CN117327145A - 肽、肽修饰的sis膜、其制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及一种肽、肽修饰的SIS膜、其制备方法及应用。具体来说，本公开涉及一种寡肽、含有前述寡肽的嵌合肽、前述嵌合肽修饰的SIS膜。本公开涉及的前述寡肽、含有前述寡肽的嵌合肽、前述嵌合肽修饰的SIS膜能够促进血管生成或加速伤口愈合。

Description

肽、肽修饰的SIS膜、其制备方法及应用
技术领域
本公开属于生物医用材料领域，具体涉及一种肽、肽修饰的SIS膜、其制备方法及应用。
背景技术
伤口愈合是人体重要而复杂的生物学过程，其中血管生成起着至关重要的作用。充足的血液供应不仅可以恢复受损组织的血液灌注(blood perfusion)，还可以为细胞增殖、迁移和代谢活动提供氧气和营养，从而加速受损组织的修复和愈合。不幸的是，由炎症、缺氧和其他病理状况引起的血管生成不足仍然是目前伤口愈合的无法克服的障碍。因此，迫切需要寻找一种促进血管生成和加速伤口愈合的方法。
肽/寡肽药物因其良好的药代动力学、低免疫原性和方便的合成而有助于这一过程。其中，寡肽是由2-20个氨基酸组成的小分子活性肽，比其他肽具有更好的生物相容性和生物降解性。此外，较短的氨基酸链使寡肽成本更低，功能更突出。因此，开发一种促进血管生成和加速伤口愈合的寡肽可能是一个很好的策略。历史上，功能性肽的发现主要依赖于现有的分子药理学知识，了解感兴趣的蛋白质的生物学功能和晶体结构信息。因此，迫切需要研究有效的方法来识别有希望的寡肽候选物，以促进血管生成和加速伤口愈合。
最近，蛋白质的内在无序区(intrinsic disorder region，IDR)因其在相分离中的作用而引起了极大的关注，而很少有研究关注它们在成药性中的潜在作用。
细胞外基质(ECM)材料是一种由蛋白质和多糖组成的无细胞三维大分子网络，可为细胞生长提供良好的微环境和多种生物活性因子，被认为是一种理想的组织工程材料。小肠黏膜下层(SIS)是一种广泛使用的天然ECM材料，因为它具有显著的生物活性、低免疫原性和良好的吸收性。此外，它在骨骼和心脏组织工程中取得了优异的效果。然而，由于存在寡肽浓度梯度，将寡肽直接附着于SIS膜会导致其从SIS膜快速释放到周围组织中。因此，有必要找到一种方法来实现SIS膜对寡肽的特异性负载和缓释。
之前的研究表明，通过将寡肽与胶原蛋白结合肽结合构建重组嵌合肽，可以获得特异性负载寡肽的SIS膜。然而，血管化速度慢被认为是用于加速伤口愈合的生物材料的主要缺点之一。已经进行了一些努力，包括细胞和非细胞技术，以促进生物材料诱导的血管生成。然而，尚未报道用于促进血管生成的成熟技术。
发明内容
发明要解决的问题
在这项研究中，小肠黏膜下层(SIS)膜被从MHCII类的内在无序区域(IDR)筛选的促血管生成寡肽(QSHGPS)修饰，用于促进血管生成和加速伤口愈合。基于SIS膜的主要成分是胶原蛋白，利用胶原蛋白结合肽TKKTLRT序列和促血管生成寡肽QSHGPS序列构建嵌合肽，获得特异性负载QSHGPS的SIS膜。嵌合肽修饰SIS膜(SIS-L-CP)可显着促进脐静脉内皮细胞血管生成相关因子的表达。此外，SIS-L-CP在小鼠后肢缺血模型和大鼠背侧皮肤缺损模型中表现出优异的血管生成和伤口愈合能力。SIS-L-CP膜突出的生物相容性和血管生成能力使其在血管生成和伤口愈合相关的再生医学中具有广阔的应用前景。
用于解决问题的方案
在本公开中，通过结合MHC II的IDR和螺旋结构，我们预测了12种可能促进血管生成的寡肽。然后我们合成并验证了每种寡肽促进血管生成的能力，以找到能够显著促进血管生成的寡肽。我们通过连接肽和胶原结合肽将寡肽靶向至SIS膜，以促进血管生成并加速伤口愈合。接下来，我们在体内和体外测试了胶原结合嵌合肽修饰的SIS膜促进血管生成和伤口愈合的能力，提供了为加速伤口愈合提供有效的临床解决方案。
本公开记载了如下技术方案。
(1)寡肽，其中，所述寡肽的序列包含由如下序列所示的序列组成的组中的至少一种或由如下序列所示的序列组成的组中的至少一种组成：
(i)如SEQIDNO：1-3任一项所示的序列；
(ii)和(i)所示的序列相比，存在保守置换的序列。
(2)嵌合肽，其中，所述嵌合肽含有如(1)所述的寡肽，并且所述嵌合肽的序列包含由如下序列所示的序列组成的组中的至少一种或由如下序列所示的序列组成的组中的至少一种组成：
(iii)如SEQIDNO：4-9任一项所示的序列；
(iv)和(iii)所示的序列相比，存在保守置换的序列。
(3)一种嵌合肽修饰的SIS膜，其中，所述嵌合肽的序列为如(2)所述的序列。
(4)根据(3)所述的嵌合肽修饰的SIS膜，其中，所述修饰的方法包括以下步骤：
(a)将所述嵌合肽溶解至溶剂中，得到含有嵌合肽的溶解液；
(b)将步骤(a)得到的溶解液施加至所述SIS膜的表面；优选的，将所述SIS膜浸入步骤(a)得到的溶解液中；
(c)干燥表面带有所述溶解液的所述SIS膜。
(5)一种嵌合肽修饰的SIS膜的制备方法，其中，所述方法包括以下步骤：
(a)将所述嵌合肽溶解至溶剂中，得到含有嵌合肽的溶解液；
(b)将步骤(a)得到的溶解液施加至所述SIS膜表面；优选的，将所述SIS膜浸入步骤(a)得到的溶解液中；
(c)干燥表面带有所述溶解液的所述SIS膜，得到所述嵌合肽修饰的SIS膜；
其中，所述嵌合肽的序列包含由如下序列所示的序列组成的组中的至少一种，或者所述嵌合肽的序列由如下序列组成的组中的至少一种组成：
(i)如SEQIDNO：1-9任一项所示的序列；
(ii)和(i)所示的序列相比，存在保守置换的序列。
(6)根据(1)所述的寡肽、(2)所述的嵌合肽、(3)-(4)任一项所述的嵌合肽修饰的SIS膜或根据(5)所述的嵌合肽修饰的SIS膜的制备方法得到的嵌合肽修饰的SIS膜在如下(a)-(b)至少一种中的用途：
(a)作为或制备促进血管生成的生物材料；
(b)作为或制备加速伤口愈合的生物材料。
(7)一种促进血管生成或加速伤口愈合的方法，其中，所述方法包括向受试者施用根据(1)所述的寡肽、(2)所述的嵌合肽、(3)-(4)任一项所述的嵌合肽修饰的SIS膜或根据(5)所述的嵌合肽修饰的SIS膜的制备方法得到的嵌合肽修饰的SIS膜的步骤。
发明的效果
在一个实施方式中，本公开提供了一种寡肽，前述寡肽能够促进血管生成或加速伤口愈合。
在一个实施方式中，本公开提供了含有上述寡肽的嵌合肽，前述嵌合肽能够促进血管生成或加速伤口愈合。
在一个实施方式中，本公开提供了含有上述嵌合肽修饰的SIS膜，前述SIS膜能够促进血管生成或加速伤口愈合。
在一个实施方式中，本公开提供了一种制备SIS膜的方法，以及通过前述方法制备得到的SIS膜的用途。
