CN117323411B - 破伤风类毒素在脐带干细胞损伤治疗中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了破伤风类毒素在脐带干细胞损伤治疗中的应用，本发明提供了破伤风类毒素在用于治疗或预防脐带干细胞损伤的药物组合物及其应用，提供了体外保护脐带干细胞的方法，以及促进脐带干细胞增殖能力、降低脐带干细胞凋亡率的方法及应用。

Description

破伤风类毒素在脐带干细胞损伤治疗中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及破伤风类毒素在脐带干细胞损伤治疗中的应用。
背景技术
脐带干细胞，通常是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞。它们具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。从人脐带中分离出MSCs，细胞含量、增殖能力优于骨髓MSCs，免疫原性比骨髓MSCs低，并且具有取材方便，无伦理学争议等优点。然而高糖环境会使干细胞功能障碍，甚至是死亡，最终会影响干细胞的治疗效果，所以临床上迫切需要找到针对高糖对干细胞损伤的治疗方法。
破伤风类毒素是用来预防破伤风的一种疫苗，是由破伤风杆菌经过培养、灭活、脱毒、除菌后制成的疫苗。注射破伤风类毒素后，会使人体产生抗体，从而达到免疫应答目的。因此我们决定利用破伤风类毒素会刺激人体产生抗体达到局部免疫应答反应这一特性，从血管内皮细胞的增殖、重塑和凋亡等因素来研究破伤风类毒素对于糖尿病或高糖环境下血管内皮细胞损伤这一不良现象的改善，希望能够推出一种新的治疗方法来改善高糖环境引起的血管损伤。
发明内容
为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
本发明第一方面提供了破伤风类毒素在制备用于治疗或预防脐带干细胞损伤的药物组合物中的应用。
进一步，所述药物组合物制备后通过口服施用、栓剂施用、局部接触施用、静脉施用、肠胃外施用、腹腔施用、肌肉施用、病灶内施用、鞘内施用、鼻内施用或皮下施用。
在某些具体的实施方案中，所述药物组合物可经由药物施用装置直接向患者施用。存在通常可用于递送各种剂型的多种不同类型的药物施用装置，包括：针筒、注射装置(例如，自动注射器、射流注射器和输注泵)、鼻腔喷雾装置和吸入器。
术语“施用”或“药物施用”是指将如本文所述的包含破伤风类毒素的组合物递送至受试者用于治疗疾病或障碍。因此，适合于药物施用的描述用于将含有破伤风类毒素的组合物用于所述药物组合物的施用用来治疗受试者的疾病或障碍。
除非上下文另有明确指示，否则术语“或”在本文中用于意指术语“和/或”，并且可与所述术语互换使用。如本文所用术语“抑制”可与“减少”、“沉默”、“下调”、“压制”和其他类似术语互换使用，并且包括任何水平的抑制。
进一步，所述药物组合物还可与第二药剂或操作组合施用，所述第二药剂或操作组合包括提高破伤风类毒素活性的物质、延缓破伤风类毒素代谢的物质和/或其任意组合。
在某些具体的实施方案中，所述第二药剂能够提高破伤风类毒素的药物活性，或与破伤风类毒素具有相互促进的药性。术语“第二药剂”包括第二药剂的所有形式，如药学上可接受的盐、溶剂合物、结晶形式、多形体、前药等。
进一步，所述药物组合物还包括辅助或提升破伤风类毒素治疗或预防功能的辅助材料。
术语“治疗或预防”是指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述化合物的药物给予有需要的个体。
