CN117321187A - 用于可编程组织和器官生物制造的功能性分级生物材料结构 - Google Patents

用于可编程组织和器官生物制造的功能性分级生物材料结构 Download PDF

Info

Publication number
CN117321187A
CN117321187A CN202280035436.7A CN202280035436A CN117321187A CN 117321187 A CN117321187 A CN 117321187A CN 202280035436 A CN202280035436 A CN 202280035436A CN 117321187 A CN117321187 A CN 117321187A
Authority
CN
China
Prior art keywords
biomaterial
lattice
structures
substrate module
substructures
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280035436.7A
Other languages
English (en)
Inventor
D·卡里昂
F·图洛莫西斯
R·常
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Stevens Polytechnic Board Of Directors
Original Assignee
Stevens Polytechnic Board Of Directors
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Stevens Polytechnic Board Of Directors filed Critical Stevens Polytechnic Board Of Directors
Publication of CN117321187A publication Critical patent/CN117321187A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/14—Scaffolds; Matrices
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B33—ADDITIVE MANUFACTURING TECHNOLOGY
    • B33Y—ADDITIVE MANUFACTURING, i.e. MANUFACTURING OF THREE-DIMENSIONAL [3-D] OBJECTS BY ADDITIVE DEPOSITION, ADDITIVE AGGLOMERATION OR ADDITIVE LAYERING, e.g. BY 3-D PRINTING, STEREOLITHOGRAPHY OR SELECTIVE LASER SINTERING
    • B33Y50/00—Data acquisition or data processing for additive manufacturing
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B33—ADDITIVE MANUFACTURING TECHNOLOGY
    • B33Y—ADDITIVE MANUFACTURING, i.e. MANUFACTURING OF THREE-DIMENSIONAL [3-D] OBJECTS BY ADDITIVE DEPOSITION, ADDITIVE AGGLOMERATION OR ADDITIVE LAYERING, e.g. BY 3-D PRINTING, STEREOLITHOGRAPHY OR SELECTIVE LASER SINTERING
    • B33Y80/00—Products made by additive manufacturing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C12M21/08—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for producing artificial tissue or for ex-vivo cultivation of tissue