附图说明
图1示出了SIS-L-CP膜促进血管生成和加速伤口愈合的制备示意图。
图2示出了选自MHCII类IDR的寡肽。其中，图2A示出了MHC II类在伤口愈合过程中的表达。图2B示出了MHC II类保守结构域中的IDR区域。图2C示出了MHC II类保守结构域中的IDR序列，其中，深色氨基酸的含义为IDR置信度＞80。图2D示出了所选寡肽的序列。
图3示出了所选寡肽对EAhy926细胞血管生成能力的影响。(A)EAhy926细胞在1、3、5和7天与每个样品共培养的CCK-8生长曲线。(B)迁移实验图像以评估四组培养的EAhy926细胞的迁移。(C)在显微镜下用选定的寡肽处理后EAhy926细胞的微管形成。(D)血管生成相关蛋白(TGF-β和VEGF)的蛋白质印迹分析。(E)蛋白质印迹分析的定量分析。单因素方差分析用于统计分析。数据表示为平均值±SD，n＝3，*表示P<0.05。(F)血管生成相关基因(TGF-β和VEGF)的RNA表达。单因素方差分析用于统计分析。数据表示为平均值±SD，n＝3，*表示P<0.05。(G)血管生成蛋白的代表性免疫荧光染色(VEGF:红色，细胞核:蓝色)。
图4A-图4B示出了寡肽P2(QSHGPS)促进血管生成和伤口愈合的机制研究。其中，图4A示出了不同基因的维恩图。图4B示出了通过RNAseq分析筛选P2和空白之间的差异表达基因。
图5示出了嵌合肽的结构预测和SIS、SIS-P、SIS-CP和SIS-L-CP膜的表征。(A)CP和L-CP的二级结构和3D视图。(B)用SEM观察SIS、SIS-P、SIS-CP和SIS-L-CP膜的表面形貌。(C)CLSM结果图像。(D)SIS、SIS-P、SIS-CP和SIS-L-CP膜的接触角观察到SIS膜上1、3和7天的嵌合肽释放。(E)SIS、SIS-P、SIS-CP和SIS-L-CP膜在干湿状态下的力学性能评价。单因素方差分析用于统计分析。数据表示为平均值±SD，n＝3，*表示P<0.05。
图6示出了具有不同寡肽/嵌合肽浓度的SIS-P、SIS-CP和SIS-L-CP膜的CLSM图像。
图7示出了SIS、SIS-P、SIS-CP和SIS-L-CP膜的体外生物相容性。(A)EAhy926细胞在1、3、5和7天后与每个样品共培养的CCK-8生长曲线。(B)迁移细胞的定量分析。单因素方差分析用于统计分析。数据表示为平均值±SD，n＝3，*表示P<0.05。(C)Transwell图像评估五组培养的EAhy926细胞的迁移。(D)在显微镜下用SIS、SIS-P、SIS-CP和SIS-L-CP膜处理后EAhy926细胞的微管形成。(E)EAhy926细胞在CLSM下与每个样品共培养的细胞骨架图像。
图8示出了SIS-L-CP对体外EAhy926细胞血管生成相关因子表达的影响。(A)与血管生成和伤口愈合相关的RNA表达基因(VEGF、TGF-β和HIF-1α)。单因素方差分析用于统计分析。数据表示为平均值±SD，n＝3，*表示P<0.05。(B)与血管生成和伤口愈合相关的蛋白质(VEGF、TGF-β和HIF-1α)的蛋白质印迹分析。单因素方差分析用于统计分析。数据表示为平均值±SD，n＝3，*代表P<0.05。(C)与血管生成和伤口愈合相关的蛋白质的代表性免疫荧光染色。
图9A-图9B示出了SIS-L-CP体外促进血管生成和伤口愈合的机制研究。其中，图9A示出了与血管生成和伤口愈合相关的蛋白质(KDR、TGF-β和HIF-1α)的蛋白质印迹分析。单因素方差分析用于统计分析。数据表示为平均值±SD，n＝3，*表示P<0.05。图9B示出了与血管生成和伤口愈合相关的蛋白质的代表性免疫荧光染色。
图10A-图10B示出了SIS-L-CP改善缺血性组织损伤后的血管生成和血液灌注。其中，图10A示出了C57BL6/J小鼠术后7天和14天后肢的LDPI图像。彩色比例尺代表LDPI比率指数中的血流速度。图10B示出了在样本处理动物的指定时间点对缺血性后肢的LDPI比率进行定量分析。单因素方差分析用于统计分析。数据表示为平均值±SD，n＝3，*代表P<0.05。
图11A-图11E示出了SIS-L-CP在体内促进血管生成并加速伤口愈合。其中，图11A示出了大鼠背侧皮肤伤口的H&E染色一周和两周(片段：未上皮伤口的长度)。图11B示出了新上皮化长度的定量分析。单因素方差分析用于统计分析。数据表示为平均值±SD，n＝3，*表示P<0.05。图11C示出了对大鼠背部皮肤伤口的Masson三色染色一周和两周(片段：伤口非胶原纤维的长度)。图11D示出了胶原纤维长度的定量分析。单因素方差分析用于统计分析。数据表示为平均值±SD，n＝3，*表示P<0.05。图11E示出了VEGF和TGF-β表达的免疫组织化学分析。
图12示出了SIS-L-CP治疗2周后雄性SD大鼠主要器官的H&E染色结果。
具体实施方式
定义
当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”联用时，词语“一(a)”或“一(an)”可以指“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
在整个申请文件中，术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。
虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。
如本公开所使用的，术语“氨基酸突变”或“核苷酸突变”，包括“取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸或核苷酸”。在本公开中，术语“突变”是指核苷酸序列或者氨基酸序列的改变。在一些实施方案中，本公开的“突变”可以选自“保守突变”、“半保守突变”、“非保守突变”。在本公开中，术语“非保守突变”或“半保守突变”可以是引起蛋白功能丧失或部分丧失的突变。术语“保守突变”是指可正常维持蛋白质的功能的突变。保守突变的代表性例子为保守置换。