进一步，所述辅助材料为药学上可接受的辅助材料，具体包括佐剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、增味剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、pH调节和/或缓冲剂、溶剂、表面活性剂或乳化剂。
在某些具体的实施方案中，所述辅助材料为药物中常规采用的各种辅料，例如赋形剂、控释剂、稳定剂等，这属于本领域技术人员常规知识范围。这些药物组合物亦可含有一种或多种缓冲剂、安定剂、表面活性剂、润湿剂、润滑剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、助流剂、加工助剂、着色剂、增甜剂、香料剂、调味剂或其它已知的添加剂，使该药物组合物以可被接受的形式制造或使用。
术语“辅助材料”是指能够递送本发明有效量活性物质、不干扰活性物质的生物活性并且对宿主或者患者无毒副作用的任何制剂或载体介质代表性的载体包括水、油、蔬菜和矿物质、膏基、洗剂基质、软膏基质等。这些基质包括悬浮剂、增粘剂、透皮促进剂等。
进一步，所述治疗或预防包括提高脐带干细胞增殖能力、降低脐带干细胞凋亡率。
进一步，导致所述脐带干细胞损伤的外部恶劣条件包括高糖、缺氧、氧化应激、缺血、血液再灌注、酸中毒、严重感染、抗原-抗体复合物、血管疾病、心血管疾病、肾素-血管紧张素系统、氧化低密度脂蛋白、内皮微颗粒或同型半胱氨酸。
进一步，所述脐带干细胞包括造血干细胞、造血祖细胞、充质干细胞、皮内干细胞、非限制性体内细胞干细胞。
本发明第二方面提供了一种用于治疗或预防脐带干细胞损伤的药物组合物，所述药物组合物包括治疗有效量或预防有效量的破伤风类毒素。
进一步，所述破伤风类毒素的有效浓度为0.025IU/mL。
进一步，所述破伤风类毒素治疗或预防脐带干细胞损伤的使用方式为直接添加。
在某些具体的实施方案中，所述破伤风类毒素需要对脐带干细胞进行1天的培养处理。
术语“有效量”是指减轻疾病或病况的至少一种或多种症状所需的治疗量，并且涉及提供所需效果的药物的足够量。因此，术语“治疗有效量”是指当施用于典型主体时，足以引起特定效果的治疗量。在各种背景下，如本文所用的有效量还包括足以延迟疾病病症的发展，改变疾病的过程(例如但不限于，减缓疾病症状的进展)，或逆转疾病病症的量。应当理解，本领域已知有许多方式来确定用于给定应用的有效量。例如，用于剂量确定的药理学方法可用于治疗背景中。在治疗性或预防性应用的背景下，施用于主体的组合物的量将取决于疾病的类型和严重性以及个体的特征，例如总体健康状况、年龄、性别、体重和对药物的耐受性。它还取决于疾病的程度、严重性和类型。本领域技术人员将能够根据这些和其他因素来确定合适的剂量。例如，Daidzin的治疗有效量可以参照其目前给药于治疗动脉血栓性疾病患者用于治疗动脉血栓性疾病时的安全使用量，并经临床考察进行确定。合适的有效给药剂量还要考虑药物剂型、给药个体的体质、体重、年龄、病况进程、给药部位等治疗因素。
在某些具体的实施方案中，所述有效浓度表示试剂的浓度为足以使测试系统中给定参数产生变化的量。
进一步，所述药物组合物中的有效成分破伤风类毒素的运载载体包括携带破伤风类毒素的纳米颗粒、携带破伤风类毒素的病毒载体、包裹破伤风类毒素的PEG修饰蛋白、包裹破伤风类毒素的蛋白微球、包裹破伤风类毒素的脂质体、包裹破伤风类毒素的细胞外囊泡和/或其任意组合。
本发明第三方面提供了一种保护体外脐带干细胞的方法，所述方法包括在受到或即将受到外部恶劣条件的脐带干细胞中添加治疗有效量或预防有效量的破伤风类毒素的步骤。
在某些具体的实施方案中，所述脐带干细胞损伤的外部恶劣条件包括高糖、缺氧、氧化应激、缺血、血液再灌注、酸中毒、严重感染、抗原-抗体复合物、血管疾病、心血管疾病、肾素-血管紧张素系统、氧化低密度脂蛋白、内皮微颗粒或同型半胱氨酸。在某些具体的实施方案中，所述脐带干细胞损伤的外部恶劣条件为高糖环境，具体能够造成脐带干细胞损伤的环境为葡萄糖溶液，其浓度为0.1g/mL。在某些具体的实施方案中，所述脐带干细胞损伤的外部恶劣条件为缺氧环境，具体能够造成脐带干细胞损伤的环境包括1％氧气浓度的环境，更具体的为94％氮气、5％二氧化碳和1％氧气组成的缺氧环境。
