CN117412756A - 磷霉素和粘菌素联合用于抗生物膜相关的细菌感染 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及粘菌素和磷霉素的协同药理抗生物膜联合，其用于治疗由优选处于生物膜生长期的选自鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌和肺炎克雷伯菌菌株的形成生物膜的病原体引起的细菌感染，特别是与呼吸道疾病相关的感染，诸如包括CF、NCFB和COPD在内的慢性呼吸道疾病，尤其是在住院患者中。

Description

磷霉素和粘菌素联合用于抗生物膜相关的细菌感染
技术领域
本发明涉及用于治疗生物膜相关细菌感染的磷霉素和粘菌素的协同药理联合(synergistic pharmacological association)。
具体而言，本发明涉及磷霉素和粘菌素的协同药理联合，其用于治疗由一种或多种优选选自鲍曼不动杆菌(A.baumannii)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、嗜麦芽窄食单胞菌(S.maltophilia)和肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)的革兰氏阴性生物膜形成病原体引起的生物膜相关细菌感染相关的疾病，尤其氏用于治疗难以治疗的呼吸系统疾病。
技术背景
粘菌素和磷霉素是“老”抗生素，由于缺乏治疗多药耐药(MDR)病原体引起的感染的新化合物，其最近重新受到关注(Karaiskos I.等人，Front Public Health.2019；7:151)。
粘菌素，也称为多粘菌素E，是一种由多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)的某些菌株产生的多粘菌素抗生素，其由具有三肽侧链的阳离子环状七肽组成，所述三肽侧链在N-末端由脂肪酸通过α-酰胺键联酰化(Reviews of Anti-Infective Agents CID 2005；40:1033-41)。其破坏细菌膜，从而导致细胞死亡。
有两种不同形式的粘菌素可用于临床使用：硫酸粘菌素(其经口施用用于肠净化，以及作为粉末局部施用用于治疗细菌性皮肤和耳部感染)和粘菌素甲磺酸钠(CMS)(也称为粘菌素甲烷硫酸盐、粘菌素甲烷硫酸五钠(pentasodium colistimethanesulfate)和粘菌素磺酰甲磺酸盐(colistin sulfonyl methate)，用于肠胃外(静脉内、肌内和鞘内/心室内)和气溶胶疗法)。
因此，粘菌素可以以粘菌素甲磺酸钠(其易于水解形成磺甲基化衍生物)的形式作为前药，以及作为粘菌素(药物的活性形式)施用。
粘菌素最近在治疗各种类型的感染(例如肺炎、菌血症和由表达MDR表型的革兰氏阴性病原体例如非发酵性革兰氏阴性病原体和耐碳青霉烯肠细菌引起的尿路感染)方面起到了关键作用。
革兰氏阴性菌之所以如此称呼是因为它们具有不保留“革兰氏”染色并且不能被许多抗生素穿透的双膜。与革兰氏阳性菌相比，革兰氏阴性菌也更容易产生多药耐药性。
在患有囊性纤维化或其它慢性呼吸系统疾病的患者中，粘菌素通常用于治疗由铜绿假单胞菌或其它MDR非发酵革兰氏阴性病原体(例如嗜麦芽窄食单胞菌和鲍曼不动杆菌)引起的感染。
磷霉素是一种抗生素，其已在欧盟(EU)使用数十年，用于治疗多种感染。例如，将其作为颗粒剂(含有氨丁三醇盐形式的磷霉素)或作为口服混悬剂(磷霉素钙)的胶囊和粉末通过口服提供，通过输注(滴注)到静脉内或通过注射到肌肉内提供。口服时，其主要用于治疗由易受磷霉素的抗菌作用影响的细菌引起的无并发症的尿路感染。在一些欧盟国家，其还被用于预防与泌尿道手术或诊断操作相关的感染。磷霉素输注已被批准用于治疗所有年龄的患有严重感染(诸如骨髓炎(骨感染)、复杂性尿路感染、医疗保健相关感染、脑膜炎和其它感染引起的血液细菌感染)的患者。不能使用其它抗生素或其它抗生素无效时，使用磷霉素输注。用于注射到肌肉中的磷霉素已被批准用于治疗或预防各种感染，包括泌尿和生殖系统感染(EMA/317719/2020限制使用磷霉素抗生素的建议，2020年6月12日)。磷霉素作为MurA酶的时间依赖性抑制剂，所述MurA酶催化细菌细胞壁的主要成分肽聚糖合成的第一关键步骤。
含磷霉素的药物在大多数欧盟国家都有售，并以各种名称上市；特别是，磷霉素氨丁三醇可以以商品名MonurolTM和MonurilTM(Zambon S.p.A.)购得。
鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌和肺炎克雷伯菌已作为重要的MDR机会性人病原体而出现，所述病原体主要、但并非仅仅在患有衰弱性疾患的患者(例如患有呼吸系统疾病的患者，所述呼吸系统疾病包括慢性阻塞性肺病(COPD)、囊性纤维化(CF)和非CF支气管扩张(NCFB)的患者)中引起各种感染。另外，这些细菌在重症监护病房(ICU)中越来越多地被鉴定为造成呼吸机相关性肺炎(VAP)，影响ICU住院时间和死亡率。
由鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌和肺炎克雷伯菌引起的感染通常是慢性的且难以治疗，因为这些细菌菌株具有通过作为粘附群体存在而适应的强大能力，所述粘附群体包埋在自产生的细胞外聚合物质基质(EPS-生物膜)中。事实上，生物膜的生长赋予这些细菌若干有利方面，并在上述呼吸道疾病的发病机理、它们对常规抗生素治疗的抗性和复发中起重要作用。
事实上，美国疾病控制中心估计，超过65％的医院感染是由形成生物膜的病原体引起的，并且所有慢性感染的80％与生物膜的存在相关，因此这代表了重要的健康挑战。
值得注意的是，生物膜内的细菌对抗生素的抗性比浮游形式的细菌强得多，并且当形成生物膜时，可能以任何方式对抗微生物剂易感的细菌可以变得对抗生素具有抗性或耐受性。
尽管已经投入了大量的时间和精力来研究用于成功应对由出现的形成生物膜的病原体引起的细菌感染的有效治疗，但是仍然基本上缺乏良好的治疗选择，因此，在本领域中高度需要对细菌生物膜介导的感染的更有效治疗。
因此，靶向这些感染代表了挑战，然而其在根除和限制复发方面，特别是在慢性患者中可能是高度有效的。
生物膜由分布在基质中的细菌微菌落组成。生物膜的主要组分是EPS，主要由蛋白质(<1-2％)(包括酶)、DNA(<1％)、多糖(1-2％)和RNA(<1％)以及除了这些组分之外还有水(高达97％)组成，水负责生物膜基质内的营养物流动。
生物膜的其它组分是：水通道，其允许营养物和代谢物的运输，以及密集堆积的细胞区域，其可以占EPS基质的高达4-5％。
最近已经阐明了生物膜的形成，例如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中的生物膜的形成(Blasi F.等人Respiratory Medicine,2016,117:190-197)：这是一个多步骤过程：从细菌附着到有生命的或无生命的表面开始，然后形成导致三维结构形成和开始生物膜形成的早期阶段的微菌落，最后，熟化，接着通过EPS的破裂而发生分离。在生物膜形成过程中，许多细菌物种能够通过称为“群体感应”的特定机制相互交流，这是一个能够协调不同基因表达的细胞间刺激的系统。
已在人病原体(例如金黄色葡萄球菌(S.aureus):Becker P.等人，Appl.Env.Microbiology,July 2001，第2958-2965页第67卷，第7期DOI:10.1128/AEM.67.7.2958-2965.2001)中确定了生物膜形成是由于浮游期不常见的细菌机制和基因转录的激活，因此支持对不同治疗方法的需要。
如上所述，细菌生物膜对公众健康构成了巨大威胁，因为它们赋予了降低的对抗生素和人免疫系统的可及性，并且与多种由MDR细菌引起的感染性疾病的恶化有关，所述MDR细菌对最近开发的抗生素具有耐药性。
令人惊讶的是，据报道，目前使用的抗生素可以减少生物膜中的细菌数量，但它们不能完全根除生物膜，因此经常发生生物膜感染的复发，如Ciofu O.等人(Frontiers inMicrobiology,2019,10:1-15doi:10.3389/fmicb.2019.00913)中综述的。
因此，本领域中特别需要高效根除通过革兰氏阴性微生物形成生物膜的细菌。
这些感染甚至更具挑战性，因为例如通过浮游微生物的敏感性测试选择的抗生素疗法可能不具有预测性，因此，其可能与感染的治疗失败或复发或再发生相关，如Hoiby N.等人(ESCMID*Guideline for the diagnosis and treatment of biofilminfections2014,Clin.Microbiol.Infect.,2015；21:S1-S25 http://dx.doi.org/10.1016/ j.cmi.2014.10.024)中所公开的。
磷霉素和粘菌素已在例如SIRIJATUPHAT R.等人Antimicrobial Agents andChemotherapy,30/6/2014,58(9):5598-5601中的临床实践中联合使用或综述于例如TRINHTRANG.D.等人Pharmacotherapy,1/11/2019,39(11):1077-1094中。由于生物膜研究的标准化测定的普及差(poor diffusion)和分离株的表征缺乏，这些研究的结果是有争议的。
总之，据我们所知，这两种抗生素的组合在已建立的生物膜中的革兰氏阴性细菌感染中的协同作用从未被明确地证实。
