CN117327708A - Ppfia1在肝细胞癌治疗、诊断以及预后评估中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了PPFIA1在肝细胞癌治疗、诊断以及预后评估中的应用，PPFIA1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明研究结果表明：与正常对照组织相比，肝细胞癌患者组织中PPFIA1的表达水平存在上调，且与患者的不良预后显著相关；进一步实验结果表明：抑制PPFIA1的表达可以抑制肝细胞癌细胞增殖及转移，故抑制PPFIA1的表达可作为治疗肝细胞癌的一种新的治疗靶点，且具有良好的临床应用价值。

Description

PPFIA1在肝细胞癌治疗、诊断以及预后评估中的应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，特别涉及PPFIA1在肝细胞癌治疗、诊断以及预后评估中的应用。
背景技术
肝细胞癌(hepatellular carcinoma，HCC)是一种常见的消化系统恶性肿瘤，全球范围内其发病率和死亡率分别居第六位和第四位。虽然在临床和实验癌症治疗方面取得了很大的进展，但由于术后肿瘤复发转移率高，HCC患者的整体预后较差。既往研究表明，HCC的发展可能是一个多因素病因和多基因交替的多步骤过程，但HCC转移的具体分子机制尚不清楚。因此，更好地了解HCC转移的潜在分子机制对肝癌的预后和靶向治疗具有重要意义。而肝癌则又被认为是异质性最高的肿瘤，深入了解其异质性的分子机制是发现潜在临床治疗策略的必要条件，且考虑到不同个体的差异影响，患者之间的预后存在很大差异。为了能够及时且准确的依据不同患者情况做出诊断并制定个体化治疗方案，寻找简单有效且精准的生物标志物用于肝细胞癌患者的预后诊断对于临床治疗有着十分重要的临床意义。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中所存在的肝细胞癌术后肿瘤复发转移率高，整体预后较差的技术问题，提供一种与肝细胞癌发生、发展高度相关的基因，即PPFIA1基因。通过以PPFIA1作为标记物，用于肝细胞癌治疗、诊断以及预后评估，能够及时且准确的依据不同患者情况做出诊断，并制定个体化的治疗方案，对肝细胞癌的临床治疗具有十分重要的临床意义。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
本发明的第一方面提供了一种与肝细胞癌相关的分子标记物PPFIA1，PPFIA1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1：
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本发明的第二方面提供了所述分子标记物PPFIA1作为检测靶标，在制备肝细胞癌辅助诊断产品、肝细胞癌预后评估产品以及靶向治疗产品中的应用；与癌旁非肿瘤组织相比，PPFIA1基因在肝细胞癌细胞或组织中高表达。
进一步的，所述肝细胞癌的靶向治疗产品包括特异性敲低PPFIA1表达的物质。
进一步的，所述特异性敲低PPFIA1表达的物质为干扰PPFIA1表达的shRNA，所述干扰PPFIA1表达的shRNA的序列如SEQ ID NO.2～3所示。
SEQ ID NO.2：
5’-GAGGAGATTGAAAGTCGAGTT-3’；
SEQ ID NO.3：
5’-GATGACAAGACAACCATAAAG-3’。
本发明的第三方面提供了检测所述分子标记物PPFIA1表达水平的试剂在制备肝细胞癌辅助诊断产品、肝细胞癌预后评估产品中的应用。
进一步的，所述检测PPFIA1表达水平的试剂包括检测PPFIA1基因表达水平的特异性引物或PPFIA1蛋白的抗体。
进一步的，所述特异性引物：上游序列如SEQ ID NO.4所示，下游序列如SEQ IDNO.5所示。具体的：
SEQ ID NO.4：
5’-GCCCTGGCCCGAGCGGGCTC-3’；
SEQ ID NO.5：
5’-GTATCAGGTGCGGCGGAAGC-3’。
进一步的，所述PPFIA1的表达水平与肝细胞癌患者的预后良好呈负相关。
本发明的第四方面提供了一种用于肝细胞癌辅助诊断和/或预后评估的试剂盒，所述试剂盒中包含检测PPFIA1表达水平的试剂。
本发明相比现有技术的有益效果为：