本发明第四方面提供了一种体外非治疗目的的促进脐带干细胞增殖能力、降低脐带干细胞凋亡率的方法，所述方法包括如下步骤：使用有效量的破伤风类毒素或包括有效量破伤风类毒素的药物组合物，处理脐带干细胞。
进一步，使用的有效量的破伤风类毒素或包含破伤风类毒素的药物组合物中的破伤风类毒素的有效浓度为0.025IU/mL。
在某些具体的实施方案中，所述破伤风类毒素保护脐带干细胞的具体形式恢复处于恶劣环境中脐带干细胞的增殖能力和分泌能力，同时降低因外部恶劣环境导致的凋亡率上升。在某些具体的实施方案中，所述破伤风类毒素保护脐带干细胞的具体形式为提前保护脐带干细胞，使脐带干细胞在受到外部恶劣环境影响时的增殖能力和分泌能力不受影响或受到较少的影响，同时使脐带干细胞在受到外部恶劣环境影响时的凋亡率不上升或较小程度的上升。
本发明第五方面提供了破伤风类毒素在促进脐带干细胞增殖能力、降低脐带干细胞凋亡率中的应用。
术语“增殖能力”是指细胞经历细胞分裂的能力。可通过本领域已知的任何方法测量细胞的增殖能力，所述方法包括但不限于，用合适的生长因子刺激前后细胞的计数、荧光染料测定、将BrdU掺入增殖细胞的DNA、将放射性标记的类似物如3H-胸腺嘧啶掺入增殖细胞的DNA和/或检测细胞增殖的细胞标志物。
在某些具体的实施方案中，所述破伤风类毒素作用于脐带干细胞的方式为直接接触或添加。
术语“凋亡”是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡，“凋亡”影响单一细胞的细胞死亡的机理，标志是细胞的皱缩、染色质的凝缩、和通过吞噬作用而消除的进入膜结合体内的细胞碎裂。术语“凋亡”经常与术语“程序性细胞死亡”同义地使用。凋亡(程序性细胞死亡)和细胞衰老(细胞增殖的永久抑制)是人体内的机理，且基于各种负面的内部或外部刺激使细胞除去(凋亡的情况下)或使细胞的进一步细胞增殖停止(衰老的情况下)。例如，DNA损伤、加热、辐射、营养缺失、病毒感染、缺氧和氧化应激都能引发由细胞释放细胞内凋亡信号。类似地，已经确定细胞衰老可由端粒缩短、氧化应激、DNA损伤、染色质重塑、肿瘤抑制物损失和肿瘤基因诱导而导致。
本发明第六方面一种筛选促进破伤风类毒素保护脐带干细胞功效的方法，所述方法包括添加或不添加其他物质后，对破伤风类毒素保护脐带干细胞功效的评价的步骤。
附图说明
图1是Edu实验来检测人脐带干细胞在不同环境下的细胞增殖情况图；
图2是通过蛋白印迹定量Bcl-2和BAX在不同组人脐带干细胞中的表达图；
图3是流式细胞学技术来检测人脐带干细胞在不同环境下的细胞凋亡情况图；
图4是ELISA检测人脐带干细胞不同培养基上清液内细胞因子的含量图；注：图1-图4中NC为普通DMEM培养基2ml，GT为0.2g无水葡萄糖溶解于1ml PBS+1ml DMEM培养基，TAT为破伤风类毒素疫苗0.05IU+2ml DMEM培养基，*p＜0.05；
图5是Edu实验来检测人脐带干细胞在不同环境下的细胞增殖情况图；
图6是通过蛋白印迹定量Bcl-2和BAX在不同组人脐带干细胞中的表达图；
图7是流式细胞学技术来检测人脐带干细胞在不同环境下的细胞凋亡情况图；
图8是ELISA检测人脐带干细胞不同培养基上清液内细胞因子的含量图；注：图5-图8中NC为普通DMEM培养基2ml，Hyp为0.2g无水葡萄糖溶解于1ml PBS+1ml DMEM培养基，TAT为破伤风类毒素疫苗0.05IU+2ml DMEM培养基，*p＜0.05；
