CN117379434A - 一种有效抑制铜绿假单胞菌生物膜细菌的头孢他啶组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种N‑(3‑环丁内酯)‑4‑溴苯丁酰胺与头孢他啶组合物，及该组合在治疗耐药菌慢性感染中的应用。N‑(3‑环丁内酯)‑4‑溴苯丁酰胺与头孢他啶联合使用后，不仅能够显著增加生物膜细菌对头孢他啶的敏感性，提高头孢他啶对生物膜细菌的杀伤作用，而且大幅度减少铜绿假单胞菌生物膜的形成量；可应用于防治耐药铜绿假单胞菌的慢性感染。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺与头孢他啶组合物。
背景技术
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)是临床常见条件致病菌，当人体免疫功能低下、组织屏障被破坏或进行有创医疗操作时，可引起人体组织局部化脓性炎症及全身感染，如呼吸道感染、肺炎、败血症等。并且，由于PA的适应能力和耐药性强，以及生物膜的作用，常见的抗菌药物通常无法对其发挥有效作用。
生物膜是由细菌及其分泌胞外多糖等物质形成结构化膜状细菌群体。生物膜结构起到保护作用，阻止抗生素进入细菌细胞。而且，生物膜的形成会促使PA转化为代谢活性较低的状态，在这种状态下，它们对抗生素的敏感性会显著降低，甚至还会出现对抗生素不敏感的现象。而为更严重的是，生物膜的存在还会导致的慢性感染和反复感染，致使感染很难被完全治愈。临床数据显示，在肺囊性纤维化中，PA形成的生物膜阻碍了抗生素的疗效，并且导致了感染的反复发生。另外，伤口慢性感染、慢性鼻窦炎、慢性中耳炎等也与PA生物膜形成有关。我们设想将生物膜抑制剂与抗生素联用以解决生物膜导致的细菌耐药，但是，前期的研究结果显示，将生物膜抑制剂与庆大霉素(Gentamicin，GM)、妥布霉素(Tobramycin，TOB)以及阿米卡星(Amikacin，AK)联用后，无法同时达到减少PA生物膜形成量和增加PA对抗生素敏感性的效果，药物组合物也无法更有效地杀伤生物膜细菌。
本发明意外地发现，化合物N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺与头孢他啶(Ceftazidime，CAZ)联合使用后，能够达到协同减少生物膜的形成量和增加生物膜细菌对CAZ敏感性的效果，该组合物具有治疗铜绿假单胞菌生物膜细菌感染所致疾病的效果，该结果为PA感染的临床治疗提供新的方法。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种增强生物膜细菌对抗生素敏感性和抑制细菌生物膜形成的组合物，具体包括以下内容：
第一方面，本发明提供了一种增强生物膜细菌对抗生素敏感性和细菌生物膜形成的组合物，所述组合物的活性成分包括头孢他啶和N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺。
优选地，所述细菌为铜绿假单胞菌。
优选地，所述头孢他啶和N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺的质量比为1:0.83～1:6.5。
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体或赋形剂。
第二方面，本发明提供了上述第一方面所述的N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺在制备增强生物膜细菌对抗生素敏感性的药物中的应用。
优选地，所述抗生素为头孢他啶。
优选地，所述细菌生物膜为铜绿假单胞菌生物膜。
优选地，所述铜绿假单胞菌为耐药铜绿假单胞菌。
第三方面，本发明提供了上述第一方面所述的组合物在制备治疗铜绿假单胞菌导致的慢性感染疾病药物中的应用。
第四方面，本发明提供了上述第一方面所述的组合物在制备治疗铜绿假单胞菌生物膜导致的慢性感染疾病药物中的应用。
优选地，所述铜绿假单胞菌导致的慢性感染疾病包括伤口慢性感染、慢性鼻窦炎、慢性中耳炎。
本发明的有益效果：
(1)N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺能够作为提高PA对CAZ敏感性的增效剂，N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺与CAZ联合使用后，能够显著增加生物膜PA细菌对CAZ的敏感性，提高CAZ对生物膜细菌的杀伤作用，(2)化合物N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺与CAZ联合使用后，能够显著减少PA生物膜的形成量。(3)N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺和CAZ作为活性成分的组合物可应用于防治铜绿假单胞菌生物膜导致的，如伤口慢性感染、慢性鼻窦炎、慢性中耳炎等的慢性感染疾病。
附图说明
图1为本发明的组合物对已形成的铜绿假单胞菌生物膜细菌生长的影响
