CN117417995A - 一种基于荧光淬灭的固态纳米孔测序方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种基于荧光淬灭的固态纳米孔测序方法和应用。该方法包括：S1，将包含待测核酸片段的测序文库添加到纳米孔测序装置中电解池的正极腔室；S2，在电解池的正极和负极之间施加易位电压，使待测核酸片段穿过固态纳米孔薄膜上的固态纳米孔通道；其中固态纳米孔薄膜设置于电解池的正极和负极之间，以将电解池分隔成正极腔室和负极腔室，且固态纳米孔通道内修饰有荧光基团；S3，捕捉待测核酸通过固态纳米孔通道时发出的荧光信号和离子电流变化信号；S4，对捕捉的荧光信号和离子电流变化信号进行分析，进而确定待测核酸片段的碱基序列。该方法将光学检测和固态纳米孔检测相结合，能高通量、快速、准确、低成本对核酸进行大规模测序。
Description
技术领域
本申请涉及基因组测序技术领域，尤其是涉及一种基于荧光淬灭的固态纳米孔测序方法和应用。
背景技术
DNA测序技术已经彻底改革了生物科学，并且具有彻底改革医疗实践的许多方面的可能性，不仅为遗传信息的揭示和基因表达调控等基础生物学研究提供重要数据，而且在基因诊断和基因治疗等应用研究中也发挥着重要的作用。传统测序技术以末端终止法为核心的Sanger测序法，这种方法费时费力，需要大量的技术人员参与，耗费大量财力。开发高通量、全自动化而且价格便宜的测序仪器目前正在全世界展开激烈的科技和商业竞赛。国际顶尖科技公司都在开发各种高通量并行化的测序技术，以达到降低测序成本，推动广泛应用的目的。高通量基因测序市场也迅速成为整个生物医学领域新的增长点。
纳米孔测序技术被认为是最有可能成为下一代基因测序的技术之一，它不仅有可能将目前的DNA序列分析的成本大大降低，分析速度大大提高，还将推进基于基因组技术的个性化医学向现实迈进一步，从而引起医学界的一次变革。固态纳米孔测序技术作为新兴的第四代DNA测序技术，具有低成本、高读长、易集成的特点，在成本、速度等方面有着十分巨大的优势。
固态纳米孔测序技术的测量方式通常采用膜片钳直流恒电位模式来记录离子的电导电流。分析物穿过纳米孔时，会引起孔道内部电解质环境的改变而产生脉冲离子电导电流的变化，这种电导电流变化的大小和持续的时间反映了分析物穿过纳米孔的信息。通过对大量脉冲电流的统计分析可实现对分析物的检测。
目前，固态纳米孔测序技术采用的直流恒电位测量模式获取的信号比较单一，在数据分析时缺乏分子穿孔机理与结构信息；并且，获取的电信号一般为单通道记录结果，难以实现未来的高通量检测的目标。因此，在纳米孔单分子检测获得离子电导电流及阻断时间的过程中，若能够提供更多的单分子成像信息，将有利于研究单分子与纳米孔的相互作用，丰富实时追踪穿孔过程与穿孔动力学信息。
核苷酸的光学检测已经作为纳米孔测序领域中的一些技术困难的潜在的解决方案被提出。然而，由于多种原因，基于光学的纳米孔测序并未被实现，所述多种原因包括缺乏合适的制造技术以及缺乏对此类系统的元件如何相互作用的认识。鉴于上述内容，需要开发一种将光学与纳米孔相结合的检测方式。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本申请提供一种基于荧光淬灭的固态纳米孔测序方法，该方法在固态纳米孔通道内修饰荧光基团，通过拍照的方式获得核酸过孔时的荧光信号，进而可以更直观、快速地分析碱基信号；同时通过将核酸的光学检测和固态纳米孔检测相结合，能高通量、快速、准确、低成本对核酸进行大规模测序。
为此，本申请第一方面提供了一种基于荧光淬灭的固态纳米孔测序方法，所述方法包括以下步骤：
S1，将包含待测核酸片段的测序文库添加到纳米孔测序装置中电解池的正极腔室；