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B33—ADDITIVE MANUFACTURING TECHNOLOGY
    • B33Y—ADDITIVE MANUFACTURING, i.e. MANUFACTURING OF THREE-DIMENSIONAL [3-D] OBJECTS BY ADDITIVE DEPOSITION, ADDITIVE AGGLOMERATION OR ADDITIVE LAYERING, e.g. BY 3-D PRINTING, STEREOLITHOGRAPHY OR SELECTIVE LASER SINTERING
    • B33Y10/00—Processes of additive manufacturing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/04—Mechanical means, e.g. sonic waves, stretching forces, pressure or shear stimuli

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Prostheses (AREA)

Abstract

用于干细胞增殖的生物材料结构包括至少一种晶格子结构，以及其中生物材料结构的一个或多个几何特征在三维空间中沿生物材料结构的至少一个维度变化的结构梯度。在一些实施方式中，结构梯度由具有至少一个不同的几何参数的第一和第二晶格子结构实现。

Description

用于可编程组织和器官生物制造的功能性分级生物材料结构
背景技术
干细胞是未特化细胞，其可以通过多次细胞分裂进行自我复制(例如，增殖)，同时保持未特化，或者可以分化为组织或器官特异性细胞，如神经、血液、脂肪和心肌细胞。干细胞在生命早期和生长过程中分化成不同的细胞类型，以及用于修复和替换患病的、受损的或破损组织的细胞。
有两种干细胞：1)胚胎干细胞(来自人类胚胎)，其可以保持一年或更长时间未分化；和2)成体干细胞(称为体细胞，即身体的细胞，并且不是精子、卵子、胚芽的细胞)。成体干细胞被发现存在于许多器官和组织的干细胞生态位中，并且通常在其生态位中保持多年未分化，仅当它们主要由组织损伤或疾病促使时，才增殖和分化。例如，骨髓含有分化形成所有类型的血细胞(例如，B淋巴细胞、T淋巴细胞、红细胞、中性粒细胞、天然杀伤细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞和单核细胞)的造血干细胞，以及分化为骨(成骨细胞和骨细胞)、软骨(软骨细胞)、脂肪(脂肪细胞)的骨髓基质干细胞(间充质干细胞或骨骼细胞)，以及支持血液形成的基质细胞。在大脑中发现的干细胞可分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元。一些特化人类成体细胞也可在基因重编程后转化为多能干细胞。成体干细胞可潜在地被定向分化(或“转分化”)成不相关的细胞类型(例如，皮肤干细胞被定向分化为血细胞，或血液形成细胞被定向分化为心肌细胞)。
成体干细胞可以从患者或从其他捐献者的身体中、从羊水中取出，或者可以从胚胎干细胞和诱导多能细胞(iPS细胞)的定向分化中获得。成体干细胞可以以不同的方式(取决于组织)从身体中分离。例如，造血干细胞可从捐献者的骨髓中、从婴儿出生时从脐带中的血液中或者从人的循环血液中取出。间充质干细胞(其可以制造骨、软骨、脂肪、纤维结缔组织和支持血液形成的细胞)也可从骨髓中分离。神经干细胞(其形成大脑的三种主要细胞类型)可从大脑和脊髓中分离。心脏干细胞可从心脏中收获。
羊水含有胎儿细胞(即由胎儿产生的细胞)，包括胎儿的间充质干细胞。在妊娠期间偶尔抽取羊水，通常用于羊膜腔穿刺术，即检测染色体缺陷。这种抽出的羊水可用于分离胎儿间充质干细胞。
胚胎干细胞和诱导多能细胞(iPS细胞)可用于产生各种类型的成体干细胞。