1、本发明研究发现PPFIA1在肝细胞癌细胞和组织中表达量明显升高，因此以PPFIA1作为肝细胞癌的分子标记物，提出PPFIA1在制备肝细胞癌辅助诊断产品、肝细胞癌预后评估产品以及靶向治疗产品中的用途；相比现有肝细胞癌诊断方法，具有方便、快速、成本低、可重复、特异性高等优点，更有助于患者的诊断、治疗预后进行精细判断，为肝细胞癌患者的精准治疗提供了重要依据，具有广泛的临床应用价值。
2、本发明设计了特异性扩增PPFIA1的引物对，可特异性有效检测PPFIA1。
3、本发明设计了体外干扰PPFIA1的shRNA序列。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明：
图1为TCGA数据库中PPFIA1在肝细胞癌(n＝336)和癌旁非肿瘤组织(n＝50)中的配对(左)和非配对(右)mRNA表达差异示意图；
图2为采用Kaplan-Meier分析计算TCGA数据库中肝细胞癌患者(n＝365)的PPFIA1生存曲线示意图；
图3为CCK-8法检测过表达PPFIA1基因的HepG2细胞增殖情况示意图及统计图；
图4为平板克隆法检测过表达PPFIA1基因的HepG2细胞集落形成情况示意图及统计图；
图5为转染短发卡RNA(shRNA)下调HepG2细胞中PPFIA1基因后，Western blot检测HepG2细胞中PPFIA1的表达示意图；
图6为图5所述HepG2细胞集落形成情况示意图及统计图；
图7为CCK-8法检测图5所述HepG2细胞增殖情况示意图及统计图；
图8为Transwell法测定过表达PPFIA1基因的HepG2细胞的迁移和侵袭能力示意图和统计图；
图9为过表达PPFIA1基因的HepG2细胞的形态学分析示意图；
图10为Transwell法测定图5所述HepG2细胞的迁移和侵袭能力示意图和统计图
图11为从过表达PPFIA1基因的HepG2细胞中提取总蛋白，并通过Western blot法检测EMT相关蛋白质生物标志物结果示意图；
图12为从图5所述HepG2细胞中提取总蛋白，并通过Western blot法检测EMT相关蛋白质生物标志物结果示意图。
图13为对照和过表达PPFIA1基因的HepG2细胞接种的裸鼠代表性生物发光图片和定量小鼠肝脏生物发光总通量统计示意图；
图14为图13所述的裸鼠肝脏的代表性图片(左)及肺转移结节数量统计示意图(右)；
图15为苏木精和伊红(H&E)染色法对图13所述的裸鼠的肝脏和肺部染色的代表性图片；
图16为免疫组化染色法检测Ki-67和E-cadherin在图13所述的裸鼠的肝脏和肺组织中的表达示意图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面将结合附图对本发明做进一步地详细说明，以令本领域技术人员参照说明文字能够据以实施。
需要说明的是，下述具体实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述具体实施例中主要试剂和材料包括：
浓盐酸、浓硫酸、氢氧化钠、二甲苯、碳酸氢钠、异丙醇、三氯甲烷、丙三醇、无水乙醇、甲醇、冰醋酸、葡萄糖、无水乙酸钠、氯化钙等购自北京化工厂；对苯二酚、2-巯乙基磺酸钠、多聚甲醛、二磷酸氯喹盐、过硫酸铵、焦碳酸二乙酯(DEPC)、结晶紫、考马斯亮蓝R250、氯化镁六水合物、氯化锰、氯化钠、硼酸、氢氧化钠、十二烷基硫酸钠(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、脱氧胆酸钠、硝普钠、乙二胺四乙酸(EDTA)、原钒酸钠盐、HEPES、二甲基亚砜(DMSO)、戊巴比妥钠、二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇、溴酚蓝、CHAPS、Tris、Tween-20、NP-40、Triton X-100、dNTP、氯霉素(Cam)等购自Sigma公司；氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kana)等购自北京鼎国昌盛生物技术公司，CCK-8试剂盒购自汉恒生物公司，Matrigel(基底胶)购自北京索莱宝生物公司，SPF级NU/NU裸鼠购自北京维通利华公司。
实施例1
选取TCGA(The Cancer GenomeAtlas)数据库336例肝细胞癌患者组织及50例癌旁非肿瘤组织数据，采用秩和检验分析PPFIA1基因的mRNA表达情况，得到如图1所示结果，说明PPFIA1在肝细胞癌患者组织中高表达。