S2，在所述电解池的正极和负极之间施加易位电压，使所述待测核酸片段穿过固态纳米孔薄膜上的固态纳米孔通道；其中所述固态纳米孔薄膜设置于所述电解池的正极和负极之间，以将所述电解池分隔成正极腔室和负极腔室，且所述固态纳米孔通道内修饰有荧光基团；
S3，捕捉所述待测核酸通过所述固态纳米孔通道时发出的荧光信号和离子电流变化信号；
S4，对捕捉的所述荧光信号和离子电流变化信号进行分析，进而确定所述待测核酸片段的碱基序列。
本申请所述方法，在固态纳米孔通道内修饰荧光基团，由于碱基本身具有荧光淬灭能力、且不同的碱基对同一种荧光基团的淬灭能力不同，因此当待测核酸片段进行穿孔时，由于核酸片段上碱基的变化进而会呈现不同的荧光信号，该荧光信号能够更直观地展示出碱基信号。本申请通过对荧光信号和纳米孔电化学检测时的离子电流变化信号进行同步采集，根据获得的荧光信号和离子电流变化信号能够更为快速、准确地确定待测核酸片段的碱基序列。
具体地，本申请所述方法采用的纳米孔测序装置包括：设有正极和负极的电解池，以及设置于所述电解池的正极和负极之间的固态纳米孔薄膜，所述固态纳米孔薄膜将所述电解池分隔成正极腔室和负极腔室；所述包含待测核酸片段的测序文库添加电解池的正极腔室内，检测时通过在正极和负极之间施加易位电压可以驱动待测核酸片段穿过固态纳米孔薄膜上的固态纳米孔通道。
本申请中，所述电解池中添加有电解质缓冲液，使待测核酸片段的穿孔过程在具有一定pH值的反应缓冲液中进行。在一些实施方式中，所述电解质缓冲液的pH值可以为7.0～8.0，所述电解质缓冲液中可以包括：0.2～0.4M的KCl、10～15mM的HEPES、10～15mMMgCl2和10～15mM的(NH4)2SO4。在一些优选的实施方式中，所述电解质缓冲液的pH值为7.5，所述电解质缓冲液中包括：0.3M的KCl、10mM的HEPES、10mM MgCl2和10mM的(NH4)2SO4。
在一些实施方式中，步骤S1中还将聚合酶添加至所述正极腔室内；所述聚合酶为phi29 DNAP。
本申请中通过将聚合酶与包含待测核酸片段的测序文库一起添加到，这样聚合酶和待测核酸片段所形成的复合物可以通过电泳被一起吸附到固态纳米孔通道的孔口，这样聚合酶可以控制待测核酸片段穿过固态纳米孔通道的易位速度，避免待测核酸片段穿孔速度过快，超出了仪器的分辨率，从而无法实现对单碱基差别的识别。
本申请中的聚合酶选用phi29 DNAP，其能更好地与待测核酸片段复合并控制其穿孔时的易位速度。本申请中phi29 DNAP添加量可以为5～10U，将添加量控制在上述范围内即可实现其对待测核酸片段穿孔速度的控制。
在一些实施方式中，所述固态纳米孔通道边缘修饰有两亲性分子材料。
本申请中，固态纳米孔通道边缘所修饰的两亲性分子材料能够与聚合酶phi29DNAP结合，进而能将聚合酶phi29 DNAP有效固定在固态纳米孔通道边缘处，避免待测核酸片段穿孔过程中聚合酶phi29 DNAP脱离固态纳米孔通道边缘，进而更稳定地控制待测核酸片段穿孔时的易位速度。
本申请中，所述两亲性分子材料可以为磷脂类、嵌段共聚物类等。例如，磷脂类可以为二植酰磷脂酰胆碱(1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DPhPC)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(Distearoyl phosphoethanolamine，DSPE)等；嵌段共聚物类可以为两嵌段共聚物(Diblock Copolymers，DBCP)和三嵌段共聚物(Tri-block Copolymer，TBCPT)等，二嵌段共聚物例如为苯乙烯-丁二烯共聚物，三嵌段共聚物例如为苯乙烯-丁二烯-3-氯丙烯共聚物。
在一些实施方式中，步骤S2中，所述易位电压为+170mV～+190mV。