如本公开所使用的，“保守置换”通常在蛋白质的一个或多个位点上交换一种氨基酸。这种取代可以是保守的。作为被视作保守置换的置换，具体而言，可以举出Ala向Ser或Thr的置换、Arg向Gln、His或Lys的置换、Asn向Glu、Gln、Lys、His或Asp的置换、Asp向Asn、Glu或Gln的置换、Cys向Ser或Ala的置换、Gln向Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg的置换、Glu向Gly、Asn、Gln、Lys或Asp的置换、Gly向Pro的置换、His向Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr的置换、Ile向Leu、Met、Val或Phe的置换、Leu向Ile、Met、Val或Phe的置换、Lys向Asn、Glu、Gln、His或Arg的置换、Met向Ile、Leu、Val或Phe的置换、Phe向Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的置换、Ser向Thr或Ala的置换、Thr向Ser或Ala的置换、Trp向Phe或Tyr的置换、Tyr向His、Phe或Trp的置换、及Val向Met、Ile或Leu的置换。此外，保守突变还包括起因于基因所来源的个体差异、株、种的差异等天然产生的突变。
本公开中的“序列同一性”和“同一性百分比”指两个或更多个多核苷酸或多肽之间相同(即同一)的核苷酸或氨基酸的百分比。两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列同一性可通过以下方法测定：将多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列对准且对经对准的多核苷酸或多肽中含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行评分，且将其与经对准的多核苷酸或多肽中含有不同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行比较。多核苷酸可例如通过含有不同核苷酸(即取代或突变)或缺失核苷酸(即一个或两个多核苷酸中的核苷酸插入或核苷酸缺失)而在一个位置处不同。多肽可例如通过含有不同氨基酸(即取代或突变)或缺失氨基酸(即一个或两个多肽中的氨基酸插入或氨基酸缺失)而在一个位置处不同。序列同一性可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中氨基酸残基的总数来计算。举例而言，可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中核苷酸或氨基酸残基的总数且乘以100来计算同一性百分比。
示例性的，在本公开中，当使用序列比较算法或通过目视检查测量以最大的对应性进行比较和比对时，两个或多个序列或子序列具有至少40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％核苷酸或氨基酸残基的“序列同一性”或“同一性百分比”。“序列同一性”或“同一性百分比”的判断/计算可以基于序列任何合适的区域上。例如，长度至少约50个残基的区域、至少约100个残基的区域，至少约200个残基的区域，至少约400个残基的区域，或至少约500个残基的区域。在某些实施方案中，所述序列在任一或两个相比较的生物聚合物(就是核酸或多肽)的整个长度上基本相同。
如本公开所使用的，术语“反向互补序列”(Reverse Complementary Sequence)的含义为：和原始多核苷酸的序列的方向相反，并且与原始多核苷酸的序列也互补的序列。示例性的，如果原始多核苷酸序列为ACTGAAC，则其反向互补序列为GTTCAGT。
如本公开所使用的，术语“多核苷酸”指由核苷酸组成的聚合物。多核苷酸可以是单独片段的形式，也可以是更大的核苷酸序列结构的一个组成部分，其是从至少在数量或浓度上分离一次的核苷酸序列衍生而来的，能够通过标准分子生物学方法(例如，使用克隆载体)识别、操纵以及恢复序列及其组分核苷酸序列。当一个核苷酸序列通过一个DNA序列(即A、T、G、C)表示时，这也包括一个RNA序列(即A、U、G、C)，其中“U”取代“T”。换句话说，“多核苷酸”指从其他核苷酸(单独的片段或整个片段)中去除的核苷酸聚合物，或者可以是一个较大核苷酸结构的组成部分或成分，如表达载体或多顺反子序列。多核苷酸包括DNA、RNA和cDNA序列。“重组多核苷酸”、“重组核酸分子”属于“多核苷酸”中的一种。
如本公开所使用的，术语“重组核酸分子”指具有在自然界中不连接在一起的序列的多核苷酸。重组多核苷酸可包括在合适的载体中，且该载体可用于转化至合适的宿主细胞。然后多核苷酸在重组宿主细胞中表达以产生例如“重组多肽”“重组蛋白”“融合蛋白”等。
如本公开所使用的，术语“连接肽”和“linker”可以替换使用，其能够将相同或者不同的多肽或者氨基酸进行连接。
连接肽包括柔性连接肽和刚性连接肽。在本公开的实施例中，连接肽选用柔性连接肽。
在本公开中，除非特别强调，否则术语“嵌合肽修饰的SIS膜”和“嵌合肽修饰的GBR膜”的含义相同，可以替换使用。
除非另外定义或由背景清楚指示，否则在本公开中的全部技术与科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
技术方案
除非另有强调，否则本公开的实施例中采用的以下通用实验方法(1)-(18)的步骤如下：
1.血管生成肽的设计与合成
为了获得MHC II类的蛋白质结构，我们在UniProt(https://www.uniprot.org/downloads)中搜索了蛋白质。MHCII类的3D结构图是从结构部分获得的。在PubMed上检查了MHCII类的保守预测(conservative forecast)，结果表明AA27-207是一个保守区域(conserved region)。选择保守区域中的所有IDR序列进行合成。
纯度>99％的肽是商业合成的(Jill Biochemistry Co.，Ltd.，Shanghai，China)。肽的序列如图2中的D所示。通过将肽粉末溶解在无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中来制备肽溶液。选出的具有最强血管生成能力的肽记为P。有和没有连接肽(GGGGS)的嵌合肽分别标记为CP和L-CP。肽用异硫氰酸荧光素(FITC，绿色)标记，用于共聚焦激光扫描显微镜(CLSM900，Zeiss，Germany)。本研究中使用的嵌合肽的二级和三级结构由蛋白质分析网站PSIPRED预测。结果通过VMD软件显示。
2.嵌合肽修饰SIS膜的制备与表征
将SIS膜(北京博辉瑞进生物科技有限公司，中国)切割成不同尺寸供使用。将嵌合肽分别制备成50×10-6M、100×10-6M、150×10-6M、200×10-6M和250×10-6M的PBS溶液。SIS膜在不同浓度的嵌合肽溶液中浸泡10min，然后用PBS洗涤3次。然后，将这些膜冷冻干燥，得到SIS-P、SIS-CP或SIS-L-CP膜。