发明内容
因此，本发明人面临治疗由形成生物膜的革兰氏阴性病原体引起的细菌感染的问题，所述病原体优选选自鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌和肺炎克雷伯菌，其中所述感染由于生物膜的存在而特别难以治疗，已知所述生物膜赋予对抗生素治疗的抗性和/或耐受性。
在一长组测试和实验之后，本发明人惊奇地发现粘菌素和磷霉素的联合对许多形成生物膜的鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌和肺炎克雷伯菌临床分离株感染具有协同的抗生物膜活性；优选当感染由嗜麦芽窄食单胞菌引起时。
粘菌素和磷霉素的联合针对鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌和肺炎克雷伯菌的形成生物膜的菌株的抗生物膜活性支持了使用所述抗生素联合治疗导致反复感染的宿主的细菌定植以及治疗由上述病原体引起的恶化的可能性，特别是在患有呼吸系统疾病(包括例如慢性阻塞性肺病(COPD)、囊性纤维化(CF)和非CF支气管扩张(NCFB)以及呼吸机相关性肺炎(VAP)及其恶化)的住院患者中。
根据一个特别优选的实施方案，本发明的联合对于治疗多重耐药性(Multi-Drug-Resistant，MDR)细菌感染特别有用。
具体实施方案
因此粘菌素和磷霉素的协同药理抗生物膜联合用于治疗由一种或多种形成生物膜的革兰氏阴性菌引起的细菌感染代表了本发明的第一实施方案，所述革兰氏阴性菌优选选自：鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌和肺炎克雷伯菌，其中所述病原体处于生物膜生长期(biofilm phase of growth)，即它们包含在已经形成的生物膜中。本发明的另一方面是粘菌素和磷霉素的协同药理抗生物膜联合用于治疗由一种或多种选自鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌和肺炎克雷伯菌的形成生物膜的病原体引起的细菌感染，其中所述感染与呼吸系统疾病，特别是慢性呼吸系统疾病相关。优选地，感染是由嗜麦芽窄食单胞菌引起的。
本发明的发现，即对抗已在身体区域中建立的生物膜中的细菌的能力，与治疗肺部的复发性感染或由革兰氏阴性菌和/或多药耐药性细菌引起的所述感染的恶化尤其相关。
根据本发明，粘菌素和磷霉素的药理联合意指通过同时或联合施用两种活性成分进行的粘菌素和磷霉素的组合，所述两种活性成分可以包装在药盒中，其中在包含合适赋形剂的药物组合物中包含合适剂量的粘菌素和磷霉素或它们的物理联合。
例如，在根据本发明的一个优选实施方案的细菌感染中，即与慢性呼吸系统疾病相关的细菌感染中，粘菌素优选通过吸入途径施用，而磷霉素优选通过口服或非肠道施用，例如静脉内施用。
因此，在本发明的一个优选实施方案中，部件的药盒包含粘菌素和磷霉素，所述粘菌素以适于溶解并优选以75mg或150mg的剂量通过喷雾器每天施用至少一次、优选每天施用两次的粉末形式存在，所述磷霉素以适于每日口服或肠胃外施用的剂量存在。
适用于溶解和稀释粘菌素和/或磷霉素的方法是技术人员所熟知的，可以是无菌生理溶液，或简单地说，无菌蒸馏水。
可以例如在患有难以治疗的呼吸系统疾病的患者中，例如，在患有COPD、CF、NCFB和VAP及其恶化的患者中，尤其是当这些患者是住院患者时，通过标准分离方法或商业测定来检测由选自鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌和肺炎克雷伯菌的一种或多种形成生物膜的病原体引起的细菌感染。
上述方面是基于对粘菌素与磷霉素之间的协同相互作用的观察，所述协同相互作用对形成生物膜的革兰氏阴性病原体感染的已建立的生物膜提供显著的抗生物膜活性，其中所述病原体优选选自：鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌和肺炎克雷伯菌菌株，更优选为嗜麦芽窄食单胞菌。
如上已提及的，由于多种原因，与细菌仍处于浮游生长期的细菌感染相比，由形成生物膜的细菌引起的细菌感染更难治疗和根除。
首先，生物膜代表了一种对药物的物理屏障，并且包裹在其中的细菌与浮游细菌相比反应较弱。此外，生物膜中的细菌不会主动分裂，因此对药物的反应也较弱。这种降低的敏感性需要使用增加的抗生素浓度，但这并不总是可能的，因为通常使用的抗生素具有高毒性。
此外，一些生物膜组分，诸如鼠李糖脂，已被证明能屏蔽嗜中性粒细胞的免疫反应(Jensen P.O.等人FEMS Immunol.Med.Microbiol.2010,59 292-305)，从而减弱先天免疫反应。
另外，针对生物膜中的细菌和对一些生物膜组分所引起的局部炎症反应本身会导致组织损伤，从而促成感染的持续传播。
