CN117343990A - 确定靶多核苷酸的方法和试剂盒，以及探针组 - Google Patents

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Abstract

一种用于确定在包括额外组分的样品中两个或更多个靶多核苷酸的存在、不存在或量的方法，所述方法包括：(i)使所述样品与两个或更多个探针的组在适于所述靶多核苷酸与所述探针杂交的条件下接触；(ii)使步骤(i)中制备的所述样品与跨膜孔接触，单链多核苷酸但不是双链多核苷酸可以穿过所述跨膜孔，并且对所述跨膜孔施加电位差，使得所述样品中的所述杂交探针与所述孔相互作用；(iii)测量具有限定窗口内的持续时间的电流阻塞；以及(iv)将所述测量的电流阻塞与所述探针相关联，从而确定所述样品中所述两个或更多个靶多核苷酸的存在、不存在或量。

Description

确定靶多核苷酸的方法和试剂盒，以及探针组
本申请为申请日为2017年10月20日、申请号为201780064931X、发明名称为“方法”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及确定样品中靶多核苷酸的存在、不存在或量的方法。本发明还涉及用于所述方法中的探针组和用于进行所述方法的试剂盒。
背景技术
跨膜孔(纳米孔)作为直接电子生物传感器具有很大的潜力，用于各种分析物，如聚合物和小分子。当跨纳米孔施加电位时，当如多核苷酸等分子瞬时驻留在纳米孔的桶或通道中一段时间时，电流发生变化。特定分子，如特定多核苷酸，给出已知特征和持续时间的电流变化。这种电流变化可以用于识别孔中存在的多核苷酸。
跨膜孔可以用于多重测定中以确定一组两种或更多种分析物中每种分析物的存在或不存在。多重测定使用探针组。组中的每个探针包含尾部，所述尾部能够进入孔并影响流过孔的电流和分析物结合区域。每个尾部以不同且独特的方式影响流过孔的电流，这取决于探针是否与感兴趣分析物中的一种结合。组中每个探针对流过孔的电流的影响也是不同的，因此可以检测每个探针的特性。
发明内容
发明人已经开发了用于使用跨膜孔确定一个或多个靶多核苷酸的存在、不存在、或浓度/量的测定。测定使用探针组，每个探针包括能够与靶多核苷酸杂交的区域和非杂交区域(尾部)。当探针与其靶多核苷酸杂交并与跨其施加电场的跨膜孔接触时，非杂交区域将进入跨膜孔并保持在那里直到靶多核苷酸与探针去杂交。停留时间可以限定为电流阻塞的长度，其中电流阻塞是由于样品中与孔相互作用的组分的存在而使流过孔的离子电流减少。电流阻塞的长度可以限定为样品中的组分引起离子电流减小直到组分不再引起所述电流减小的这种时间之间的时间段。对于给定的孔和电位，停留时间取决于靶多核苷酸在施加电位的力下与探针去杂交所花费的时间。施加电位的强度和孔的尺寸也影响停留时间。
发明人已经认识到，可以构建探针组以提供大致相同的停留时间，并且可以用于基于跨膜孔的测定以确定靶多核苷酸的存在、不存在或量。这是特别有利的，例如，当包括靶多核苷酸的样品含有与跨膜孔相互作用的其它组分时。在方法中仅需要分析某些停留时间的电流阻塞。可以从分析排除更长和/或更短的电流阻塞。发明人已经发现，可以通过调节组中一个或多个探针的杂交区域的组成来设计具有大致相同停留时间的探针组。发明人已经发现，可以通过将非天然核苷酸引入杂交区域中来增加或减少探针与其靶多核苷酸保持杂交的时间长度。
因此，在一个方面，本发明提供了一种用于确定在包括额外组分的样品中两个或更多个靶多核苷酸的存在、不存在或量的方法，所述方法包括：
(i)使所述样品与两个或更多个探针的组在适于所述靶多核苷酸与所述探针杂交的条件下接触，其中：
(a)每个探针包括非杂交区域和与所述靶多核苷酸中的一个特异性杂交以形成杂交探针的杂交区域；并且
(b)所述组中的探针的所述杂交区域包括一个或多个非天然核苷酸；
(ii)使步骤(i)中制备的所述样品与跨膜孔接触，单链多核苷酸但不是双链多核苷酸可以穿过所述跨膜孔，并且
对所述跨膜孔施加电位差，使得所述样品中的所述杂交探针与所述孔相互作用；
(iii)测量具有限定窗口内的持续时间的电流阻塞，其中：
(a)存在于所述探针的所述杂交区域中的所述一个或多个非天然核苷酸由于所述探针与其靶多核苷酸杂交而增加或减少所述电流阻塞的所述持续时间，使得与所述杂交区域中存在对应的一个或多个天然核苷酸时相比，由于所述杂交探针与所述孔的相互作用而在所述窗口内发生的电流阻塞的比例增加；并且
(b)每个杂交探针产生指示所述探针的电流阻塞；以及
(iv)将所述测量的电流阻塞与所述探针相关联，从而确定所述样品中所述两个或更多个靶多核苷酸的存在、不存在或量。
本发明的另外方面包含：
-一种诊断疾病的方法，其中所述方法包括执行用于确定两个或更多个靶多核苷酸的存在、不存在或量的所述方法，其中所述靶多核苷酸是所述疾病的标志物；
-一种两个或更多个探针的组，其在用于确定两个或更多个靶多核苷酸的存在、不存在或量的方法中使用；以及
-一种本发明的探针组在检测两个或更多个靶多核苷酸的存在、不存在或量的方法中的用途。
附图说明
应理解的是，附图仅用于说明本发明的具体实施例而并不旨在是限制性的。
图1示出了校准双链体(用微RNA 192形成，并标记为Y)和每个微RNA 150变体和双链体的平均电流阻塞长度。
图2示出了校准双链体(用微RNA 192形成，标记为Y)和每个微RNA 182变体和双链体的平均电流阻塞长度。
图3示出了miRNA:DNA杂交双链体的成功调整。组1示出了未修饰的342_3T_3SPRNA双链体的电流嵌段比和停留时间。组2示出了向原始样品添加停留调整的342_3T_3SP双链体(342 3T_3Sp_all_enh标记为X)。可以观察到杂交区域的修饰(其中杂交区域中的所有核苷酸都是非天然核苷酸)已经将簇的平均停留移动到以1秒为中心的期望窗口内。组3示出了添加校准双链体(标记为Y)，其用于实验之间的比较。
图4示出了如何使用三个度量来确定对应于特定微RNA的簇的同一性:电流阻塞长度(或停留)(A部分)；“变体”或标准偏差(B部分)；和电流阻塞噪声(C部分)。
序列表说明
SEQ ID NO：1是四链体形成序列的实例。
SEQ ID NO：2是编码α-溶血素-E111N/K147N的一种单体的多核苷酸序列(α-HL-NN；Stoddart等人，《美国国家科学院院刊(PNAS)》，2009；106(19):7702-7707)。
SEQ ID NO：3是α-HL-NN的一种单体的氨基酸序列。
SEQ ID No：4到26示出了在实例中使用的多核苷酸序列。
应理解的是，序列不旨在是限制性的。
具体实施方式
应理解的是，所公开的产品和方法的不同应用可以根据本领域的特定需要而定制。还应理解的是，本文所用的术语仅出于描述本发明的具体实施例的目的而并不旨在是限制性的。
此外，如在本说明书中所使用的，除非内容另外明确指明，否则单数形式的“一种(a)”、“一个(an)”以及“所述”均包含复数对象。因此，提及“一个孔”包含两个或更多个这种孔，提及“一个尾部”包含两个或更多个这种尾部，提及“一个多核苷酸”包含两个或更多个这种多核苷酸，等等。
本文，无论是上文还是下文所引用的所有公开、专利和专利申请特此通过引用以其整体并入。
方法
发明人已经开发了用于检测和/或分析一个或多个靶多核苷酸的测定，例如，使用跨膜孔确定一个或多个靶多核苷酸的存在、不存在、或浓度/量。在一个方面，本文提供了一种测定，其使用探针组，每个探针包括能够与靶多核苷酸(例如，杂交区域)杂交的区域和非杂交区域。在探针的杂交区域与靶多核苷酸的一部分之间杂交时，跨跨膜孔施加电位以使探针的非杂交区域的至少一部分进入跨膜孔并与跨膜孔相互作用，从而减少通过跨膜孔的离子电流。与孔相互作用的非杂交区域的一部分保留在跨膜孔内，直到靶多核苷酸与探针的杂交区域去杂交。去杂交是由孔的解链效应(即，跨膜施加的电压)引起的。当靶和探针杂交时进行测量，但最终靶将与探针的杂交区域完全去杂交。与跨膜孔相互作用的非杂交区域部分保留在跨膜孔内的时间长度通常对应于发生电流阻塞的时间长度。这被称为“停留时间”。因此，停留时间可以限定为发生电流阻塞的时间长度，其中电流阻塞指示由于样品中与孔相互作用的组分的存在而使流过孔的离子电流减少。发生电流阻塞的时间长度可以限定为样品中的组分引起通过跨膜孔的离子电流减少与组分不再这样做之间的时间段。对于给定的跨膜孔和电位，停留时间可以取决于靶多核苷酸在施加电位的力下与探针的杂交区域去杂交所花费的时间。在一些实施例中，施加电位的强度和/或孔的尺寸也可以影响停留时间。在一些实施例中，探针的杂交区域与靶多核苷酸的对应部分之间的结合亲和力也可以影响停留时间。
发明人已经认识到构建以提供大致相同的停留时间(例如，在10％的差异内，在5％的差异内，或在1％的差异内)的探针组可以用于基于跨膜孔的测定以确定一个或多个靶多核苷酸的存在、不存在或量。停留时间窗口的范围通常为1纳秒到100秒，10微秒到10秒。约0.5秒的停留时间窗口是最佳的。
例如，当包括靶多核苷酸的样品含有可以与跨膜孔相互作用的其它组分(例如，非靶多核苷酸和/或非靶分析物)时，这是特别有利的。仅需要分析某些停留时间的电流阻塞以确定一个或多个靶多核苷酸的存在、不存在或量。可以从分析排除更长和/或更短的电流阻塞。
可以通过改变组中一个或多个探针的杂交区域的组成或构成来设计具有大致相同的停留时间窗口的探针组。发明人已经发现，通过将适当类型、图案和/或数量的非天然核苷酸引入到杂交区域中，可以增加或减少探针的杂交区域与靶多核苷酸的对应部分保持杂交的时间长度。
发明人还已经示出，探针组可以被设计成进行多重多核苷酸测定(例如，为了区分第一靶多核苷酸与第二靶多核苷酸)。例如，通过设计组中每个探针的非杂交区域以赋予指示不同靶多核苷酸的独特信号图案，其与具有与上述大致相同的停留时间窗口的探针的特征组合，可以分析发生在限定的停留时间窗口内的电流阻塞信号图案以检测样品中的多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个)不同的靶多核苷酸。除了具有大致相同的停留时间窗口的探针之外，应当构建每个探针的非杂交区域以赋予指示不同靶多核苷酸的独特信号图案，以允许多重测定。在一个实施例中，每个探针的非杂交区域可以包括多T或无碱基核苷酸。无碱基核苷酸既没有嘌呤也没有嘧啶碱基。
在一个方面，本发明提供了一种确定包括额外组分的样品中两个或更多个靶多核苷酸的存在、不存在或量的方法。
所述方法包括使样品与两个或更多个探针的组接触。此步骤在适于靶多核苷酸与探针杂交的条件下进行。组中的每个探针特异性结合靶多核苷酸并包括非杂交区域和杂交区域。杂交区域与靶多核苷酸特异性杂交。非杂交区域能够进入跨膜孔，单链多核苷酸但不是双链多核苷酸可以在施加的电位差下通过所述跨膜孔。非杂交区域对流过孔的电流具有不同的影响，这取决于探针是否与其靶多核苷酸杂交。
如果靶多核苷酸存在于样品中，则探针通常在允许探针与它们各自的靶多核苷酸杂交的条件下与样品接触。允许杂交的条件是本领域公知的(例如，Sambrook等人，2001，《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:a laboratory manual)》，第3版，冷泉港实验室出版社；以及《当代分子生物学实验手册(Current Protocols in MolecularBiology)》，第2章，Ausubel等人编辑，格林出版与威利交叉科学出版社(GreenePublishing and Wiley-lnterscience)，纽约，(1995))。杂交可以在低严格条件下进行，例如在37℃下存在30％到35％甲酰胺，1M NaCl和1％ SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液，然后在50℃下在1X(0.1650M Na+)到2X(0.33M Na+)SSC(标准柠檬酸钠)中洗涤。杂交可以在中严格条件下进行，例如在37℃下存在40％到45％甲酰胺，1M NaCl和1％ SDS的缓冲溶液，然后在55℃下在0.5X(0.0825M Na+)到1X(0.1650M Na+)SSC中洗涤。杂交可以在高严格条件下进行，例如在37℃下存在50％甲酰胺，1M NaCl，1％ SDS的缓冲溶液，然后在60℃下在0.1X(0.0165M Na+)SSC中洗涤。
合适的杂交条件包含40mM KCl，10mM HEPES，pH8，在约97℃下2.5分钟。然后每5秒钟将温度降低0.1℃，直到温度达到20℃。优选的杂交条件是实例中描述的那些。在具体实例中，杂交条件是50mM NaCl，10mM Tris pH7.5，在约95℃下2.5分钟。然后每5秒钟将温度降低0.1℃，直到温度达到约18℃。杂交之后，探针可以在分析之前保持在约4℃。
方法包括使样品与跨膜孔接触，单链多核苷酸但不是双链多核苷酸可以穿过所述跨膜孔。当使样品和探针组与跨膜孔接触时，优选地跨孔施加电位。这允许样品中的杂交探针与孔相互作用。所施加的电位可以是电压电位。替代性地，所施加的电位可以是化学电位。此的实例是跨两亲层使用盐梯度。盐梯度公开在Holden等人，《美国化学学会期刊(J AmChem Soc.)》，2007Jul11:129(27):8650-5中。
通常，杂交区域与靶多核苷酸内的序列互补至少约80％，如至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少100％。
方法还包括测量流过孔的离子电流，以确定组中哪些探针，如果有的话，已经与靶多核苷酸结合，并且从而确定样品中一个或多个靶多核苷酸的存在或不存在，以及任选地浓度/量。离子电流的测量可以包括测量电流或测量指示流动的光学信号。可以使用本领域中已知的任何方法来测量电流。当与它们各自的靶多核苷酸杂交时，组中的不同探针以不同且独特的方式影响流过孔的电流。这允许识别组中的特定探针。由于可以测量探针的特性及其与靶多核苷酸的结合，因此可以确定样品中靶多核苷酸的存在或不存在以及任选地量。因此，方法包括将测量的电流阻塞与探针相关联，从而确定样品中两个或更多个靶多核苷酸的存在或不存在以及任选地量。
组的至少一个探针的杂交区域包括一个或多个非天然核苷酸。存在于所述探针的所述杂交区域中的所述一个或多个非天然核苷酸由于所述探针与其靶多核苷酸杂交而增加或减少所述电流阻塞的所述持续时间，使得与所述杂交区域中存在对应的一个或多个天然核苷酸时相比，由于所述杂交的探针与所述孔的相互作用，发生在限定窗口内的电流阻塞的比例增加。与使用不含非天然核苷酸的杂交序列获得的电流阻塞的持续时间相比，使用含有非天然核苷酸的杂交序列获得的电流阻塞的持续时间可以例如增加或减少约50％，约20％，约10％，约5％或约1％。这允许通过仅测量落入限定窗口内的电流阻塞来确定靶多核苷酸的存在或不存在。除了杂交的孔之外，由样品中的组分引起的电流阻塞可以从分析排除。额外组分可以例如包括非靶多核苷酸、折叠和未折叠蛋白质、肽、碳水化合物、短聚合物和细胞碎片中的一种或多种。因此，本发明的方法特别适用于分析脏样品或复杂基质样品，如生物样品和/或含有低浓度的靶多核苷酸中的一个或多个的样品。低浓度可以是例如以飞摩尔、阿托摩尔、微摩尔或纳摩尔测量的浓度。
来自测定的输出可以被实时分析，允许当已经得到足够的信息时停止测定。方法允许在最少或没有样品制备的情况下检测单个样品中的多个多核苷酸，例如直接取自患者的体液样品，从而允许由具有最少培训或资格的人员进行方法。这移除或减少了涉及洗涤步骤或移除样品制备中未结合的探针和/或多核苷酸的步骤的需要。