在溅射镀金后，通过SEM(Gemini300，Zeiss，Germany)观察SIS、SIS-P、SIS-CP和SIS-L-CP膜的表面形态。在光学平台型接触角测角仪(JGW-360A，中国)下，采用静滴法在37℃下测定了这些膜的水接触角。并通过极限拉伸试验机(3367，Instron，USA)以10mm/分钟的速度检测这些膜(宽15mm，长15mm)在干态和湿态(PBS中浸泡0.5h)状态下的力学性能。
3.与SIS膜结合的嵌合肽的评价
为了检测结合能力，通过CLSM观察SIS-P、SIS-CP和SIS-L-CP膜以获得图像。P、CP和L-CP用FITC(绿色)标记。将荧光标记的SIS-P、SIS-CP和SIS-L-CP膜浸泡在黑盒中的PBS溶液中，1d、3d、5d后取出膜。然后将这些膜冷冻干燥并通过CLSM观察以观察嵌合肽从SIS膜的释放。
4.细胞培养
将EAhy926细胞(Procell Life Science&Technology Co.，Ltd，武汉)接种到培养皿中，在含有10％(v/v)胎牛血清(FBS，Gibco，USA)和1％青霉素/链霉素的新鲜Dulbecco'sModified Eagle's培养基(DMEM，HyClone，USA)中培养，并在37℃下在5％CO2环境中孵育。每2天更换新鲜培养基。我们的研究中使用了第3-4代中的EAhy926细胞。
5.细胞增殖试验
根据制造商的说明，使用CCK-8试剂盒(Solarbio，中国)检测EAhy926细胞的增殖能力。将SIS、SIS-P、SIS-CP和SIS-L-CP膜预先切割并放入96孔板中。将EAhy926细胞接种在96孔板上(2000、100μL/孔)。1、3、5、7d后，每孔加入100μL新鲜DMEM和10μL CCK-8试剂。在37℃和5％CO2下孵育2小时后，通过测量450nm吸光度处的吸光度(OD)来确定相对细胞数。
6.细胞迁移能力
通过transwell测定评估EAhy926细胞的迁移。EAhy926细胞分别以1×104个细胞/孔接种到上层transwell室(孔径＝8μm，Thermo Fisher Scientific，USA)中。将选定的肽、SIS、SIS-P、SIS-CP或SIS-L-CP膜和500μL培养基(2％FBS)放入下transwell小室中，以刚加培养基的空白孔作为对照。24小时后，取出transwell小室并用PBS洗涤3次。然后，将细胞用4％多聚甲醛固定30分钟，并用0.1％结晶紫(Sigma-Aldrich，美国)染色30分钟。用棉签轻轻擦拭未迁移的细胞。用PBS洗涤细胞3次。在光学显微镜(Olympus，IX71，Japan)下观察迁移图像。
7.细胞形态
为观察SIS、SIS-P、SIS-CP、SIS-L-CP膜培养的细胞形态，在SIS膜上接种EAhy926细胞(1×104细胞/孔)，观察细胞骨架。共培养24小时后，将细胞在4％多聚甲醛中固定30分钟，然后在0.5％TritonX-100中渗透10分钟。通过罗丹明B鬼笔环肽(Cytoskeleton，Inc.，USA)染色获得细胞骨架观察结果。细胞核用DAPI染色。通过CLSM(CLSM900，Zeiss，Germany)系统观察细胞形态。
8.管形成测定
将SIS、SIS-P、SIS-CP和SIS-L-CP膜置于DMEM培养基中3天以收集样品的浸出液。使用ECMatrixGel(Corning，356234，USA)进行体外血管生成试验。简而言之，将熔化的Matrigel以80μL/孔添加到96孔板中，并在37℃下放置30分钟以固化。EAhy 926细胞(3×104细胞/孔)用凝胶上的标本条件培养基在37℃下接种4小时。在光学显微镜(OlympusBX51-FL-CCD，Japan)下观察管形成的图像，并使用分析软件用Olympus XC50相机成像。
9.qRT-PCR分析
通过qRT-PCR测量EAhy926细胞中血管生成相关基因的表达水平。培养3天后，收获不同组培养的EAhy926细胞。使用TRIzol(Invitrogen)提取总细胞RNA。血管生成相关基因的引物(Invitrogen)列于表1。接下来，使用QuantiTectSYBRGreenPCR试剂盒(Qiagen，Germany)将获得的RNA逆转录为cDNA。管家基因(housekeepinggene)GAPDH的相对表达水平用于标准化不同组中每个样本的血管生成相关基因表达。使用2-ΔΔCt方法确定相对基因表达。
表1 实时PCR的引物序列
10.蛋白质印迹分析
培养3天后收集EAhy926细胞。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离来自培养细胞的蛋白质并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Sigma-Aldrich，USA)。然后将膜在室温下用5％牛血清白蛋白(BSA)(Sigma-Aldrich，USA)封闭1小时。接下来，将PVDF膜与一抗(1:1000稀释度)在4℃下孵育过夜(Abcam，UK)。然后将膜与相应的二抗(1:5000稀释度)在37℃下孵育1小时。然后，使用ECL蛋白质印迹分析系统(CWBIO，北京，中国)检测抗体结合蛋白。使用ImageJ软件对综合光密度进行量化。所有值均由GAPDH标准化。
11.免疫荧光染色
培养3天后，将不同组培养的EAhy926细胞用4％多聚甲醛固定30分钟，并用0.5％(v/v)TritonX-100(Sigma，USA)在37℃下透化5分钟。然后，将样品用PBS洗涤3次，并在BSA(5mg/mL)溶液中于37℃封闭30分钟。然后将细胞在4℃下与以下一抗(1:400稀释)之一孵育过夜：抗TGF-β、抗VEGF、抗HIF-1α和抗KDR。然后，将Cy3缀合的抗兔二抗(Abcam，UK)添加到样品中，并在37℃下孵育1小时。细胞核用DAPI染色。然后用CLSM(CLSM900，Zeiss，Germany)对细胞进行成像。
12.RNA-seq检测
将EAhy926细胞接种到具有P2的六孔板中。没有肽的空白板用作对照。3d后，刮取细胞并收集。然后通过RNA-seq(Novogene Co.，Ltd.，Beijing，China)对样品进行商业检测，以寻找差异表达的基因。
13.SIS-L-CP促进血管生成的机制
为了确认VEGF信号传导参与SIS-L-CP介导的对EAhy926细胞的作用，将EAhy926细胞与空白组、SIS、SIS-P、SIS-CP和SIS-L-CP组共培养5天。然后，如上所述进行蛋白质印迹和免疫荧光染色。
14.动物
我们工作中的动物实验得到了天津医科大学学术医学中心动物伦理委员会的批准。雌性C57BL/6J小鼠(16-18g，6-8周)和雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(250-280g，6-8周)用于体内研究。