在一些优选的实施方式中，所述易位电压为+180mV。
本申请通过将易位电压控制在上述范围内，有助于驱动待测核酸片段以更适宜的速度穿过固态纳米孔薄膜上的固态纳米孔通道。
在一些实施方式中，步骤S1中，所述测序文库中还包括DNA模板链、引物和阻断剂链；所述DNA模板链、引物和阻断剂链的摩尔比为(1.0～1.5):(1.0～1.5):(1.0～1.5)。
本申请在测序文库构建的时候除了需要添加待测核苷酸片段外，还需要添加DNA模板链、引物和阻断剂链，通过添加DNA模板链、引物和阻断剂链能有效“牵引”待测核苷酸片段至固态纳米孔通道的孔口处进行穿孔运动，同时所添加DNA模板链、引物和阻断剂链还能使待测核苷酸片段仅单链穿过固态纳米孔通道。
本申请中，所述DNA模板链的序列例如可以为：iSp8iSp8i Sp8iSp8iSp8iSp8iSp8iSp8iSp8iSp8iSp8iSp8iSp8iSp8iSp8iSp8iSp8iSp8-5’-ACTGTCGT-iSp18iSp18iSp18iSp18iSp18iSp18iSp18iSp18iSp18iSp18-CGATGCTAGCTACTACGATCGATCTTT-3’，序列中的iSp8为间隔片；如SEQ ID NO.1所示，其中序列表中SEQ ID NO.1省去了DNA模板链的序列中的间隔片。所述引物的序列例如可以为：iSpC3iSpC3iSpC3iSpC3iSpC3iSpC3iSpC3iSpC3iSpC3iSpC3iSpC3iSpC3-5’-GTTTGATCGTAG TAGCTAGCTCTACTAGTA-3’，序列中的iSpC3为间隔片，如SEQ ID NO.2所示，其中序列表中SEQ ID NO.2省去了引物序列中的间隔片。所述阻断剂链的序列例如可以为5’-GGATCAGCCCCTTCG-3’，如SEQ ID NO.3所示。
本申请中上述DNA模板链、引物和阻断剂链均可以通过常规的合成机构进行合成，且上述DNA模板链、引物和阻断剂链可以通用，进行不同种待测核苷酸片段测序时均可以使用。
本申请对测序文库中待测核苷酸片段的含量没有明确限定，一般地待测核苷酸的终浓度控制在10μM左右即可使用。
在一些实施方式中，所述测序文库的制备方法包括：将所述待测核酸片段、DNA模板链、引物和阻断剂链添加至缓冲液中进行混合获得混合物；将所述混合物于90～95℃孵育2～5min，然后再以-5℃/min～-8℃/min的速度冷却至20～25℃，制得所述测序文库。
在一些具体实施方式中，将所述混合物于95℃孵育2min，然后再以-5℃/min的速度冷却至25℃，制得所述测序文库。通过上述退火处理，能使待测核苷酸片段与上述序列进行有效复合，进而更为有效地发挥上述序列的作用。
在一些实施方式中，步骤S1中还将dNTPs添加至所述正极腔室内。所添加的dNTPs可以为待测核苷酸片段的移动提供能量，所添加的dNTPs的量可以使其在电解质缓冲液中的终浓度为200～250μM。
在一些实施方式中，所述纳米孔测序装置的上方设置有荧光拍照装置，用于捕捉所述荧光信号；所述电解池上还电连接有膜片钳放大器，用于捕捉所述离子电流变化信号。
本申请中，膜片钳放大器的型号可以为膜片钳放大器Axopatch 200B(MolecularDevice Inc.)，膜片钳放大器中采集移位和对接信号的装置可以采用5khz四极贝塞尔低通滤波器，采样频率为25khz。
在一些实施方式中，所述荧光基团选自FAM、VIC、TET、JOE和HEX中的任意一种。
本申请中，上述荧光基团均可以为碱基发生反应，进而对荧光基团发出的荧光进行淬灭，且不同碱基对上述同一种荧光基团的淬灭能力不同，因此利用上述荧光基团可以有效展示核酸片段上碱基的变化进而呈现的不同荧光信号。
