₂HPO₄,2mM NaH₂PO₄,PH7.3)(碧云天，C0221A，PBS)80ml悬浮菌体，使用高压800bar破菌三遍，破菌之后12000rpm离心10min，取50μl上清作为电泳样品，将沉淀用与上清等体积的1X PBS重悬，取50μl重悬菌液作为电泳样品，将上清用滤纸进行过滤，过滤操作在4℃条件下进行；

(5)将过滤后的菌液在重力条件下流穿已提前用裂解液1X PBS平衡的镍柱(碧云天，P2233 BeyoGold^TM His-tag Purification Resin(耐变性剂型))，收集流穿，取50μl流穿作为电泳样品，之后用裂解液清洗杂蛋白；接着分别用含10mM和20mM咪唑的裂解液清洗填料，同时G250检测含10mM和20mM咪唑裂解液的清洗液；收集清洗液并分别取50μl作为电泳样品；

(6)用含250mM咪唑的裂解液进行洗脱，同时用G250进行检测，直至G250不变色即可停止洗脱，收集洗脱液并取50μl作为电泳样品；

(7)分别向50μl上清、沉淀、流穿、不同浓度咪唑对应的电泳样品中加入10μl 6XSDS-PAGE Loading Buffer，混合均匀，沸水浴10分钟，12000rpm离心10分钟，分别取10μl进行SDS-PAGE凝胶电泳检测蛋白表达。电泳结果如图7所示。

(8)将用含高浓度咪唑的裂解液洗脱得到的蛋白使用1X PBS进行4℃过夜透析以去除咪唑；第二天使用相同的透析液再次透析3-4小时，随后进行蛋白浓缩，并通过SDS-PAGE凝胶电泳确定最终的蛋白浓度，并按酶活定义确定所纯化的DpnI的酶活单位(DpnI的酶活定义为：在37℃，50微升反应体系中反应1小时，将1微克的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位，即1U)。

结论：

比较菌株BL21(DE3)-DpnI和BL21(DE3)(Dam^-)-DpnI表达DpnI的效果，如图6所示，菌株BL21(DE3)(Dam^-)-DpnI表达DpnI的水平远远高于菌株BL21(DE3)-DpnI。

如图7所示，用菌株BL21(DE3)(Dam-)菌株表达的DpnI经镍柱纯化可以得到较高产量(约10mg/L)的限制性内切酶DpnI。

实施例4、限制性内切酶DpnI的酶活检测

进行限制性内切酶DpnI的酶活检测，针对的酶切底物为质粒，所述质粒为从DH5α菌株(Dam⁺)中提取的甲基化质粒或从JM110菌株(Dam^-)中提取的非甲基化质粒(将质粒pUC18分别转化DH5α菌株(Dam⁺)和JM110菌株(Dam^-)，之后从DH5α菌株(Dam⁺)中提取甲基化的pUC18质粒，从JM110菌株(Dam^-)中提取非甲基化的pUC18质粒)；包含甲基化或非甲基化的“GATC”位点；方法如下：

1.将纯化得到的限制性内切酶DpnI稀释至10U/μl；

2.配制反应体系：

3.反应条件：37℃孵育1小时；

4.反应结束后，取出5μl反应液，加入1μl 6X DNA Loading Buffer，混合均匀后进行琼脂糖凝胶电泳(1％)，电泳结束后进行凝胶成像检测。

结果如图8所示，用菌株BL21(DE3)(Dam^-)表达纯化得到的限制性内切酶DpnI可以完全消化甲基化质粒(从DH5α菌株(Dam⁺)中提取)，而对非甲基化质粒(从JM110菌株(Dam^-)中提取)没有任何非特异性的酶切作用，说明使用BL21(DE3)(Dam^-)菌株可以表达并纯化出高活性的DpnI。

实施例5、限制性内切酶DpnI的结构分析及突变体构建

1、野生型限制性内切酶DpnI与含有Gm6ATC的双链DNA分子的复合物结构分析

酶与底物结合的三维复合物结构能直观展示蛋白与底物相互作用的区域、底物结合与释放的方式、酶切底物的可能作用机制以及参与底物特异性识别的关键氨基酸位点等信息。

目前PDB蛋白质结构数据库(Protein Data Bank,PDB)有已解析的DpnI空间结构数据(PDB号：4KYW))。

DpnI的N端和C端催化结构域细节展示如图9和图10所示。

图9中，展示了位于限制性内切酶DpnI N端的催化结构域细节。左侧展示了DpnI N端与含有Gm6ATC的双链DNA分子复合物三维结构；DpnI与底物相互作用的局部细节图呈现在右侧。