15.后肢缺血模型和激光多普勒灌注成像(LDPI)
雄性C57BL/6J小鼠(16-18g，6-8周)随机分为五组：空白组、SIS、SIS-P、SIS-CP和SIS-L-CP组(每组n＝3)。用氯胺酮(200mg/kg，IP)麻醉小鼠，剃去手术部位的毛发，用碘消毒手术区域，然后用4-0丝线结扎左股动脉近端。手术后，小鼠随机给予SIS、SIS-P、SIS-CP、SIS-L-CP的浸出液肌肉注射或不处理的浸出液。从手术后第0天开始，立即(同侧大腿)肌肉注射样品的浸出液，每两天给予一次，直到第14天。使用激光多普勒灌注成像(LDPI，PERIMED PeriCam PSI，瑞典)评价术后即刻及术后7、14d双下肢血流情况。分别在第7天和第14天用异氟醚麻醉动物。采用LDPI扫描各组下肢灌注情况，计算各肢体缺血/非缺血肢体LDPI血流比值。
16.大鼠背侧皮肤缺损模型的建立与修复
雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(250-280g，6-8周)随机分为五组：空白组、SIS、SIS-P、SIS-CP和SIS-L-CP组(n＝3每组)。用氯胺酮(200mg/kg，IP)麻醉大鼠，剃掉手术部位的毛发，用碘消毒手术区域。随后，在大鼠背侧皮肤上制作直径为1cm的圆形全层缺损。空白组不做处理，其他组在缺损处放置SIS、SIS-P、SIS-CP或SIS-L-CP膜。然后逐层缝合手术区。将大鼠圈养在单独的笼子中以避免相互咬伤。
手术后1周和2周，收集皮肤样本并在4％多聚甲醛中固定24小时。接下来，将组织包埋在石蜡中并切片(厚度为5μm)。通过苏木精伊红(H&E)和Masson-Goldner(Solarbio，China)染色进行组织学分析。将1:200稀释度的一抗抗VEGF、抗TGF-β和荧光偶联二抗IgG(Abcam，UK)用于免疫组织化学。使用数字切片扫描系统(NanoZoomer，Hamamatsu，Japan)观察图像。
17.体内毒性研究
为检测SIS-L-CP膜对重要脏器的毒性，给药后采集心、肺、肝、脾、肾。然后将器官切片并在石蜡包埋后进行H&E染色以进行毒性分析。
18.统计分析
所有定量实验数据均表示为平均值±标准偏差(SD)，并至少重复3次。使用Tukey检验的单向方差分析(one-way analysis of variance，ANOVA)评估统计分析。并且p值小于0.05被认为具有显着的统计学差异。
实施例
本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法，例如下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。
实施例1.选自MHCII的寡肽
建立功能性寡肽选择模型的几个关键因素总结如下：(a)寡肽通常长度较短，难以形成典型的空间结构。因此，需要选择合适的方法来解释功能性寡肽的氨基酸序列特征；(b)为了找到没有空间结构的功能性寡肽序列，需要选择特定序列作为感兴趣区域。筛选功能性生物分子的效率是新型蛋白质或多肽药物开发的瓶颈，特别是蛋白质由于其复杂的结构可能具有多种生物学功能。最近的研究表明，理解蛋白质的功能不能局限于其固有的三维结构。大多数蛋白质含有大量没有明显结构特征的氨基酸序列(称为IDR)。IDP/IDR的相互作用通常由短相互作用模块介导，称为肽基序(也称为短线性基序，SLiM或真核线性基序，ELM)。肽基序的长度通常小于10个残基，它们更喜欢位于蛋白质IDR内，并且基于存在一些高度保守的特异性决定残基。因此，IDR没有显着的结构特征，但最近被报道具有一系列关键的生物学功能，这是一个合适的候选区域。在这里，我们专注于MHC II类的IDR区域，以筛选促进血管生成并排除MHCII执行的非目标功能的功能区域。
在这项研究中，我们确定了一种具有多种功能的蛋白质MHC II类，例如促进血管生成、免疫调节和抗原呈递，作为筛选寡肽的靶蛋白。伤口愈合过程中不同时间点(1d、7d、14d)的免疫组化染色显示，MHCII类在伤口愈合过程中的表达明显增加，提示其在加速伤口愈合中具有重要作用(图2A)。此外，我们通过蛋白质数据库UniProt搜索了MHC II类的结构信息(其UniProt编号为P01906)，发现它包含多段IDR(图2B)。通过结合PubMed中的蛋白质保守预测信息，我们选择了保守区域中的IDR序列(UniProt编号为P01906所示的氨基酸序列的第27-207位氨基酸)(图2C)。最后，我们合成了具有相应序列的寡肽，用于后续促进血管生成的验证实验(图2D)。
前述保守区域中的IDR序列如下所示(SEQ ID NO：27)：
VADHVASYGVNFYQSHGPSGQYTHEFDGDEEFYVDLETKETVWQLPMFSKFISFDPQSALRNMAVGKHTLEFMMRQSNSTAATNEVPEVTVFSKFPVTLGQPNTLICLVDNIFPPVVNITWLSNGHSVTEGVSETSFLSKSDHSFFKISYLTFLPSADEIYDCKVEHWGLDEPLLKHWEPE
其中，合成的寡肽的具体序列如表2所示：
表2 合成的寡肽序列
P1：VADHV(SEQ ID NO：10) P7：KFPVTLGQP(SEQ ID NO：14)
P2：QSHGPS(SEQ ID NO：1) P8：FPPV(SEQ ID NO：15)
P3：LETK(SEQ ID NO：11) P9：KSDHS(SEQ ID NO：16)
P4：QLPM(SEQ ID NO：12) P10：LPSADEI(SEQ ID NO：2)
P5：FISFD(SEQ ID NO：13) P11：WGLDEP(SEQ ID NO：3)
P6：SNS P12：EPE
实施例2.寡肽的生物相容性和促血管生成能力
生物相容性是贯穿生物材料研究的主题，是药物应用应具备的基本特性。因此，进行CCK-8测定以评估寡肽的体外生物相容性。此外，还应用迁移实验(transwell)、管形成(tube formation)、qRT-PCR、蛋白质印迹和荧光测定来探索寡肽在体外促进血管生成的能力。
CCK-8实验(图3中的A)发现，不同组的EAhy926细胞随着时间的推移以不同的速度增殖，并在7d时达到生长平台期。在前5天，P2、P10和P11组的细胞增殖速度快于空白组和其他寡肽组。因此，我们选择了P2、P10和P11进行进一步研究。