图2为本发明的组合物对已形成的铜绿假单胞菌生物膜形成的影响
图3为激光共聚焦显微镜下观察本发明的组合物对已形成的PA生物膜细菌的影响
图4为N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺和TOB对已形成的PA生物膜细菌生长的影响
图5为N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺和TOB对已形成的PA生物膜形成的影响
图6为激光共聚焦显微镜下观察N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺和TOB联合使用对已形成的PA生物膜细菌的影响
图7为N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺和AK对已形成的PA生物膜细菌生长的影响
图8为N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺和AK对已形成的PA生物膜形成的影响
图9为N-(3-环丁内酯)-4-溴苯乙酰胺和CAZ对已形成的PA生物膜细菌生长的影响
图10为N-(3-环丁内酯)-4-溴苯乙酰胺和CAZ对已形成的PA生物膜形成的影响
图11为N-(3-环丁内酯)-4-硝基苯乙酰胺和CAZ对已形成的PA生物膜细菌生长的影响
图12为N-(3-环丁内酯)-4-硝基苯乙酰胺和CAZ对已形成的PA生物膜形成的影响
具体实施方式
以下提供具体实施例以实现本发明所述的技术方案，但不限于这些实施例。
实施例1PAO1游离细菌和生物膜细菌对不同抗生素的MIC检测
该实验方法参照于(Liu et al.,2019)的实验方法，并在此基础上进行简要调整，具体实验方式如下：挑取PAO1单菌落于LB液体培养基中，200rpm、37℃恒温培养15h。15h后，用新鲜无菌的LB培养基将菌液稀释至5×105CFU/mL。并以2倍连续稀释的方式稀释抗生素(CAZ、GM、TOB、AK和CIP)。接下来，将连续稀释后的抗生素加入到稀释的菌液中，使菌液浓度保持为5×105CFU/mL。最后，将含有不同浓度抗生素的菌液以150μL/孔接种于96孔板中，并分别以不加抗生素组和培养基组作为对照。96孔板于37℃静置培养24h。当不加抗生素组细菌正常生长则实验有效，MIC值为可见生长显示出完全抑制的最低浓度。生物膜细菌MIC检测的实验方法参照于(Zhou et al.,2018)，并在此基础上进行简要调整，具体实验方式如下：挑取PAO1单菌落于LB液体培养基中，200rpm、37℃恒温培养15h。15h后，用新鲜无菌的LB培养基将菌液稀释至5×105CFU/mL。将稀释好的菌液以150μL/孔接种于96孔板中，并将该平板于37℃静置培养24h以形成成熟的生物膜。24h后，将孔中的菌液弃掉，用1×PBS轻柔地冲洗两遍，以去除浮菌。在最后一遍洗涤之后，将孔中残余地液体完全弃掉。接下来，将含有不同抗生素的LB培养基以150μL/孔接种于96孔板中，并分别以不加抗生素组和培养基组作为对照。96孔板于37℃静置培养24h。当不加抗生素组细菌正常生长则实验有效，生物膜细菌的MIC值是可见生长显示出完全抑制的最低浓度。
如表1所示，除CIP之外，其余三种抗生素对PAO1生物膜细菌的MIC均大于游离细菌的MIC。其中，CAZ的生物膜细菌MIC是游离细菌MIC的32倍，AK的生物膜细菌MIC是游离细菌MIC的4倍，TOB的生物膜细菌MIC是游离细菌MIC的4倍。由此可见，细菌生物膜的形成是细菌耐药的原因之一。
表1不同抗生素对PAO1浮游细菌和生物膜细菌的MIC
实施例2生物膜抑制剂和抗生素联合使用对PA生物膜细菌生长的影响
挑已复苏的PA接种于LB液体培养基中培养15h后，用含有0.5％葡萄糖的LB培养基将菌液浓度调整为5.0×105CFU/mL，加入96孔板中，150μL/孔，放置于37℃静恒温培养中培养24h，让其先形成成熟的生物膜。24h后，将孔中的菌液弃掉，用无菌PBS轻柔地洗涤两遍去除浮菌，保留细菌已形成的细菌生物膜。随后，向LB培养基中分别加入终浓度为25、50、100及200μM的N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺和10μg/mL的CAZ，150μL/孔，分别以空白培养基和仅含有CAZ的培养基作为对照，放置于37℃的恒温培养箱中培养18～20h。用酶标仪检测600nm处的OD值，每组做6个平行孔。数据采用mean±SD表示，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。
AK和TOB与N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺联合使用的实验方法与CAZ一致，其使用浓度分别为4μg/mL和1.25μg/mL。此外，CAZ分别与N-(3-环丁内酯)-4-溴苯乙酰胺和N-(3-环丁内酯)-4-硝基苯乙酰胺联合使用方法也于上述一致。