使用人类干细胞的实验室研究可被采用作为研究疾病的发展和出生缺陷以及筛选新药的模型系统。可以在从人类多能细胞系产生的分化细胞和疾病模型上测试新药的安全性。例如，癌细胞系可用于筛选潜在的抗肿瘤药物。为了有效地筛选药物，当比较不同药物时，筛选条件必须相同。当使用干细胞时，需要控制干细胞分化为在其上将要测试药物的特定细胞类型。然而，缺乏对控制分化的信号的知识，并且目前在工业上不可能以如此精确的方式模拟细胞培养条件，从而获得纯的分化细胞群并将其用于每种被测试的药物。
通常，干细胞被转移到含有营养物质(即培养基)的培养皿中。当细胞分裂和扩散(即增殖)以覆盖培养皿的表面时，它们被移除并接种到新鲜的培养皿中，其中每个增殖周期称为“传代”。
为了鉴定成体干细胞，用分子标志物标记活组织中的细胞，然后确定它们产生的特化细胞类型。为了有用，获得的成体干细胞应能够增殖以产生一系列在遗传上相同的细胞(即“保留其干性”)，然后其可以被定向分化为其他细胞类型，以便它们可被移植用于组织修复。
干细胞需要定期进行表征，以确保它们保持未分化。这可以使用不同的方法完成，所述方法包括显微镜检查、转录因子(包括Nanog和Oct4)的确定、细胞表面标志物的表征、或将细胞注入到具有抑制的免疫系统的动物内以跟踪它们在体内的分化。为了确定细胞是否保持其多能性，可以操纵细胞进行分化(即，经由改变培养基的组成、修饰培养皿表面以及通过插入特异性基因修饰细胞来定向分化)。此外，可以通过允许细胞聚集在一起形成胚状体来定向细胞自发分化。
如果干细胞在培养基中增殖超过六个月而没有分化(多能干细胞)，它们形成可以冷冻、运输、解冻并用于研究或移植的干细胞系。然而，可不仅需要增殖，而且还需要引导定向干细胞的分化，以便它们可以被移植到体内以治疗损伤或患病的组织。
事实上，人类干细胞的一个潜在应用是产生可用于基于细胞的疗法的细胞和组织。今天，捐献的器官和组织通常用于替换受损或患病的组织。但此类捐献的器官和组织的可得性非常有限。被定向分化成特定细胞类型的干细胞为治疗包含以下的疾病提供了替代细胞和组织的可再生资源的可能性：黄斑变性、脊髓损伤、中风、烧伤、心脏病、1型糖尿病、骨关节炎、类风湿性关节炎等。
捐献的器官和组织的挑战之一是移植后排斥的可能性。这是与非自体(即捐献者和患者不同)的基于细胞的疗法相关的主要问题。克服免疫排斥需要持续施用免疫抑制药物，这些药物具有显著的副作用。然而，使用成体干细胞和来源于患者自身成体干细胞的组织的能力将显著降低被患者免疫系统排斥的可能性。例如，从羊水中收获的胎儿间充质干细胞可用于为患有出生缺陷(诸如，先天性膈疝)的婴儿生长新组织。这些组织在基因上与婴儿相匹配，因此可能不会被免疫系统排斥，并且可以在子宫内植入或在婴儿出生后植入。
不幸的是，成体干细胞在成熟组织中不是很多，并且因此分离和收获它们是挑战。而且，不同于胚胎干细胞，成体干细胞在身体外分裂的能力是有限的。因此，找到能够使培养基中大量成体干细胞增殖的方法是挑战。将干细胞在身体外保持未分化状态，直到被定向分化也是挑战。因此，定向成体干细胞分化成特定的细胞类型，以便它们可用于再生医学也是挑战。因此，这样做的能力将标志着再生医学和治疗的进展中的显著成就。
概要
根据本公开的实施方式，用于干细胞增殖的生物材料结构包括至少一种晶格子结构，并且具有结构梯度，其中生物材料结构的一个或多个几何特征在三维空间中沿生物材料结构的至少一个维度变化。至少一种晶格子结构可包含至少第一和第二晶格子结构。以及生物材料结构的结构梯度可通过具有至少一个不同的几何参数的第一和第二晶格子结构来实现。
在一些实施方式中，至少一种晶格子结构、第一和第二晶格子结构或生物材料结构可由直径为约10微米至约100微米的细丝构成。
根据实施方式，至少一种晶格子结构、至少第一和第二晶格子结构、或生物材料结构可包括组装成第一生物材料基材模块的第一多个晶格子结构；以及组装成第二生物材料基材模块的第二多个晶格子结构，并且第一和第二生物材料基材模块可被组装成多模块生物材料基材。第一生物材料基材模块的第一多个晶格子结构的至少两个可具有至少一个不同的几何参数。第二生物材料基材模块的第二多个晶格子结构中的每一个都可具有相同的几何参数。在一些实施方式中，第一生物材料基材模块的第一多个晶格子结构中的每一个可具有相同的几何参数，第二生物材料基材模块的第二多个晶格子结构的每一个可具有相同的几何参数，并且第一生物材料基材模块的第一多个晶格子结构和第二生物材料基材模块的第二多个晶格子结构具有至少一个不同的几何参数。