在一些实施方式中，所述固态纳米孔薄膜为通道孔径为2～10nm硅基固态纳米孔薄膜。
本申请中，采用的硅基固态纳米孔薄膜在稳定性、电流噪声、工艺集成方面有着显著的优势，其通道的孔径控制在2～10nm，例如5nm，可以允许单链核苷酸分子顺利通过。
本申请中，所述方法在检测过程中，可以将整个检测装置放置在置有铜箱的法拉第笼内，以尽量减少外部电磁噪声的耦合。
本申请第二方面提供了一种如本申请第一方面所述的方法在对核酸分子进行测序中的应用，所述核酸分子选自DNA、RNA和肽核酸中的任意一种。
本申请所述基于荧光淬灭的固态纳米孔测序方法能够结合待测核酸片段穿孔时的荧光信号和离子电流变化信号对待测核酸片段的碱基序列进行确定，能够更为快速、直观、准确地确定待测核酸片段的碱基序列，因此能较好地应用于对核酸分子的测序中，且待检测的核酸分子可以为DNA、RNA或肽核酸，应用更为广泛。
本申请的有益技术效果为：本申请所提供的基于荧光淬灭的固态纳米孔测序方法，在固态纳米孔通道内修饰荧光基团，这样可以通过拍照的方式获得核酸过孔时的荧光信号，进而可以更直观、快速地分析碱基信号；同时检测过程中通过特定的聚合酶控制核酸穿过固态纳米孔通道的易位速度，有效避免待测核酸片段穿孔速度过快。本申请所提供的方法将核酸的光学检测和固态纳米孔检测相结合，能高通量、快速、准确、低成本对核酸进行大规模测序，这对于通常的纳米孔传感器技术和其特定应用包括测序将是一个新方向。
附图说明
图1为本申请实施例1中所采用的固态纳米孔薄膜上通道孔径的扫描电镜图。
图2为实施例1中被FAM荧光基团和两亲性分子材料DPhPC修饰后的固态纳米孔薄膜的固态纳米通道的结构示意图。
图3为实施例2中测序文库和phi29 DNAP形成的复合物被固态纳米孔薄膜捕获后的结构示意图。
图4为实施例2中经检测后获得的离子电流变化信号结果图。
其中，附图中的附图标记的含义为：1-硅基固态纳米孔薄膜；2-两亲性分子材料DPhPC；3-FAM荧光基团(其中图2中的FAM荧光基团发有荧光，图3中的FAM荧光基团的荧光被淬灭)；4-聚合酶phi29 DNAP；5-待检测的DNA片段；6-荧光拍照装置。
具体实施方式
为使本申请更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本申请，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本申请的应用范围。本申请中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。
实施例1：测序装置的配置
1.固态纳米孔薄膜的通道内荧光基团的修饰
本实施例中采用的固态纳米孔薄膜为通道孔径为5nm硅基固态纳米孔薄膜，其通道孔径的扫描电镜图如图1所示。将装有6-FAM(6-羧基荧光素)荧光基团的离心管于4000rpm下离心60s，小心开启管盖，以免粉末飞扬引起损失，在上述离心管中加入适量的0.1M NaOH溶液配成10mg/mL的储存原液，涡旋震荡混匀使其充分溶解。配制的储存原液透明至略带雾状，橙色，暂时不用放入-4℃储存。取部分储存原液用适量的缓冲液(0.3M KCl、10mM HEPES、10mM MgCl2和10mM(NH4)2SO4，pH 7.5)配成1mg/mL，然后将该溶液后注入到附着在固态纳米孔薄膜两侧的两个入口孔中，并保存1小时，用荧光基团修饰壁面，然后用PBS洗涤纳米孔，制得通道内修饰FAM荧光基团的固态纳米孔薄膜。
2.装置的组装