这使得在已经形成的生物膜中发现的粘菌素与磷霉素之间对革兰氏阴性菌的协同作用成为重要的治疗工具，因为与单独使用每种单独的抗生素根除此类感染所需的剂量相比，其允许减少抗生素剂量。
在实验部分中更详细描述的本发明的发现是特别相关的，因为测试的菌株代表不同的基因型，已经从身体不同区域的感染中分离出来，并且显示最常见的抗生素抗性，最吸引人的是碳青霉烯抗性，其目前代表了抗微生物化学疗法的主要临床挑战(Bush K,Bradford PA.Clin Microbiol Rev.2020Feb 26；33(2):e00047-19.https://doi: 10.1128/CMR.00047-19)。
据我们所知，这是粘菌素与磷霉素之间对包裹在生物膜中的细菌的直接协同作用的首次证明。
根据本发明，术语“粘菌素”包括粘菌素及其药学上可接受的盐和/或前药，诸如硫酸粘菌素和粘菌素甲磺酸钠。
此外，根据本发明，术语“磷霉素”包括磷霉素及其药学上可接受的盐，诸如磷霉素氨丁三醇(也称为磷霉素氨基丁三醇(fosfomycin tromethamine))、磷霉素钙和磷霉素二钠。
由于这些类型的感染在世界范围内，特别是在ICU(重症监护病房)中变得越来越重要，最近，已在Macià等人(MaciàMD等人2014Oct；20(10):981-90.https://doi.org/ 10.1111/1469-0691.12651)和Verderosa等人(Verderosa A.D.等人，Frontiers inChemistry,November 28,2019.https://doi:10.3389/fchem.2019.00824.)中综述了生物膜的结构以及适合于它们的研究的方法。值得注意的是，形成生物膜的病原体表现出的特征，包括对抗生素的抗性，与相同病原体在浮游生长期表现出的特征极其不同。这些差异解释了为什么许多对浮游--快速生长--的细菌有效的抗生素，对被包裹在细胞外聚合物质(EPS)生物膜中时的相同细菌无效，在所述细胞外聚合物质生物膜中，所述细菌也具有降低的生长速率。
事实上，当细菌细胞切换到生物膜生长期时，其经历了行为上的表型转变，其中大套基因被差异性调节和表达(Blasi F.等人Respiratory Medicine,2016,117:190-197)。
本发明人已经观察到粘菌素与磷霉素的组合显示出针对已建立的生物膜中的形成生物膜的革兰氏阴性病原体的惊人的显著协同作用，其中所述病原体选自由以下组成的组：鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌和肺炎克雷伯菌菌株，并且优选通过使用吸入(这是治疗呼吸系统疾病时一种优选的施用途径)后在上皮衬里液(EpithelialLining Fluid，ELF)中可达到的高药物浓度来选择。
不受特定科学理论的束缚，观察到的协同抗生物膜活性可能归因于不同的机制，诸如两种抗生素在EPS中的渗透增加，或对生物膜形成的直接协同活性，或细菌生长减少。
根据本发明，如应用于联合使用(无论是同时使用还是相继使用)的粘菌素和磷霉素的效应的术语“协同的”和“协同地”，是指相对于单独使用粘菌素或磷霉素治疗上面鉴定的细菌而言，获得了更强的抗菌效应。在一些实施方案中，联合使用(无论是同时使用还是相继使用)的粘菌素和磷霉素的效应大于每种单独施用的药剂的效应的简单相加，即存在超过基于加成效果所预期的效应。统计方法，诸如在实验部分更详细描述的那些，在本领域中可用于识别协同作用或简单的加成效果。
联合使用的粘菌素和磷霉素的活性和观察到的协同作用在治疗多药耐药性(MDR)细菌感染中特别重要，对于这样的多药耐药性(MDR)细菌感染，新开发的抗生素已显示疗效较差或根本无效。
根据本发明的药理联合(pharmacological association)的粘菌素和磷霉素可以以任意顺序分开或同时施用，其中施用期重叠或不重叠并且通过相同或不同的施用方式施用。
例如，可以在单一剂型中同时施用粘菌素和磷霉素，或者，可以在分开的剂型中以任意顺序伴随或依次施用粘菌素和磷霉素，其中施用期重叠或不重叠并且通过相同或不同的施用途径施用。
粘菌素和磷霉素的药理联合的同时或分开施用具有杀伤生长在生物膜中的选自鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌和肺炎克雷伯菌的病原体的作用，如本申请的实验部分所证实的，所述作用出乎意料和令人惊讶地大于在生物膜暴露于单独的粘菌素或磷霉素时所观察到的作用。因此，这种联合的作用被定义为“协同的”。
粘菌素和磷霉素的联合可以以一种单一药物组合物或多种药物组合物的形式向患者施用。