图10中，展示了位于限制性内切酶DpnI C端的底物特异性识别结合结构域细节。左侧展示了DpnI C端与含有Gm6ATC的双链DNA分子复合物三维结构；DpnI与底物相互作用的局部细节图呈现在右侧。

本发明人结合应用蛋白三维空间结构展示与分析工具对其整体结构进行分析，并进行关键酶活性位点分析，推测可能涉及底物识别与结合、影响催化活性的氨基酸位点，最后在野生型DpnI的基础上构建了一系列定点突变体，并对这些定点突变体进行酶活性检测。

2、DpnI定点突变体的构建

(1)以带His标签的pET22b-DpnI质粒为模板，设计并合成基因定点突变PCR引物，使用QuickMutation^TM基因定点突变试剂盒(碧云天，D0206)进行基因定点突变PCR。

(2)50μl反应体系中包括：29μl nuclease-free water，5μl 10XBeyoFusion^TMBuffer(含Mg²⁺)，10μl dNTP mix(每种2.5mM)，2μl正向引物(10μM)，2μl反向引物(10μM)，1μl pET22b-DpnI质粒(200ng)，和1μl BeyoFusion^TMDNA聚合酶。

(3)PCR程序为：95℃预变性3min；20个循环：95℃30s，55℃30s，68℃3min(30s/kb)；68℃继续延伸15min；4℃forever。

(4)PCR反应结束后，在PCR反应体系中加入1μl DpnⅠ内切酶(碧云天，D6257)，混匀37℃孵育1小时以消化模板质粒。

(5)消化后的PCR产物各取10μl，加到100μl DH5α超级感受态细胞(碧云天，D1031)中，混匀后冰上放置30min，42℃热激90s，冰上孵育2min。

(6)加入900μl无抗性的LB培养基，37℃摇菌1小时。离心收集菌体，用100μl无抗性的LB培养基重悬后，将菌液均匀涂布于含100μg/ml氨苄青霉素(碧云天，ST007)的LB平板上，将平板倒置在37℃培养箱中，培养过夜。

(7)次日，挑单个菌落至10ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，培养过夜。用质粒小量抽提试剂盒(碧云天，D0003)提取各突变体菌液中的质粒，并测定质粒浓度。

(8)利用T7和T7-Terminator通用引物对目的基因进行测序。对于引入多个突变位点的突变体，需要进行多轮定点突变，每轮引入1个或多个位点突变，且每轮都需要经过测序验证确保成功后、进行下一轮。

3、DpnI突变体粗酶的酶活性检测

(1)将野生型pET22b-DpnI质粒或测序正确的DpnI突变质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)(Dam^-Clone16)感受态细胞，并在含氨苄青霉素的LB平板上37℃培养过夜。

(2)次日，挑取单个菌落至1ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm的摇床中培养至OD600值介于0.6-0.8之间，加入终浓度为1mM的IPTG(碧云天，ST098)，37℃诱导蛋白表达。

(3)将培养好的1ml菌液在室温，8000rpm，5分钟条件下进行离心，收集菌体；离心后去除上清，向菌体中加入500μl的BeyoLytic^TM细菌活性蛋白抽提试剂(碧云天，P0013Q)，吹打混匀，室温静置1小时进行充分裂解与抽提蛋白。

(4)充分裂解后的培养物在4℃，12000rpm条件下离心10分钟，并将离心后上清转移到新的1.5ml的离心管中，用于后续粗酶活性检测的初步筛选工作。

(5)取诱导表达好的野生型DpnI及突变体粗酶，在含有甲基化DNA的20μl反应体系中进行酶活检测与比较。20μl反应体系中包括：9μl nuclease-free water，2μl 10XReaction Buffer(含Mg²⁺)，1μl DpnI粗酶，8μl甲基化质粒(400ng)。反应程序为：37℃孵育一小时进行底物酶切反应，85℃孵育20分钟进行终止反应。

(6)取10μl反应后产物加入2μl DNA上样缓冲液(6X)(碧云天，D0071)，进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，拍照观察结果，并比较分析不同DpnI突变体与对照野生型DpnI间的酶活差异。