在通道内修饰FAM荧光基团的固态纳米孔薄膜的小孔上滴加5μL正癸烷含量为10％的正癸烷/正戊烷溶液进行亲油预处理，待正戊烷完全挥发以后，将该固态纳米孔薄膜安装在定制的电解池中，将电解池分隔成正极腔室和负极腔室，正极腔室和负极腔室内均添加50μL的电解质缓冲液(0.3M KCl、10mM HEPES、10mM MgCl2和10mM(NH4)2SO4，pH 7.5)，且两个腔室都与单独的Ag/AgCl电极接触，并电连接到膜片钳放大器Axopatch 200B(分子器件)，形成一个闭合电路按照惯例，正极腔是电气接地的。此时小孔区域不要有多余的油残留，膜片钳检测还是可以测到电流的(施加偏置电压为0mV时，膜两侧依然有一个较小的电势差)；如果小孔被过多的油堵住，可以用移液器吸取电解质缓冲液对着孔口的位置缓慢地把多余的油吹开。然后向正极腔室和负极腔室内电解质缓冲液液面上各滴加一小滴(5μL)的10mg/ml的DPhPC戊烷溶液，待戊烷完全挥发后，先从一侧腔室(如正极腔室)的底部吸走电解质缓冲液将液面上的单层磷脂在经过小孔时通过气液界面转移到孔上，然后将电解质缓冲液缓缓注回使液面再次升到小孔的上方。在两侧腔室(正极腔室和负极腔室)反复提拉液面多次后，即可形成脂双层并完全封住小孔，进而在固态纳米孔薄膜通道的边缘修饰上两亲性分子材料DPhPC，此时电流降到接近0pA。修饰后的固态纳米孔薄膜的固态纳米通道的结构示意图如图2所示。
装置内的膜片钳放大器Axopatch 200B(Molecular Device Inc.)用于测量系统中的离子电流变化，移位和对接信号采用5khz四极贝塞尔低通滤波器，采样频率为25khz。在组装后的固态纳米孔测序装置上放设置荧光拍照装置，用于通过荧光拍照装置对碱基过孔时的荧光图像信号进行采集。
实施例2：采用基于荧光淬灭的固态纳米孔测序方法对待测核苷酸片段的检测(1)测序文库的构建
将待检测的DNA片段、DNA模板链、引物和阻断剂链在缓冲液(0.3M KCl、10mMHEPES、10mM MgCl2和10mM(NH4)2SO4)中混合，获得混合物；其中DNA模板链、引物和阻断剂的摩尔比为1:1:1.2，且DNA模板链、引物和阻断剂的具体序列如表1所示。对混合物进行热退火处理，具体为：将混合物在95℃下孵育2min，程序以-5℃/min的速度冷却至25℃，进而获得固态纳米孔测序可读的DNA测序文库。
表1
注，DNA模板链序列中的iSp8为间隔片，序列表中SEQ ID NO.1省去了DNA模板链序列中的间隔片；引物序列中的iSpC3为间隔片，序列表中SEQ ID NO.2省去了引物序列中的间隔片。
(2)荧光测序
将制备的测序文库、dNTPs和phi29 DNA聚合酶(DNAP)(5U)加入到电解池的正极腔室并进行磁搅拌；其中，待检测的DNA片段在电解质缓冲液中的终浓度为10uM，DNA模板链、引物和阻断剂链在电解质缓冲液中的总终浓度为5nM、dNTPs在电解质缓冲液中的终浓度为250Mm。在电解池的正负极之间持续应用+180mV的易位电压，使测序文库和phi29DNAP的复合物被孔电泳捕获，复合物被固态纳米孔薄膜捕获后的结构示意图如图3所示。如图3所示，当待检测的DNA片段被孔捕获时，阻断剂链被纳米孔解压缩从待检测的DNA片段上分离出来，接着，当DNA片段上不同碱基通过纳米通道时与荧光基团发生反应，荧光被淬灭，且不同的碱基对荧光基团的淬灭能力不同，进而生成不同的荧光信号，随后生成的荧光信号被荧光拍照装置捕获，从而获得待检测DNA片段的荧光信号。同时在DNA片段进行穿孔的过程中同步采用膜片钳放大器Axopatch 200B(Molecular Device Inc.)测量系统中的离子电流变化信号，其中的移位和对接信号采用5khz四极贝塞尔低通滤波器进行，采样频率为25khz，最终获得的离子电流变化信号结果如图4所示。根据获得的离子电流变化信号和荧光信号，通过分析即可确定所述待测的DNA片段的碱基序列。测序过程中，整个装置被放置在置有铜箱的法拉第笼内，以尽量减少外部电磁噪声的耦合。