本发明的药物制剂包含粘菌素和/或磷霉素以及由一种或多种赋形剂组成的适用于药物用途的载体。例如，本发明的药物制剂可包含粘菌素和磷霉素以及由一种或多种赋形剂组成的适用于药物用途的载体，即用于同时施用粘菌素和磷霉素的药物制剂；或者本发明的药物制剂可包含磷霉素和由一种或多种赋形剂组成的适用于药物用途的载体；或者本发明的药物制剂可包含粘菌素和由一种或多种赋形剂组成的适用于药物用途的载体，即用于粘菌素和磷霉素的依次或同时施用的单独的药物制剂。
根据本发明，术语“赋形剂”包括添加到药物组合物中以进一步促进活性成分施用的任何惰性物质。
根据本发明，术语“载体”包含适于作为将粘菌素和/或磷霉素递送至体内或体外合适部位的媒介物的任何物质。
药学上可接受的赋形剂是本领域技术人员公知的，可用于生产包含粘菌素和/或磷霉素的其形式适于向受试者施用的药物制剂。用于制备根据本发明的药物制剂的可接受的方法是本领域技术人员熟知的。
本发明的又一目的是在有此需要的受试者中治疗由一种或多种选自鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌和肺炎克雷伯菌的形成生物膜的病原体引起的细菌感染的方法，其包括向受试者施用粘菌素和磷霉素的联合，其中所述联合对包裹在已建立的生物膜中的细菌具有协同活性。
本发明的又一目的是在有此需要的受试者中治疗由一种或多种选自鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌和肺炎克雷伯菌的生物膜形成病原体引起的细菌感染的方法，其包括同时施用包含粘菌素和磷霉素的联合，其中所述联合对包裹在已经建立的生物膜中的细菌具有协同活性。
本发明的又一目的是在有此需要的受试者中治疗由选自鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌和肺炎克雷伯菌的形成生物膜的病原体引起的细菌感染的方法，其包括分开地施用包含粘菌素和磷霉素的联合，其中所述联合对包裹在生物膜中的细菌具有协同活性。
根据本发明，术语“个体”、“受试者”和“患者”可互换使用，指患有特定疾病、病症或疾患的哺乳动物物种成员，优选为人。
根据本发明，术语“抗生物膜(antibiofilm)”意指在生物膜生长期中抑制或阻抑形成生物膜的细菌中的生物膜(形成)或持续存在。换句话说，本发明的联合对已建立的生物膜中的选自以下的革兰氏阴性病原体具有活性：鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌和肺炎克雷伯菌，这些病原体在所述生物膜中通常对药物不太敏感。
根据本发明，术语“抗生物膜剂”包括粘菌素和磷霉素。
形成生物膜的细菌的生命周期中的生物膜形成可以通过在实验部分有更详细描述的标准方法(诸如棋盘分析)(Pollini S.等人JAntimicrob Chemother 2018；73:2388-2395,doi:10.1093/jac/dky185)，或通过标准化的体外生物膜模型，诸如Nunc-lid系统(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)(如Harrison Jj等人(NatProtoc.2010；5(7):1236-1254.https://doi.org/10.1038/nprot.2010.71)中所述的)来鉴定。
根据本发明，“细菌感染”是指其中一个或多个微生物群体的存在对宿主哺乳动物有害的任何情况。因此，当过量数量的微生物群体存在于个体体内或体表时，或者当一个或多个微生物群体的存在的影响正在损害个体的细胞或其它组织时，个体就“患有”微生物感染。特别地，“细菌感染”是指由细菌菌株引起的感染，对于该感染，使用本文公开的粘菌素和磷霉素的协同抗生物膜药理联合是合适的。
根据本发明，术语“医院感染”是指医院获得性感染(HAI)，其是在医院或其它卫生保健机构中获得的感染。为了强调医院和非医院环境，其有时被称为卫生保健机构相关感染(HAI或HCAI)。这种感染可在医院、疗养院、康复机构、门诊诊所或其它临床环境中获得。
根据本发明，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指由选自鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌和肺炎克雷伯菌菌株的一种或多种形成生物膜的病原体引起的细菌感染或其相关疾病状况和症状的程度、强度、范围的消减、降低、限制或缓解，这通过减少、抑制或阻抑所述细菌在受试者身上或体内的生长、复制和/或增殖或者死亡或破坏来实现。
根据本发明，术语“药理联合”是指粘菌素和磷霉素在一种单位剂型中的固定组合、非固定组合或用于联合施用的部件的药盒，其中粘菌素和磷霉素，如上所定义，可以同时施用、同时独立施用或在允许组合伙伴显示协同作用的时间间隔内分开施用。