如图11A所示，野生型DpnI及各DpnI突变体对提取自JM110的非甲基化质粒均不能进行有效酶切；对提取自DH5α菌株的甲基化质粒均有不同程度的酶切效果。如图11B所示，不同的DpnI突变体对甲基化质粒的酶切效率不同；与野生型DpnI相比，部分DpnI突变体的酶切效率呈现50-700％等不同程度的明显提高。

4、高酶活性DpnI突变体的纯化

(1)根据粗酶活性检测的初步结果，筛选酶活性有显著提高的12个DpnI突变体，和对照野生型DpnI在BL21(DE3)(Dam^-Clone16)菌株中各表达500ml。

(2)具体的表达和纯化步骤同前述的野生型DpnI的诱导表达和纯化步骤。

(3)利用Bradford蛋白浓度测定试剂盒(去垢剂兼容型)(碧云天，P0006)测定蛋白浓度，并通过SDS-PAGE进行电泳检测(图12A)，保证各DpnI样品中的蛋白含量一致，用于后续酶活性检测与比较，分装好的蛋白经液氮速冻后储存在-80℃。

5、纯化的野生型DpnI与各高活性DpnI突变体酶活性检测比较

(1)根据前期蛋白浓度测定结果和SDS-PAGE电泳检测结果，将DpnI突变体和野生型DpnI使用酶储存液分别稀释至0.03mg/ml，随后再次进行10，15，20，30，40倍的稀释。

(2)用再次稀释后的样品进行酶活性检测与比较。使用DH5α菌株中提取的带有甲基化修饰的质粒作为底物，20μl反应体系中包括：9μl nuclease-free water，2μl 10XReaction Buffer(含Mg²⁺)，1μl DpnI蛋白样品，8μl甲基化质粒(400ng)。反应程序为：37℃孵育1小时进行底物酶切反应，85℃孵育20分钟进行终止反应。

(3)取10μl反应后产物加入2μl DNA上样缓冲液(6X)(碧云天，D0071)，进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，拍照观察结果，并比较分析不同DpnI突变体与对照野生型DpnI间的相对酶活差异(图12B)。

与对照野生型DpnI相比，其余12个DpnI突变体的酶活性均有明显提高，约为对照野生型的1.5-8倍。该酶活性检测结果与前期粗酶活性检测结果基本一致。

实施例6、酶活性显著改善的DpnI各突变位点三维结构预测与野生型DpnI结构对比分析

根据实施例5筛选到的高活性的DpnI突变体，使用蛋白结构预测工具对12个酶活性显著提高的DpnI突变体进行结构预测。并使用蛋白结构展示与分子工具蛋白三维空间结构展示与分析工具对DpnI突变体与野生型DpnI结构进行对比分析，阐述突变位点改善酶活的作用的潜在机制。

酶活有显著改善的DpnI各突变位点的三维结构预测与DpnI-WT结构对比与分析结果如图13所示。突变体与野生型整体上具有相同的拓扑构象，结构相似性较高(RMSD＝0.376)，且负责底物结合的空间区域一致。从两个不同的方向对DpnI N端的催化结构域与C端结构域进行细节展示，显示了各位点突变前后的差异。同时，对最优突变位点N223Q进行进一步的空间细节展示，突变后其氨基酸侧链与底物DNA的空间距离更近，对DNA的相互作用力明显增强。该结果提示，对底物亲和性增加可能是该突变体酶活力显著提高的重要原因。

实施例7、最优突变体M63(N223Q)与野生型DpnI的底物酶切及酶切后产物转化测试

1.用酶储存液将野生型DpnI及DpnI最优突变体M63(N223Q)的蛋白浓度稀释至0.95mg/ml，随后将野生型DpnI再次稀释50，100，160，240，400，560，800倍，将DpnI突变体M63(N223Q)再次稀释400，800，1280，1920，3200，4480，6400倍。

2.使用稀释后的样品进行甲基化质粒的酶切检测。在含有甲基化质粒的20μl反应体系中进行酶活检测与比较。20μl反应体系中包括：9μl nuclease-free water，2μl 10XReaction Buffer(含Mg²⁺)，1μl DpnI蛋白样品，8μl DH5α菌株中提取的甲基化修饰的质粒(400ng)。反应程序为：37℃孵育1小时进行底物酶切反应，85℃孵育20分钟进行终止反应。