样品
样品可以是任何合适的样品。合适的样品是适合于本文所述方法的样品。方法通常在已知含有或疑似含有靶多核苷酸中的至少一个，如至少两个或更多个的样品上进行。方法允许在样品中存在其它组分的情况下检测靶多核苷酸。方法将由探针与其靶多肽相互作用产生的电流阻塞从样品中存在的其它组分产生的电流阻塞中滤出。这种其它组分包含但不限于，例如，以下中的一种或多种：可以折叠或未折叠的蛋白质、肽、碳水化合物、聚合物，如非靶多核苷酸；和细胞碎片。
样品可以是生物样品。可以在从任何生物体或微生物获得或提取的样品上体外进行本方法。生物体或微生物通常是古细菌、原核或真核微生物，并且通常属于以下五界中的一种：植物界、动物界、真菌界、原核生物界和原生生物界。可以在从任何病毒获得或提取的样品上体外进行本发明。
样品可以是流体样品。在一个实施例中，样品可以包括体液。体液可以从人或动物获得。人或动物可能患有、疑似患有疾病或有患病风险。样品可以是尿液、淋巴液、唾液、粘液、精液或羊膜液，但优选地是全血、血浆或血清。通常，样品来源于人，但替代性地其可以来自另一种哺乳动物，如来自商业养殖动物，如马、牛、绵羊或猪，或替代性地可以是宠物，如猫或狗。样品可以是细胞悬浮液或组织匀浆。
替代性地，来源于植物的样品通常从经济作物获得，如谷物、豆科植物、果实或蔬菜，例如小麦、大麦、燕麦、油菜、玉米、大豆、稻谷、香蕉、苹果、蕃茄、马铃薯、葡萄、烟草、菜豆、小扁豆、甘蔗、可可、棉花、茶叶或咖啡。
样品可以是非生物样品。非生物样品优选地是流体样品。非生物样品的实例包含手术液、水，如饮用水、海水或河水、和实验室测试用试剂。
样品可以在测定之前被处理，例如通过离心或穿过滤出不需要的分子或如红细胞等细胞的膜。可以在紧接着取得样品之后对其进行测量。通常也可以在测定之前储存样品，例如在-70℃，或低于-70℃的温度下。
靶多核苷酸
探针组或探针可以用于确定一个或多个靶多核苷酸的存在、不存在或量，如1个、2个、5个、10个、15个、20个、30个、40个、50个、100个、500个、1000个、1500个、1750个、2000个或更多个靶多核苷酸。优选地，探针组或探针可以用于确定约1个到约2000个多核苷酸的存在、不存在或量，如约5个到约1500个多核苷酸，约10个到约1000个多核苷酸，约20个到约500个多核苷酸或约50个到约100个多核苷酸。
多核苷酸是包括两个或更多个核苷酸的大分子。靶多核苷酸可以包括任何核苷酸的任何组合。核苷酸可以是天然存在的或人工的。靶多核苷酸中的一个或多个核苷酸可以被氧化或甲基化。靶多核苷酸中的一个或多个核苷酸可以是受损的。例如，多核苷酸可以包括嘧啶二聚体。这种二聚体通常与紫外光引起的损坏相关联并且是皮肤黑色素瘤的主要病因。靶多核苷酸中的一个或多个核苷酸可以例如用标记或标签修饰。
靶多核苷酸可以是单链的或双链的。多核苷酸的至少一部分可以是双链的。靶多核苷酸优选地是单链的。靶多核苷酸可以是来自双链多核苷酸的一条链。多核苷酸可以是核酸，如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。多核苷酸可以包括与一条DNA链杂交的一条RNA链。多核苷酸可以是本领域已知的任何合成核酸，如肽核酸(PNA)、甘油核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、锁核酸(LNA)或具有核苷酸侧链的其它合成聚合物。多核苷酸可以包括本文讨论的核苷酸中的任何核苷酸，包含无碱基和经修饰的核苷酸。
靶多核苷酸可以是从细胞分泌的多核苷酸。替代性地，靶多核苷酸可以是存在于细胞内部的多核苷酸，使得在可以进行本发明之前必须从细胞提取多核苷酸。
靶多核苷酸可以是任何长度。例如，多核苷酸的长度可以是至少7个、至少10个、至少50个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少300个、至少400个或至少500个核苷酸或核苷酸对。例如，多核苷酸的长度可以是约7个到约200个核苷酸、约10个到约500个核苷酸、约50个到约400个核苷酸、约100个到约300个核苷酸或约150个到约250个核苷酸。多核苷酸可以是多达约1000个或更多个核苷酸，长度多达约5000个或更多个核苷酸或长度多达约100000个或更多个核苷酸。靶多核苷酸可以是寡核苷酸。寡核苷酸是短核苷酸聚合物，其通常具有50个或更少核苷酸，如40个或更少、30个或更少、20个或更少、10个或更少或5个或更少核苷酸。靶寡核苷酸的长度优选地为约15个到约30个核苷酸，如长度为约20个到约25个核苷酸。例如，寡核苷酸的长度可以是约15个、约16个、约17个、约18个、约19个、约20个、约21个、约22个、约23个、约24个、约25个、约26个、约27个、约28个、约29个或约30个核苷酸。
靶多核苷酸可以是任何一组多核苷酸。例如，组可以与特定表型相关联。组可以与特定类型的细胞相关联。例如，组可以指示细菌细胞。组可以指示病毒、真菌或寄生虫。
靶多核苷酸可以是由两个或更多个多核苷酸构成的组，所述多核苷酸是与特定疾病或病状相关联的生物标志物。生物标志物可以用于诊断或预测疾病或病状。合适的生物标志物组是本领域已知的，例如如Edwards等人(2008)《分子细胞蛋白质组学(Mol.Cell.Proteomics)》，7,p1824-1837；Jacquet等人(2009)《分子细胞蛋白质组学(Mol.Cell.Proteomics)》，8,p2687-2699；Anderson等人(2010)《Clin.Chem.(临床化学)56》，177-185中所述。疾病或病状优选地为癌症、心脏病，包含冠心病和心血管疾病，或传染病，如败血症。
靶寡核苷酸或多核苷酸优选地是微RNA(或miRNA)或siRNA。siRNA是一类双链RNA分子，长度为20个到25个碱基对，类似于miRNA。一组两个或更多个靶寡核苷酸或多核苷酸优选地是一组两个或更多个miRNA。适用于本发明的miRNA是本领域熟知的。例如，合适的miRNA存储在公开可用的数据库上(Jiang等人，(2009)“miR2Disease：用于人类疾病中微RNA失调的手动精选数据库”核酸研究(Nucleic Acids Res.)37(数据库问题)：D98到104)。
探针组
所述方法包括使样品与两个或更多个探针的组接触。在一个方面，本发明还提供了一种两个或更多个探针的组。所述一组两个或更多个探针可以用于确定样品中一个或多个靶多核苷酸的存在、不存在或量。两个或更多个探针各自包括非杂交区域和杂交区域，如下所述。所述组中的每个探针可以进一步包括允许其联接到膜的锚。示例性锚是脂质结合分子，如胆固醇。
在探针组中，探针中至少两个的非杂交区域，如组中探针的至少三个、至少四个、至少五个或更多个彼此不同。在利用这种探针组确定至少两个靶多核苷酸的存在、不存在或量的方法中，靶多核苷酸与至少两个探针中的每一个杂交。在一个实施例中，组中的每个探针(即每个类型的探针)包括独特的非杂交区域。组中探针中不同非杂交区域之间的差异可能有助于每个探针对流过孔的电流的影响的独特性。
探针组通常包括组中每个或每个探针的多个拷贝。如果样品中存在靶多核苷酸，则样品中几乎肯定存在靶多核苷酸的多个实例。
优选地，探针中每一个的杂交区域中的每一个是独特的，使得当样品中存在多个拷贝的靶多核苷酸时，靶多核苷酸仅与样品中的一种类型的探针杂交。换句话说，优选组中没有两个探针(即没有两种类型的探针)包括相同的杂交区域。这意味着当靶多核苷酸存在于样品中时，它总是产生相同的独特电流阻塞，其主要由与其结合的探针的非杂交区域确定。
在一个实施例中，组中的两个或更多个探针可以包括相同的杂交区域和不同的非杂交区域。在此实施例中，每个探针对流过孔的电流的影响的独特性通常由非杂交区域之间的差异提供。在此实施例中，两个(或更多个)探针靶向相同的靶多核苷酸。这可以提供内部对照，因为需要来自两个探针的阳性信号来推断靶多核苷酸存在于样品中。
组中的两个或更多个探针可以包括不同的杂交区域和相同的非杂交区域。在此实施例中，每个探针对流过孔的电流的影响的独特性通常由杂交区域中的差异提供。设计杂交区域使得它们产生具有类似持续时间的电流阻塞。因此，任何差异都可能是微妙的。因此，此实施例特别适用于不希望区分不同的靶多核苷酸的情况，或者杂交区域结合到相同靶多核苷酸的不同部分的情况。
在一个实施例中，组中的每个探针(即每种类型的探针)包括不同的杂交区域和不同的非杂交区域。换句话说，组中的每个探针具有独特的杂交区域和独特的非杂交区域。在此实施例中，杂交区域和不同的非杂交区域通常都有助于两个或更多个探针中的每一个对流过孔的电流的影响的独特性。这有助于区分样品中存在的不同靶多核苷酸。
组可以包括任何数量的两个或更多个探针，如2个、5个、10个、15个、20个、30个、40个、50个、100个或更多个探针。组优选地具有约4个到约100个探针，如约5个到约80个探针，约10个到约60个探针或约20个到约50个探针。组中探针的数量(即探针的类型)通常与待检测的靶多核苷酸的数量相同或更大。如果组中探针的数量大于靶多核苷酸的数目，则可以将两个或更多个探针靶向相同的靶多核苷酸，并且本发明的方法包括如上所述的内部对照。
探针可以是任何长度。例如，探针的长度可以是约17个到约240个核苷酸。例如约20个到约200个核苷酸，约30个到约150个、约40个到约100个或约50个到约70个核苷酸。探针可以是单链的，或者可以包括一个或多个，如两个或三个单链部分和一个或多个，如两个或三个双链部分。探针可以在杂交区域与非杂交区域之间包括一个或多个接头。
杂交区域和非杂交区域可以位于探针中的任何位置。非杂交区域可以是杂交区域的3'或5'。优选地，非杂交区域是组中探针的至少一个，并且优选地所有中的杂交区域的5'。
在一个实施例中，探针中的至少一个包括单个杂交区域和单个非杂交区域，例如探针由单个杂交区域和单个非杂交区域组成或基本上由其组成。通常，组中的所有探针具有相同的基本结构，例如在探针内以相同的朝向都含有相同数量的杂交区域和非杂交区域。
在一些实施例中，探针中的至少一个可以进一步包括除第一非杂交区域之外的第二非杂交区域和第二杂交区域、四链体形成序列或第一非杂交区域与第二非杂交区域之间的双链区域。
优选地，组中的所有探针具有相同的总体结构。例如，所有探针可以具有相同的杂交和非杂交区域的布置，并且如果存在，可以具有四链体形成序列和/或双链区域。在此实施例中，测量的电流阻塞的窗口可以涵盖由整个探针与孔相互作用产生的电流阻塞。这优选地是所有探针具有相同总体结构的情况。替代性地，测量的窗口内的电流阻塞可以是部分电流阻塞，每个阻断对应于探针的非杂交区域在与孔中的非杂交区域相邻的杂交区域去杂交之前与孔的桶或通道相互作用的时间。这优选地是探针具有不同总体结构的情况，特别是在探针具有不同数量的杂交区域的情况下。
两个杂交区域可以结合相同的靶多核苷酸或两个不同的靶多核苷酸。当两个杂交区域结合不同的靶多核苷酸时，靶多核苷酸优选地以某种方式相关联，例如指示相同的疾病或病状。
优选地，两个杂交区域都结合相同的靶多核苷酸，并且可以是相同的，使得它们结合靶多核苷酸的相同区域，或者可以结合相同靶多核苷酸的不同部分。在任一情况下，优选非杂交区域导致预限定窗口内的电流阻塞。
当探针包括四链体形成区域或双链区域时，四链体或双链区域不能穿过孔，导致第二非杂交区域保持在孔中并且使得能够测量第二非杂交区域的电流特性。第二非杂交区域保持在孔中的时间通常导致与电流阻塞相同的窗口中的电流阻塞，所述电流阻塞是由靶多核苷酸与保持孔中的第一非杂交区域的探针的杂交区域杂交产生的。
因此，当靶多核苷酸存在于样品中时，其将导致具有一部分和另一部分的电流阻塞，所述一部分是第一非杂交区域的特征，所述另一部分是第二非杂交区域的特征。第一非杂交区域和第二非杂交区域可以相同或不同。
使用第二非杂交区域结合第二杂交区域、四链体形成区域或双链区域使得能够使用相同数量的不同非杂交区域区分更多的靶多核苷酸。例如，当组中的每个探针包括单个杂交区域和单个非杂交区域时，六个不同的非杂交区域，每个包括不同的“条形码”，可以用于区分六种不同的靶多核苷酸。然而，当组中的每个探针包括两个非杂交区域时，非杂交区域的36个不同组合是可能的，并且因此组可以用于检测36个不同的靶多核苷酸。
在组的探针中的至少一个，并且优选地所有探针中，所述杂交区域或杂交区域位于探针的末端处，其可以是3'末端或5'末端。
探针的杂交和非杂交区域可以直接附接，或者可以通过接头连接。可以使用任何合适的接头。接头优选地是聚合物。聚合物优选地是多核苷酸、多肽或聚乙二醇(PEG)。
在一个优选实施例中，探针中的一个或多个进一步包括允许其与膜偶联的锚。
杂交区域
杂交区域特异性结合靶多核苷酸。优选地，杂交区域结合靶多核苷酸的亲和力比其对其它(非靶)多核苷酸的亲和力大至少10倍，如至少50倍、至少100倍、至少200倍、至少300倍、至少400倍、至少500倍、至少1000倍或至少10,000倍，例如在适于进行本文所述方法的条件下。可以使用已知的结合测定来测量亲和力，如利用荧光和放射性同位素的那些。竞争性结合测定也是本领域已知的。优选地，杂交区域不通过碱基配对结合任何其它寡核苷酸或多核苷酸(任何非靶多核苷酸)。
最优选地，即使在高严格条件下，杂交区域也不与任何其它寡核苷酸或多核苷酸(任何非靶多核苷酸)杂交。
杂交区域通常包括与靶多核苷酸至少部分互补的核酸序列。在优选实施例中，杂交区域是多核苷酸，如DNA或RNA。杂交通常是单链的。
杂交区域可以在靶多核苷酸的整个长度上或靶多核苷酸的至少10个、20个或30个核苷酸的区域内与靶多核苷酸的互补序列具有至少90％，如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的核苷酸同一性。杂交区域可以在其整个长度上与靶多核苷酸的互补序列相同，或与靶多核苷酸的至少10个、20个或30个核苷酸的区域相同，除了一个或多个天然核苷酸被一个或多个非天然核苷酸取代的位点。
不同的杂交区域以不同的程度结合到靶多核苷酸，例如具有不同的结合常数。以更大强度结合到靶多核苷酸的杂交区域通常会阻止探针移动通过孔更长的时间段，并且这可以通过测量流过孔的电流来识别。相反的情况也是如此，例如以更小强度结合到靶多核苷酸的杂交区域会阻止探针移动通过孔更短的时间，并且这可以通过测量流过孔的电流来识别。
通过引入一个或多个碱基对错配，可以降低在用于确定两个或更多个靶多核苷酸的存在、不存在或量的方法中使用的条件下结合靶多核苷酸的强度。在优选实施例中，当通过将一个或多个非天然核苷酸引入探针的杂交区域中，用于确定如本文所述的两个或更多个靶多核苷酸的存在、不存在或量的方法中时，可以调节探针与其靶多核苷酸的结合强度以提供杂交探针的限定停留时间。探针中的至少一个的杂交区域包括一个或多个非天然氨基酸以增加或降低结合强度，例如增加或减少杂交探针与孔相互作用的时间长度。
当探针的非杂交区域在跨膜孔的桶内时，引入非天然氨基酸的位点对于确定探针保持结合靶多核苷酸的时间长度可能是重要的。例如，削弱探针的杂交区域与靶多核苷酸之间的相互作用的非天然氨基酸可以存在于杂交区域的末端，其邻接非杂交区域，以促进去杂交并缩短杂交探针的停留时间。
