CN117338902B - 一种用于治疗卵子成熟障碍的复方制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医疗领域，具体公开了一种用于治疗卵子成熟障碍的复方制剂，所述复方制剂包含如下浓度的组分：姜黄素(Curcumin,0.5‑200nmol),二氢香豆素（Dihydrocoumarin,0.1‑100nml）、烟酰胺(Nicotinamide,0.1‑100 mmol）、泽布拉林(Zebularine,0.5‑200μmol),佛司可林(Forskolin,0.5‑100μmol）、图巴辛（Tubacin,0.5‑50μmol）、腺苷三磷酸（ATP,1‑20 mmol）、以及二甲双胍（Metformin,0.5‑20mmol）。本发明针对基因突变引起的卵子成熟障碍这一疑难杂症，通过合理配比构成复方治疗型制剂，促进卵母细胞正常减数分裂进程的推进，加快能量代谢，清除代谢活性氧，有利于卵母细胞核成熟，提高受精率和囊胚发育率，表型挽救显著，治疗效果良好。
Description
技术领域
本发明属于生物医疗领域，涉及一种用于治疗因TUBB8、TRIP13、TACC3、PATL2基因突变导致的卵子成熟障碍和女性不孕的制剂。
背景技术
虽然辅助生殖技术(assisted reproductive technology,ART)已广泛应用于多种不孕不育症的治疗，但仍存在一些无法明确和解决的不孕不育病因，如卵母细胞成熟阻滞，目前也被称作一种新的孟德尔遗传病，是一类较为罕见的原发性不孕症。
自1990年报道第一例人类卵母细胞成熟停滞以来，卵子成熟障碍的病因一直处于探索中。自2016年起，TUBB8、TRIP13、TACC3、PATL2等可遗传的人类卵子成熟障碍的致病基因相继被发现，并且可以解释30-40％患者卵子发育停滞的病因，但对于由这些基因突变引起的卵子成熟障碍的治疗目前仍是一片空白。探寻和开发由TUBB8、TRIP13、TACC3、PATL2基因突变引起的卵母细胞停滞相关的治疗方法，对于临床上解决女性生殖障碍相关疾病具有重要的现实意义和指导价值。虽然由TUBB8、TRIP13、TACC3、PATL2基因突变导致的卵母细胞成熟障碍的病因能够通过全外显子测序来确定，但目前尚未发现有对于这类疾病的干预措施能治疗由基因突变导致的卵母细胞成熟障碍，因此迫切需要开发安全且有效治疗卵母细胞成熟障碍的方法。
发明内容
针对现有问题的不足，本发明的目的是提供一种用于治疗卵子成熟障碍的复方制剂，用于治疗因TUBB8、TRIP13、TACC3、PATL2基因突变导致的卵子成熟障碍和女性不孕。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是：
第一方面，本发明保护一种治疗人卵母细胞成熟停滞的组合物，所述组合物包括如下组分：二氢香豆素(Dihydrocoumarin)、泽布拉林(Zebularine)、图巴辛(Tubacin)以及腺苷三磷酸(ATP)。
在具体的实施方案中，所述组合物摩尔比为Dihydrocoumarin：Zebularine：Tubacin：ATP＝0.1～100nmol：0.5～200μmol：0.5～50μmol：1～20mmol。
在更具体的实施方案中，所述组合物摩尔比为Dihydrocoumarin：Zebularine：Tubacin：ATP＝10nmol：10μmol：20μmol：5mmol。
在具体的实施方案中，所述组合物还包括以下组分：姜黄素(Curcumin)、烟酰胺(Nicotinamide)、佛司可林(Forskolin)以及二甲双胍(Metformin)。