3.取10μl反应后产物加入2μl DNA上样缓冲液(6X)(碧云天，D0071)，进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，比较分析DpnI N223Q突变体与野生型DpnI间的酶活差异(图14A)。

4.取各酶切反应后的产物5μl分别转化DH5α感受态细胞然后涂板，37℃培养过夜。第二日观察野生型DpnI与DpnI N223Q突变体分别酶切甲基化质粒后的产物转化所产生的克隆数比较(图14B)。

不同稀释倍数下野生型DpnI与最优突变体M63(N223Q)的酶切效果如图14A所示，0.95mg/ml的野生型DpnI和0.95mg/ml的DpnI N223Q在稀释倍数相差8倍的情况下，酶切活性表现基本一致。因此，DpnI N223Q突变体的酶活是野生型DpnI的8倍。

对应稀释倍数下酶切反应后的产物转化效果如图14B所示，此结果也再次验证了最优活性的DpnI N223Q突变体的酶活是野生型DpnI的8倍。

实施例总结

通过Red重组系统结合Cre-loxP系统介导的基因编辑技术将BL21(DE3)菌株的Dam基因进行基因敲除，成功获得能用于限制性内切酶DpnI高产量表达制备的大肠杆菌Dam基因敲除菌BL21(DE3)(Dam^-)。

通过使用蛋白三维空间结构展示与分析工具对已公布的野生型限制性内切酶DpnI与含有Gm6ATC的双链DNA分子的复合物结构进行分析，考虑了大量涉及酶活的关键氨基酸位点，结合定点突变，设计并筛选构建了一系列DpnI突变体。经过筛选分析，对其中12个酶活性较高的突变体进行了表达纯化和酶活测定。

经检测，与对照野生型DpnI相比，所有12个纯化的突变体的酶活性都显著提高。其中M63(N223Q)的酶活性提高最为显著，选择以这个酶突变体为例，发现可以很好地用于基因定点突变反应中甲基化质粒的去除，进而可以广泛应用于涉及基因突变的相关试剂盒中。

序列信息

野生型DpnI的DNA序列(SEQ ID NO:1)：

ATGGAATTACACTTTAATTTAGAATTAGTAGAAACCTATAAAAGTAATAGCCAAAAGGCACGTATCTTAACGGAGGATTGGGTTTATCGTCAGTCTTATTGCCCTAATTGTGGGAACAATCCCTTAAATCATTTTGAAAATAATCGGCCTGTAGCAGATTTTTACTGTAATCATTGTAGTGAGGAGTTTGAACTAAAGAGCAAAAAAGGAAATTTTTCATCAACAATCAATGATGGTGCTTATGCAACGATGATGAAGCGTGTGCAGGCAGATAATAATCCTAATTTCTTTTTTTTAACTTACACAAAAAATTTTGAGGTAAATAACTTTCTTGTCCTTCCGAAGCAATTTGTTACACCGAAATCGATTATTCAAAGAAAACCACTTGCACCAACTGCTAGACGAGCAGGTTGGATTGGTTGTAACATTGATTTATCACAAGTACCTTCTAAAGGAAGGATATTTCTTGTGCAAGATGGACAAGTTAGAGATCCAGAAAAAGTTACAAAAGAATTTAAGCAAGGTTTATTTTTAAGGAAGAGCTCTCTGTCATCAAGAGGTTGGACAATAGAAATTCTAAATTGTATAGATAAGATAGAGGGTTCAGAATTTACCCTTGAAGATATGTATCGTTTTGAAAGTGACCTAAAAAATATCTTTGTTAAGAACAATCATATCAAAGAAAAGATTAGGCAACAGCTTCAAATATTAAGAGACAAAGAAATAATAGAATTTAAAGGTAGAGGAAAGTATCGGAAATTATGA

野生型DpnI酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)：

M2(Y210W)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第210位由Y突变为W。

M19(Y13L)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第13位由Y突变为L。

M28(N16K)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第16位由N突变为K。

M37(N71K)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第71位由N突变为K。

M39(T100W)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第100位由T突变为W。

M63(N223Q)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第223位由N突变为Q。

M78(F72W)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第72位由F突变为W。

M83(F245Y)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第245位由F突变为Y。

M98(L206F)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第206位由L突变为F。

M101(I76F)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第76位由I突变为F。

M102(A82K)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第82位由A突变为K。

M108(T100F)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第100位由T突变为F。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种高效制备DpnI酶的方法，包括：