设计探针组，使得当在施加的电位下与跨膜孔接触时，组中探针中的每一个的杂交区域保持结合到其各自的靶多核苷酸类似的时间段。这通过将至少一个非天然核苷酸引入组中一个或多个探针的杂交区域中来实现。可以将一个或多个非天然核苷酸引入组中探针的一些或所有的杂交区域中。例如，组中的两个到100个，如5个到80个或10个到50个探针可以含有一个或多个非天然核苷酸。确切的数量取决于组的大小以及杂交区域的长度和序列。例如，约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的组中探针可以包括一个或多个非天然核苷酸。
杂交区域可以是任何长度，条件是实现所需的停留时间，例如，当在施用电位下与跨膜孔接触时，当结合到其各自的靶多核苷酸时，组中探针的停留时间是类似的。杂交区域的长度通常为至少10个核苷酸，如约15个到约50个，约20个到约40个或约25个到约30个核苷酸的长度，优选地约18个到约25个核苷酸。
杂交区域中的核苷酸的全部或一些可以是非天然核苷酸。杂交区域可以例如包括1个到约50个，如2个到约40个，3个到约30个或5个到约20个或约10个到约15个非天然核苷酸，如6个、7个、8个或9个非天然核苷酸，以实现所需的去杂交。例如，杂交区域中1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％或更多，如多达约50％的核苷酸可以是非天然的。在探针组中，探针中的零个、一个、两个或更多个可以仅包括杂交区域中的天然核苷酸，条件是探针中的至少一个如两个或更多个，例如3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个或更多个包括包括至少一个非天然核苷酸的杂交区域。
非天然核苷酸是自然界中不存在的核苷酸。非天然核苷酸通常含有核碱基、糖和至少一个磷酸基，其中核苷酸的组分中的一个被修饰。非天然核苷酸可以包括经修饰的糖和/或经修饰的核碱基。优选地，非天然核苷酸包括经修饰的糖或经修饰的核碱基。经修饰的糖包含但不限于2'O-甲基核糖。非天然核苷酸可以是肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)和解锁核酸(UNA)、桥接核酸(BNA)或吗啉代(morpholino)、硫代磷酸酯或甲基膦酸酯。非天然核苷酸修饰的核碱基包含但不限于三环胞嘧啶类似物、2-氨基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶、C(5)-丙炔基胞嘧啶、C(5)-丙炔基尿嘧啶、2-氨基嘌呤和6-氮杂嘧啶。
非天然核苷酸可以是在某种程度上与靶多核苷酸中的所有核苷酸杂交的核苷酸。非天然核苷酸优选地是在某种程度上与包括核苷腺苷(A)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)、鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)的核苷酸杂交的核苷酸。
非天然核苷酸可以是通用核苷酸。通用核苷酸可以包含在杂交区域中，但是会损害特异性。通用核苷酸可以包含在杂交区域中，其中期望检测多于一种靶多核苷酸，其中不必在类似的靶多核苷酸之间进行区分。通用核苷酸是在某种程度上与模板多核苷酸中的所有核苷酸杂交或结合的核苷酸。通用核苷酸优选地是在某种程度上与包括核苷腺苷(A)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)、鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)的核苷酸杂交或结合的核苷酸。与与其它核苷酸的杂交或结合强度相比，通用核苷酸可以以更大强度与一些核苷酸杂交或结合。例如，包括核苷、2'-脱氧的通用核苷酸(I)将示出I-C>I-A>I-G约＝I-T的配对的优先顺序。
探针中的非天然核苷酸可以以任何方式附接到探针中的其它非天然核苷酸或探针中的天然核苷酸。非天然核苷酸和天然核苷酸通常通过其糖和磷酸基附接，如在核酸中那样。非天然核苷酸或天然核苷酸可以通过其核碱基连接，如在嘧啶二聚体中那样。
可以将非天然核苷酸引入探针中，以便在与其靶多核苷酸杂交时增加探针的停留时间。术语非天然核苷酸旨在包含除鸟嘌呤、胞嘧啶、苏氨酸和丙氨酸之外的所有核苷酸。非天然核苷酸包含经修饰的或非经典的碱基。增加停留时间的非天然核苷酸包含但不限于2-O-甲基-RNA碱基。其它非天然核苷酸包含例如锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、桥接核酸(BNA)、乙二醇核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、吗啉代、丙烯基脱氧尿苷和丙烯基脱氧胞苷。事实上，引入探针中的核苷酸可以是天然的或非天然的，只要改变双链体的Tm以改变/改善停留时间即可。
如果含有非天然核苷酸的杂交探针的停留时间大于杂交探针的停留时间，则所述杂交探针的停留时间被认为已经增加，所述杂交探针不同于仅含有非天然核苷酸的杂交探针，因为它包括在非天然核苷酸的位置处与靶序列互补的天然核苷酸。
可以将非天然核苷酸引入探针中，以便在与其靶多核苷酸杂交时减少探针的停留时间。减少重复单元停留时间的非天然核苷酸包含但不限于2-氨基嘌呤、解锁核酸(UNA)、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和6-氮杂嘧啶。2-氨基嘌呤可以取代寡核苷酸中的dA。它是一种对局部环境敏感的天然荧光碱，使其成为监测DNA发夹的结构和动力学以及检测双链体碱基堆积状态的有用探针。2-氨基嘌呤可以是不稳定的并且可以略微降低Tm。UNA对Tm的影响取决于构建体、糖类型和位置。然而，通常UNA每次更换将Tm降低5℃到10℃。然而，寡核苷酸中过多的UNA修饰可以阻碍双链体杂交。通常，硫代磷酸酯略微降低RNA双链体的Tm，甲基膦酸酯降低Tm更多并且UNA将具有最大效果。如果含有非天然核苷酸的杂交探针的停留时间小于杂交探针的停留时间，则所述杂交探针的停留时间被认为已经减少，所述杂交探针不同于仅含有非天然核苷酸的杂交探针，因为它包括在非天然核苷酸的位置处与靶序列互补的天然核苷酸。
非天然核苷酸可以是无碱基核苷酸。通过在杂交区域中包含一个或多个无碱基核苷酸可以减少停留时间。然而，无碱基残基的包含将损害特异性。无碱基核苷酸可以包含在杂交区域中，其中期望检测多于一种靶多核苷酸，但不必在类似的靶多核苷酸之间进行区分。无碱基核苷酸是缺乏核碱基的核苷酸。无碱基核苷酸通常含有糖和至少一个磷酸基。糖通常是戊糖，如核糖和脱氧核糖。无碱基核苷酸通常是无碱基核糖核苷酸或无碱基脱氧核糖核苷酸。无碱基核苷酸通常含有单磷酸盐、二磷酸盐或三磷酸盐。磷酸可以附接在无碱基核苷酸的5'或3'侧上。
通过在杂交区域中包含一个或多个碱基对错配可以减少停留时间。然而，碱基对错配的包含将损害特异性。碱基对错配可以包含在杂交区域中，其中期望检测多于一种靶多核苷酸，但不必在类似的靶多核苷酸之间进行区分。
可以通过改变杂交区域中非天然核苷酸的数量和/或通过改变杂交区域中非天然核苷酸的分布图案来微调停留时间。通常增加增加杂交区域中停留时间的非天然核苷酸的数量将进一步增加停留时间。
例如，具有非天然核苷酸的杂交区域，其增加停留时间，沿着杂交区域的长度均匀分布将导致比聚集在杂交区域的一个末端处具有相同数量的相同非天然核苷酸的杂交区域更长的停留时间。增加相邻非天然核苷酸的数量，这增加了杂交区域中的停留时间，在图案中将进一步增加停留时间。例如，具有非天然和天然核苷酸图案的杂交区域，其序列为ZXNY或NYZX，其中Z是非天然核苷酸，并且N是天然核苷酸，其中X是1且Y是1将导致比X是2且Y是1的停留时间短的停留时间，并且其中X是2且Y是1的停留时间将导致比X是3且Y是1的停留时间短的停留时间。
杂交区域可以包括天然和非天然核苷酸的图案或由其组成。杂交区域优选地包括ZXNY和/或NYZX的一个或多个实例的图案或由其组成，其中Z是非天然核苷酸，并且N是天然核苷酸。图案可以是规则的或不规则的。杂交区域可以包括ZXNY的一个或多个实例或由其组成。杂交区域可以包括NYZX的一个或多个实例或由其组成。杂交区域可以包括ZXNY和NYZX的一个或多个实例或由其组成。杂交区域优选地包括ZXNY和/或NYZX的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个实例或由其组成。
如果杂交区域中存在两个或更多个非天然核苷酸，则非天然核苷酸可以相同或不同。优选地，杂交区域中Z的所有实例是相同类型的非天然核苷酸。
N通常与靶多核苷酸中的核苷酸中的一个互补。Z优选地与靶多核苷酸中的核苷酸中的一个互补。对于本领域技术人员来说，识别互补的核苷酸是直截了当的。如果核苷酸通过碱基配对，优选地Watson和Crick碱基配对，与核苷酸杂交，则核苷酸与另一个核苷酸互补。互补核苷酸可以与其不互补的其它核苷酸杂交，但其程度小于与其互补的核苷酸杂交的程度。N优选地包括核碱基腺嘌呤(A)、尿嘧啶(U)、鸟嘌呤(G)或胞嘧啶(C)中的一种。替代性地，N优选地包括核碱基A、胸腺嘧啶(T)、G或C。A与T或U互补，并且反之亦然。G与C互补，并且反之亦然。
对于ZXNY和/或NYZX，X是1、2、3、4、5或6，并且Y是1、2、3、4、5或6。ZXNY和/或NYZX的图案优选地是规则的。这允许非天然核苷酸在整个杂交区域中均匀分布。特别地，X和/或Y在ZXNY和/或NYZX的不同实例中可以是相同的。X和Y两者优选地在ZXNY和/或NYZX的不同实例中相同，即在组的探针中的不同杂交区域中。例如，在ZXNY和/或NYZX的至少一个实例中：(i)X是1且Y是1；(ii)X是2且Y是2；(iii)X是3且Y是3；(iv)X是4且Y是4；(v)X是5且Y是5；(vi)Y是1且Z是2、3、4、5或6；(vii)Y是2、3、4、5或6且Z是1；(viii)Y是2且Z是2、3、4、5或6；(viii)Y是2、3、4、5或6且Z是2；(ix)Y是3且Z是3、4、5或6；或(x)Y是3、4、5或6且Z是3。杂交区域中的至少一个和任选地所有可以具有规则图案。
组中探针中的杂交区域中的一个或多个，任选地所有可以包括或由以下组成：
(a)ZN-ZN-ZN-ZN-ZN-ZN；
(b)NZ-NZ-NZ-NZ-NZ-NZ；
(c)ZZNN-ZZNN-ZZNN；
(d)NNZZ-NNZZ-NNZZ；
(e)ZZZNNN-ZZZNNN；
(f)NNNZZZ-NNNZZZ；
(g)ZZZZNNNN-ZZZZNNNN；
(h)NNNNZZZZ-NNNNZZZZ；
(i)ZN-ZN-ZN-ZN；
(j)NZ-NZ-NZ-NZ；
(k)ZZNN-ZZNN；
(l)NNZZ-NNZZ；
(m)ZZZZNNNN；
(n)NNNNZZZZ；
(o)ZZN-ZZN-ZZN；
(p)NNZ-NNZ-NNZ；
(q)ZZZN-ZZZN-ZZZN-ZZZN；
(r)NNNZ-NNNZ-NNNZ-NNNZ；
(s)ZZZN-ZZZN-ZZZN；或
(t)NNNZ-NNNZ-NNNZ
(u)NNNNZ-NNNNZ-NNNNZ
(v)ZNNNN-ZNNNN-ZNNNN
(w)NNNNNZ-NNNNNZ-NNNNNZ
(x)ZNNNNN-ZNNNNN-ZNNNNN。
在上文中，“-”用于表示目的以分离ZXNY或NYZX的重复单元。以下同样适用。
ZXNY和/或NYZX的图案可以是不规则的。特别地，X和/或Y在ZXNY和/或NYZX的不同实例中可以是不同的。X和Y更优选地在ZXNY和/或NYZX的不同实例中不同，即在组的探针中的不同杂交区域中。例如，在ZXNY和/或NYZX的至少一个实例中，X是2且Y是1；X是1且Y是2；X是3且Y是1；或X是1且Y是3。杂交区域中的至少一个和任选地所有可以具有不规则图案。
组中探针中的杂交区域中的一个或多个，任选地所有可以包括或由以下组成：
(aa)NZ-ZNN-ZZNN-ZZN；
(bb)ZN-NZZ-NNZZ-NNZ；
(cc)NNZZ-ZZNN-NNNZZZ-ZNN；
(dd)ZZNN-NNZZ-ZZZNNN-NZZ；
(ee)NNZZ-ZZNN；
(ff)ZZNN-NNZZ；
(gg)NZZ-NNZ-ZNN-ZZN；
(hh)ZNN-ZZN-NZZ-NNZ；
(ii)NZZ-NNZ-ZN；或
(jj)ZNN-ZZN-NZ
探针组通常包括含有杂交区域的探针，所述杂交区域包括天然和非天然核苷酸的不同图案，其可以是规则的或不规则的，并且可以包含至少一个仅包括天然核苷酸的杂交区域，以优化组中探针的停留时间，即当样品中存在它们各自的靶多核苷酸时，组中的所有探针具有限定窗口内的停留时间。
限定的停留时间窗口
如果停留时间在彼此的10秒或更短时间内，优选地在彼此的5秒、2秒、1秒、0.5秒、0.2秒或0.1秒或更短时间内，则认为停留时间类似或大致相同。停留时间最优选地在彼此的1秒或更短时间内。
在用于确定两个或更多个靶多核苷酸的存在、不存在或量的方法中，由组中探针中的至少两个，如3个、4个、5个、6个、10个或所有探针引起，杂交到它们各自的靶多核苷酸的电流阻塞的持续时间可以在10秒或彼此的更少时间内，优选地5秒或更少时间内，优选地2秒或更少时间内，1秒或更少，0.5秒或更少，0.2秒或更少或彼此的0.1秒。
因此，在一些实施例中，限定的窗口可以具有10秒、5秒、4秒、3秒、2秒、1秒、0.5秒或0.2秒的总宽度。例如，10秒的窗口可以捕获0.01秒到10秒、1秒到11秒、5秒到15秒等的电流阻塞。不测量具有短于限定的窗口的持续时间，或长于限定的窗口的持续时间的电流阻塞。
术语“测量”旨在表示检测和分析。将检测由样品的组分与孔相互作用产生的所有电流阻塞。然而，将仅以用于确定两个或更多个靶多核苷酸的存在、不存在或量的方法测量落入感兴趣的窗口内的电流阻塞。
在一个实施例中，由于杂交探针与孔的相互作用，基本上所有电流阻塞发生在窗口内和/或发生在窗口外的大多数电流阻塞是由于样品中的额外组分。
非杂交区域
非杂交区域包括能够进入孔的部分。非杂交区域通常是线性分子，其能够进入并穿过孔的桶或通道。当非杂交区域进入孔时，它以对桶或通道中存在的非杂交区域的部分特异的方式影响流过孔的电流。
非杂交区域对流过孔的电流具有不同的影响，这取决于探针是否与其靶多肽杂交。当靶多核苷酸未结合到探针时，每个探针中的非杂交区域以一种方式影响流过孔的电流，并且当靶多核苷酸结合到探针时，其以不同方式影响流过孔的电流。这允许使用方法确定靶多核苷酸的存在或不存在。
探针与靶多核苷酸的杂交影响探针移动通过孔所花费的时间。在不存在靶多核苷酸的情况下，探针快速通过孔。当孔与其靶多核苷酸杂交时，探针通过孔的通道受到阻碍。
通常，当探针未与其靶多核苷酸杂交时，其在施加的电位下快速通过孔。由组中的未杂交探针产生的电流阻塞通常具有落在限定窗口之外的短持续时间，其中测量电流阻塞。
不希望受理论束缚，在一段时间内，整个探针通过孔的移动被杂交的靶多核苷酸阻止(即延迟)。双链多核苷酸通常太大而不能移动通过孔的桶或通道。片刻之后，在电位的影响下靶多核苷酸从探针释放，并且整个探针能够移动穿过孔。一旦探针已经离开孔，流过孔的电流就返回到不存在样品和探针组时所见的水平。每个杂交的探针影响流过孔的电流特定的时间量(“停留时间”)。当靶多核苷酸存在于样品中时，可以通过修饰如本文所讨论的探针的杂交区域来控制由杂交探针引起的电流阻塞的持续时间。
可以基于由探针的非杂交区域与任选地探针的杂交区域之间的差异(例如，信号水平、信号图案、信号偏差的差异)产生的电流阻塞中的差异来区分由杂交探针中的每一个的相互作用产生的电流阻塞。