如图1所示，与DMSO组相比，化合物在25～200μM的使用浓度范围内，能够以剂量依赖的方式增加CAZ对生物膜细菌生长的抑制。单独使用时，CAZ对生物膜细菌生长的抑制率为5.63％，而与200μM的N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺联合使用后，则抑制率增加至35.42％，显著增加了美罗培南对生物膜细菌生长的抑制。如图4所示，单独使用时，TOB对生物膜细菌生长的抑制率为38.67％，而与200μM的N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺联合使用后，则抑制率增加至54.93％。如图7所示，单独使用时，AK对生物膜细菌生长的抑制率为13.95％，而与200μM的N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺联合使用后，则抑制率增加至26.92％。以上结果表明化合物N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺能够协同增加CAZ、TOB和AK对PAO1生物膜细菌生长的抑制。
而如图9和图11所示，CAZ分别与N-(3-环丁内酯)-4-溴苯乙酰胺联合使用后能够以剂量依赖关系增加CAZ对于生物膜细菌的杀伤能力，而CAZ与N-(3-环丁内酯)-4-硝基苯乙酰胺联合使用后，并不能增加CAZ对于生物膜细菌的杀伤能力。
研究表明，除了细菌的活性之外，生物膜的形成量也是影响PA导致的慢性感染的治疗关键点之一，因此我们继续评价上述药物组合对生物膜生成的抑制效果。
实施例3生物膜抑制剂和抗生素联合使用对PA生物膜的影响
按实施例2所述方法培养铜绿假单胞菌PA结束后，将96孔板内的菌液吸掉，每孔加入200μL无菌PBS洗涤2次，以除去游离的菌体，之后用干净的滤纸将孔内残留的液体吸干，往每孔中加入0.1％的结晶紫溶液150μL，染色15min。染色结束后，将孔内的结晶紫溶液吸掉，加入200μL无菌PBS洗涤3次，用干净的滤纸将孔内残留的液体吸干。向每孔中加入33％的乙酸溶液150μL，溶解生物膜-结晶紫复合物后，用酶标仪检测570nm处的OD值，每组做6个平行孔。数据采用mean±SD表示，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。
如图2所示，当单独使用CAZ和200μMN-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺时，其对生物膜形成的抑制率仅仅分别为45.26％和14.58％，而化合物N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺在25-200μM浓度范围内，能够以剂量依赖的方式与CAZ协同抑制生物膜形成(62.78％-74.66％)。结果表明，CAZ和N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺能够协同抑制PA细菌生物膜的形成。如图5和如图8所示，单独使用TOB和AK时，反而对细菌生物膜的形成具有促进作用，该现象也与(Tahrioui et al.,2019)等人报道现象一致。而联合使用后，能够在一定程度上缓解其促进生物膜形成的现象，但是不具有协同作用。
而如图10和图12所示，N-(3-环丁内酯)-4-溴苯乙酰胺和N-(3-环丁内酯)-4-硝基苯乙酰胺在25μM～200μM的浓度范围之内能够以剂量依赖的方式的减少生物膜的形成量，而当以上两种化合物与CAZ联合使用后，其减少生物膜形成量的程度与单独使用一致。由此可见，N-(3-环丁内酯)-4-溴苯乙酰胺和N-(3-环丁内酯)-4-硝基苯乙酰胺并不能协同发挥减少生物膜形成量的作用。
为了对上述结果进行进一步的描述，我们接下来通过荧光染色(FITC-ConA标记胞外多糖，PI标记死细菌)并在激光共聚焦下观察了生物膜抑制剂和抗生素联合使用对PA生物膜的影响。
实施例4激光共聚焦显微镜观察生物膜抑制剂和抗生素联合使用对PA生物膜细菌的影响
按照实例3中的实验方式处理菌液，在24孔培养板的每孔中放入一个无菌玻片(直径14mm)，取1mL上述处理好的菌液分别加至每孔中，做3个复孔。将24孔培养板放置到恒温培养箱内，静置培养24h后，取出玻片，用1×PBS轻柔冲洗两次，以去除浮菌。将玻片用2.5％戊二醛溶液，于4℃下固定1.5h后，用1×PBS液轻柔冲洗三次，每次10min，并用吸水纸将玻片上残留的PBS吸干。均匀滴加20μL的1mg/mL的FITC-ConA溶液于玻片上，将玻片置于室温下染色30min。30min后，将多余的染料弃掉，用1×PBS轻柔冲洗一遍以去除多余染料，并用吸水纸将玻片上残留的PBS吸干。然后，再次均匀滴加20μL的50μg/mL的PI溶液于玻片上，将玻片置于室温下染色15min。15min后，将多余的染料弃掉，用1×PBS轻柔冲洗一遍以去除多余染料，并用吸水纸将玻片上残留的PBS吸干。最后，将玻片置于激光共聚焦显微镜下下观察生物膜及生物膜细菌的变化情况。以上染色过程中，要避光处理，防止荧光淬灭。