在具体的实施方案中，所述组合物摩尔比为Curcumin：Dihydrocoumarin：Nicotinamide：Zebularine：Forskolin：Tubacin：ATP：Metformin＝0.5～200nmol：0.1～100nmol：0.1～100nmol：0.5～200μmol：0.5～100μmol：0.5～50μmol：1～20mmol：0.5～20mmol。
优选的，所述组合物摩尔比为Curcumin：Dihydrocoumarin：Nicotinamide：Zebularine：Forskolin：Tubacin：ATP：Metformin＝5nmol：10nmol：2nmol：10μmol：10μmol：20μmol：5mmol：2mmol。
第二方面，本发明保护一种治疗人卵母细胞成熟停滞的复方制剂，包括前文所述的组合物及药学上可接受的辅料。
在具体的实施方案中，所述药学上可接受的辅料选自填充剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂中的一种或多种。
在具体的实施方案中，所述制剂为口服制剂、注射制剂、经皮给药制剂或黏膜给药制剂。
本发明的组合物或制剂可用任何公知的给药方法给药。
本发明的组合物或制剂的给药剂量依照所述治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型可以有大范围的变化。
本发明组合物或制剂可单独使用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用，当本发明的组合物或制剂与其他治疗药物存在协同作用时，应该根据试剂情况调整它的剂量。
第三方面，本发明还保护前文所述的组合物、前文所述的复方制剂在制备治疗人卵母细胞成熟停滞的药物中的应用。
第四方面，本发明还保护一种治疗治疗人卵母细胞成熟停滞的方法，所述方法包括向患者施加前文所述的组合物或者前文所述的复方制剂。
有益效果
本发明提供的一种用于治疗卵子成熟障碍的复方制剂，与现有技术相比，具有以下有益效果：
(a)小鼠GV期卵母细胞注射含有致病基因(TUBB8、TRIP13、TACC3、PATL2)的野生型(Wild-type,WT)及相应点突变的cRNA后，IBMX抑制20小时，在对照培养基及添加复方制剂的培养基中恢复减数分裂后，通过统计卵母细胞成熟率，发现在添加复方制剂培养后卵母细胞成熟率显著恢复。
(b)通过活性氧检测试剂盒检测携带致病基因点突变的卵母细胞在治疗前后的活性氧ROS水平，结果表明经复方制剂治疗后可明显降低突变卵母细胞ROS水平。
(c)收集相应卵子固定后利用免疫荧光方法于共聚焦显微镜测定细胞内磷酸化、乙酰化水平，发现与对照组相比，注射携带致病点突变cRNA的卵母细胞在含有以上复方制剂的培养基中培养15h后磷酸化水平降低，整体乙酰化水平升高。
(d)收集相应卵子进行体外授精及早期胚胎培养，发现复方制剂的添加提高了注射点突变cRNA卵母细胞的受精能力及早期胚胎发育能力。以上结果都表明该复方制剂能有效治疗卵母细胞突变引起的卵子发育停滞表型，且体外受精实验验证该复方制剂能有效提高基因突变卵母细胞受精率和囊胚发育率，表型挽救显著，治疗效果良好。
附图说明
图1培养液中添加复方制剂与否在注射点突变RNA后的突变卵母细胞成熟率统计；
图2培养液中添加复方制剂与否在注射点突变RNA后的突变卵母细胞成熟率统计；
图3培养液中添加复方制剂降低注射点突变RNA的卵母细胞ROS水平；
图4培养液中添加复方制剂与改善注射点突变RNA的卵母细胞磷酸化及乙酰化水平；
图5培养液中添加复方制剂提高注射点突变RNA卵母细胞受精率及囊胚发育率。
图6培养液中添加复方制剂与否在注射点突变RNA后的突变卵母细胞成熟率统计；
图7培养液中添加复方制剂与否在注射点突变RNA后的突变卵母细胞成熟率统计。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。所用试剂或者仪器设备未注明生产厂商的，均视为可以通过市场购买的常规产品。