使用Kaplan-Meier生存分析曲线分析计算TCGA数据库中365例肝细胞癌患者的PPFIA1基因表达量高低的生存曲线。如图2所示，结果显示PPFIA1基因表达量高可能提示肝癌患者的不良预后。
实施例2
本实施例首先构建获得敲低PPFIA1基因的HepG2细胞。
为了得到稳定敲低PPFIA1基因的HepG2细胞，具体步骤为：首先将干扰PPFIA1表达的shRNA进行慢病毒包被，收集病毒上清并进行过滤，对生长至对数生长期的HepG2细胞按照完全培养基：病毒上清体积为1：1的比例进行病毒感染，同时设置未感染的空白对照组，在37℃，5％CO2细胞培养箱中培养24小时后，加入嘌呤霉素抗生素进行筛选，待空白对照组细胞被抗生素全部杀死后，感染病毒组剩余的细胞即为稳定敲低PPFIA1基因的HepG2细胞，对该细胞进行扩增培养。
所述干扰PPFIA1表达的shRNA的序列如SEQ ID NO.2～3所示。
SEQ ID NO.2：
5’-GAGGAGATTGAAAGTCGAGTT-3’；
SEQ ID NO.3：
5’-GATGACAAGACAACCATAAAG-3’。
为探究PPFIA1基因在肝癌细胞增殖中的作用，通过细胞增殖CCK-8实验检测稳定高表达Flag-PPFIA1基因的HepG2细胞和稳定敲低PPFIA1基因的HepG2细胞的增殖能力，具体步骤为：将细胞消化和计数后，向96孔培养板中加入细胞，按照检测天数进行接种，并设置3个复孔。按照1:10的比例配制CCK-8工作液后将CCK-8工作液加至目的孔中，注意设置空白对照孔。在37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育0.5-4h，吸出培养基上清，用酶标仪测定波长在420-480nm的吸光度，统计实验期间每天每组细胞的吸光度变化，进行统计分析。
通过CCK-8实验对稳定高表达Flag-PPFIA1基因或敲低的PPFIA1基因HepG2细胞的增殖情况进行观察，得到如图3及图7所示结果，说明高表达PPFIA1蛋白促进肝细胞癌细胞的增殖，而敲低PPFIA1蛋白表达则抑制肝细胞癌细胞的增殖。
进一步，为探究PPFIA1的表达量对于肝癌细胞克隆形成能力的影响，进行平板克隆实验。具体步骤为：将稳定高表达Flag-PPFIA1基因的HepG2细胞或敲低PPFIA1基因的HepG2细胞进行消化和计数后，将含10％FBS的细胞培养液加入至6孔培养板中，而后向每个孔加入800-1000个细胞，每组设置3个复孔，轻轻摇匀，培养5-10天。PBS清洗后加入4％多聚甲醛组织固定液，清洗再加入结晶紫染料染色，清水洗去浮色。待培养板彻底干燥后拍照，计数，并进行统计，分别得到如图4和图6所示结果，结果显示高表达PPFIA1促进肝细胞癌细胞克隆形成能力，而敲低PPFIA1蛋白表达则抑制肝细胞癌细胞克隆形成能力。
实施例3
分别从实施例2所述稳定高表达Flag-PPFIA1基因的HepG2细胞，和敲低的PPFIA1基因的HepG2细胞中提取总蛋白，进行蛋白质免疫印迹实验(Western Blot)，具体步骤为：配制SDS-PAGE凝胶，在电泳槽中架好SDS-PAGE胶板后进行蛋白上样，电泳后将蛋白转移至PVDF膜，5％牛奶封闭，分别进行一抗(过夜)，二抗(室温1h)孵育并用TBST缓冲液多次清洗后，置于曝光机进行化学发光。得到如图5所示结果，证明本申请实施例2提供的干扰PPFIA1表达的shRNA序列能够成功敲低该蛋白。
如图11和图12所示，通过一系列相关标记蛋白的结果显示高表达PPFIA1蛋白促进肝细胞癌细胞的上皮间质转化(EMT)和细胞增殖，而敲低PPFIA1蛋白表达则抑制肝细胞癌细胞的EMT和细胞增殖。
实施例4
对实施例2所述稳定高表达Flag-PPFIA1基因的HepG2细胞，和敲低PPFIA1基因的HepG2细胞，分别进行Transwell细胞迁移实验，具体步骤为：细胞消化和计数后，在小室配套的24孔培养板中加入20-25％FBS的细胞培养液，小室内加入带有0.5％FBS的细胞悬液，放置于细胞培养箱中进行培养，6-10h后收取Transwell小室，4％多聚甲醛固定，清洗后加入结晶紫染料，清水漂洗小室，观察、拍照与计数。
Transwell细胞侵袭实验，具体步骤为：提前用Matrigel处理小室，后续实验与Transwell细胞迁移实验相同，可适当延长小室收取时间。
得到如图8及图10所示结果，说明高表达PPFIA1蛋白促进肝细胞癌细胞的迁移和侵袭，而敲低PPFIA1蛋白表达则抑制肝细胞癌细胞的迁移和侵袭。
用显微镜明场观察上述细胞形态，并拍照记录。如图9所示，高表达PPFIA1的肝细胞癌细胞呈现更高程度梭形形态。