进行迁移实验和管形成实验(图3中的B、C)以评估P2、P10和P11对EAhy926细胞迁移和促血管生成能力的影响。迁移实验结果(图3中的B)显示P2、P10、P11组细胞迁移次数高于空白组，说明P2、P10、P11能够促进细胞迁移，有效解决组织缺损，而其中P2组细胞迁移次数最多。管形成实验结果(图3中的C)显示，与空白组组相比，P2、P10、P11组形成了血管样结构，空白组几乎没有形成小管，说明P2、P10、P11促进了血管的形成，其中P2形成的血管样结构最为完整。
然后，进行qRT-PCR、蛋白质印迹和免疫荧光染色以进一步探索P2、P10和P11促进血管生成的能力。VEGF和TGF-β是调节血管生成分化的重要因素，因此我们将它们的表达视为每个样本促进血管生成的能力。qRT-PCR(图3中的F)显示，P2组的mRNA表达(VEGF和TGF-β)水平显着高于空白组(P<0.05)。一致地，蛋白质印迹结果(图3中的D，E)还显示，与其他组相比，P2组中的EAhy926细胞表达更多的血管生成标志物蛋白(VEGF和TGF-β)(P<0.05)。免疫荧光染色(图3中的G)表明P2组显示出VEGF的荧光强度显着增加。在这些组中，P2显示出血管生成相关蛋白标志物的最高表达水平。
基于以上结果，不难发现P2、P10、P11均具有优异的生物相容性和的血管生成能力，其中，P2的效果最佳。这意味着我们成功筛选出多种促进血管生成的寡肽QSHGPS、LPSADEI、WGLDEP，其中QSHGPS效果最佳。
实施例3.寡肽促进体外血管生成的机制
RNA-seq用于探索QSHGPS和空白组之间差异基因的表达。与空白组相比，QSHGPS增加了230个基因，减少了86个基因(图4B)。维恩图显示10853个基因具有相同的趋势(图4A)。通过分析不同的基因，我们发现QSHGPS上调了激酶插入域受体(KDR)的表达。KDR是VEGF信号通路的重要蛋白，与血管生成密切相关。因此，我们推测QSHGPS可以通过上调VEGF信号通路的KDR来促进血管生成。
实施例4.嵌合肽的设计与结构预测
如图5中的A所示，设计和研究了由不同成分组成的两种嵌合肽，QSHGPS和具有(L-CP)或不具有(CP)连接肽(GGGGS)的胶原蛋白结合肽(TKKTLRT)。连接肽是构建嵌合肽的必要元素，为嵌合肽提供结构灵活性并保持功能域的原始结构。为了有效分离嵌合肽的功能基序，GGGGS连接肽的序列重复四次(n＝4)。GGGGS是一种广泛使用的柔性连接肽，由丝氨酸(Ser)和甘氨酸(Gly)组成。Ser和Gly确保连接肽的灵活性和稳定性，这对于构建工程嵌合肽很重要。预测结果表明CP和L-CP具有不同的空间结构(图5中的A)。
本公开中采用的嵌合肽序列如表3所示。
表3 合成的嵌合肽序列
QSHGPSTKKTLRT(SEQ ID NO：4) QSHGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSTKKTLRT(SEQ ID NO：7)
LPSADEITKKTLRT(SEQ ID NO：5) LPSADEIGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSTKKTLRT(SEQ ID NO：8)
WGLDEPTKKTLRT(SEQ ID NO：6) WGLDEPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSTKKTLRT(SEQ ID NO：9)
在以下的实施例中，除非特别强调，否则CP肽的序列均为如SEQ ID NO：7所示的序列，L-CP肽的序列均为如SEQ ID NO：4所示的序列。
实施例5.嵌合肽修饰的SIS膜的表征
然后，将SIS膜浸入不同浓度的CP和L-CP肽溶液中。共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)(图6)用于检测嵌合肽在SIS膜表面的结合能力。我们将CP和L-CP肽溶液的浓度范围设置为50×10-6M到250×10-6M。CLSM图像显示，随着CP和L-CP肽溶液的浓度从50增加到200×10- 6M，SIS膜上的荧光逐渐增强。然而，当肽溶液增加到250×10-6M时，SIS膜上的荧光并没有继续增加。可以看出，当嵌合肽溶液的浓度为200×10-6M时，嵌合肽与SIS膜的结合达到最佳。
如图5中的B所示，通过扫描电子显微镜(SEM)观察了SIS、SIS-P、SIS-CP和SIS-L-CP膜的表面形态。SIS膜由胶原纤维组成，胶原纤维交织成网状。SIS-P、SIS-CP和SIS-L-CP膜具有纵横交错的网络表面，具有球形肽颗粒，其中SIS-L-CP的颗粒数量最多。这意味着与P和CP相比，L-CP对SIS膜的结合能力最好。
为了进一步研究嵌合肽从SIS膜的释放，我们通过CLSM在1、3和5天观察了SIS-L-CP上嵌合肽的数量(图5中的C)。第一天可以看到SIS-P、SIS-CP、SIS-L-CP上有大量肽段，与SIS-L-CP结合的嵌合肽段数量最多。随着时间的推移，各组SIS膜上肽的数量逐渐减少。5天后，SIS膜上的肽数量急剧下降，但SIS-CP和SIS-L-CP上的肽数量仍然相当可观。这表明胶原结合嵌合肽不断从SIS-CP和SIS-L-CP中释放出来，带有连接肽的嵌合肽更好地与SIS膜结合。可能是连接肽使嵌合肽的功能域之间的连接更加稳定，有利于嵌合肽从SIS膜上持续稳定释放。
此外，还进行了水接触角实验(图5中的D)和拉伸试验(图5中的E)以研究SIS膜的亲水性和机械性能。结果表明，样品间的水接触角无统计学差异，说明P、CP、L-CP对SIS膜的改性不影响其亲水性。还发现，在干湿条件下，各样品的机械强度没有显着差异，这意味着P、CP和L-CP对SIS膜的改性并没有改变其机械性能。
综上所述，我们成功获得了一种嵌合肽修饰的SIS膜，它具有良好的肽负载能力、机械性能和亲水性。其中，L-CP对SIS膜的修饰效果最好，这可能归因于GGGGS连接肽对嵌合肽的修饰。我们之前的研究表明，通过GGGGS连接肽对嵌合肽的修饰使其具有优异的稳定性，在此再次验证。SIS膜是由Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白组成的纤维膜。而我们之前的研究表明，Ⅰ型(TKKTLRT)胶原蛋白结合肽对SIS膜具有突出的修饰能力，因此我们用TKKTLRT将QSHGPS靶向SIS膜。幸运的是，我们的结果证明TKKTLRT足以获得良好的SIS膜特异性药物递送系统。接下来，将进行体外实验，进一步验证SIS-L-CP是否对细胞行为有更积极的影响。
实施例6.体外生物相容性和细胞行为测定
生物相容性是材料应具备的基本特性之一。细胞增殖和迁移是血管生成和伤口愈合的重要步骤。因此，进行了CCK8、迁移实验、管形成实验等，考察了SIS-L-CP对体外EAhy926细胞活性的影响。