在一些实施方式中，至少一种晶格子结构、至少第一和第二晶格子结构、或生物材料结构可包含组装成第一生物材料基材模块的第一多个晶格子结构，以及第二晶格子结构，并且第一生物材料基材模块和第二晶格子结构可组装成多模块生物材料基材。第一生物材料基材模块的第一多个晶格子结构中的至少两个可具有至少一个不同的几何参数。第一生物材料基材模块的第一多个晶格子结构中的每一个都可具有相同的几何参数。
根据一些实施方式，制备生物材料结构的方法被设计为生长模拟天然组织形成或天然器官结构的特定组织形成或器官结构，其包括从数据库中生成生物材料结构的数字模型，该数据库将预测的细胞分化类型或预测的长期组织结构与具有特定几何参数的晶格子结构相关联。该数字模型包括：至少一种晶格子结构，其具有根据需要由数据库识别为形成模拟天然组织形成或天然器官结构所需的每种组织类型的结构梯度，该结构梯度使得生物材料结构的一个或多个几何特征在三维空间中沿生物材料结构的至少一个维度变化；和/或晶格子结构的组合，其根据需要由数据库识别为形成模拟天然组织形成或天然器官结构所需的每种组织类型。方法进一步包括使用数字模型构建或打印生物材料结构。
在一些具体实施方式中，数字模型可包含至少一种具有结构梯度的晶格子结构、不同晶格子结构的组合、不同生物材料基材模块的组合、或至少一种晶格子结构和至少一种生物材料基材模块的组合。
根据一些实施方式，使用数字模型构建或打印生物材料结构包括使用数字模型作为指令或模板3D打印生物材料结构。在一些实施方式中，使用数字模型构建或打印生物材料结构包括使用数字模型作为指令或模板手动连接或组装生物材料结构。
在本公开的一些实施方式中，在生物材料结构上调整早期单细胞形状的方法包括改变生物材料结构的物理特性以引导长期组织功能，其中早期单细胞形状是在细胞接种后24小时形成的单细胞形状。根据一些实施方式，改变生物材料结构的物理特性包括赋予生物材料结构以结构梯度，其中生物材料结构的一个或多个几何特征在三维空间中沿生物材料结构的至少一个维度变化。
在一些具体实施方式中，生物材料结构包括至少一种晶格子结构，并且生物材料结构的物理特性的变化包括赋予至少一种晶格子结构以结构梯度，其中晶格子结构的一个或多个几何特征在三维空间中沿至少一个维度变化。在一些实施方式中，至少一种晶格子结构或生物材料结构可包含至少第一和第二晶格子结构。生物材料结构的结构梯度可通过具有至少一个不同的几何参数的第一和第二晶格子结构来实现。在一些实施方式中，至少一种晶格子结构、第一和第二晶格子结构或生物材料结构可以由直径为约10微米至约100微米的细丝构成。
在一些实施方式中，至少一种晶格子结构、至少第一和第二晶格子结构、或生物材料结构可包括组装成第一生物材料基材模块的第一多个晶格子结构，以及组装成第二生物材料基材模块的第二多个晶格子结构，并且第一和第二生物材料基材模块可组装成多模块生物材料基材。第一生物材料基材模块的第一多个晶格子结构的至少两个可具有至少一个不同的几何参数。第二生物材料基材模块的第二多个晶格子结构中的每一个可具有相同的几何参数。
在一些实施方式中，第一生物材料基材模块的第一多个晶格子结构中的每一个可具有相同的几何参数，第二生物材料基材模块的第二多个晶格子结构中的每一个可具有相同的几何参数，并且第一生物材料基材模块的第一多个晶格子结构和第二生物材料基材模块的第二多个晶格子结构可具有至少一个不同的几何参数。
根据一些实施方式，至少一种晶格子结构的每一个、至少第一和第二晶格子结构、或者生物材料结构可包含组装成第一生物材料基材模块的第一多个晶格子结构、以及第二晶格子结构，并且第一生物材料基材模块和第二晶格子结构可组装成多模块生物材料基材。
在一些实施方式中，第一生物材料基材模块的第一多个晶格子结构中的至少两个可具有至少一个不同的几何参数。并且在一些实施方式中，第一生物材料基材模块的第一多个晶格子结构中的每一个可具有相同的几何参数。
附图的简要说明
当结合附图考虑时，参照详细的说明书将更好地理解本公开的这些和其它特征和优点，其中：
图1是描绘根据本公开的实施方式将晶格子结构几何形状与细胞表型和组织类型相关联的数据库的构建的示意图。
图2A是阐释根据本公开的实施方式组装或连接三种不同晶格子结构以形成异质生物材料基材模块的示意图；
图2B-2D是根据本公开的实施方式由图2A中描绘的晶格子结构构建的不同生物材料基材模块的示意图。