本发明提供了一种治疗人卵母细胞成熟停滞的复方制剂，所述复方制剂包括如下组分：Dihydrocoumarin、Zebularine、Tubacin以及ATP。
在具体的实施方案中，所述组合物摩尔比为Dihydrocoumarin：Zebularine：Tubacin：ATP＝0.1～100nmol：0.5～200μmol：0.5～50μmol：1～20mmol。
在具体的实施方案中，所述组合物摩尔比为Dihydrocoumarin：Zebularine：Tubacin：ATP＝10nmol：10μmol：20μmol：5mmol。
在具体的实施方案中，所述复方制剂还包括以下组分：所述组合物还包括以下组分：Curcumin、Nicotinamide、Forskolin以及Metformin。
优选的，所述组合物摩尔比为Curcumin：Dihydrocoumarin：Nicotinamide：Zebularine：Forskolin：Tubacin：ATP：Metformin＝0.5～200nmol：0.1～100nmol：0.1～100nmol：0.5～200μmol：0.5～100μmol：0.5～50μmol：1～20mmol：0.5～20mmol。
更优选的，所述组合物摩尔比为Curcumin：Dihydrocoumarin：Nicotinamide：Zebularine：Forskolin：Tubacin：ATP：Metformin＝5nmol：10nmol：2nmol：10μmol：10μmol：20μmol：5mmol：2mmol。
下方举例说明本发明优选的具体实施方式，但本发明不限于此。
实施例1
一种治疗人卵母细胞成熟停滞的复方制剂，各组分摩尔比为Dihydrocoumarin：Zebularine：Tubacin：ATP＝10nmol：10μmol：20μmol：5mmol，制备方法如下：将配料表所述各种成分以浓储(1000x或更高)形式溶解于DMSO备用，另取1mL M2培养基，随后将组合物中各成分以所述浓度加入到M2培养基中，混匀后即得复方制剂。
选择NCBI中ClinVar数据库上已公布的PATL2,TUBB8的致病突变位点，通过扩增相应基因cDNA合成及将这些片段构建至pCMV6-FLAG载体，使用点突变试剂盒(Vazyme，C214)构建相应的点突变质粒，并利用体外转录试剂盒(NEB，E2060S)及RNA纯化试剂盒(NEB,T2040S)合成相应cRNA。
使用5周的ICR雌性小鼠，断颈处死后取出卵巢，解剖镜下用注射器针头戳破大卵泡，口吸管拾取COCs后机械性去除其周围的颗粒细胞，将洗净后的较大的、圆形饱满、有明显GV核的GV卵母细胞置于预热的加入IBMX(浓度为200μM)的M2培养基，37℃放置准备用于显微注射。小鼠GV期卵母细胞注射含有致病基因(PATL2及TUBB8)的野生型(Wild-type,WT)及相应点突变的cRNA后，于含有IBMX抑制剂的M2培养基抑制20小时后，洗净IBMX，随后再置于对照M16培养基及添加实施例1的复方制剂(Dihydrocoumarin：Zebularine：Tubacin：ATP＝10nmol：10μmol：20μmol：5mmol)后的M16培养基中进行减数分裂恢复培养，在培养15h后统计分析卵母细胞成熟率。结果显示，当向培养体系补充上述复方制剂后能有效提高点突变后的卵母细胞成熟率(图1，以PATL2及TUBB8的点突变为例)。
实施例2
一种治疗人卵母细胞成熟停滞的复方制剂，各组分摩尔比为Curcumin：Dihydrocoumarin：Nicotinamide：Zebularine：Forskolin：Tubacin：ATP：Metformin＝5nmol：10nmol：2nmol：10μmol：10μmol：20μmol：5mmol：2mmol，制备方法如下：将配料表所述各种成分以浓储(1000x或更高)形式溶解于DMSO备用，另取1mL M2培养基，随后将组合物中各成分以所述浓度加入到M2培养基中，混匀后即得复方制剂。