为了评估嵌合肽修饰的SIS膜的生物相容性及其对细胞增殖的影响，进行了CCK8细胞计数实验(图7中的A)。发现不同组的EAhy926细胞随时间以不同的速度增殖，并在7d时达到生长平台期。每个样本组的细胞增殖速度都快于空白组，其中SIS-L-CP组在前5天增殖最快。SIS膜含有多种生长因子，如VEGF和转化生长因子(TGF-β)，可能促进样本组细胞的增殖。
进行迁移实验以评估不同样品对EAhy926细胞迁移能力的影响(图7中的B、C)。不同样品的细胞迁移次数均高于空白组，其中SIS-L-CP组的细胞迁移次数最多。这表明SIS膜促进EAhy926细胞的迁移，嵌合肽对SIS膜的修饰可以增强这种作用。基于此，我们推测SIS-L-CP膜可以有效促进细胞向伤口移动。
血管生成在伤口愈合中起着至关重要的作用。进行管形成实验(图7中的D)以验证嵌合肽修饰的SIS膜在体外促进血管生成。结果表明，SIS-P、SIS-CP、SIS-L-CP组与空白组和SIS组相比，形成了完整的血管样结构，空白组几乎没有形成小管(tubules)，这意味着选择的寡肽具有很好的促血管生成能力。此外，SIS-L-CP比SIS-CP形成更多的血管样结构，这表明具有连接肽的嵌合肽有效地促进了血管形成。
通过CLSM观察与SIS、SIS-P、SIS-CP和SIS-L-CP共培养的EAhy926细胞的形态(图7中的E)。共聚焦图像显示不同组中的EAhy926细胞具有良好拉伸的肌动蛋白束。特别是在SIS-L-CP上，细胞表现出更好的扩散形态，平均细胞面积最大。上述结果表明SIS-L-CP增强了细胞的细胞骨架发育。
综上所述，嵌合肽修饰的SIS膜对EAhy926细胞增殖、迁移和拉伸具有促进作用，表明修饰的SIS膜具有良好的生物相容性和无细胞毒性。此外，具有GGGGS连接肽的嵌合肽修饰的SIS膜对细胞活性的促进作用最强，这表明具有GGGGS连接肽的嵌合肽具有更好的生物学功能。
实施例7.SIS-L-CP对EAhy926细胞血管生成相关因子表达的影响
血管生成是促进伤口愈合的关键。为了研究SIS-L-CP膜促进血管生成的能力，进行了qRT-PCR(图8中的A)、蛋白质印迹(图8中的B)和免疫荧光染色(图8中的C)以探索血管生成的表达水平EAhy926细胞中的相关因子。EAhy926细胞的血管生成分化受VEGF、TGF-β和HIF-1α等因子的调节。qRT-PCR显示各样本组mRNA表达水平(VEGF、TGF-β、HIF-1α)均显着高于空白组，SIS-L-CP组最高(P<0.05)。Western印迹结果还显示，与其他组相比，SIS-L-CP组的EAhy926细胞表达更多的血管生成标志物蛋白(VEGF、TGF-β和HIF-1α)(P<0.05)。此外，免疫荧光染色显示VEGF、TGF-β和HIF-1α的荧光强度从空白组到SIS-L-CP组逐渐增加。其中，SIS-L-CP组血管生成相关蛋白标志物的表达量最高。
综上所述，以上结果表明SIS、SIS-P、SIS-CP、SIS-L-CP提高了VEGF的表达，有利于激活VEGF信号通路，促进血管生成[35]。此外，值得注意的是，SIS-L-CP在促进血管生成方面比SIS、SIS-P和SIS-CP组更有效(P<0.05)，这可能是由于胶原结合肽的作用和GGGGS连接肽。换言之，胶原结合肽可能将更多的寡肽靶向SIS膜，而GGGGS连接肽确保了寡肽的稳定功能。因此，嵌合肽对SIS膜的修饰可以促进血管生成，有利于加速伤口愈合。
实施例8.SIS-L-CP促进体外血管生成和伤口愈合的机制
接下来，我们探索了SIS-L-CP膜促进血管生成的潜在机制。据报道，VEGF可以通过激活AKT的磷酸化来促进细胞的存活和增殖。NOS活化产生的一氧化氮介导VEGF信号通路的多个方面，促进血管内皮细胞的增殖。此外，我们之前的研究表明，QSHGPS可以促进KDR的表达，并且KDR与VEGF信号通路和血管生成密切相关，因此我们检测了KDR、AKT丝氨酸/苏氨酸激酶1(p-AKT1)和磷酸化硝酸盐的表达。WB的氧化物合酶3(p-NOS3)(图9A)。图9B示出了与血管生成和伤口愈合相关的蛋白质的代表性免疫荧光染色。我们发现SIS-L-CP、SIS-CP和SIS-P组的KDR、p-AKT1和p-NOS3的表达水平高于SIS组和空白组。SIS-L-CP组的KDR、p-AKT1和p-NOS3水平最高。这些结果表明，EAhy926细胞中的VEGF信号通路被SIS-L-CP膜激活，SIS-L-CP膜诱导的血管生成和伤口愈合至少部分是由于VEGF信号通路的激活。
实施例9.SIS-L-CP改善小鼠后肢缺血模型中的血管生成血液灌注
SIS-L-CP膜具有出色的细胞相容性并在体外促进血管生成，表明其在体内的潜在应用。因此，我们建立了小鼠后肢缺血模型，以探索SIS-L-CP促进血管生成的能力。
通过LDPI观察到小鼠的后肢缺血(图10A)。紫色代表缺血，黄色代表灌注。不难发现，与Blank、SIS、SIS-P、SIS-CP组相比，SIS-L-CP能够更快地恢复受损组织的血流灌注。从柱状图中我们也可以直观的发现，SIS-L-CP组在第7天和第14天的血液灌注比其他组好(图10B)，这意味着SIS-L-CP的效果最好。关于促进血管生成。
许多研究表明，后肢缺血模型中的动脉生成发生在结扎部位的近端，结扎远端的急性缺血区域通常与血管生成和毛细血管密度增加有关。因此，采用后肢缺血模型研究SIS-L-CP对缺血组织血管生成的影响。因此，上述结果表明SIS-L-CP成功地促进了缺血组织的血管生成，这也意味着QSHGPS可以有效地促进体内血管生成。
实施例10.SIS-L-CP促进大鼠背侧皮肤缺损模型的血管生成和伤口愈合
建立大鼠背侧皮肤缺损模型，进一步探索SIS-L-CP通过促进血管生成加速伤口愈合的能力。并通过H&E染色评估伤口的愈合病理学。令人惊讶的是，用SIS-L-CP膜治疗的皮肤缺损创面在初始阶段(1周)愈合得比其他组快得多，并且创面充满了丰富的新生肉芽组织和新表皮(图11A)。2周时，SIS-L-CP组皮肤创面基本被新表皮覆盖，而对照组新表皮较少(P<0.05)(图11B)。此外，SIS-L-CP组出现皮肤附属物结构样组织，提示SIS-L-CP膜具有加速伤口愈合的能力。空白组和SIS-L-CP组小鼠主要器官H&E染色无差异，说明SIS-L-CP膜具有很好的生物相容性(图12)。
Masson染色揭示了皮肤伤口中的胶原沉积和重塑(图11C)。SIS-L-CP组的胶原蛋白含量明显高于其他组，这也证实了H&E染色结果。在第14天，SIS-L-CP和SIS-CP治疗组的皮肤伤口中的胶原纤维较高(图11D)。此外，与其他组相比，SIS-L-CP和SIS-CP组中的胶原纤维更密集且更有组织。这些结果表明SIS-L-CP膜可以加速伤口愈合过程中的胶原沉积和重塑。