图3A是阐释根据本公开的实施方式组装或连接六种不同晶格子结构以形成多模块生物材料基材的示意图；
图3B是阐释根据本公开的实施方式由图3A的晶格子结构构建的多模块生物材料基材的示意图。
图4是描绘根据本公开的实施方式由异质生物材料基材模块构建“界面组织”的示意图。
图5是阐释复杂天然组织形成的示意图，所述复杂天然组织可潜在地用作构建多模块生物材料基材(例如，根据本公开的实施方式使用晶格子结构和生物材料基材模块)的模型，用于根据本公开的实施方式模拟天然组织形成的组织的生长和形成。
图6A是阐释根据本公开的实施方式的熔融电写装置的示意图；
图6B是描绘根据本公开的实施方式的定制制造系统的示意图。
图7是描绘图6的定制制造系统的热图的屏幕截图图像和相关数据展示。
图8是图6的定制制造系统的一部分的摄影图像的复制图。
图9是图6的定制制造系统的操作摄氏温度作为尖部与集电极之间的距离的函数的图。
图10是阐释根据本公开的实施方式提出的加热元件的示意图。
图11是阐释根据本公开的实施方式的聚合物熔融供应和自由流动体系(regime)中的关键热传递机制的示意图。
图12-16是一组摄影图像的复制图，其显示了通过根据本公开的实施方式的方法由聚(己内酯)(“PCL”)熔融制成的支架，根据本公开的实施方式该支架具有不同的配置，并且图14的支架具体为编织支架。
图17和图18是摄影图像的复制图，以及各自放大的子图(图17A和18A)，其显示了通过根据本公开的实施方式的方法由PCL熔融制成的纤维支架，该支架具有含有不同的多孔微架构的编织配置。图21的支架具有MEW I 0-90°配置，并且支架D具有MEW I 0-45°配置。
图19是根据本公开的实施方式提供细胞分类方法的概述的示意图。
图20是根据本公开的实施方式的特征提取算法的流程图。
图21-24是一组摄影免疫荧光图像的复制图，其显示了通过根据本公开的实施方式的方法在干细胞扩增期间观察到的细胞结构，其中图21是通过组合三种不同的单通道最大投影获得的灰度多通道最大投影图像，该单通道最大投影通过处理Z-stack原始图像获得，其中红色通道与细胞骨架相关，蓝色通道与细胞核相关，以及绿色通道与粘着斑蛋白相关。图22是红色通道细胞体图像与分割的细胞体的轮廓叠加的灰度最大投影，图23是蓝色通道图像与分割的细胞核的轮廓叠加的灰度最大投影，以及图24是绿色通道图像与分割的焦点粘附的轮廓叠加的灰度最大投影(比例尺：20μm)。
图25-33是使用根据本公开的实施方式的方法对免疫荧光图像进行单细胞自动生物图像分析的特征提取程序的实施例的图解阐释，其提供了根据本公开的实施方式的自动图像处理算法工作流程的性能的演示，该工作流程使用在3-D微型纤维支架中培养的代表性细胞。图25-33阐释根据本公开的实施方式的算法程序，该算法程序允许开发关键的细胞和亚细胞焦点粘附形态和分布指标，这些形态和分布指标用于根据本公开的实施方式将所开发的分类方法训练和应用于各种细胞类型。
图34-39呈现了图形实施例(图34、36和38)和混淆矩阵(图35、37和39)，其阐释了根据本公开的实施方式对不同支架几何形状的分类方法的使用，以及干细胞在支架内在扩增过程中的受限状态，图形实施例和混淆矩阵记录了细胞和亚细胞粘附蛋白的不同的几何形状(对于在分析下的所有细胞>100)的变化，并证明了根据本公开的实施方式的新型3-D基材架构诱导均匀的和几何依赖的细胞形状和产生的表型，相反，在平面上或具有随机取向纤维的非编织2-D网格上的对照干细胞培养物诱导异质细胞形状，推测诱导表型异质性；和
图40是根据本公开的实施方式的分类方法的工业开发概念的示意图，进一步包括用于具有表型的干细胞的可编程扩增和收获的反馈和前馈控制方法，所述表型通过根据本公开的实施方式的方法被靶向和实现。
详细描述
组织工程和再生医学研究中的关键挑战是如何通过设计具有细胞指导的(cell-instructive)微环境的体外模型来将干细胞的分化定向至特定的命运。生长因子和基质分子的特异性配体-受体相互作用对于调节细胞是重要的。已经采用了各种地形图案技术来在二维平面上图案化生物活性分子。除此之外，微流体技术已被采用以通过已知为趋化性的过程应用动态化学梯度。此外，局部微环境的物理特性(诸如基质微环境的弹性)也可通过已知为趋硬性(durotaxis)的过程在决定细胞功能和命运中发挥关键作用。通过改变基材的刚度，人类间充质干细胞可以沿神经元、肌肉或骨骼谱系被定向。为此，具有严格控制趋化性和趋硬性微环境的2D体外模型可被用作研究干细胞分化的控制的工具。考虑到围绕生物制剂和药物的严格调控途径，在三维(3D)生物材料结构内的物理信号梯度(类趋硬性)的设计具有巨大的临床应用潜力，其产生的治疗/生物学功能源于化学信号。