图9是破伤风类毒素在体外治疗HKC损伤模拟示意图；注：HKC：肾小管上皮细胞；
图10是HKC的细胞划痕实验的迁移能力的三维图片及柱状分析图，其中，A为细胞迁移率统计分析柱状图，B为细胞划痕实验结果的三维图；
图11是BCL-2在不同环境下的HKC中mRNA与蛋白的表达分析图和蛋白印迹胶图以及BAX蛋白印迹胶图，其中，A为BCL-2与BAX的蛋白印迹胶图，A为BCL-2的mRNA的表达分析柱状图，C为BCL-2的蛋白表达分析柱状图；
图12是BAX在不同环境下的HKC中mRNA与蛋白的表达分析图，其中，A为BAX的mRNA的表达分析柱状图，C为BAX的蛋白表达分析柱状图；
图13是Edu实验检测HKC在不同环境下的细胞增殖图，其中，A为Edu实验的荧光标记图，B为HKC在不同环境下的细胞增殖统计分析柱状图；
图14是流式细胞术检测HKC在不同环境下的细胞凋亡图，其中，A为HKC在不同环境下的细胞增殖统计分析柱状图，B为流式细胞术分析图。
注：对照组与实验组之间的显著性比较：*p<0.05；实验组与治疗组之间的显著性比较：&p<0.05。
具体实施方式
实施例1
1、人脐带干细胞(hUC-MSC)的培养材料和试剂
人脐带干细胞(hUC-MSC)、培养基(DMEM；Invitrogen，加利福尼亚州，美国)、10％胎牛血清(FBS；Invitrogen)、破伤风类毒素(成都欧林生物科技股份有限公司：吸附破伤风疫苗)、无水葡萄糖、PBS溶液、
2、人脐带干细胞(hUC-MSC)的培养方法
hUC-MSC在含有10％胎牛血清培养基中以含有5％ CO2的37℃加湿培养箱中进行培养。
3、细胞处理
将hUC-MSC分为3组，其中
1)NC组为对照组，使用普通DMEM培养基2ml培育2天。
2)GT组为实验组，使用0.1g无水葡萄糖溶解于1ml PBS+1ml DMEM培养基培育2天。
3)TAT组为治疗组，使用0.1g无水葡萄糖溶解于1ml PBS+1ml DMEM培养基培育1天后，置换为破伤风类毒素0.05IU+2ml DMEM培养基培育1天。
4)Edu免疫荧光细胞增殖检测
Edu是一种胸腺嘧啶核苷类似物，它们能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在复制的DNA分子，然后分别利用免疫荧光技术、与Apollo荧光染料特异性反应检测细胞增殖情况。如图1A，1B，高糖处理组的人脐带干细胞增殖情况明显低于对照组，然后经过破伤风类毒素的处理，人脐带干细胞增殖情况有所提高。
4、蛋白印迹实验
BCL-2(B细胞淋巴瘤/白血病-2)基因，具有使细胞存活时间延长、抵抗细胞凋亡等功能。现有研究表明，BCL-2是调控细胞凋亡的关键蛋白之一。当人脐带干细胞暴露于短暂高糖环境下后，BCL-2的mRNA和蛋白表达显著下降(图2A，2B，2C)，且经过TAT治疗后，其表达量并未上调。
BAX，一个关键的促细胞凋亡蛋白，在调控线粒体凋亡途径中发挥着不可或缺的作用。正常情况下，BAX是以单体形式静存于细胞基质中。当细胞接收到凋亡信号后，BAX会被激活并在线粒体膜中形成多聚体孔洞，释放细胞色素C，从而起动凋亡程序。当人脐带干细胞暴露于短暂高糖环境下后，BAX的mRNA和蛋白表达显著上调(图2A，2D，2E)，且经过TAT治疗后，其表达量并未下降。
5、流式细胞术
将5×104个细胞悬浮在1×Binding Buffer中，加入10μl Annexin V-fitc和PI培养15min，流式细胞仪将凋亡细胞计数为Annexin V+/PI-和Annexin V+/PI+染色细胞(BDBiosciences)。如图3所示，高糖环境下细胞的凋亡率约为10％-12％，经破伤风类毒素培育后的细胞凋亡率约为6.67％，可见破伤风类毒素可使在高糖环境下的细胞凋亡率降低。