(一)复方制剂培养后突变卵母细胞成熟率显著恢复
选择NCBI中ClinVar数据库上已公布的PATL2,TACC3,TUBB8,TRIP13的致病突变位点，通过扩增相应基因cDNA合成及将这些片段构建至pCMV6-FLAG载体，使用点突变试剂盒(Vazyme，C214)构建相应的点突变质粒，并利用体外转录试剂盒(NEB，E2060S)及RNA纯化试剂盒(NEB,T2040S)合成相应cRNA。
使用5周的ICR雌性小鼠，断颈处死后取出卵巢，解剖镜下用注射器针头戳破大卵泡，口吸管拾取COCs后机械性去除其周围的颗粒细胞，将洗净后的较大的、圆形饱满、有明显GV核的GV卵母细胞置于预热的加入IBMX(浓度为200μM)的M2培养基，37℃放置准备用于显微注射。小鼠GV期卵母细胞注射含有致病基因(TUBB8、TRIP13、TACC3、PATL2)的野生型(Wild-type,WT)及相应点突变的cRNA后，于含有IBMX抑制剂的M2培养基抑制20小时后，洗净IBMX，随后再置于对照M16培养基及添加复方制剂(Curcumin：Dihydrocoumarin：Nicotinamide：Zebularine：Forskolin：Tubacin：ATP：Metformin＝5nmol：10nmol：2nmol：10μmol：10μmol：20μmol：5mmol：2mmol)后的M16培养基中进行减数分裂恢复培养，于培养后15h观察统计PBE率。结果显示，当向培养体系补充上述复方制剂后能有效提高点突变后的卵母细胞成熟率(图2，以PATL2及TUBB8的点突变为例)。
(二)复方制剂培养后突变卵母细胞有效抑制活性氧ROS水平
使用5周的ICR雌性小鼠，断颈处死后取出卵巢，解剖镜下用注射器针头戳破大卵泡，口吸管拾取COCs后机械性去除其周围的颗粒细胞，将洗净后的较大的、圆形饱满、有明显GV核的GV卵母细胞置于预热的加入IBMX(浓度为200μM)的M2培养基，37℃放置准备用于显微注射。小鼠GV期卵母细胞注射含有致病基因(TUBB8、TRIP13、TACC3、PATL2)的野生型及相应点突变的cRNA后，于含有IBMX抑制剂的M2培养基抑制20小时后，洗净IBMX，随后再置于对照M16培养基及添加复方制剂后的M16培养基中进行减数分裂恢复培养，于培养后15h收集卵母细胞，使用ROS检测试剂盒(碧云天，S0033S)根据其说明书进行操作，随后利用共聚焦显微镜检测活性氧ROS水平。结果表明，当向培养体系补充上述复方制剂后能有效抑制点突变后的卵母细胞ROS水平(图3A-B，以PATL2及TUBB8的点突变为例)。
(三)复方制剂培养后突变卵母细胞异常蛋白修饰水平恢复正常
使用5周的ICR雌性小鼠，断颈处死后取出卵巢，解剖镜下用注射器针头戳破大卵泡，口吸管拾取COCs后机械性去除其周围的颗粒细胞，将洗净后的较大的、圆形饱满、有明显GV核的GV卵母细胞置于预热的加入IBMX(浓度为200μM)的M2培养基，37℃放置准备用于显微注射。小鼠GV期卵母细胞注射含有致病基因(TUBB8、TRIP13、TACC3、PATL2)的野生型及相应点突变的cRNA后，于含有IBMX抑制剂的M2培养基抑制20小时后，洗净IBMX，随后再置于对照M16培养基及添加复方制剂后的M16培养基中进行减数分裂恢复培养，于培养后15h收集卵母细胞，使用免疫荧光技术检测磷酸化及乙酰化修饰水平，并利用共聚焦显微镜检测卵母细胞磷酸化及乙酰化修饰水平。结果表明，当向培养体系补充上述复方制剂后能抑制异常高磷酸化(图4A)并提高乙酰化水平(图4B，均以PATL2及TUBB8的点突变为例)。
(四)复方制剂培养后突变卵母细胞显著提高其受精率及囊胚发育率