可以制造在生物刺激器的分布中包含系统梯度的组织工程基材。例如，如C.Erisken、D.M.Kalyon和H.Wang，“Functionally and continuously gradedelectrospun polycaprolactone andβ-tricalcium phosphate nanocomposites forinterface tissue engineering applications”，Biomaterials 29,4065-4073(2008)(如下所述其全部内容通过引用并入本文)中所讨论的，使用混合双螺杆挤出和静电纺丝方法，两种生物活性剂的浓度分布(例如，胰岛素和β-甘油磷酸)可在纳米纤维基材的两侧之间同时变化(例如，一个增加；另一个单调减少)，以生成例如胰岛素(软骨分化的刺激物)和例如β-甘油磷酸盐(β-GP)(用于矿化作用)的梯度。C.Erisken、D.Kalyon、C.Ornek、H.Wang和J.Xu，“Osteochondral tissue formation through adipose-derived stem celldifferentiation using biomimetic tissue scaffolds with graded stimulatorconcentrations”，Tissue Engineering:Part A,17,9,1239-1252(2011)，如下所述其全部内容通过引用并入本文。当分级的聚(己内酯)网格接种人脂肪来源的基质细胞并培养超过8周时，所得的组织结构揭示了人脂肪来源的基质细胞选择性分化为软骨形成谱系和矿化，作为相应浓度的胰岛素和β-GP的结果的位置函数。干细胞的软骨分化在富含胰岛素的位置增加，并且矿化在富含β-GP的位置增加。应该注意的是，梯度是使用不同的生物活性分子产生的，其浓度是系统地变化的。此外，基材是具有随机“不规则”结构的纤维网格。
还可以在具有晶格微架构的精密制造的3D生物材料支架上通过单细胞形状操纵，从骨髓中均匀地引导间充质干细胞的干性。Tourlomousis等人，标题为“Integratedmethods for precision manufacturing of tissue engineering scaffolds”的美国专利申请号15/998,685(现为2021年8月3日授权的美国专利号11,078,459)(转让给与本申请相同的受让人)，如下所述其全部内容通过引用并入本文。正如Tourlomousis中所讨论的，获得的细胞形状的均匀性和形态特征与指定底层细胞培养平台的晶格微架构的几何特征的均匀性和尺度是因果相关的。这些几何特征的非限制性实例包括细丝规格，以及由细丝间距离和细丝取向参数限定的孔规格。并且Tourlomousis公开了用于精确控制具有细胞相关几何特征尺寸的3-D支架的多孔微架构的方法，从而提供了对扩增的干细胞的形状和表型的控制。这些方法结合了熔融静电纺丝和增材制造，并且可用于制造具有无与伦比的几何保真度和精度的支架网格，包括具有一致纤维直径、取向、排列和互联性的纤维架构。
根据本发明的一些实施方式，干细胞形状和组织形成(包括，例如器官结构)可以通过定制(tailoring)干细胞在其上生长的3-D基材的几何形状来操纵、预测或控制。这可以提供形状驱动的途径来控制干细胞的表型(例如，细胞形态和细胞特异性功能)。具有几何特征(例如，细丝和/或孔规格)的晶格子结构具有与单个典型真核细胞相同的尺寸尺度(例如，10-100微米或10-20微米)，使细胞能够形成对晶格子结构的定向粘附，这允许通过调整(或定制)晶格子结构的几何形状来控制所得的细胞形状。根据本公开的实施方式，然后可组合这些晶格子结构以形成具有在三维空间中跨越不同方向的分级的几何形状的更复杂的支架(或生物材料结构)，使得能够形成不同的组织类型和组织形成(包括，例如，器官结构)。这些分级的几何形状在本文中也被称为“结构梯度”，并且与现有的传统类趋硬性刚度梯度相比，它们是独特和新颖的。