孔包括桶或通道，并且可以包括前庭。桶或通道通常允许探针的非杂交区域进入，但不允许探针的双链杂交区域，例如包括杂交区域和靶多核苷酸的杂交孔的区域进入。对于特定的孔，可以基于例如桶或通道的已知长度，以及孔的前庭存在的地方设计适合包含在探针组中的非杂交区域。
探针的非杂交区域可以包括本文所讨论的任何核苷酸。在一些实施例中，非杂交区域具有无碱基前导序列，其中前导序列是非杂交区域用于进入孔中的第一区域。前导序列通常是单链的，并且可以例如包括3个到20个，如5个到15个或8个到12个，例如10个核苷酸。在一些实施例中，非杂交区域包括至少两个相邻的无碱基残基，例如3个、4个、5个、6个、7个或更多个相邻的无碱基残基。
在优选实施例中，非杂交区域包括聚合物，例如线性聚合物。聚合物能够进入孔并影响流过孔的电流。聚合物优选地是多核苷酸、多肽、多糖或聚乙二醇(PEG)。非杂交区域可以包括不同的聚合物组合。
非杂交区域可以是任何长度。尾部优选地包括长度为约7个到约70个核苷酸的多核苷酸，如长度为约10个到约60、约20个到约50个或约30个到约40个核苷酸。
非杂交区域可以是如WO2013/121201中所述的尾区。
非杂交区域优选地包括至少一个单链多核苷酸或多核苷酸区域。单链多核苷酸用于非杂交区域中，因为它们可以穿过孔并且可以容易地分成至少两个不同的区域，所述区域以不同的方式影响流过孔的电流。例如，具有不同序列的多核苷酸的不同区域通常以不同方式影响流过孔的电流。至少两个不同区域优选地对应于至少两段不同核苷酸。例如，单链多核苷酸区域可以包括一段腺嘌呤核苷酸和一段无碱基核苷酸。每一段将以不同的方式影响流过孔的电流。替代性地，至少两段不同的核苷酸是不同的多核苷酸条形码。多核苷酸条形码是本领域公知的(Kozarewa,I.等人，(2011)，《分子生物学方法(MethodsMol.Biol.)》733，p279-298)。条形码是多核苷酸的特定序列，其以特定且已知的方式影响流过孔的电流。
非杂交区域可以包括一个或多个非天然核苷酸。例如，T k聚体(即其中中心核苷酸是基于胸腺嘧啶的k聚体，如TTA、GTC、GTG和CTA)通常具有最低的电流状态。可以将修饰形式的T核苷酸引入探针中，特别是引入非杂交区域中，以进一步减少电流状态，并且从而增加当经修饰的多核苷酸移动通过孔时所见的总电流范围。
G k聚体(即其中中心核苷酸是基于鸟嘌呤的k聚体，如TGA、GGC、TGT和CGA)趋于受到k聚体中其它核苷酸的强烈影响，并且因此修饰了探针中的G核苷酸，特别是在非杂交区域中，可以帮助它们具有更多独立的电流位置。
包含相同核苷酸的三个拷贝而不是三个不同的核苷酸可以促进表征，因为当时仅需要在探针中定位例如3-核苷酸的k聚体。然而，这种修饰确实减少了由探针提供的信息。
包含一个或多个无碱基核苷酸导致特征性电流尖峰。这允许清楚地突出显示探针中一个或多个核苷酸的位置。
在一些实施例中，非杂交区域与样品中存在的任何靶或非靶多核苷酸无关，或者可能预期存在于样品中。例如，非杂交区域可以与靶多核苷酸的任何部分互补小于约70％，如小于约50％、小于约30％、小于约20％或小于约10％。
四链体
组中的一个或多个，如所有探针可以包括能够在如上定义的两个非杂交区域之间形成四链体的序列。四链体形成序列也不与靶多核苷酸杂交。四链体是由四个序列链形成的三维结构。
四链体不能移位或移动通过孔的最窄部分。四链体比孔的最窄部分宽。例如，野生型α-HL孔的最窄部分直径为1.3nm。α-HL-NN孔的最窄部分直径为1.5nm。在使用这些孔的实施例中，四链体优选地具有大于1.3nm的宽度，如大于1.5nm，如大于2nm、大于3nm或大于5nm。本领域技术人员将能够为所使用的孔设计合适尺寸的四链体。当四链体形成序列未形成四链体时，其能够移位或移动通过孔的最窄部分。
四链体形成序列优选地是多核苷酸。它可以是本文讨论的任何核苷酸。例如，四链体形成序列可以。具有约10个到约50个核苷酸的长度，如约12个到约40个核苷酸，约14个到约30个核苷酸或约16个到约20个核苷酸。
四链体可以是任何类型的四链体。四链体可以是分子间四链体，如双分子四链体或四分子四链体。四链体形成序列优选地能够形成分子内四链体。
四链体形成序列优选地能够形成G-四链体(也称为G-四分体或G4-DNA)。这些是富含鸟嘌呤并且能够形成四链结构的多核苷酸序列。四个鸟嘌呤碱基可以通过Hoogsteen氢键结合形成被称为鸟嘌呤四分体的方形平面结构，并且两个或更多个鸟嘌呤四分体可以堆叠在彼此之上以形成G-四链体。通过存在阳离子，尤其是钾，进一步稳定四链体结构，所述阳离子位于每对四分体之间的中心通道中。形成G-四链体是本领域熟知的(Marathias和Bolton，《核酸研究(Nucleic Acids Research)》，2000；28(9):1969-1977；Kankia和Marky，《美国化学协会期刊(J.Am.Chem.Soc.)》，2001,123,10799-10804；和Marusic等人，《核酸研究(Nucleic Acids Research)》，2012,1–11)。
四链体形成序列更优选地包括序列Ga、接着是Nb、接着是Gc、接着是Nd、接着是Ge、接着是Nf、接着是Gg，其中G是包括鸟嘌呤的核苷酸，其中a、c、e和g独立地选自1、2、3、4和5，其中N是任何核苷酸，并且其中b、d和f是2到50。a、c、e和g的值可以相同。G优选地是单磷酸鸟苷(GMP)、环鸟苷酸(cGMP)、脱氧鸟苷单磷酸(dGMP)、二脱氧鸟苷单磷酸、N2-甲基-GMP、N2-甲基-cGMP、N2-甲基-dGMP、N2-甲基-二脱氧鸟苷单磷酸、N2-甲基-06-甲基-GMP、N2-甲基-06-甲基-cGMP、N2-甲基-06-甲基-dGMP、N2-甲基-06-甲基-二脱氧鸟苷单磷酸、2'-O-甲基-GMP、2'-O-甲基-cGMP、2'-O-甲基-dGMP、2'-O-甲基--二脱氧鸟苷单磷酸、6-硫代GMP、6-硫代-cGMP、6-硫代-dGMP、6-硫代-二脱氧鸟苷单磷酸、7-甲基-GMP、7-甲基-cGMP、7-甲基-dGMP、7-甲基-二脱氧鸟苷单磷酸、7-脱氮-GMP、7-脱氮-cGMP、7-脱氮-dGMP、7-脱氮-二脱氧鸟苷单磷酸、8-氧代-GMP、8-氧代-cGMP、8-氧代-dGMP或8-氧代-二脱氧鸟苷单磷酸。
WO2014/072703中公开了合适的四链体形成序列。四链体形成序列优选地包括SEQID NO：1的核苷酸28到42中所示的序列。
由于四链体不能通过孔的最窄部分移位，因此它起到制动作用并且保持区域中孔最窄部分中的非杂交区域中的一个。然后，非杂交区域产生识别探针的独特电流。片刻之后，四链体通常会在施加的电位和展开的影响下不稳定。因此，四链体的制动作用通常是暂时的。非杂交区域通常仅暂时保持在孔的最窄部分中。展开的四链体形成序列在施加电位的影响下易位或移动通过孔。
双链区域
双链多核苷酸不能通过孔，并且因此可以在组中的探针中包含双链区域代替四链体形成序列或第二杂交区域。在实践中，探针可以作为单链分子生成，所述单链分子在两个非杂交区域之间掺入双链区域的一条链。然后，在使样品与探针组接触之前或当探针组与样品接触时，双链区域的另一个链可以与探针杂交。双链区域通常在组中的探针中的每一个中具有相同的序列。这种双链区域的存在不会阻止探针移动穿过孔，而是简单地延迟探针通过孔的移动，因为双链区域中的链中的一条在电位的影响下从探针剥离。可以看出这种延迟是测量流过孔的电流。电流阻塞的持续时间通常落在电流阻塞持续时间的相同窗口内，因为电流阻塞是由于组中探针与它们各自的靶多核苷酸杂交引起的延迟所致。
可以通过例如改变双链区域的长度，改变双链区域的链之间的互补程度和/或改变双链区域的组成，如通过掺入如本文所述的非天然核苷酸用于杂交区域，调节由双链区域产生的电流阻塞的持续时间以适合在限定的时间窗口内。
双链区域可以例如具有约10个到约50个核苷酸的长度，如约12个到约40个核苷酸，约14个到约30个核苷酸或约16个到约20个核苷酸。
双链区域可以例如包括第一链和第二链，其中第一链与第二链至少70％，如至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补。在每个探针区域中包含一个或多个双链多核苷酸区域增加了可以从探针组获得的可能信号的数量，并且因此增加了可以使用本发明的方法测定的靶多核苷酸的数量。
例如，双链多核苷酸区域可以用于保持非杂交区域的特定区域，如条形码，其指示孔的桶或通道中的探针，从而可以根据本发明读入。
接头
本文所述探针的不同区域可以直接连结或通过一个或多个接头连结。在一些实施例中，接头可以是肽基接头或寡核苷酸接头。在一些实施例中，任何合适的间隔物可以用作接头。合适的间隔物的实例包含idSp(1'，2'-双脱氧核糖)或iSpC3(内部C3间隔物)，并且其它合适的间隔物是本领域已知的(参见，例如，https://www.idtdna.com/Site/Catalog/Modifications/Category/6)。另一个实例是三甘醇(TEG)。一个或多个，如2个、3个或4个间隔物，如idSp、iSpC3和/或TEG可以用于连结探针的相邻区域。
核苷酸
探针组中的每个探针包括核苷酸序列。核苷酸通常含有核碱基、糖和至少一个磷酸基。核碱基通常是杂环的。核碱基包含但不限于嘌呤和嘧啶，以及更具体地说，腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶和胞嘧啶。糖通常是戊糖。核苷酸糖包含但不限于核糖和脱氧核糖。核苷酸通常是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。核苷酸通常含有单磷酸、二磷酸或三磷酸。磷酸可以附接在核苷酸的5'或3'侧上。
核苷酸包含但不限于：单磷酸腺苷(AMP)、二磷酸腺苷(ADP)、三磷酸腺苷(ATP)、单磷酸鸟苷(GMP)、二磷酸鸟苷(GDP)、三磷酸鸟苷(GTP)、单磷酸胸苷(TMP)、二磷酸胸苷(TDP)、三磷酸胸苷(TTP)、单磷酸尿苷(UMP)、二磷酸尿苷(UDP)、三磷酸尿苷(UTP)、单磷酸胞苷(CMP)、二磷酸胞苷(CDP)、三磷酸胞苷(CTP)、5-甲基胞苷单磷酸、5-甲基胞苷二磷酸、5-甲基胞苷三磷酸、5-羟基甲基胞苷单磷酸、5-羟基甲基胞苷二磷酸、5-羟基甲基胞苷三磷酸、环单磷酸腺苷(cAMP)、环单磷酸鸟苷(cGMP)、单磷酸脱氧腺苷(dAMP)、二磷酸脱氧腺苷(dADP)、三磷酸脱氧腺苷(dATP)、单磷酸脱氧鸟苷(dGMP)、二磷酸脱氧鸟苷(dGDP)、三磷酸脱氧鸟苷(dGTP)、单磷酸脱氧胸苷(dTMP)、二磷酸脱氧胸苷(dTDP)、三磷酸脱氧胸苷(dTTP)、单磷酸脱氧尿苷(dUMP)、二磷酸脱氧尿苷(dUDP)、三磷酸脱氧尿苷(dUTP)、单磷酸脱氧胞苷(dCMP)、二磷酸脱氧胞苷(dCDP)和三磷酸脱氧胞苷(dCTP)、5-甲基-2'-脱氧胞苷单磷酸、5-甲基-2'-脱氧胞苷二磷酸、5-甲基-2'-脱氧胞苷三磷酸、5-羟基甲基-2'-脱氧胞苷单磷酸、5-羟基甲基-2'-脱氧胞苷二磷酸以及5-羟基甲基-2'-脱氧胞苷三磷酸。核苷酸优选地选自AMP、TMP、GMP、UMP、dAMP、dTMP、dGMP或dCMP。核苷酸可以是无碱基的(即缺乏核碱基)。核苷酸可以含有额外修饰。具体地说，适当的经修饰核苷酸包含但不限于2'氨基嘧啶(如2'-氨基胞苷和2'-氨基尿苷)、2'-羟基嘌呤(如2'-氟嘧啶)(如2'-氟胞苷和2'-氟尿苷)、羟基嘧啶(如5'-α-P-硼烷尿苷)、2'-O-甲基核苷酸(如2'-O-甲基腺苷、2'-O-甲基鸟苷、2'-O-甲基胞苷和2'-O-甲基尿苷)、4'-硫代嘧啶(如4'-硫代尿苷和4'-硫代胞苷)，并且核苷酸具有对核碱基的修饰(如5-戊炔基-2'-脱氧尿苷、5-(3-氨基丙基)-尿苷和1,6-二氨基己基-N-5-氨基甲酰基甲基尿苷)。
如果探针是DNA，探针可以包括一个或多个非天然核苷酸，其包括不同于腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或甲基胞嘧啶的核碱基和/或包括与脱氧腺苷、脱氧鸟苷、胸苷、脱氧胞苷或羟甲基吡啶不同的核苷。如果探针是RNA，则探针可以包括一个或多个不同于腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶或甲基胞嘧啶的非天然核苷酸和/或包括不同于腺苷、鸟苷、尿苷、胞苷或甲基胞苷的核苷。当存在于杂交区域中时，不同的核碱基和/或核苷能够与靶多核苷酸中的核苷酸中的一个或多个杂交。可商购的核苷包含但不限于2,6-二氨基嘌呤-2'-脱氧核苷、2-氨基嘌呤-2'-脱氧核苷、2,6-二氨基嘌呤-核糖苷、2-氨基嘌呤-核糖苷、假尿苷、嘌呤霉素、2,6-二氨基嘌呤-2'-O-甲基阿糖苷、2-氨基嘌呤-2'-O-甲基阿糖苷和阿糖胞苷。非天然核苷酸可以包括这些核苷中的任何一个。
非天然核苷酸可以是通用核苷酸。通用核苷酸优选地包括以下核碱基中的一个：次黄嘌呤、4-硝基吲哚、5-硝基吲哚、6-硝基吲哚、甲酰基吲哚、3-硝基吡咯、硝基咪唑、4-硝基吡唑、4-硝基苯并咪唑、5-硝基吲唑、4-氨基苯并咪唑或苯基(C6-芳环)。通用核苷酸更优选地包括以下核苷中的一个：2'-脱氧肌苷、肌苷、7-脱氮-2'-脱氧肌苷、7-脱氮-肌苷、2-氮杂-脱氧肌苷、2-氮杂-肌苷、2-O'-甲基肌苷、4-硝基吲哚2'-脱氧核苷、4-硝基吲哚核苷、5-硝基吲哚2'--脱氧核苷、5-硝基吲哚核苷、6-硝基吲哚2'--脱氧核苷、6-硝基吲哚核苷、3-硝基吡咯2'--脱氧核苷、3-硝基吡咯核苷、次黄嘌呤的非环糖类似物、硝基咪唑2'--脱氧核苷、硝基咪唑核苷、4-硝基吡唑2'--脱氧核苷、4-硝基吡唑核苷、4-硝基苯并咪唑2'--脱氧核苷、4-硝基苯并咪唑核苷、5-硝基吲唑2'--脱氧核苷、5-硝基吲唑核苷、4-氨基苯并咪唑2'--脱氧核苷、4-氨基苯并咪唑核苷、苯基C-核苷、苯基C-2'-脱氧核糖基核苷、2'-脱氧烟云杯伞素、2'-脱氧异鸟苷、K-2'-脱氧核苷、P-2'-脱氧核苷和吡咯烷。通用核苷酸更优选地包括2'-脱氧肌苷。通用核苷酸更优选地是IMP或dIMP。通用核苷酸最优选地是dPMP(2'-脱氧-P-核苷单磷酸)或dKMP(N6-甲氧基-2,6-二氨基嘌呤单磷酸)。
非天然核苷酸可以包括其正在取代的天然核苷酸中不存在的化学原子或基团。化学基团优选地是丙炔基、硫基、氧代基、甲基、羟甲基、甲酰基、羧基、羰基、苯甲基、炔丙基或炔丙胺基。化学基团或原子可以是或可以包括荧光分子、生物素、洋地黄毒苷、DNP(二硝基苯酚)、光不稳定基团、炔烃、DBCO、叠氮化物、游离氨基、氧化还原染料、汞原子或硒原子。