(1)提供大肠杆菌表达菌株，所述菌株的甲基化酶基因Dam缺失；

(2)将编码DpnI酶的DNA引入(1)的菌株中，培养该重组菌株，表达DpnI酶；

其中，所述DpnI酶为突变型DpnI酶或野生型DpnI酶。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，通过Red重组系统结合Cre-loxP系统介导的基因编辑技术将大肠杆菌的Dam基因进行基因敲除；

较佳地，根据Dam基因的5’端设计重组臂5HR、3’端设计重组臂3HR，建立重组片段Dam-Loxp；将编码Red重组酶的DNA引入大肠杆菌，获得表达Red重组酶的重组菌株，进一步引入所述Dam-Loxp，获得甲基化酶基因Dam缺失的大肠杆菌表达菌株。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DpnI酶为突变型DpnI酶，对应于野生型DpnI酶的氨基酸序列，具有以下突变：

A.选自(a)-(k)的突变或其组合：

(a)第223位由N突变为Q；

(b)第100位由T突变为W或F；

(c)第71位由N突变为K；

(d)第72位由F突变为W；

(e)第206位由L突变为F；

(f)第210位由Y突变为W；

(g)第76位由I突变为F；

(h)第13位由Y突变为L；

(i)第16位由N突变为K；

(j)第82位由A突变为K；

(k)第245位由F突变为Y；

B.将A蛋白的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有A蛋白功能的由A衍生的蛋白，但对应于A中(a)-(k)所限定的位点是保守的；

C.与A蛋白的氨基酸序列有80％以上同源性且具有A蛋白功能的由A衍生的蛋白，但对应于A中(a)-(k)所限定的位点是保守的。

4.一种突变型DpnI酶，对应于野生型DpnI酶的氨基酸序列，其具有以下突变：

A.选自(a)-(k)的突变或其组合：

(a)第223位由N突变为Q；

(b)第100位由T突变为W或F；

(c)第71位由N突变为K；

(d)第72位由F突变为W；

(e)第206位由L突变为F；

(f)第210位由Y突变为W；

(g)第76位由I突变为F；

(h)第13位由Y突变为L；

(i)第16位由N突变为K；

(j)第82位由A突变为K；

(k)第245位由F突变为Y；

5.一种提高DpnI酶的酶活性的方法，所述方法通过点突变进行，包括：将DpnI酶进行突变改造，形成权利要求4所述的突变型DpnI酶。

6.一种多核苷酸、含有该多核苷酸的载体或遗传工程化的宿主细胞，所述的多核苷酸编码权利要求4所述的突变型DpnI酶；所述宿主细胞中含有所述载体或其基因组中整合有所述的多核苷酸。

7.权利要求4所述的突变型DpnI酶、表达该突变体的宿主细胞或其裂解产物的用途，用于作为限制性内切酶，识别和切割DNA双链中腺嘌呤N6位甲基化的GATC序列。

8.一种特异性识别和切割包含GATC位点且其中A发生N6位甲基化的核酸的方法，包括：利用权利要求4所述的突变型DpnI酶、表达该突变体的宿主细胞或其裂解产物进行切割。

9.一种用于识别和切割包含GATC位点且其中A发生N6位甲基化的核酸的反应体系或试剂盒，其中含有权利要求4所述的突变型DpnI酶、表达该突变体的宿主细胞或其裂解产物；较佳地，所述试剂盒中含有DpnI酶突变体或编码其的多核苷酸的文库，所述文库包括1～12种所述DpnI酶突变体或编码其的多核苷酸。

10.一种用于制备DpnI酶的大肠杆菌表达菌株，所述菌株的甲基化酶基因Dam缺失；较佳地，所述菌株通过Red重组系统结合Cre-loxP系统介导的基因编辑技术将大肠杆菌的Dam基因进行基因敲除制备获得；更佳地，根据Dam基因的5’端设计重组臂5HR、3’端设计重组臂3HR，建立重组片段Dam-Loxp；将编码Red重组酶的DNA引入大肠杆菌，获得表达Red重组酶的重组菌株，进一步引入所述Dam-Loxp，获得甲基化酶基因Dam缺失的大肠杆菌表达菌株。