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本申请，并不构成对本申请的任何限制。通过参照典型实施例对本申请进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本申请权利要求的范围内对本申请作出修改，以及在不背离本申请的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本申请涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本申请限于其中公开的特定例，相反，本申请可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
Claims (10)
1.一种基于荧光淬灭的固态纳米孔测序方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1，将包含待测核酸片段的测序文库添加到纳米孔测序装置中电解池的正极腔室；
S2，在所述电解池的正极和负极之间施加易位电压，使所述待测核酸片段穿过固态纳米孔薄膜上的固态纳米孔通道；其中所述固态纳米孔薄膜设置于所述电解池的正极和负极之间，以将所述电解池分隔成正极腔室和负极腔室，且所述固态纳米孔通道内修饰有荧光基团；
S3，捕捉所述待测核酸通过所述固态纳米孔通道时发出的荧光信号和离子电流变化信号；
S4，根据捕捉的所述荧光信号和离子电流变化信号确定所述待测核酸片段的碱基序列。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中还将聚合酶添加至所述正极腔室内；所述聚合酶为phi29 DNAP。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述固态纳米孔通道边缘修饰有两亲性分子材料。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述易位电压为+170mV~+190mV。
5. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述测序文库中还包括DNA模板链、引物和阻断剂链；所述DNA模板链、引物和阻断剂链的摩尔比为（1.0~1.5）: （1.0~1.5）:（1.0~1.5）。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述测序文库的制备方法包括：将所述待测核酸片段、DNA模板链、引物和阻断剂链添加至缓冲液中进行混合获得混合物；将所述混合物于90~95℃孵育2~5min，然后再以-5℃/min ~-8℃/min的速度冷却至20~25℃，制得所述测序文库。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述纳米孔测序装置的上方设置有荧光拍照装置，用于捕捉所述荧光信号；所述电解池上还电连接有膜片钳放大器，用于捕捉所述离子电流变化信号。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述荧光基团选自FAM、VIC、TET、JOE和HEX中的任意一种。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述固态纳米孔薄膜为通道孔径为2~10nm硅基固态纳米孔薄膜。
10.一种如权利要求1-9中任意一项所述的方法在对核酸分子进行测序中的应用，所述核酸分子选自DNA、RNA 和肽核酸中的任意一种。
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