可商购的包括天然存在的核苷中不存在的化学基团的核苷包含但不限于6-硫代-2'-脱氧鸟苷、7-脱氮-2'-脱氧腺苷、7-脱氮-2'-脱氧鸟苷、7-脱氮-2'-脱氧鸟苷、7-脱氮-8-氮-2'-脱氧腺苷、8-5'(5'S)-环-2'-脱氧腺苷，8-氨基-2'-脱氧腺苷、8-氨基-2'-脱氧鸟苷、8-氘代-2'-脱氧鸟苷、8-氧代-2'-脱氧腺苷、8-氧代-2'-脱氧鸟苷、亚乙烯基-2'-脱氧腺苷、N6-甲基-2'-脱氧腺苷、O6-甲基-2'-脱氧鸟苷、O6-苯基-2'-脱氧肌苷、2'-脱氧假尿苷、2-硫代胸苷、4-硫代-2'-脱氧尿苷、4-硫代胸苷、5'-氨基胸苷、5-(1-炔基乙炔基)-2'-脱氧尿苷、5-(C2-EDTA)-2'-脱氧尿苷、5-(羧基)乙烯基-2'-脱氧尿苷、5,6-二氢-2'-脱氧尿苷、5.6-二氢胸苷、5-溴-2'-脱氧胞苷、5-溴-2'-脱氧尿苷、5-羧基-2'-脱氧胞苷、5-氟-2'-脱氧尿苷、5-甲酰-2'-脱氧胞苷、5-羟基-2'-脱氧胞苷、5-羟基-2'-日氧氟尿苷、5-羟甲基-2'-脱氧胞苷、5-羟甲基-2'-脱氧尿苷、5-碘-2'-脱氧胞苷、5-碘-2'-脱氧尿苷、5-甲基-2'-脱氧胞苷、5-甲基-2'-脱氧异胞苷、5-丙炔基-2'-脱氧胞苷、5-丙炔基-2'-脱氧尿苷、6-O-(TMP)-5-F-2'-脱氧尿苷、C4-(1,2,4-三唑-1-基)-2'-脱氧尿苷、C8-炔-胸苷、dT-二茂铁、N4-乙基-2'-脱氧胞苷、O4-甲基胸苷、吡咯-2'-脱氧胞苷、胸苷乙二醇、4-硫尿苷、5-甲基胞苷、5-甲基尿苷、吡咯环胞苷、3-脱氮-5-氮杂-2'-O-甲基胞苷、5-氟-2'-O-甲基尿苷、5-氟-4-O-TMP-2'-O-甲基尿苷、5-甲基-2'-O-甲基胞苷、2-甲基-2'-O-甲基胸苷、2',3'-二脱氧腺苷、2',3'-二脱氧胞苷、2',3'-双脱氧鸟苷、2',3'-双脱氧胸苷、3'-脱氧腺苷，3'-脱氧胞苷、3'-脱氧鸟苷、3'-脱氧胸苷和5'-O-甲基胸苷。非天然核苷酸可以包括这些核苷中的任何一个。非天然核苷酸最优选地是2'-氟-2'-脱氧腺苷或5-羧基-2'-脱氧胞苷。
替代性地，非天然核苷酸优选地缺少其正在替代的天然核苷酸中存在的化学基团或原子。
与被替代的所述一个或多个核苷酸相比，非天然核苷酸优选地具有改变的电负性。具有改变的电负性的非天然核苷酸优选地包括卤素原子。卤素原子可以附接到非天然核苷酸上的任何位置，如核碱基和/或糖。卤素原子优选地是氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)或碘(I)。卤素原子最优选地是F或I。
可商购的包括卤素的核苷包含但不限于8-溴-2'-脱氧腺苷、8-溴-2'-脱氧鸟苷、5-溴尿苷、5-碘尿苷、5-溴尿苷、5-碘尿苷、5'-碘胸苷和5-溴-2'-O-甲基尿苷。非天然核苷酸可以包括这些核苷中的任何一个。
实例中提到的任何核苷酸也可以用于本文所述的方法中。
独特的电流
每个探针(即每种类型的探针)以独特的方式影响流过孔的电流。换句话说，探针以可以与不同探针影响流过孔的电流的方式区分或区别的方式影响流过孔的电流。这允许根据本发明确定每个探针(即每种类型的探针)的同一性。然后可以如上所述测量探针与靶多核苷酸的结合。由于可以测量每个探针的同一性和每个探针与靶多核苷酸的结合，因此可以确定每个靶多核苷酸的存在或不存在。
每个探针(即每种类型的探针)优选地在其结合到靶多核苷酸时，以独特的方式影响流过孔的电流。换句话说，靶多核苷酸与探针的结合优选地以一种方式影响流过孔的电流，所述方式可以与不同探针在其结合靶多核苷酸时影响流过孔的电流的方式区分或区别。不同的探针可以结合相同的靶多核苷酸。
独特的方式可能涉及流过孔的电流受到影响的程度，即当探针结合到其靶多核苷酸时流过孔的电流量的变化，和/或电流受探针与其靶多核苷酸的结合影响的时间(“停留时间”)。电流破坏的值比停留时间更大，因为前者提供更明显的特征，而探针的杂交区域已经设计成使得当与其各自的靶多核苷酸杂交时组中探针的停留时间在限定的窗口内。这意味着各种杂交探针的停留时间具有窄分布。独特的方式可能涉及流过孔的电流的变化受到影响的程度。由于靶多核苷酸与探针的结合，变化可以增加或减少。
当与它们各自的靶多核苷酸杂交并使用纳米孔分析时，可以设计探针组给出分离良好的电流阻塞簇。可以用于识别与特定靶多核苷酸杂交的探针的电流特征的实例包含电流阻塞长度(或停留)，“变化”或标准偏差和/或电流阻塞噪声。这在本申请的实例4中举例说明。当探针组与靶多核苷酸杂交并与纳米孔接触时，可见对应于通过靶多核苷酸与其探针杂交形成的双链体中的每一个的簇。对于图4中的特定实例示出了这一点。在限定的窗口内检测由所有双链体形成的电流阻塞。仅测量发生在限定窗口内的这些电流阻塞并提出用于进一步分析。
可以进行对照实验以确保当探针结合靶多核苷酸时，不同的探针对流过孔的电流具有不同的影响。当探针结合到其靶多核苷酸时，这种对照实验还可以帮助确定特定探针对流过孔的电流的影响。然后可以将对测试样品进行本发明的方法产生的结果与源自于这种对照实验的那些结果进行比较，以确定测试样品中是否存在或不存在特定靶多核苷酸或确定测试样品中多核苷酸的量。
探针之间的独特性可以通过它们的长度差异来实现。较长的探针将影响流过孔的电流较长的时间，即较长的停留时间。较短的探针将影响流过孔的电流较短的时间，即较短的停留时间。
在优选实施例中，当探针结合其靶多核苷酸时，非杂交区域或其部分短暂地保持在孔的桶或通道中。当探针包括通过第二杂交区域、四链体形成区域或双链区域与第一非杂交区域分开的第二非杂交区域时，第二非杂交区域在第一杂交区域之前或之后保持在孔中，这取决于探针中区域的顺序。组中不同探针的特定区域之间的差异，如不同聚合物和不同多核苷酸种类的存在，影响流过孔的电流。例如，相同类型聚合物的不同序列，例如其中一个序列包括两个或更多个相邻的无碱基残基，也可以解释探针之间的区别。设计一组具有所需独特性的非杂交区域是直截了当的，例如在WO2013/121201中所述。
在探针包括四链体形成区域或双链区域的情况下，如果相关的靶多核苷酸存在于样品中，则电流阻塞具有两个相，但是如果不存在靶多核苷酸则仅具有一个相。
跨膜孔
跨膜孔是在某种程度上穿过膜的结构。它允许由施加的电位驱动的水合离子流过膜或膜内。跨膜孔通常穿过整个膜，使得水合离子可以从膜的一侧流到膜的另一侧。然而，跨膜孔不必穿过膜。其可能在一端处关闭。例如，孔可以是膜中的阱、间隙、通道、沟槽或狭缝，水合离子可以沿着所述孔流动或流入其中。
任何跨膜孔可以用于本发明中。孔可以是生物的或人造的。合适的孔包含但不限于蛋白质孔、多核苷酸孔和固态孔。孔可以是DNA折纸孔(Langecker等人，《科学(Science)》，2012年；338:932-936)。合适的DNA折纸孔在WO2013/083983中公开。
跨膜孔优选地是跨膜蛋白质孔。跨膜蛋白质孔是多肽或多肽的集合，其允许如多核苷酸等水合离子从膜的一侧流到膜的另一侧。在本发明中，跨膜蛋白质孔能够形成孔，所述孔允许由施加的电位驱动的水合离子从膜的一侧流到另一侧。跨膜蛋白质孔优选地允许多核苷酸从膜的一侧，如三嵌段共聚物膜流到另一侧。跨膜蛋白质孔允许如DNA或RNA等多核苷酸移动通过孔。
跨膜蛋白质孔可以是单体或寡聚体。孔优选地由几个重复的亚基组成，如至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或至少16个亚基。孔优选地是六聚体、七聚体、八聚体或非三聚体孔。孔可以是同源寡聚体或异源寡聚体。
跨膜蛋白质孔优选地衍生自CsgG，更优选地衍生自来自大肠杆菌菌株K-12亚株MC4100的CsgG。这种孔将是寡聚的并且通常包括衍生自CsgG的7个、8个、9个或10个单体。孔可以是衍生自CsgG的同源寡聚孔，其包括相同的单体。替代性地，孔可以是衍生自CsgG的异源寡聚孔，其包括不同于其它单体的至少一种单体。在WO/2016/034591、WO 2017/149316、WO 2017/149317和WO 2017/149318中描述了合适的CsgG孔的实例。
跨膜蛋白质孔通常包括离子可以流过的桶或通道。孔的亚基通常围绕中心轴线并且为跨膜桶或通道或跨膜α-螺旋束或通道提供链。
跨膜蛋白质孔的桶或通道通常包括促进与分析物的相互作用的氨基酸，如核苷酸、多核苷酸或核酸。这些氨基酸优选地位于桶或通道的收缩部附近。跨膜蛋白质孔通常包括一个或多个带正电荷的如精氨酸、赖氨酸或组氨酸等氨基酸，或如酪氨酸或色氨酸等芳香族氨基酸。这些氨基酸通常促进孔与核苷酸、多核苷酸或核酸之间的相互作用。
根据本发明使用的跨膜蛋白质孔可以衍生自β桶孔或α螺旋束孔。β-桶孔包括由β-链形成的桶或通道。合适的β-桶孔包含但不限于β-毒素，如α-溶血素、炭疽毒素和白细胞素，以及细菌的外膜蛋白质/孔蛋白，如耻垢分枝杆菌孔蛋白(Msp)，例如MspA、MspB、MspC或MspD、CsgG，外膜孔蛋白F(OmpF)、外膜孔蛋白G(OmpG)、外膜磷脂酶A和奈瑟氏球菌自转运脂蛋白(NalP)以及其它孔，如胞溶素。α-螺旋束孔包括由α-螺旋形成的桶或通道。合适的α螺旋束孔包含但不限于内膜蛋白和α外膜蛋白，如WZA和ClyA毒素。
跨膜孔可以衍生自或基于Msp、α-溶血素(α-HL)、胞溶素、CsgG、ClyA、Sp1和溶血性蛋白质fragaceatoxin C(FraC)。跨膜蛋白质孔优选地衍生自CsgG，更优选地衍生自来自大肠杆菌菌株K-12亚株MC4100的CsgG。WO 2016/034591中公开了衍生自CsgG的合适的孔。跨膜孔可以衍生自胞溶素。WO 2013/153359中公开了衍生自胞溶素的合适的孔。
野生型α-溶血素孔由7个相同的单体或亚基形成(即，其是七聚体)。α-溶血素孔可以是α-溶血素-NN或其变体。变体优选地在位置E111和K147处包括N个残基。α-溶血素-NN的一个单体或亚基的序列示出在SEQ ID NO：3中。
衍生自α-HL-NN的单体通常包括SEQ ID NO：3或其变体中所示的序列。SEQ ID NO：3的变体是具有不同于SEQ ID NO：3的氨基酸序列并且保持其形成孔的能力的多肽。可以使用本领域中已知的任何方法来测定变体形成孔的能力。例如，可以将变体连同其它适当的亚基一起插入到两亲层中，并且可以确定其寡聚形成孔的能力。用于将亚基插入到膜，如两亲层中的方法在本领域中已知。例如，可以将纯化形式的亚基悬浮于含有三嵌段共聚物膜的溶液中，使得其扩散到膜并且通过结合到膜和组装成功能性状态来插入。替代性地，可以使用M.A.Holden，H.Bayley.《美国化学协会期刊(J.Am.Chem.Soc.)》2005,127,6502-6503和WO 2006/100484中描述的“拾取和放置”方法将亚基直接插入膜中。
在SEQ ID NO：3的氨基酸序列的整个长度内，基于氨基酸类似性或同一性，变体将优选地与所述序列至少50％同源。更优选地，基于氨基酸类似性或同一性，变体可以在整个序列内与SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％，并且更优选地至少95％、97％或99％同源。在100个或更多个，例如125个、150个、175个或200个或更多个连续氨基酸的段内，可能存在至少80％，例如至少85％、90％或95％的氨基酸类似性或同一性(“硬同源性(hard homology)”)。
本领域中的标准方法可以用于确定同源性。例如，UWGCG程序包提供了BESTFIT程序，其可以用于计算同源性，例如根据其默认设置使用(Devereux等人(1984)《核酸研究(Nucleic Acids Research)》12,p387-395)。PILEUP和BLAST算法可以用于计算同源性或对序列进行排序(如识别等同残基或对应序列(通常根据其默认设置))，例如如AltschulS.F.(1993)《分子进化杂志(J Mol Evol)》36:290-300；Altschul,S.F等人(1990)《分子生物学杂志(J Mol Biol)215:403-10》中所述。用于执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。类似性可以使用成对同一性或通过应用如BLOSUM62等评分矩阵并且转换为等效同一性来测量。由于它们表示功能变化而非演化变化，所以在确定同源性时将掩盖故意突变的位置。通过在蛋白质序列的综合数据库上使用例如PSIBLAST来应用位置特异性评分矩阵，可以更灵敏地确定类似性。可以使用反映氨基酸化学-物理性质而不是演化时间尺度(例如，电荷)内的取代频率的不同评分矩阵。
可以对SEQ ID NO：3的氨基酸序列进行氨基酸取代，例如多达1个、2个、3个、4个、5个、10个、20个或30个取代。保守取代使用具有类似化学结构、类似化学性质或类似侧链体积的其它氨基酸来代替氨基酸。所引入的氨基酸可以具有与其所代替的氨基酸类似的极性、亲水性、疏水性、碱性、酸性、电中性或电荷。替代性地，保守取代可以引入芳香族或脂肪族的另一种氨基酸代替预先存在的芳香族或脂肪族氨基酸。
跨膜蛋白质孔优选地衍生自Msp，更优选地衍生自MspA。WO 2012/107778中公开了衍生自MspA的合适的孔。
例如通过添加组氨酸残基(his标签)、天冬氨酸残基(asp标签)、抗生蛋白链菌素标签、旗标、SUMO标签、GST标签或MBP标签，或通过添加信号序列以促进其从细胞分泌，其中多肽不天然地含有这种序列，可以修饰本文所述的如跨膜蛋白质孔等任何蛋白质以帮助其识别或纯化。引入基因标签的替代性方案是将标签化学反应到孔或构建体上的原生或工程化的位置上。此的实例将是使凝胶迁移试剂与孔外部上的工程化半胱氨酸反应。这已经被显示为一种用于分离溶血素异源寡聚物的方法(Braha等人(1997)《生物化学(ChemBiol)》，4(7):497-505)。
孔可以用显露标记来进行标记。显露标记可以是允许孔被检测到的任何适当标记。合适的标记包含但不限于荧光分子、放射性同位素，例如125I、35S，酶、抗体、抗原、多核苷酸和配体如生物素。
本文所述的如跨膜蛋白质孔等任何蛋白质可以合成制备或通过重组方式制备。例如，可以通过体外转译和转录(IVTT)合成孔。可以修饰孔的氨基酸序列以包含非天然存在的氨基酸或增加蛋白质的稳定性。当通过合成方式生产蛋白质时，可以在生产期间引入这种氨基酸。在合成或重组生产后，也可以改变孔。
本文所述的如跨膜蛋白质孔等任何蛋白质可以使用本领域已知的标准方法生产。可以使用本领域的标准方法衍生和复制编码孔或构建体的多核苷酸序列。可以使用本领域的标准技术在细菌宿主细胞中表达编码孔或构建体的多核苷酸序列。可以通过从重组表达载体原位表达多肽在细胞中产生孔。表达载体任选地携带诱导型启动子以控制多肽的表达。这些方法描述于Sambrook,J.和Russell,D.(2001)，《分子克隆实验指南(MolecularCloning:A Laboratory Manual)》第3版，纽约冷泉港冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press)中。
可以在从蛋白质产生生物体通过任何蛋白质液相色谱系统纯化之后或在重组表达之后，大规模生产孔。典型的蛋白质液相色谱系统包含FPLC、AKTA系统、Bio-Cad系统、Bio-Rad生物系统和Gilson HPLC系统。
偶联
在一些实施例中，探针可以包括能够与膜偶联的一个或多个锚。在一些实施例中，用于确定两个或更多个靶多核苷酸的存在、不存在或量的方法可以进一步包括使用所述一个或多个锚将探针偶联到膜。
锚包括偶联(或结合)到探针的基团和偶联(或结合)到膜的基团。每个锚可以共价偶联(或结合)到探针和/或膜。
可以使用任何数量的锚将探针偶联到膜，如2个、3个、4个或更多个锚。例如，可以使用两个锚将探针偶联到膜，每个锚将探针分别偶联(或结合)到膜。
所述一个或多个锚可以包括一个或多个多核苷酸结合蛋白。