免疫组织化学检测了皮肤伤口中血管生成相关因子的表达，例如VEGF和TGF-β(图11E)。从结果可以看出SIS-L-CP组VEGF和TGF-β的含量最高，说明SIS-L-CP膜在伤口愈合过程中能有效促进血管生成。此外，我们推测SIS-L-CP膜促进上皮细胞迁移和胶原沉积，可能与VEGF和TGF-β的表达增加有关。
综上所述，SIS-L-CP膜可有效促进体内血管生成并加速伤口愈合。并且体外实验也表明SIS-L-CP膜对EAhy926细胞具有极好的促血管生成作用。以上结果表明SIS-L-CP膜是一种生物材料，具有良好的生物相容性，可促进血管生成，加速伤口愈合。
总之，我们成功地从MHCII类IDR中筛选出一种促进血管生成的寡肽，并将其靶向SIS膜，形成SIS-L-CP药物递送系统。细胞和动物实验均表明SIS-L-CP膜促进了VEGF、TGF-β和HIF-1α的表达，这使得SIS-L-CP膜能够促进血管生成并加速伤口愈合。该研究为寡肽类药物的开发提供了新思路，为促进血管生成、加速伤口愈合提供了实验基础。
本公开的上述实施例仅是为清楚地说明本公开所作的举例，而并非是对本公开的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本公开的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本公开权利要求的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京博辉瑞进生物科技有限公司
<120> 肽、肽修饰的SIS膜、其制备方法及应用
<130> 6733-2263356IP
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Thr
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Gly Gly Ala Ala Gly Gly
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
Val Ala Asp His Val Ala Ser Tyr Gly Val Asn Phe Tyr Gln Ser His
1 5 10 15
Gly Pro Ser Gly Gln Tyr Thr His Glu Phe Asp Gly Asp Glu Glu Phe
20 25 30
Tyr Val Asp Leu Glu Thr Lys Glu Thr Val Trp Gln Leu Pro Met Phe
35 40 45
Ser Lys Phe Ile Ser Phe Asp Pro Gln Ser Ala Leu Arg Asn Met Ala
50 55 60
Val Gly Lys His Thr Leu Glu Phe Met Met Arg Gln Ser Asn Ser Thr
65 70 75 80
Ala Ala Thr Asn Glu Val Pro Glu Val Thr Val Phe Ser Lys Phe Pro
85 90 95
Val Thr Leu Gly Gln Pro Asn Thr Leu Ile Cys Leu Val Asp Asn Ile
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115 120 125
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130 135 140
Phe Phe Lys Ile Ser Tyr Leu Thr Phe Leu Pro Ser Ala Asp Glu Ile
145 150 155 160
Tyr Asp Cys Lys Val Glu His Trp Gly Leu Asp Glu Pro Leu Leu Lys
165 170 175
His Trp Glu Pro Glu
180

Claims (7)

1.寡肽，其中，所述寡肽的序列包含由如下序列所示的序列组成的组中的至少一种或由如下序列所示的序列组成的组中的至少一种组成：
(i)如SEQ ID NO：1-3任一项所示的序列；
(ii)和(i)所示的序列相比，存在保守置换的序列。
2.嵌合肽，其中，所述嵌合肽含有如权利要求1所述的寡肽，并且所述嵌合肽的序列包含由如下序列所示的序列组成的组中的至少一种或由如下序列所示的序列组成的组中的至少一种组成：
(iii)如SEQ ID NO：4-9任一项所示的序列；
(iv)和(iii)所示的序列相比，存在保守置换的序列。
3.一种嵌合肽修饰的SIS膜，其中，所述嵌合肽的序列为如权利要求2所述的序列。
4.根据权利要求3所述的嵌合肽修饰的SIS膜，其中，所述修饰的方法包括以下步骤：
(a)将所述嵌合肽溶解至溶剂中，得到含有嵌合肽的溶解液；
(b)将步骤(a)得到的溶解液施加至所述SIS膜的表面；优选的，将所述SIS膜浸入步骤(a)得到的溶解液中；
(c)干燥表面带有所述溶解液的所述SIS膜。
5.一种嵌合肽修饰的SIS膜的制备方法，其中，所述方法包括以下步骤：
(a)将所述嵌合肽溶解至溶剂中，得到含有嵌合肽的溶解液；
(b)将步骤(a)得到的溶解液施加至所述SIS膜表面；优选的，将所述SIS膜浸入步骤(a)得到的溶解液中；
(c)干燥表面带有所述溶解液的所述SIS膜，得到所述嵌合肽修饰的SIS膜；
其中，所述嵌合肽的序列包含由如下序列所示的序列组成的组中的至少一种，或者所述嵌合肽的序列由如下序列组成的组中的至少一种组成：
(i)如SEQ ID NO：1-9任一项所示的序列；
(ii)和(i)所示的序列相比，存在保守置换的序列。
6.根据权利要求1所述的寡肽、权利要求2所述的嵌合肽、权利要求3-4任一项所述的嵌合肽修饰的SIS膜或根据权利要求5所述的嵌合肽修饰的SIS膜的制备方法得到的嵌合肽修饰的SIS膜在如下(a)-(b)至少一种中的用途：
(a)作为或制备促进血管生成的生物材料；
(b)作为或制备加速伤口愈合的生物材料。
7.一种促进血管生成或加速伤口愈合的方法，其中，所述方法包括向受试者施用根据权利要求1所述的寡肽、权利要求2所述的嵌合肽、权利要求3-4任一项所述的嵌合肽修饰的SIS膜或根据权利要求5项所述的嵌合肽修饰的SIS膜的制备方法得到的嵌合肽修饰的SIS膜的步骤。
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