任何合适的施用途径都可用于本发明的组合物，包括口服、肠胃外(皮下、肌内、腹膜内或静脉内)和吸入途径，优选为吸入途径。
根据本发明，术语“口服(oral)”或“经口(orally)”是指通过嘴引入体内，从而在身体的一个或多个以下区域发生吸收：嘴、胃、小肠和口腔粘膜的小血管。
根据本发明用于口服施用的药物制剂的非限制性实例包括，例如，用于个体口服摄入的片剂、包衣片、颗粒剂、丸剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、混悬剂等。用于口服施用的合适载体是本领域公知的。
对于肠胃外施用，根据本发明的药物制剂可以例如配制在水溶液中，诸如生理相容性缓冲液或生理盐缓冲液中。用于注射的制剂可以以单位剂型存在，例如，在安瓿中，或在任选地加入了防腐剂的多剂量容器中。
对于通过吸入途径的施用，可将根据本发明的药物制剂配制成溶液、悬浮液和干粉，并通过使用常规方法递送，以便为患者提供最佳量的合适范围的粒度。
根据本发明的一个特别优选的实施方案，通过吸入途径治疗上述感染。事实上，通过吸入施用允许在上皮衬里液(Epithelial Lining Fluid，ELF)中达到高药物浓度，同时使全身毒性降至最低。特别地，粘菌素优选通过吸入途径施用。
或者，粘菌素和磷霉素的组合可通过吸入途径施用一种药物，即粘菌素，而全身性(即口服或肠胃外)施用另一种药物。特别优选的是药物组合，其中粘菌素通过吸入途径施用，而磷霉素通过口服或肠胃外施用。
根据本发明的一个另外的实施方案涉及用于在有此需要的受试者中治疗性治疗由形成生物膜的革兰氏阴性病原体引起的细菌感染的方法，所述病原体优选选自由以下组成的组：鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌和肺炎克雷伯菌，所述方法包括分开地或同时施用粘菌素与磷霉素的组合，或者施用包含有效量的粘菌素和磷霉素以及至少一种合适的赋形剂的药物组合物，其中所述组合具有协同抗生物膜作用。
这种治疗性治疗可包括施用有效量的粘菌素，包括约7.5万单位至1200万单位(即约6mg至约960mg)，优选约50万单位至1200万单位(即约40mg至约960mg)；磷霉素的有效量可以从0.1g/模变化至5g/模，更优选从1mg/模变化至3mg/模。
根据本发明使用的粘菌素和磷霉素的量可以根据施用途径、选择的组合物类型、患者的个体特征、治疗的持续时间和同时治疗的性质而变化。
在任何情况下，协同有效量的粘菌素和磷霉素的药理联合可以消减、降低、限制或缓解由选自鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌和肺炎克雷伯菌的一种或多种形成生物膜的病原体引起的细菌感染或其相关症状的程度、强度、范围。
根据一个实施方案，足以对选自鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌和肺炎克雷伯菌菌株的形成生物膜的病原体引起的细菌感染具有协同作用的粘菌素和磷霉素的量可以例如根据患者的身体特征、受试者症状的严重性、感染的形式、身份和细菌载量、用于施用药物的制剂和方式而变化。给定受试者的具体剂量通常由主治医师的判断来设定。然而，作为一个实例，粘菌素的有效量可包括约7.5万单位至1200万单位(即约6mg至960mg)，优选约50万单位至1200万单位(即在约40mg与960mg之间)，以单剂量或更多重复剂量施用；磷霉素的有效量可从0.1g/模变化至5g/模，或优选包括1g/模至3g/模，以单剂量或更多重复剂量施用。
根据施用方式，剂量可以一次全部施用或在一段时间内缓慢施用，诸如通过i.v.或通过吸入施用。
根据本发明，术语“剂量(dose)”、“单位剂量”、“剂量(dosage)”、“有效剂量”和相关术语是指物理上分离的单位，其含有经计算可产生或诱导所需的治疗效果的预定量的活性成分。因此，单剂量是向患者施用的预定量的粘菌素或磷霉素。
用本发明的药物组合进行的治疗应该持续需要的时间，以获得根据本发明的治疗效果。
粘菌素与磷霉素之间的协同相互作用的确定基于通过下文所述测定获得的结果；如以下实施例中更详细地所述，测定粘菌素与磷霉素之间的体外抗生物膜协同作用。
实验部分
实施例1.材料和方法
细菌菌株
研究了17种革兰氏阴性临床分离株，包括鲍曼不动杆菌(n＝3)、铜绿假单胞菌(n＝5)、嗜麦芽窄食单胞菌(n＝3)和肺炎克雷伯菌(n＝6)(列于表1)。
选择代表不同基因型和抗性表型(即多基因座序列分型或MLST型，粘菌素和磷霉素、MDR表型)的菌株。由于碳青霉烯酶的产生，大多数患者表现出获得性碳青霉烯耐药性，这是目前抗菌化疗的主要临床挑战(上文引用的Bush K，Bradford PA.)。
测试的分离物的表征如表1所示。