使用5周的ICR雌性小鼠，断颈处死后取出卵巢，解剖镜下用注射器针头戳破大卵泡，口吸管拾取COCs后机械性去除其周围的颗粒细胞，将洗净后的较大的、圆形饱满、有明显GV核的GV卵母细胞置于预热的加入IBMX(浓度为200μM)的M2培养基，37℃放置准备用于显微注射。小鼠GV期卵母细胞注射含有致病基因(TUBB8、TRIP13、TACC3、PATL2)的野生型及相应点突变的cRNA后，于含有IBMX抑制剂的M2培养基抑制20小时后，洗净IBMX，随后再置于对照M16培养基及添加复方制剂后的M16培养基中进行减数分裂恢复培养，体外培养15小时后，收集卵母细胞进行体外受精及胚胎培养，体外受精6小时后，在KSOM培养基中清洗受精卵，并将受精卵置入预平衡的KSOM培养液中，统计观察受精率及囊胚发育率：发育至二细胞的卵母细胞数/形态完好的细胞总数即为受精率；明显形成囊胚腔/总胚胎数即为囊胚发育率。结果表明，复方制剂提高了携带突变位点卵母细胞的受精能力及早期胚胎发育能力(图5A-C，以PATL2及TUBB8的点突变为例)。
实施例3
一种治疗人卵母细胞成熟停滞的复方制剂，各组分摩尔比为Curcumin：Dihydrocoumarin：Nicotinamide：Zebularine：Forskolin：Tubacin：ATP：Metformin＝0.5nmol：0.1nmol：0.1nmol：0.5μmol：0.5μmol：0.5μmol：1mmol：0.5mmol，制备方法如下：将配料表所述各种成分以浓储(1000x或更高)形式溶解于DMSO备用，另取1mL M2培养基，随后将组合物中各成分以所述浓度加入到M2培养基中，混匀后即得复方制剂。
选择NCBI中ClinVar数据库上已公布的PATL2,TUBB8的致病突变位点，通过扩增相应基因cDNA合成及将这些片段构建至pCMV6-FLAG载体，使用点突变试剂盒(Vazyme，C214)构建相应的点突变质粒，并利用体外转录试剂盒(NEB，E2060S)及RNA纯化试剂盒(NEB,T2040S)合成相应cRNA。
使用5周的ICR雌性小鼠，断颈处死后取出卵巢，解剖镜下用注射器针头戳破大卵泡，口吸管拾取COCs后机械性去除其周围的颗粒细胞，将洗净后的较大的、圆形饱满、有明显GV核的GV卵母细胞置于预热的加入IBMX(浓度为200μM)的M2培养基，37℃放置准备用于显微注射。小鼠GV期卵母细胞注射含有致病基因(PATL2及TUBB8)的野生型(Wild-type,WT)及相应点突变的cRNA后，于含有IBMX抑制剂的M2培养基抑制20小时后，洗净IBMX，随后再置于对照M16培养基及添加实施例3的复方制剂(Curcumin：Dihydrocoumarin：Nicotinamide：Zebularine：Forskolin：Tubacin：ATP：Metformin＝0.5nmol：0.1nmol：0.1nmol：0.5μmol：0.5μmol：0.5μmol：1mmol：0.5mmol)后的M16培养基中进行减数分裂恢复培养，在培养15h后统计分析卵母细胞成熟率。结果显示，当向培养体系补充上述复方制剂后可提高点突变后的卵母细胞成熟率(图6，以PATL2及TUBB8的点突变为例)。
实施例4
一种治疗人卵母细胞成熟停滞的复方制剂，各组分摩尔比为Curcumin：Dihydrocoumarin：Nicotinamide：Zebularine：Forskolin：Tubacin：ATP：Metformin＝200nmol：100nmol：100nmol：200μmol：100μmol：50μmol：20mmol：20mmol，制备方法如下：将配料表所述各种成分以浓储(1000x或更高)形式溶解于DMSO备用，另取1mL M2培养基，随后将组合物中各成分以所述浓度加入到M2培养基中，混匀后即得复方制剂。