6、ELISA测定
FGF2，成纤维细胞生因子2(FGF2)在细胞表面激活其靶受体酪氨酸激酶FGFR，以激活许多下游通路，包括几种丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路。FGF2抑制了TGFβ介导的成纤维细胞活化。FGF2促进干细胞增殖和血管生成。按操作顺序形成抗体夹心结构后，加入TMB底物，板孔液体由无色变成蓝色，再加入终止液液体变为黄色。颜色的深浅和样品中的纤维细胞生因子2(FGF2)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(0D值)，计算样品液度，结果如图4所示。
EGF，表皮生长因子(EGF)前蛋白经蛋白水解处理生成53个氨基酸的EGF肽。EGF结合细胞表面EGF受体，介导酪氨酸残基上受体的固有磷酸化。EGF在细胞上清液中都能检测到。EGF在调节细胞生长、增殖和分化等多种生物过程中发挥重要作用。按操作顺序形成抗体夹心结构后，加入TMB底物，板孔液体由无色变成蓝色，再加入终止液液体变为黄色。颜色的深浅和样品中的表皮生长因子(EGF)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(0D值)，计算样品液度，结果如图4所示。
VEGF-A，血管内皮生长因子A(VEGF-A)在细胞上清液中都能检测到。往预先包被血管内皮生长因子A(VEGF-A)抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的血管内皮生长因子A(VEGF-A)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(0D值)，计算样品液度，结果如图4所示。
实施例2
1、人脐带干细胞(hUC-MSC)的培养材料和试剂
人脐带干细胞(hUC-MSC)、培养基(DMEM；Invitrogen，加利福尼亚州，美国)、10％胎牛血清(FBS；Invitrogen)、破伤风类毒素(成都欧林生物科技股份有限公司：吸附破伤风疫苗)、无水葡萄糖、PBS溶液、
2、人脐带干细胞(hUC-MSC)的培养方法
hUC-MSC在含有10％胎牛血清培养基中以含有5％ CO2的37℃加湿培养箱中进行培养。
3、细胞处理
将hUC-MSC分为3组，其中
1)NC组为对照组，使用普通DMEM培养基2ml培育2天。
2)Hyp为实验组，使用普通DMEM培养基2ml，置于37℃、94％ N2、1％ O2、5％CO2低氧培养箱中缺氧培养2天。
3)TAT组为治疗组，使用普通DMEM培养基，置于37℃、94％ N2、1％ O2、5％CO2低氧培养箱中缺氧培养1天后，置换为破伤风类毒素0.05IU+DMEM 2ml培养基培育1天。
4、Edu免疫荧光细胞增殖检测
Edu是一种胸腺嘧啶核苷类似物，它们能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在复制的DNA分子，然后分别利用免疫荧光技术、与Apollo荧光染料特异性反应检测细胞增殖情况。如图5所示1A,1B，缺氧处理组的人脐带干细胞增殖情况明显低于对照组，然后经过破伤风类毒素的处理，人脐带干细胞增殖情况有所提高。
5、蛋白印迹实验
BCL-2(B细胞淋巴瘤/白血病-2)基因，具有使细胞存活时间延长、抵抗细胞凋亡等功能。现有研究表明，BCL-2是调控细胞凋亡的关键蛋白之一。当人脐带干细胞暴露于短暂缺氧环境下后，BCL-2的mRNA和蛋白表达显著下降(图6A，6B，6C)，且经过TAT治疗后，其表达量并未上调。