表1.鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、大肠杆菌和肺炎克雷伯菌分离株的表征
a)CVC，中心静脉导管相关感染；BSI，血流感染；LRTI，下呼吸道感染；SP，痰；CF，囊性纤维化；UTI，尿路感染；直肠拭子。
b)根据巴斯德和阿奇特曼MLST方案。
c)AMK，阿米卡星；C/T，头孢洛扎(ceftolozane)/他唑巴坦(固定浓度为4μg/ml的他唑巴坦)；CAZ，头孢他啶；CIP，环丙沙星；CST，粘菌素；FEP，头孢吡肟；IPM，亚胺培南；MEM，美罗培南；TZP、哌拉西林/他唑巴坦(固定浓度为4μg/ml的他唑巴坦)。
活性成分
在本发明的实验部分，术语“粘菌素”是指硫酸粘菌素(根据临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute)-CLSI和欧洲抗微生物敏感性测试委员会(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing)-EUCAST提供的抗微生物敏感性测试国际指南)。
在本发明的实验部分，术语“磷霉素”是指磷霉素二钠盐(根据临床和实验室标准协会-CLSI和欧洲抗微生物敏感性测试委员会-EUCAST提供的抗微生物敏感性测试国际指南)。
最低抑制浓度(MIC)的确定
根据临床和实验室标准协会指南[CLSI_M07 2018,CLSI_M1002020]进行抗微生物敏感性测试。具体地，通过肉汤微量稀释法确定粘菌素的MIC，通过琼脂稀释法(推荐加入25μg/ml的葡萄糖-6-磷酸)测定磷霉素的MIC。所有数据都是在至少两个独立实验中获得的，其中第三个实验是在MIC值差异超过1log2稀释度的情况下进行的。大肠杆菌ATCC29522和铜绿假单胞菌ATCC 27853用于质量控制目的。
生物膜敏感性测试
如前所述(Harrison Jj等人Nat Protoc.2010；5(7):1236-1254.https:// doi.org/10.1038/nprot.2010.71)，使用标准化的体外生物膜模型Nunc-lid系统(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)中所述的)进行生物膜敏感性测试。简言之，将生物膜在阳离子调节的Mueller Hinton肉汤(CAMHB)(静态条件，35℃)中生长24小时，除了鲍曼不动杆菌，其需要在每日更新的培养基中生长7天(Pollini S等人J.Antimicrob.Chemother.2018Sep 1；73(9):2388-2395.https://doi.org/10.1093/jac/ dky185)。然后将预先形成的生物膜暴露于磷霉素、粘菌素和磷霉素/粘菌素组合24小时(静态条件，35℃)进行生物膜敏感性测试。
如前所述(Macià等人，如上所述)确定磷霉素和粘菌素的最小生物膜根除浓度(MBEC)，其中MBEC被定义为在恢复培养基中防止可见细菌生长的最低抗生素浓度。
如前所述(Bonapace CR等人，Diagn Microbiol Infect Dis.2002；44(4):363-366.https://doi.org/10.1016/S0732-8893(02)00473-X)，使用预先形成的生物膜作为细菌接种物进行生物膜棋盘分析。简言之，在生物膜抗生素暴露24小时后，移除peg盖并进行超声处理，并且在35℃下进行24小时后，检查培养基中细菌生长的存在/不存在。通过计算分数生物膜根除浓度指数(fractional biofilm eradication concentration index，FBECI)来评估粘菌素/磷霉素组合的协同活性，其中FBECI值≤0.5表示协同效应(Wang L.等人Frontiers in Microbiology,2019,10,2252,doi:10.3389/fmicb.2019.02522)。数据是在两个独立的实验中获得的，其中每个实验每个条件六个重复。使用中值进行数据分析。
最后，使用可通过吸入获得的高药物浓度，对所有菌株进行定量生物膜敏感性测试。将预先形成的生物膜暴露于单独的和组合的三种磷霉素和三种粘菌素浓度。如前所述(Pollini S.等人J Antimicrob Chemother 2018；73:2388-2395,doi:10.1093/jac/dky185；Ciacci_N.等人，Antibiotics 2019,8:101；doi:10.3390/antibiotics8030101)，通过超声处理破坏生物膜，并测定每peg的平均活细胞数(CFU/peg)来评价抗生物膜活性。进行了初步实验，以便确定用于每种菌株的待测试的抗生素浓度的最佳范围。数据在至少两个独立的实验中获得，其中每个实验每个条件六个重复。使用带有Welch校正(GraphPadPrism 7.0版，San Diego,CA,USA)的非配对t检验进行统计分析，比较磷霉素/粘菌素组合对比单一药物的抗生物膜活性。