选择NCBI中ClinVar数据库上已公布的PATL2,TUBB8的致病突变位点，通过扩增相应基因cDNA合成及将这些片段构建至pCMV6-FLAG载体，使用点突变试剂盒(Vazyme，C214)构建相应的点突变质粒，并利用体外转录试剂盒(NEB，E2060S)及RNA纯化试剂盒(NEB,T2040S)合成相应cRNA。
使用5周的ICR雌性小鼠，断颈处死后取出卵巢，解剖镜下用注射器针头戳破大卵泡，口吸管拾取COCs后机械性去除其周围的颗粒细胞，将洗净后的较大的、圆形饱满、有明显GV核的GV卵母细胞置于预热的加入IBMX(浓度为200μM)的M2培养基，37℃放置准备用于显微注射。小鼠GV期卵母细胞注射含有致病基因(PATL2及TUBB8)的野生型(Wild-type,WT)及相应点突变的cRNA后，于含有IBMX抑制剂的M2培养基抑制20小时后，洗净IBMX，随后再置于对照M16培养基及添加实施例4的复方制剂(Curcumin：Dihydrocoumarin：Nicotinamide：Zebularine：Forskolin：Tubacin：ATP：Metformin＝200nmol：100nmol：100nmol：200μmol：100μmol：50μmol：20mmol：20mmol)后的M16培养基中进行减数分裂恢复培养，在培养15h后统计分析卵母细胞成熟率。结果显示，当向培养体系补充上述复方制剂后可有效提高点突变后的卵母细胞成熟率(图7，以PATL2及TUBB8的点突变为例)。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。
Claims (9)
1.一种治疗人卵母细胞成熟停滞的组合物，其特征在于，所述组合物包括如下组分：
二氢香豆素，泽布拉林，图巴辛以及腺苷三磷酸；
所述组合物摩尔比为二氢香豆素：泽布拉林：图巴辛：腺苷三磷酸 =0.1~100nmol：0.5~200μmol：0.5~50 μmol：1~20mmol。
2. 根据权利要求1所述的治疗人卵母细胞成熟停滞的组合物，其特征在于，所述组合物摩尔比为二氢香豆素：泽布拉林：图巴辛：腺苷三磷酸 =10nmol：10μmol：20μmol：5mmol。
3.根据权利要求1所述的治疗人卵母细胞成熟停滞的组合物，其特征在于，所述组合物还包括以下组分：姜黄素，烟酰胺，佛司可林，二甲双胍。
4. 根据权利要求3所述治疗人卵母细胞成熟停滞的组合物，其特征在于，所述组合物摩尔比为姜黄素：二氢香豆素：烟酰胺：泽布拉林：佛司可林：图巴辛：腺苷三磷酸：二甲双胍=0.5~200nmol：0.1~100nmol：0.1~100nmol：0.5~200 μmol：0.5~100μmol：0.5~50μmol：1~20mmol：0.5~20mmol。
5.根据权利要求4所述的治疗人卵母细胞成熟停滞的组合物，其特征在于，所述组合物摩尔比为姜黄素：二氢香豆素：烟酰胺：泽布拉林：佛司可林：图巴辛：腺苷三磷酸：二甲双胍=5nmol：10nmol：2nmol：10μmol：10μmol：20μmol：5mmol：2mmol。
6.一种治疗人卵母细胞成熟停滞的复方制剂，其特征在于，包括权利要求1-5任一所述的组合物及药学上可接受的辅料。
7.根据权利要求6所述的复方制剂，其特征在于，所述药学上可接受的辅料选自填充剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的复方制剂，其特征在于，所述制剂为口服制剂、注射制剂、经皮给药制剂或黏膜给药制剂。
9.权利要求1-5任一所述的组合物、权利要求7-8任一所述的复方制剂在制备治疗人卵母细胞成熟停滞的药物中的应用。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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