BAX,一个关键的促细胞凋亡蛋白，在调控线粒体凋亡途径中发挥着不可或缺的作用。正常情况下，BAX是以单体形式静存于细胞基质中。当细胞接收到凋亡信号后，BAX会被激活并在线粒体膜中形成多聚体孔洞，释放细胞色素C，从而起动凋亡程序。当人脐带干细胞暴露于短暂缺氧环境下后，BAX的mRNA和蛋白表达显著上调(图6A，6D，6E)，且经过TAT治疗后，其表达量并未下降。
6、流式细胞术
将5×104个细胞悬浮在1×Binding Buffer中，加入10μl Annexin V-fitc和PI培养15min，流式细胞仪将凋亡细胞计数为Annexin V+/PI-和Annexin V+/PI+染色细胞(BDBiosciences)。如图7所示，缺氧环境下细胞的凋亡率约为10％-12％，经破伤风类毒素培育后的细胞凋亡率约为6.67％，可见破伤风类毒素可使在缺氧环境下的细胞凋亡率降低。
7、ELISA测定
FGF2，成纤维细胞生因子2(FGF2)在细胞表面激活其靶受体酪氨酸激酶FGFR，以激活许多下游通路，包括几种丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路。FGF2抑制了TGFβ介导的成纤维细胞活化。FGF2促进干细胞增殖和血管生成。按操作顺序形成抗体夹心结构后，加入TMB底物，板孔液体由无色变成蓝色，再加入终止液液体变为黄色。颜色的深浅和样品中的纤维细胞生因子2(FGF2)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(0D值)，计算样品液度，结果如图8所示。
EGF,表皮生长因子(EGF)前蛋白经蛋白水解处理生成53个氨基酸的EGF肽。EGF结合细胞表面EGF受体，介导酪氨酸残基上受体的固有磷酸化。EGF在细胞上清液中都能检测到。EGF在调节细胞生长、增殖和分化等多种生物过程中发挥重要作用。按操作顺序形成抗体夹心结构后，加入TMB底物，板孔液体由无色变成蓝色，再加入终止液液体变为黄色。颜色的深浅和样品中的表皮生长因子(EGF)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(0D值)，计算样品液度，结果如图8所示。
VEGF-A，血管内皮生长因子A(VEGF-A)在细胞上清液中都能检测到。往预先包被血管内皮生长因子A(VEGF-A)抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的血管内皮生长因子A(VEGF-A)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(0D值)，计算样品液度，结果如图8所示。
实施例3
检测破伤风类毒素疫苗对于高糖环境下肾小管上皮细胞是否具有保护作用。
一、实验材料
肾小管上皮细胞(HKC)、培养基(DMEM；Invitrogen，加利福尼亚州，美国)、10％胎牛血清(FBS；Invitrogen)、破伤风类毒素(成都欧林生物科技股份有限公司：吸附破伤风疫苗)、无水葡萄糖、PBS溶液、
二、实验方法
1、肾小管上皮细胞(HKC)的培养
HKC在含有10％胎牛血清培养基中以含有5％ CO2的37℃加湿培养箱中进行培养。
2、细胞处理
将HKC分为如图9所示的4组，其中，
1)NC组为对照组，使用普通DMEM培养基2ml培育1天。
2)GT1组为实验组I，使用0.2g无水葡萄糖溶解于1ml PBS+1ml DMEM培养基培育2天。
3)GT2组为实验组II，使用0.2g无水葡萄糖溶解于1ml PBS+1ml DMEM培养基培育2天后，置换为DMEM培养基2ml培育1天。
4)TAT组为治疗组，使用0.2g无水葡萄糖溶解于1ml PBS+1ml DMEM培养基培育2天后，置换为破伤风类毒素0.05IU+2ml DMEM培养基培育1天。
三、实验结果
1、细胞迁移实验