实施例5
为进一步探究高表达PPFIA1蛋白对肝脏肿瘤形成和发展的作用，本实施例进行裸鼠异种移植瘤实验，具体步骤为：将Firefly luciferase荧光素酶基因整合到预期观察的细胞染色体DNA上以表达荧光素酶，培养出能稳定表达荧光素酶的Flag-Vector或Flag-PPFIA1的HepG2细胞株。对裸鼠肝脏表面进行细胞接种。继续饲养小鼠，每隔7天对裸鼠进行活体生物发光成像及记录。接种后42天左右，脱颈处死裸鼠，解剖取肝脏和肺组织，拍照。根据肿瘤细胞的荧光强度进行统计分析并作图，比较不同处理组裸鼠成瘤能力大小。
如图13和图14所示，结果显示高表达PPFIA1蛋白促进裸鼠肝脏肿瘤形成及发展。
进一步对上述实验裸鼠的肝脏和肺组织进行HE染色实验和免疫组化染色。
HE染色实验具体步骤为：石蜡切片脱蜡水化，Harry’s苏木精染色后水洗。在酒精酸中漂洗2遍，随后用自来水后在伊红染料中染色。石蜡切片脱水(上行)后用中性树脂进行封片，然后在显微镜下观察并拍照。
如图15结果显示，高表达Flag-PPFIA1蛋白的裸鼠肝脏和肺组织中形成的肿瘤数目更多。
免疫组化染色具体步骤为：石蜡切片脱蜡水化(下行)后用3％的过氧化氢对内源过氧化物酶进行封闭，随后进行抗原修复及一抗和二抗的孵育。用DAB在镜下边观察边显色至合适程度，置于自来水中，再置于蒸馏水中。随后用Mayer’s苏木精对细胞核进行染色，再将切片放在水龙头下缓慢冲洗进行返蓝，直到细胞核呈现明显的蓝色。石蜡切片脱水(上行)后，用中性树胶进行封片，然后在显微镜下观察并拍照。
如图16结果显示，高表达PPFIA1蛋白促进肝细胞癌细胞的上皮间质转化(EMT)和细胞增殖。
实施例6
本实施例提供了一种用于肝细胞癌辅助诊断和/或预后评估的试剂盒，所述试剂盒中包含检测PPFIA1表达水平的特异性引物，PPFIA1是与肝细胞癌相关的分子标记物，PPFIA1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述特异性引物：上游序列如SEQ ID NO.4所示，下游序列如SEQ ID NO.5所示。
SEQ ID NO.4：5’-GCCCTGGCCCGAGCGGGCTC-3’；
SEQ ID NO.5：5’-GTATCAGGTGCGGCGGAAGC-3’。
最后应说明的是，以上仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳布置方案对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (9)

1.一种与肝细胞癌相关的分子标记物PPFIA1，其特征在于，PPFIA1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的分子标记物PPFIA1作为检测靶标，在制备肝细胞癌辅助诊断产品、肝细胞癌预后评估产品以及靶向治疗产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肝细胞癌的靶向治疗产品包括特异性敲低PPFIA1表达的物质。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述特异性敲低PPFIA1表达的物质为干扰PPFIA1表达的shRNA，所述干扰PPFIA1表达的shRNA的序列如SEQ ID NO.2～3所示。
5.检测如权利要求1所述分子标记物PPFIA1表达水平的试剂在制备肝细胞癌辅助诊断产品、肝细胞癌预后评估产品中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述检测PPFIA1表达水平的试剂包括检测PPFIA1基因表达水平的特异性引物或PPFIA1蛋白的抗体。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述特异性引物为：上游序列如SEQ IDNO.4所示，下游序列如SEQ ID NO.5所示。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述PPFIA1的表达水平与肝细胞癌患者的预后良好呈负相关。
9.一种用于肝细胞癌辅助诊断和/或预后评估的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含检测PPFIA1表达水平的试剂。
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