实施2.粘菌素/磷霉素组合抗生物膜的活性
磷霉素和粘菌素的MBEC值始终高于所有测试菌株各自的MIC：即对于磷霉素，MIC50＝64μg/ml对比MBEC50＝>1024μg/ml，MIC90＝>1024μg/ml对比MBEC90＝>1024μg/ml；对于粘菌素，MIC50＝4μg/ml对比MBEC50＝512μg/ml，MIC90＝32μg/ml对比MBEC90＝>1024μg/ml(表1)。
生物膜棋盘分析显示了磷霉素/粘菌素组合对于所有测试菌株的协同作用。有趣的是，磷霉素/粘菌素组合的协同抗生物膜活性似乎不是物种特异性的或与磷霉素和粘菌素MIC相关(例如，铜绿假单胞菌FZ34和FZ45菌株显示类似的磷霉素和粘菌素MIC，但对药物组合暴露的反应不一致)(表2)。未观察到拮抗作用。
定量抗生物膜测定(使用吸入后ELF中可达到的高药物浓度)证明了磷霉素/粘菌素组合针对所有测试菌株的显著抗生物膜协同作用，但两种铜绿假单胞菌菌株(即FZ34和FZ45)除外，对这两种菌株观察到了表明协同作用的趋势，尽管未达到统计学显著性。生物膜中生长的细菌群体的异质性至少可以部分解释这一结果。
总之，磷霉素和粘菌素的MIC值不能预测表现针对特定菌株的抗生物膜协同作用的药物浓度，这突出显示了生物膜对抗生素暴露的反应的复杂性以及生物膜反应与抗生素敏感性之间的差异。
表2.磷霉素/粘菌素组合的生物膜棋盘分析的结果：
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缩写：MIC，最小抑制浓度；MBEC，最小生物膜根除浓度；FBECI，分数生物膜根除浓度指数。FBECI值解释如下：FBECI≤0.5，协同；FBECI>0.5-1，加成效应；FBECI>1-4.0，无相互作用；FBECI>4.0，拮抗作用。表示协同或加成效应的FBECI值以粗体显示。

Claims (12)

1.粘菌素和磷霉素的协同药理组合用于治疗由一种或多种形成生物膜的革兰氏阴性病原体引起的细菌感染，所述病原体优选选自：鲍曼不动杆菌(A.baumannii)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、嗜麦芽窄食单胞菌(S.maltophilia)和肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，其中所述病原体处于生物膜生长期。
2.根据权利要求1所述的供使用的组合，其中所述细菌感染与呼吸系统疾病相关，优选与慢性呼吸系统疾病相关。
3.根据权利要求2所述的供使用的组合，其中所述慢性呼吸系统疾病选自由以下组成的组：慢性阻塞性肺病(COPD)、囊性纤维化(CF)、非囊性纤维化(NCFB)、呼吸机相关性肺炎(VAP)及其恶化。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的供使用的组合，其中所述细菌感染为复发性感染。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的供使用的组合，其中所述细菌感染影响住院患者或重症监护病房患者。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的供使用的组合，其中所述病原体是多药耐药性细菌。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的供使用的组合，其中粘菌素和磷霉素以任意顺序、分开地或同时施用，其中施用期重叠或不重叠并且通过相同或不同的施用途径施用。
8.根据权利要求7所述的供使用的组合，其中所述给施用途径是吸入途径。
9.根据权利要求7所述的供使用的组合，其中粘菌素通过吸入途径施用，而磷霉素通过口服或肠胃外途径施用。
10.一种多部分的药盒，其包含任选地与稀释工具组合的粘菌素瓶和磷霉素瓶，用于粘菌素和磷霉素的协同组合的组合施用。
11.根据权利要求10所述的多部分的试剂盒，其中粘菌素被稀释用于通过吸入途径施用，而磷霉素被稀释用于通过口服或肠胃外途径施用。
12.粘菌素和磷霉素的协同药理联合用于制备用于治疗由病原体引起的革兰氏阴性感染的抗生物膜药物的用途，所述病原体优选选自由以下组成的组：鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌和肺炎克雷伯菌，其中所述病原体处于生物膜生长期。
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