如果膜是如三嵌段共聚物膜等两亲层，则所述一个或多个锚优选地包括可以插入膜中的多肽锚和/或疏水性锚。疏水性锚优选地是脂质、脂肪酸、固醇、碳纳米管、多肽、蛋白质或氨基酸，例如胆固醇、棕榈酸或生育酚。在优选实施例中，锚是胆固醇。锚优选地不通过孔偶联到膜。
可以化学修饰或官能化如两亲分子、共聚物或脂质等膜的组分以形成所述一个或多个锚。下文论述合适的化学修饰和使膜的组分官能化的合适方式的实例。可以对任何比例的膜组分进行官能化，例如至少0.01％、至少0.1％、至少1％、至少10％、至少25％、至少50％或100％。
探针可以直接偶联到膜。用于将探针偶联到膜的所述一个或多个锚优选地包括接头。所述一个或多个锚可以包括一个或多个接头，如2个、3个、4个或更多个。可以使用一个接头将多于一个，如2个、3个、4个或更多个探针偶联到膜。
优选的接头包含但不限于聚合物，如多核苷酸、聚乙二醇(PEG)、多糖和多肽。这些接头可以是线性、分支链或环状的。例如，接头可以是环状多核苷酸。探针可以与环状多核苷酸接头上的互补序列杂交。
所述一个或多个锚或一个或多个接头可以通常包括可以进行剪切或分解的组分，如限制位点或光不稳定性基团。
官能化接头和其可以偶联分子的方式在本领域中是已知的。例如，用马来酰亚胺基团官能化的接头将与蛋白质中的半胱氨酸残基反应并附接。在本发明的上下文中，蛋白质可以存在于膜中，可以是探针的一部分或可以用于偶联(或结合)到多核苷酸探针。
可以使用“锁和钥”布置来避免多核苷酸的交联。每个接头的仅一端可以一起反应形成较长接头，并且接头的另一端各自分别与多核苷酸或膜反应。这种接头描述于WO2010/086602中。
偶联优选地是瞬态的。换句话说，偶联可以使得探针在与孔相互作用时可以与膜分离。使用胆固醇或脂肪酰基链，探针可以暂时偶联到两亲层或三嵌段共聚物膜。可以使用长度为6个到30个碳原子的任何脂肪酰基链，如十六烷酸。
在优选实施例中，探针偶联到两亲层，如三嵌段共聚物膜或脂质双层。先前已经用各种不同网络共享的策略进行核酸与合成脂质双层的偶联。这些总结在下文表1中。
表1
包括硫醇、生物素或表面活性剂的锚可以与可以被切割或分解的组分结合使用，以实现探针与膜的瞬时偶联。
可以在合成反应中使用修饰胺基磷酸酯来官能化合成多核苷酸和/或接头，所述修饰胺基磷酸酯容易地与直接添加合适锚定基团相容，所述锚定基团如胆固醇、生育酚、棕榈酸、硫醇、脂质和生物素基团。这些不同的附接化学物质为多核苷酸的附接提供了一套选择。每个不同的修饰基团以稍微不同的方式偶联多核苷酸，并且偶联未必总是永久性的，因此给予探针到膜的不同停留时间。因此，当在本发明的方法中使用偶联时，组中的所有探针以相同的方式偶联到膜。
多核苷酸与接头或与官能化膜的偶联还可以通过多种其它手段来实现，条件是可以向多核苷酸添加互补反应性基团或锚定基团。先前已经报道了向多核苷酸的任一末端添加反应性基团。可以使用T4多核苷酸激酶和ATPγS向ssDNA或dsDNA的5'添加硫醇基(Grant,G.P.和P.Z.Qin(2007)。“《一种用于在核酸的5'末端处附接氮氧化物自旋标记的简易方法(A facile method for attaching nitroxide spin labels at the 5'terminusof nucleic acids)》”，《核酸研究(Nucleic Acids Res)》35(10):e77。可以使用T4多核苷酸激酶和γ-[2-叠氮基乙基]-ATP或γ-[6-叠氮基己基]-ATP向ssDNA或dsDNA的5'-磷酸添加叠氮基团。使用硫醇或点击化学，含有硫醇、碘乙酰胺OPSS或马来酰亚胺基团(与硫醇具有反应性)或DIBO(二苯并环氧磷)或炔基(与叠氮化物具有反应性)中的任一个的系链可以共价附接到多核苷酸。可以使用末端转移酶将修饰寡核苷酸并入到ssDNA的3'，以添加更多样的化学基团选择，如生物素、硫醇和荧光团(Kumar,A.，P.Tchen等人(1988)，“《通过末端脱氧核苷酸转移酶对合成寡核苷酸探针进行非放射性标记(Nonradioactive labeling ofsynthetic oligonucleotide probes with terminal deoxynucleotidyltransferase)》”，《生物化学分析(Anal Biochem)》169(2):376-82)。抗生蛋白链菌素/生物素和/或抗生蛋白链菌素/脱硫生物素偶联可以用于任何其它多核苷酸。也有可能，可以使用末端转移酶(例如胆固醇或棕榈酸)向具有合适经修饰的核苷酸的多核苷酸直接添加锚。
所述一个或多个锚可以通过杂交将探针偶联到膜。杂交可以存在于所述一个或多个锚的任何部分中，如所述一个或多个锚与探针之间、在所述一个或多个锚内或在所述一个或多个锚与膜之间。如上文所论述，所述一个或多个锚中的杂交允许以暂时方式进行偶联。例如，接头可以包括两个或更多个杂交在一起的多核苷酸，如3个、4个或5个多核苷酸。所述一个或多个锚可以与多核苷酸杂交。所述一个或多个锚可以直接与探针的非杂交区域杂交。替代性地，所述一个或多个锚可以与一个或多个，如2个或3个，与探针杂交的中间多核苷酸(或“夹板”)杂交。
可以在探针的化学合成期间掺入所述一个或多个锚。例如，可以使用具有附接于其的反应性基团的引物来合成探针。
腺苷酸化多核苷酸是接合反应中的中间物，其中单磷酸腺苷附接于多核苷酸的5'-磷酸。用于生成这种中间物的各种试剂盒是可获得的，如来自NEB的5'DNA腺苷酰化试剂盒。通过在反应中对于修饰核苷酸三磷酸进行取代ATP，然后可以向多核苷酸的5'添加反应性基团(如硫醇、胺、生物素、叠氮化物等)。还可能的是，可以使用5'DNA腺苷酸化试剂盒将锚直接添加到具有适当经修饰的核苷酸(例如胆固醇或棕榈酸)的多核苷酸。
理想地，探针与膜偶联而不必使探针官能化。这可以通过将所述一个或多个如多核苷酸结合蛋白或化学基团等锚偶联到膜并且使所述一个或多个锚与探针相互作用或通过使膜官能化实现。所述一个或多个锚可以通过本文描述的任何方法偶联到膜。特别地，所述一个或多个锚可以包括一个或多个接头，如马来酰亚胺官能化接头。
所述一个或多个锚可以包括与单链多核苷酸、探针内的特定核苷酸序列或探针内经修饰的核苷酸的图案、或探针上存在的任何其它配体偶联、结合或相互作用的任何基团。
用于锚中的合适结合蛋白包含但不限于：大肠杆菌单链结合蛋白、P5单链结合蛋白、T4 gp32单链结合蛋白、TOPO V dsDNA结合区域、人类组蛋白、大肠杆菌HU DNA结合蛋白和其它古细菌、原核或真核单链或双链多核苷酸(或核酸)结合蛋白。
所述一个或多个锚可以包括与多核苷酸偶联、结合、插入或相互作用的任何基团。基团可以通过静电、氢结合或范德华力相互作用插入探针或与其相互作用。这种基团包含赖氨酸单体、聚赖氨酸(其将与ssDNA或dsDNA相互作用)、溴化乙锭(其将插入dsDNA)、通用碱基或通用核苷酸(其可以与任何多核苷酸杂交)和锇络合物(其可以与甲基化碱基反应)。因此，探针可以使用附接到膜的一个或多个通用核苷酸与膜偶联。每个通用核苷酸可以使用一个或多个接头与膜偶联。通用核苷酸优选地包括以下核碱基中的一个：次黄嘌呤、4-硝基吲哚、5-硝基吲哚、6-硝基吲哚、甲酰基吲哚、3-硝基吡咯、硝基咪唑、4-硝基吡唑、4-硝基苯并咪唑、5-硝基吲唑、4-氨基苯并咪唑或苯基(C6-芳环)。通用核苷酸更优选地包括以下核苷中的一个：2'-脱氧肌苷、肌苷、7-脱氮-2'-脱氧肌苷、7-脱氮-肌苷、2-氮杂-脱氧肌苷、2-氮杂-肌苷、2-O'-甲基肌苷、4-硝基吲哚2'-脱氧核苷、4-硝基吲哚核苷、5-硝基吲哚2'--脱氧核苷、5-硝基吲哚核苷、6-硝基吲哚2'--脱氧核苷、6-硝基吲哚核苷、3-硝基吡咯2'--脱氧核苷、3-硝基吡咯核苷、次黄嘌呤的非环糖类似物、硝基咪唑2'--脱氧核苷、硝基咪唑核苷、4-硝基吡唑2'--脱氧核苷、4-硝基吡唑核苷、4-硝基苯并咪唑2'--脱氧核苷、4-硝基苯并咪唑核苷、5-硝基吲唑2'--脱氧核苷、5-硝基吲唑核苷、4-氨基苯并咪唑2'--脱氧核苷、4-氨基苯并咪唑核苷、苯基C-核苷、苯基C-2'-脱氧核糖基核苷、2'-脱氧烟云杯伞素、2'-脱氧异鸟苷、K-2'-脱氧核苷、P-2'-脱氧核苷和吡咯烷。通用核苷酸更优选地包括2'-脱氧肌苷。通用核苷酸更优选地是IMP或dIMP。通用核苷酸最优选地是dPMP(2'-脱氧-P-核苷单磷酸)或dKMP(N6-甲氧基-2,6-二氨基嘌呤单磷酸)。
所述一个或多个锚可以通过Hoogsteen氢键(其中两个核碱基通过氢键保持在一起)或反向Hoogsteen氢键(其中一个核碱基相对于其它核碱基旋转180°)与多核苷酸偶联(或结合)。例如，所述一个或多个锚可以包括与多核苷酸形成Hoogsteen氢键或反向Hoogsteen氢键的一个或多个核苷酸、一个或多个寡核苷酸或一个或多个多核苷酸。这些类型的氢键允许第三多核苷酸链缠绕双链螺旋并且形成三链体。
在此实施例中，至少1％、至少10％、至少25％、至少50％或100％的膜组分可以进行官能化。
当所述一个或多个锚包括蛋白质时，它们可以能够直接锚定到膜中而无需进一步官能化，例如当其已经具有与膜相容的外部疏水区域时。这种蛋白质的实例包含但不限于跨膜蛋白质、膜内蛋白质和膜蛋白。替代性地，蛋白质可以用与膜相容的遗传融合的疏水区域表达。这种疏水蛋白质区域是本领域已知的。
优选地在递送到膜之前将所述一个或多个锚与探针混合，但是所述一个或多个锚可以与膜接触并且随后与探针接触。
在另一个方面，可以使用本文所述的方法使探针官能化，使得其可以被特异性结合基团识别。具体地说，探针可以用配体进行官能化，所述配体如生物素(用于结合到抗生蛋白链菌素)、直链淀粉(用于结合到麦芽糖结合蛋白或融合蛋白)、Ni-NTA(用于结合到聚组氨酸或聚组氨酸标签的蛋白质)或肽(如抗原)。
诊断
在一些实施例中，靶多核苷酸是微RNA(或miRNA)。一组两个或更多个靶多核苷酸优选地是一组两个或更多个miRNA。适用于诊断的miRNA是本领域熟知的。例如，合适的miRNA存储在公开可用的数据库中(Jiang Q.，Wang Y.，Hao Y.，Juan L.，Teng M.，ZhangX.，Li M.，Wang G.，Liu Y.，(2009)miR2Disease：人工疾病中微RNA失调的手动策划数据库。《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》)。
一个或多个miRNA可以例如用于诊断或预测疾病或病状。疾病或病状优选地是癌症、冠心病、心血管疾病或败血症。疾病或病状更优选地是腹主动脉瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、急性心肌梗塞、急性早幼粒细胞白血病(APL)、腺瘤、肾上腺皮质癌、酒精性肝病、阿尔茨海默病、甲状腺未分化癌(ATC)、焦虑症、哮喘、星形细胞瘤、特应性皮炎、自闭症谱系障碍(ASD)、B细胞慢性淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤、Becker肌营养不良症(BMD)、膀胱癌、脑肿瘤、乳腺癌、伯基特淋巴瘤、心肌肥厚、心肌病、心血管疾病、小脑神经变性、宫颈癌、胆管癌、胆脂瘤、绒毛膜癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、慢性胰腺炎、结肠癌、结直肠癌、先天性心脏病、冠状动脉疾病、牛犊综合征、皮肌炎(DM)、糖尿病肾病、腹泻为主的肠易激综合征、弥漫性大B细胞淋巴瘤、扩张型心肌病、唐氏综合征(DS)、杜氏肌营养不良症(DMD)、子宫内膜癌、子宫内膜子宫内膜样腺癌、子宫内膜异位症、上皮性卵巢癌、食道癌、食道鳞状细胞癌、原发性血小板增多症(ET)、面肩肱型肌营养不良症(FSHD)、滤泡性淋巴瘤(FL)、滤泡性甲状腺癌(FTC)、额颞叶痴呆、胃癌(胃癌)、胶质母细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤(GBM)、胶质瘤、肾小球疾病、肾小球硬化、错构瘤、HBV相关肝硬化、HCV感染、头和颈癌、头和颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、听力损失、心脏疾病、心脏衰竭、乙型肝炎、丙型肝炎、肝细胞癌(HCC)、肝门胆管癌、霍奇金氏淋巴瘤、纯合镰状细胞病(HbSS)、亨廷顿舞蹈病(HD)、高血压、下咽癌、包涵体肌炎(IBM)、胰岛素瘤、肝内胆管细胞癌(ICC)、肾癌、肾病、喉癌、晚期失眠(睡眠病)、肺平滑肌瘤、白血病、肢带肌营养不良症2A型(LGMD2A)、脂肪瘤、肺腺癌、肺癌、淋巴增生性疾病、恶性淋巴瘤、恶性黑色素瘤、恶性间皮瘤(MM)、套细胞淋巴瘤(MCL)、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、脑膜瘤、代谢性疾病、三好氏远端肌肉病变(MM)、多发性骨髓瘤(MM)、多发性硬化、MYC重排淋巴瘤、骨髓增生异常综合征、骨髓增生性疾病、心肌梗死、心肌损伤、肌瘤、鼻咽癌(NPC)、线状体肌病(NM)、肾炎、神经母细胞瘤(NB)、中性粒细胞增多症、尼曼-皮克型(NPC)疾病、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非小细胞肺癌(NSCLC)、肥胖、口腔癌、卵巢癌(OC)、胰腺癌、胰腺导管腺癌(PDAC)、胰腺肿瘤、恐慌症、乳头状甲状腺癌(PTC)、帕金森病、PFV-1感染、咽部疾病、垂体腺瘤、多囊肾病、多囊肝病、真性红细胞增多症(PV)、多发性肌炎(PM)、原发性胆汁性肝硬化(PBC)、原发性骨髓纤维化、朊病毒疾病、前列腺癌、牛皮癣关节炎、牛皮癣、肺动脉高压、复发性卵巢癌、肾细胞癌、肾透明细胞癌、视网膜色素变性(RP)、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、风湿性心脏病和心房颤动、类风湿性关节炎、肉瘤、精神分裂症、败血症、浆液性卵巢癌、塞扎里综合征、皮肤疾病、小细胞肺癌、脊髓小脑性共济失调、鳞状细胞癌、T细胞白血病、畸胎癌、睾丸生殖细胞肿瘤、地中海贫血、甲状腺癌、舌鳞状细胞癌、图雷特综合征、类型2型糖尿病、溃疡性结肠炎(UC)、子宫平滑肌瘤(ULM)、葡萄膜黑色素瘤、血管疾病、水疱性口炎、或瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)。由于本发明的多重方法可以确定是否存在两个或更多个miRNA，因此可以预测或诊断上文列出的任何疾病中的两种或更多种。
设备和条件
可以使用本领域已知的标准单通道记录设备进行电测量，例如，如Stoddart，D.S.等人，(2009)，《美利坚合众国国家科学院院刊(Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America)》，106,p7702-7707，Lieberman KR等人，《美国化学协会期刊(J Am Chem Soc)》，2010；132(50):17961-72和国际申请WO-2000/28312中所述。替代性地，可以使用多通道系统进行电测量，例如如WO2009/077734和WO2011/067559中所述。
可以使用适合于研究孔插入到膜中的膜/孔系统的任何设备进行方法。可以使用适合于跨膜孔感测的任何设备进行方法。例如，设备包括包括水溶液的室以及将室分成两个区段的屏障。屏障具有开孔，在开孔中形成含有孔的膜。