由图3所示，相对于DMSO组(40μm)，N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺单独使用能够在一定程度上减少生物膜的形成量，将生物膜厚度减少至25μm，并且没有红色荧光出现，表明该化合物单独使用没有抑菌作用。单独使用CAZ后，其生物膜厚度为30μm，并且图中仅有弱弱的红色荧光，表明该浓度下的CAZ能够在一定程度上减少生物膜的形成，并仅具有微弱的细菌杀伤能力。而当N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺和CAZ联合使用，生物膜的厚度减少至18μm，并且红色荧光也显著增强，表明N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺和CAZ联合使用既能够增加生物膜细菌对CAZ的敏感性，又能协同减少生物膜的形成量。
如图6所示，相对于DMSO组(40μm)，N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺单独使用能够在一定程度上减少生物膜的形成量，将生物膜厚度减少至25μm，并且没有红色荧光出现，表明该化合物单独使用没有抑菌作用。单独使用TOB后，其生物膜厚度反而增加至80μm，并且图中仅有弱弱的红色荧光，表明该浓度下的TOB能够促进细菌生物膜的形成，并仅具有微弱的细菌杀伤能力。而当N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺和TOB联合使用，生物膜的厚度减少至30μm，并且红色荧光也显著增强，表明N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺和TOB联合使用能够在一定程度上增加生物膜细菌对TOB的敏感性，但是不能协同减少生物膜的形成量。
综上所述，CAZ与N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺联合使用不仅能够增加CAZ对生物膜细菌的杀伤能力，而且还能够协同减少生物膜的形成量，而AK和TOB分别与N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺联合使用只能增加抗生素对生物膜细菌的杀伤能力，但是无法显著降低生物膜形成量。而研究显示，生物膜的存在会增加患者反复感染的风险，导致铜绿假单胞菌导致的感染难以被治愈。因此，AK和TOB分别与N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺的组合物无法被用于治疗慢性感染疾病。此外，N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺的类似物N-(3-环丁内酯)-4-溴苯乙酰胺和N-(3-环丁内酯)-4-硝基苯乙酰胺分别与CAZ联合使用既不能增加生物膜细菌对于CAZ的敏感性，又不能协同减少细菌生物膜的形成量，因此上述组合物也不能够用于治疗慢性感染疾病。而本发明的组合物可以显著降低PA生物膜生成，并提高生物膜PA对抗生素的敏感性，可用于治疗PA慢性感染，具有广阔的临床应用前景。
Claims (10)
1.一种增强生物膜细菌对抗生素敏感性和抑制细菌生物膜形成的组合物，所述组合物的活性成分包括头孢他啶和N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述细菌为铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)。
3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述头孢他啶和N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺的质量比为1:0.83～1:6.5。
4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体或赋形剂。
5.N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺在制备增强生物膜细菌对抗生素敏感性的药物中的应用，所述抗生素为头孢他啶。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述生物膜细菌为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述铜绿假单胞菌为耐药铜绿假单胞菌。
8.如权利要求1-4任一所述的组合物在制备治疗铜绿假单胞菌导致的慢性感染疾病药物中的应用。
9.如权利要求8所述的组合物在制备治疗铜绿假单胞菌生物膜导致的慢性感染疾病药物中的应用。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述铜绿假单胞菌导致的慢性感染疾病包括伤口慢性感染、慢性鼻窦炎、慢性中耳炎。
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