使用细胞划痕实验来检测在不同环境下血管内皮细胞24小时的迁移能力，结果如图10所示，对照组(NC)的细胞迁移率达到了58％，高糖处理组(GT1/2)与TAT治疗组的细胞迁移率均低于20％，证实了破伤风类毒素并没有促进高糖环境下肾小管上皮细胞的迁移能力。
2、蛋白印迹实验
BCL-2(B细胞淋巴瘤/白血病-2)基因，具有使细胞存活时间延长、抵抗细胞凋亡等功能。现有研究表明，BCL-2是调控细胞凋亡的关键蛋白之一。当HKC暴露于短暂高糖环境下后，BCL-2的mRNA和蛋白表达显著下降，结果如图11所示，其中经过TAT治疗后，BCL-2表达量并未上调。
BAX是一个关键的促细胞凋亡蛋白，在调控线粒体凋亡途径中发挥着不可或缺的作用。正常情况下，BAX是以单体形式静存于细胞基质中。当细胞接收到凋亡信号后，BAX会被激活并在线粒体膜中形成多聚体孔洞，释放细胞色素C，从而起动凋亡程序。当HKC暴露于短暂高糖环境下后，BAX的mRNA和蛋白表达显著上调，结果如图11A与图12所示，其中经过TAT治疗后，BAX表达量并未下降。
3、Edu免疫荧光细胞增殖检测
Edu是一种胸腺嘧啶核苷类似物，它们能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在复制的DNA分子，然后分别利用免疫荧光技术、与Apollo荧光染料特异性反应检测细胞增殖情况。结果如图13所示，高糖处理组的HKC增殖情况显著低于对照组，然后经过破伤风类毒素的处理，HKC增殖情况并没有变化。
4、流式细胞术
将5×104个细胞悬浮在1×Binding Buffer中，加入10μl Annexin V-fitc和PI培养15min，流式细胞仪将凋亡细胞计数为Annexin V+/PI-和Annexin V+/PI+染色细胞(BDBiosciences)。结果如图14所示，高糖环境下细胞的凋亡率约为20％，经破伤风类毒素培育后的细胞凋亡率并未见明显改变，可见破伤风类毒素不能使HKC的细胞凋亡率降低。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (9)

1.破伤风类毒素在制备用于治疗高糖或缺氧导致的脐带间充质干细胞损伤的药物组合物中的应用，所述治疗包括提高脐带间充质干细胞增殖能力、降低脐带间充质干细胞凋亡率。
2.如权利要求1所述的应用，所述药物组合物制备后通过局部接触施用。
3.如权利要求1所述的应用，所述药物组合物制备后通过口服施用、栓剂施用、静脉施用、腹腔施用、肌肉施用、病灶内施用、鞘内施用、鼻内施用或皮下施用。
4.如权利要求1所述的应用，所述药物组合物还包括提升破伤风类毒素治疗功能的辅助材料。
5.如权利要求4所述的应用，所述辅助材料为药学上可接受的辅助材料，具体包括佐剂。
6.如权利要求4所述的应用，所述辅助材料为药学上可接受的辅助材料，具体包括赋形剂。
7.如权利要求4所述的应用，所述辅助材料为药学上可接受的辅助材料，具体包括载体、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、着色剂、增味剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、pH 调节和/或缓冲剂、溶剂或乳化剂。
8.一种非治疗目的保护体外脐带间充质干细胞的方法，所述方法包括在高糖或缺氧条件下培养的脐带间充质干细胞的培养体系中添加治疗有效量的破伤风类毒素的步骤。
9.一种体外非治疗目的的促进脐带间充质干细胞增殖能力、降低脐带间充质干细胞凋亡率的方法，所述方法包括如下步骤：使用有效量的破伤风类毒素或包括有效量破伤风类毒素的药物组合物，处理脐带间充质干细胞。
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