可以使用WO2008/102120、WO2010/122293或WO00/28312中描述的设备进行方法。
方法涉及测量通过孔的离子电流，通常通过电流测量。替代性地，可以光学测量通过孔的离子流，如Heron等人：《美国化学协会期刊(J.Am.Chem.Soc.)》9Vol.131,No.5,2009中所公开的。因此，设备还可以包括能够施加电位并且测量跨膜和孔的电信号的电路。可以使用贴片钳或电压钳进行方法。方法优选地涉及使用电压钳。
方法可以在基于硅的孔阵列上进行，其中每个阵列包括128个、256个、512个、1024个、2000个、3000个、4000个、6000个、10000个、12000个、15000个或更多个孔。
本发明的方法可以涉及测量流过孔的电流。用于测量通过跨膜孔的离子电流的适当条件在本领域中是已知的并且在实例中公开。方法通常在跨膜和孔施加电压的情况下进行。所使用的电压通常为+2V到-2V，通常为-400mV到+400mV。所使用的电压优选地处于具有下限和上限的范围内，所述下限选自-400mV、-300mV、-200mV、-150mV、-100mV、-50mV、-20mV和0mV，并且所述上限独立地选自+10mV、+20mV、+50mV、+100mV、+150mV、+200mV、+300mV和+400mV。所使用的电压更优选地处于100mV到240mV的范围内，并且最优选地处于120mV到220mV的范围内。通过使用增加的施加电位，可以通过孔增加不同核苷酸之间的区分。
通常在存在任何电荷载流子的情况下进行方法，所述电荷载流子如金属盐，例如碱金属盐；卤盐，例如如碱金属氯化物盐等氯化物盐。电荷载流子可以包含离子液体或有机盐，例如四甲基氯化铵、三甲基苯基氯化铵、苯基三甲基氯化铵或1-乙基-3-甲基氯化咪唑鎓。在以上讨论的示例性设备中，盐存在于室中的水溶液中。通常使用氯化钾(KCl)、氯化钠(NaCl)或氯化铯(CsCl)。KCl是优选的。盐可以是碱土金属盐，如氯化钙(CaCl2)。盐浓度可以是饱和的。盐浓度可以是3M或更低，并且通常为0.1M到2.5M、0.3M到1.9M、0.5M到1.8M、0.7M到1.7M、0.9M到1.6M、或1M到1.4M。盐浓度优选地为150mM到1M。优选地使用至少0.3M的盐浓度进行方法，如至少0.4M，至少0.5M，至少0.6M，至少0.8M，至少1.0M，至少1.5M，至少2.0M，至少2.5M或至少3.0M。高盐浓度提供高信噪比，并允许在正常电流波动的背景下识别指示结合/无结合的电流。
通常在存在缓冲液的情况下进行方法。在以上讨论的示例性设备中，缓冲液存在于室中的水溶液中。任何缓冲液可以用于本发明的方法中。通常，缓冲液是HEPES。另一种合适的缓冲液是Tris-HCl缓冲液。通常在以下pH下进行方法：4.0到12.0、4.5到10.0、5.0到9.0、5.5到8.8、6.0到8.7、或7.0到8.8、或7.5到8.5。所使用的pH优选地为约7.5。
可以在以下温度下进行方法：0℃到100℃、15℃到95℃、16℃到90℃、17℃到85℃、18℃到80℃、19℃到70℃或20℃到60℃。通常在室温下进行方法。任选地在支持酶功能的温度下进行方法，如约37℃。
可以使样品和探针组在膜的两侧与孔接触。通常使样品和探针组在膜的同一侧上与孔接触。
可以以任何顺序使样品和探针组与孔接触。优选在使样品和探针与孔接触之前使样品与探针组接触。替代性地，可以在使样品与探针组接触之前使样品与孔接触，或者可以在使样品与探针组接触之前使探针组与孔接触。如果在样品与孔接触之前使探针组与孔接触，则必须确保有足够的探针用于结合靶多核苷酸(并且没有全部穿过孔穿过膜)，例如通过确保在探针已经结合样品中存在的靶多核苷酸之前不将电位施加到跨膜孔。
测量浓度的方法
在一些实施例中，用于确定两个或更多个靶多核苷酸的存在、不存在或量的方法可以进一步包括，特别是对于包括四链体序列或双链序列和第二非杂交区域的那些探针，当每个探针结合其靶多核苷酸和未结合时比较流过孔的不同电流。这有助于确定样品中存在的靶多核苷酸的浓度，通常参考校准曲线，使用平衡常数或参考控制数据。用于计算浓度的方法是本领域熟知的。例如，可以使用校准曲线或控制数据。
本发明还提供了一种在样品中确定两个或更多个靶多核苷酸的量的方法，所述方法包括：
(i)进行用于确定两个或更多个靶多核苷酸的存在、不存在或量的方法；以及
(ii)对于示出存在于样品中的一个或多个靶多核苷酸，将流过孔的电流与每种靶多核苷酸的对照或参考数据进行比较，并且从而确定样品中所述一个两个或更多个靶多核苷酸的量。
可以通过进行对照实验生成对照或参考数据，其中已知量的靶多核苷酸用于校准测定。
在一些实施例中，方法可以包括向样品加入校准多核苷酸并使样品与探针组接触，所述探针组进一步包括校准探针，所述校准探针包括非杂交区域和与校准多核苷酸特异性杂交以形成杂交探针的杂交区域。可以以与本文所述的靶多核苷酸的探针类似的方式设计校准探针。例如，校准探针的杂交区域可以包括一个或多个非天然核苷酸。存在于校准探针的杂交区域中的所述一个或多个非天然核苷酸可以增加或减少由于探针与校准多核苷酸杂交而导致的电流阻塞的持续时间。电流阻塞的持续时间的增加或减少通常使得相比于对应的一个或多个天然核苷酸存在于校准探针的杂交区域中时，由发生在测量的电流阻塞窗口内的结合校准多核苷酸的校准探针引起的电流阻塞的比例增加。杂交的校准探针产生指示所述探针的电流阻塞。方法可以进一步包括将由校准探针/校准多核苷酸相互作用产生的电流阻塞的频率或数量与由一个或多个探针/靶多核苷酸相互作用产生的电流阻塞的频率或数量进行比较，以确定样本中一个或多个靶多核苷酸的量。可以计算样品中靶多核苷酸的浓度。
在一些实施例中，可以将具有与其结合的校准探针的校准多核苷酸添加到方法中使用的样品。将校准多核苷酸以已知量添加到样品，如以已知浓度。校准探针通常在靶多核苷酸结合探针组中的其相应探针的相同条件下结合校准多肽。
试剂盒
在另一个方面，本发明还提供了一种试剂盒，其用于确定样品中两个或更多个靶多核苷酸的存在、不存在或量。试剂盒包括(a)如本文所限定的探针组和(b)膜锚、(c)校准多核苷酸和(d)校准探针中的一个或多个。校准多核苷酸可以是在确定样品中靶多核苷酸的量或靶多核苷酸的方法中可以以已知浓度添加到样品的任何多核苷酸。可以使用任何合适的多核苷酸。通常，校准多核苷酸是与靶多核苷酸相同类型的多核苷酸。当靶多核苷酸是DNA时，校准多核苷酸通常是DNA，并且当靶多核苷酸是RNA时，校准多核苷酸通常是RNA。例如，校准多核苷酸可以是样品中不存在或仅以可忽略的水平存在的微RNA。校准多核苷酸可以是天然存在的多核苷酸或人工多核苷酸。校准探针通常是如本文所述的探针，其具有结合校准多核苷酸的杂交区域。校准探针可以存在于探针组中。替代性地，校准探针可以与试剂盒中的校准多核苷酸杂交。试剂盒可以进一步包括跨膜孔。上文参考本发明方法论述的实施例中任一个同样适用于试剂盒。
试剂盒可以进一步包括膜的组分，如形成两亲层所需的磷脂，如脂质双层或三嵌段共聚物。
试剂盒可以额外包括使上文提到的实施例中的任何实施例能够被进行的一种或多种其它试剂或仪器。这种试剂或仪器包含以下中的一项或多项：一种或多种适当的缓冲液(水溶液)、用于从受试者获得样品的装置(如包括针的容器或仪器)、用于扩增和/或表达多核苷酸的装置、如上文限定的膜或电压钳或贴片钳设备。试剂可以以干态存在于试剂盒中，使得流体样品使试剂再悬浮。试剂盒还可以任选地包括使试剂盒能够在本发明的方法中使用的说明书或关于方法可以用于哪些患者的详情。试剂盒可以任选地包括核苷酸。
设备
在另一个方面，本发明还提供了一种设备，其用于确定样品中两个或更多个靶多核苷酸的存在、不存在或量。设备包括多个孔和本发明的探针组。设备优选地进一步包括用于进行任何一个实施例的方法的说明书。设备可以是用于多核苷酸分析的任何常规设备，如阵列或芯片。以上参考用于确定两个或更多个靶多核苷酸的存在、不存在或量的方法讨论的任何实施例同样适用于本发明的设备。
优选地设置设备以进行用于确定两个或更多个靶多核苷酸的存在、不存在或量的方法的任何实施例。
设备优选地进一步包括：
传感器装置，其能够支撑膜和多个孔，并且能够操作以使用孔进行靶多核苷酸表征；
至少一个储槽，其用于盛放进行表征用的材料；
流体系统，其被配置成可控地从至少一个储槽供应材料到传感器装置；以及
多个容器，其用于收纳相应样品，所述流体系统被配置成选择性地将样品从容器供应到传感器装置。
以下实例示出本发明。
实例1
此实例示出了可以如何调节作为败血症的候选微RNA标志物的微RNA 150的停留时间。
材料
DNA序列(其中mN表示2-O-me-RNA碱基取代)
150_4G1C_1Alt(SEQ ID NO：4，胆固醇TEG位于3'末端)最终浓度＝500pM
TTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTCGGGGmCAmCTmGGmUAmCAmAGmGGmUTmGGmGA/3CholTEG/
150_4G1C_2Alt(SEQ ID NO：5，胆固醇TEG位于3'末端)最终浓度＝500pM
TTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTCGGGGmCACmUGGmUACmAAGmGGTmUGGmGA/3CholTEG/
150_4G1C_3Alt(SEQ ID NO：6，胆固醇TEG位于3'末端)最终浓度＝500pM
TTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTCGGGGmCACTmGGTAmCAAGmGGTTmGGGA/3CholTEG/
150_4G1C_4Alt(SEQ ID NO：7，胆固醇TEG位于3'末端)最终浓度＝500pM
TTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTCGGGGmCACTGmGTACAmAGGGTmUGGGA/3CholTEG/
150_4G1C_5Alt(SEQ ID NO：8，胆固醇TEG位于3'末端)最终浓度＝500pM
TTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTCGGGGmCACTGGmUACAAGmGGTTGGmGA/3CholTEG/
192_6T(SEQ ID NO：9，胆固醇TEG位于3'末端)最终浓度＝500pM
TTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTGGCTGTCAATTCATAGGTCAG/3CholTEG/
RNA序列
miR-150(SEQ ID NO：10)最终浓度＝500pM
UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG
miR-192(SEQ ID NO：11)最终浓度＝500pM
CUGACCUAUGAAUUGACAGCC
方法
并行建立六个杂交，其中使用以下方案将10μM样品miRNA与50mM NaCl，10mM TrispH7.5中的10μM对应DNA探针杂交：
将等体积的每种10μM预制双链体加入低结合管，并将样品在500mM氯化钾、25mM磷酸钾缓冲液pH 8中稀释到最终工作浓度(500pM)。
从插入缓冲液(600mM KCl，25mM磷酸钾缓冲液，75mM亚铁氰化钾(II)，25mM亚铁氰化钾(III)，pH 8.0)中的嵌段共聚物中的单个α-溶血素纳米孔获得电测量。在实现将单一孔插入嵌段共聚物中之后，然后缓冲液(1mL 600mM KCl，25mM磷酸钾缓冲液，150mM亚铁氰化钾(II)，150mM铁氰化钾(III)，pH 8.0)流过系统，以移除任何过量α-溶血素纳米孔。在约900秒之后加入500uL预杂交样品，并使用以下方案控制电位：
上述详述的方案进行1小时，并监测每个孔的电流。
结果
当一起观察时，杂交区域中存在的非天然核苷酸导致不同双链体变体之间的停留时间的明显差异。所有变体产生比未修饰的双链体更长的电流阻塞(图1中标记为X)。从数据来看，存在2-O-me碱基(非天然核苷酸)总数增加的趋势，导致更长的电流阻塞。还示出了校准双链体的电流阻塞持续时间(图1中标记为Y)，以证明双链体的停留时间的调整。
实例2
此实例示出了可以如何调节作为败血症的推定微RNA标志物的微RNA 182的停留时间。
材料
DNA序列(其中mN表示2-O-me-RNA碱基取代)
182_3T_3G_1Alt(SEQ ID NO：12，胆固醇TEG位于3'末端)最终浓度＝500pM
TTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTGGGmAGmUGmUGmAGmUTmCTmACmCAmUTmGCmCAmAA/3CholTEG/
182_3T_3G_2Alt(SEQ ID NO：13，胆固醇TEG位于3'末端)最终浓度＝500pM
TTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTGGGmAGTmGTGmAGTmUCTmACCmATTmGCCmAAA/3CholTEG/
182_3T_3G_3Alt(SEQ ID NO：14，胆固醇TEG位于3'末端)最终浓度＝500pM
TTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTGGGmAGTGmUGAGmUTCTmACCAmUTGCmCAAA/3CholTEG/
182_3T_3G_4Alt(SEQ ID NO：15，胆固醇TEG位于3'末端)最终浓度＝500pM
TTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTGGGmAGTGTmGAGTTmCTACCmATTGCmCAAA/3CholTEG/
182_3T_3G_5Alt(SEQ ID NO：16，胆固醇TEG位于3'末端)最终浓度＝500pM
TTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTGGGmAGTGTGmAGTTCTmACCATTmGCCAAA/3CholTEG/
192_6T(SEQ ID NO：9，胆固醇TEG位于3'末端)最终浓度＝500pM
TTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTGGCTGTCAATTCATAGGTCAG/3CholTEG/
RNA序列
miR-182(SEQ ID NO：17)最终浓度＝500pM
UUUGGCAAUGGUAGAACUCACACU
miR-192(SEQ ID NO：11)最终浓度＝500pM
CUGACCUAUGAAUUGACAGCC
方法
并行建立六个杂交，其中使用以下方案将10μM样品miRNA与50mM NaCl，10mM TrispH7.5中的10μM对应DNA探针杂交：
将等体积的每种10μM预制双链体加入低结合管，并将样品在500mM氯化钾、25mM磷酸钾缓冲液pH 8中稀释到最终工作浓度(500pM)。
从插入缓冲液(600mM KCl，25mM磷酸钾缓冲液，75mM亚铁氰化钾(II)，25mM亚铁氰化钾(III)，pH 8.0)中的嵌段共聚物中的单个α-溶血素纳米孔获得电测量。在实现将单一孔插入嵌段共聚物中之后，然后缓冲液(1mL 600mM KCl，25mM磷酸钾缓冲液，150mM亚铁氰化钾(II)，150mM铁氰化钾(III)，pH 8.0)流过系统，以移除任何过量α-溶血素。在约900秒之后加入500uL预杂交样品，并使用以下方案控制电位：
上述详述的方案进行1小时，并监测每个孔的电流。
结果
当一起观察时，杂交区域中存在的非天然核苷酸导致不同双链体变体之间的停留时间的明显差异。从数据来看，存在2-O-me(非天然核苷酸)碱基总数增加的趋势，导致更长的电流阻塞(参见图2)。还示出了校准双链体的电流阻塞(图2中标记为Y)，以证明双链体的停留时间的调整。
实例3
此实例示出了可以如何调节作为败血症的候选微RNA标志物的微RNA 342的停留时间。
材料
DNA序列(其中mN表示2-O-me-RNA碱基取代)
342 3T_3Sp(SEQ ID NO：18通过3个iSpC3间隔区与其3'末端附接到SEQ ID NO：19的5'末端，其在3'末端处具有胆固醇TEG)最终浓度＝500pM
TTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTT/iSpC3//iSpC3//iSpC3/TCAATCACAGATAGCACCCCT/3CholTEG/
342 3T_3Sp_all_enh(SEQ ID NO：18通过3个iSpC3间隔区与其3'末端附接到SEQID NO：20的5'末端，其在3'末端处具有胆固醇TEG)最终浓度＝500pM
TTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTT/iSpC3//iSpC3//iSpC3/mTmCmAmAmTmCmAmCmAmGmAmTmAmGmCmAmCmCmCmCmT/3CholTEG/
192_6T(SEQ ID NO：9，胆固醇TEG位于3'末端)最终浓度＝500pM
TTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTGGCTGTCAATTCATAGGTCAG/3CholTEG/
RNA序列
miR-342(SEQ ID NO：21)最终浓度＝500pM
AGGGGUGCUAUCUGUGAUUGA
miR-192(SEQ ID NO：11)最终浓度＝500pM
CUGACCUAUGAAUUGACAGCC
方法
并行建立三个杂交，其中使用以下方案将10μM样品miRNA与50mM NaCl，10mM TrispH7.5中的10μM对应DNA探针杂交：
将等体积的每种10μM预制双链体加入低结合管，并将样品在500mM氯化钾、25mM磷酸钾缓冲液pH 8中稀释到最终工作浓度(500pM)。
从插入缓冲液(600mM KCl，25mM磷酸钾缓冲液，75mM亚铁氰化钾(II)，25mM亚铁氰化钾(III)，pH 8.0)中的嵌段共聚物中的单个α-溶血素纳米孔获得电测量。在实现将单一孔插入嵌段共聚物中之后，然后缓冲液(1mL 600mM KCl，25mM磷酸钾缓冲液，150mM亚铁氰化钾(II)，150mM铁氰化钾(III)，pH 8.0)流过系统，以移除任何过量α-溶血素纳米孔。在约900秒后加入500uL预杂交样品，并使用以下方案控制电位。
上述详述的方案进行1小时，并监测每个孔的电流。
结果
图3示出了有可能成功调整miRNA:DNA杂交双链体阻断的停留时间，使其聚集在所需的窗口中(在此实例中约为1秒)。图3的组1示出了未修饰的342_3T_3SP RNA双链体的电流嵌段比和停留时间。图3的组2示出了向原始样品添加停留调整的342_3T_3SP双链体(3423T_3Sp_all_enh，标记为X)。观察到杂交区域的修饰(其中杂交区域中的所有核苷酸都是非天然核苷酸)已经将电流阻塞簇的平均停留移动到以1秒为中心的期望窗口内。组3示出了添加校准双链体(标记为Y)，其用于实验之间的比较。
实例4
此实例示出了如何使用纳米孔检测五种不同的微RNA(其是败血症的候选标志物)。用于检测微RNA的探针具有a)杂交区域中没有非天然核苷酸(微RNA 192和486)，b)杂交区域中的所有非天然核苷酸(微RNA 342)或c)杂交区域中的图案化的非天然核苷酸(微RNA 150和182)。
材料
DNA序列(其中mN表示2-O-me-RNA碱基取代)
182_6T_1Alt(SEQ ID NO：22，胆固醇TEG位于3'末端)最终浓度＝500pM
TTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTmAGmUGmUGmAGmUTmCTmACmCAmUTmGCmCAmAA/3CholTEG/
192_3_3SP(SEQ ID NO：18通过3个iSpC3间隔区与其3'末端附接到SEQ ID NO：23的5'末端，其在3'末端处具有胆固醇TEG)最终浓度＝500pM
TTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTT/iSpC3//iSpC3//iSpC3/GGCTGTCAATTCATAGGTCAG/3CholTEG/
342_3T_3SP_All_enh(SEQ ID NO：18通过3个iSpC3间隔区与其3'末端附接到SEQID NO：20的5'末端，其在3'末端处具有胆固醇TEG)最终浓度＝500pM
TTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTT/iSpC3//iSpC3//iSpC3/mTmCmAmAmTmCmAmCmAmGmAmTmAmGmCmAmCmCmCmCmT/3CholTEG/
150_4G1C_2Alt(SEQ ID NO：5，胆固醇TEG位于3'末端)最终浓度＝500pM
TTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTCGGGGmCACmUGGmUACmAAGmGGTmUGGmGA/3CholTEG/
486_3T_3X(SEQ ID NO：18在其3'末端处附接到三个1',2'-双脱氧核糖间隔区，其附接到SEQ ID NO：24的5'末端，其在3'末端处具有胆固醇TEG)最终浓度＝500pM
TTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTT/idSp/idSp/idSp/CTCGGGGCAGCTCAGTACAGGA/3CholTEG/
RNA序列
hsa-miR-192(SEQ ID NO:11)
CUGACCUAUGAAUUGACAGCC
hsa-miR-342(SEQ ID NO:25)
AAAGGGGUGCUAUCUGUGAUUGA
hsa-miR-150(SEQ ID NO:10)
UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG
hsa-miR-182(SEQ ID NO:17)
UUUGGCAAUGGUAGAACUCACACU
hsa-miR-486(SEQ ID NO:26)
UCCUGUACUGAGCUGCCCCGAG
方法
并行建立五个杂交，其中使用以下方案将10μM样品miRNA与50mM NaCl，10mM TrispH7.5中的10μM对应DNA探针杂交：
将等体积的每种10μM预制双链体加入低结合管，并将样品在500mM氯化钾、25mM磷酸钾缓冲液pH 8中稀释到最终工作浓度(500pM)。
从插入缓冲液(600mM KCl，25mM磷酸钾缓冲液，75mM亚铁氰化钾(II)，25mM亚铁氰化钾(III)，pH 8.0)中的嵌段共聚物中的单个α-溶血素纳米孔获得电测量。在实现将单一孔插入嵌段共聚物中之后，然后缓冲液(1mL 600mM KCl，25mM磷酸钾缓冲液，150mM亚铁氰化钾(II)，150mM铁氰化钾(III)，pH 8.0)流过系统，以移除任何过量α-溶血素纳米孔。在约900秒后加入500uL预杂交样品，并使用以下方案控制电位。
上述详述的方案进行1小时，并监测每个孔的电流。
结果
在这里，我们展示了miRNA和杂交探针组，它们已经被设计用于给出分离良好的电流阻塞簇。图4示出了如何使用三个度量来确定对应于特定微RNA的簇的同一性。电流阻塞长度(或停留)(A部分)，“变化”或标准偏差(B部分)和电流阻塞噪声(C部分)。五簇是可见的对应于5个双链体，如图4中高亮显示的。按降序排列：192-3T_3Sp、342-3T_3Sp_all_enh、486-3T_3X、150_4G_1C_2Alt、182-6T_1Alt。从第一组可以看出，仅测量在限定的窗口内检测到的电流阻塞并提出用于进一步分析。

Claims (19)

1.一种用于确定在包括额外组分的样品中两个或更多个靶多核苷酸的存在、不存在或量的方法，所述方法包括：
(i)使所述样品与两个或更多个探针的组在适于所述靶多核苷酸与所述探针杂交的条件下接触，其中：
(a)每个探针包括非杂交区域和与所述靶多核苷酸中的一个特异性杂交以形成杂交探针的杂交区域；以及
(b)所述组中的探针的所述杂交区域包括一个或多个非天然核苷酸；
(ii)使步骤(i)中制备的所述样品与跨膜孔接触，单链多核苷酸而不是双链多核苷酸能够穿过所述跨膜孔，并且对所述跨膜孔施加电位差，使得所述样品中的所述探针穿过所述孔，其中所述样品中的探针的所述非杂交区域的至少一部分进入所述跨膜孔，并保留在所述跨膜孔内，直到所述靶多核苷酸与所述探针的所述杂交区域去杂交，然后所述探针穿过所述孔；
(iii)测量具有限定窗口内的持续时间的电流阻塞，所述电流阻塞包括由结合到其各自的靶的探针引起的电流阻塞并排除更长和/或更短的电流阻塞，其中：
(a)存在于所述探针的所述杂交区域中的所述一个或多个非天然核苷酸，与所述杂交区域中存在对应的一个或多个天然核苷酸时相比，由于所述探针与其靶多核苷酸杂交而增加或减少所述电流阻塞的所述持续时间，使得由于所述杂交探针移动穿过所述孔而发生的电流阻塞在所述限定窗口内发生；并且
(b)每个杂交探针产生指示所述探针的电流阻塞信号图案；以及
(iv)将所述测量的电流阻塞信号图案与所述探针相关联，从而确定所述样品中所述两个或更多个靶多核苷酸的存在、不存在或量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述组中至少两个探针的所述非杂交区域彼此不同，并且所述方法包括单独确定与所述至少两个探针中的每一个杂交的所述靶多核苷酸的存在或不存在。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述组中每一个探针包括唯一非杂交区域。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述非天然核苷酸包括(ⅰ)经修饰的糖，任选地，其中所述经修饰的糖是2'O-甲基核糖；和/或(ⅱ)经修饰的核碱基。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述非天然核苷酸是肽核酸、锁核酸、解锁核酸、桥接核酸(BNA)或吗啉代。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述杂交区域中的至少一个包括ZxNy和/或NyZx中的一个或多个实例，其中Z是非天然核苷酸，并且N是与所述靶多核苷酸中的所述核苷酸中的一个互补的天然核苷酸，X是1、2、3、4或5，并且Y是1、2、3、4或5。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述探针中的至少一个中，所述非杂交区域是所述杂交区域的5'；和/或其中在所述探针中的至少一个中，所述杂交区域位于所述探针的3'末端处。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述探针进一步包括第二非杂交区域，以及第二杂交区域、四链体序列或双链区域，其中所述第一和第二非杂交区域由所述第一或第二杂交区域、所述四链体序列或所述双链区域隔开。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述非杂交区域包括聚合物；任选地，其中所述聚合物是多核苷酸、多肽、聚乙二醇(PEG)或多糖。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述探针中的一个或多个进一步包括允许其与所述膜偶联的锚。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述窗口被限定为包含0.01秒与10秒之间的电流阻塞。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中由与其各自的靶多核苷酸杂交的所述探针中的至少两个引起的或由所述组中所有杂交探针引起的所述电流阻塞的所述持续时间在彼此的一秒或更短时间内。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述靶多核苷酸是长度为约15个到约30个核苷酸的单链寡核苷酸；任选地，其中所述多核苷酸中的至少一个是siRNA或微RNA。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述跨膜孔是蛋白质孔或固态孔。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中：
(a)所述样品包括已知量的校准探针，所述校准探针与校准多核苷酸杂交，或步骤(i)进一步包括向所述样品添加已知量的校准多核苷酸，并使所述样品与校准探针在适于所述校准多核苷酸与所述校准探针杂交的条件下接触，其中所述校准探针包括杂交区域和非杂交区域，所述杂交区域与所述校准多核苷酸特异性杂交，所述非杂交区域产生指示所述校准探针的电流阻塞；并且
(b)所述方法进一步包括(v)将由与靶多核苷酸杂交的一个或多个探针穿过所述孔的移动产生的电流阻塞的频率与由杂交校准探针穿过所述孔的移动产生的电流阻塞的频率进行比较，以确定所述靶多核苷酸中的一个或多个的浓度。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述校准探针的所述杂交区域包括一个或多个非天然核苷酸，所述非天然核苷酸由于所述校准探针与所述校准多核苷酸杂交而增加或减少所述电流阻塞的所述持续时间，使得与所述杂交区域中存在对应的一个或多个天然核苷酸时相比，由于所述杂交校准探针穿过所述孔的移动，在所述窗口内发生的电流阻塞的比例增加。
17.一种诊断疾病的方法，其中所述方法包括执行根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述靶多核苷酸是所述疾病的标志物；任选地，其中所述疾病是癌症、心脏病或传染病。
18.探针组在根据权利要求1-17中任一项所述的方法检测两个或更多个靶多核苷酸的存在或不存在的用途，其中所述探针根据权利要求1-10中任一项定义。
19.一种用于确定两个或更多个靶多核苷酸的存在、不存在或量的试剂盒，包括(a)根据权利要求1-10所述的探针组以及(b)膜锚、(c)校准多核苷酸和(d)校准探针中的一个或多个。
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