事实上，根据本公开的实施方式的结构梯度，通过用户设计的几何特征来调节生物功能，这些几何特征在打印或制造过程期间自动实现。相比之下，传统的刚度梯度使用固有的材料刚度特性来调节细胞反应，这是原材料的分子结构的结果，并且可以通过包括填料或诱导光和/或化学交联途径的分子来调节。在一些实施方式中，例如，根据本公开的实施方式的结构梯度是通过修改或调整细丝的物理、几何特征(例如，细丝直径)及其相对于彼此的间距(例如，细丝间距离和细丝取向)来赋予的，其从而调整或修改晶格子结构(或晶格子结构的特定区域)的多孔微架构。并且通过在晶格子结构的不同区(或区域)(或通过将多个不同的晶格子结构连接在一起)来调整这些几何特征，可以创建其中一个或多个几何特征在三维空间中沿至少一个维度变化的结构梯度。
根据本公开的实施方式，并参照图2B-2D和3B，异质生物材料基材模块100具有功能分级的几何形状，其可以被定制以实现所期望的细胞形状和/或长期组织形成。这些功能分级的异质生物材料基材100可以使用可编程多模态组织制造数据库来构建，并且可包括多个不同的晶格微架构(本文中也可互换地称为“晶格子结构”)110。例如，根据本公开的实施方式的异质生物材料基材模块100可包括多个连接在一起并具有至少一个不同的几何晶格参数(例如，纤维直径、纤维间距和/或层间角)的晶格子结构110。
此外，在一些实施方式中，多个异质生物材料基材模块100可以组合(或连接)以形成多模块生物材料基材200，其可用于使用单个支架(或结构)来形成多种组织类型。然而，在一些实施方式中，多模块生物材料基材200可包括多个不同的均质生物材料基材模块(例如，在图3B中显示为100b、c和d)，或异质和均质生物材料模块的任意组合。如本文其他地方所讨论的，不同均质模块的组合或均质模块与至少一种异质模块的组合(例如，如图3B中所示)可产生具有结构梯度和多种组织类型的复杂组织形成(包括，例如，器官结构)。如本文中使用的，术语“异质生物材料基材模块”指的是包括多个晶格子结构的生物材料基材模块，其中至少两个具有不同的晶格几何形状(如该术语在本文中的定义)。此类异质生物材料基材模块的示例在图3B中显示为100a。相反，术语“均质生物材料基材模块”指的是包括具有相同(或基本上相同)几何形状的多个晶格子结构的生物材料基材模块。均质生物材料基材模块的实例在图3B中显示为100b、100c和100d。如本文中使用的，术语“基本上”用作为近似的术语，并且不是程度的术语，并且旨在解释测量和测量方法的固有差异。例如，在该上下文中，“基本上相同”指的是几何形状在可接受的测量误差水平内相同，诸如例如，由两个晶格子结构产生的细胞表型没有有意义的差异。
有助于功能分级生物材料基材模块100的晶格子结构110可以通过任何合适的方法并使用任何合适的材料制造，而没有限制。例如，在一些实施方式中，晶格子结构110可使用Tourlomousis等人，标题为“Integrated methods for precision manufacturing oftissue engineering scaffolds”的美国专利申请号15/998,685(现为2021年8月3日授权的美国专利号11,078,459)(转让给与本申请相同的受让人)(其全部内容通过引用并入本文)中描述的方法、材料和尺寸/参数制造其。单个晶格子结构110也可以用任何合适的几何参数制造，也如Tourlomousis等人，标题为“Integrated methods for precisionmanufacturing of tissue engineering scaffolds”的美国专利申请号15/998,685(现为2021年8月3日授权的美国专利号11,078,459)(转让给与本申请相同的受让人)(其全部内容通过引用并入本文)中公开的。例如，如Tourlomousis等人，标题为“Integrated methodsfor precision manufacturing of tissue engineering scaffolds”的美国专利申请号15/998,685(现为2021年8月3日授权的美国专利号11,078,459)(转让给与本申请相同的受让人)(其全部内容通过引用并入本文)中公开的，细丝可以由聚合物、聚合物凝胶或混悬液，诸如，但不限于聚己内酯(其已获得联邦药物管理局批准用于体内应用)构成。
在一些实施方式中，晶格子结构可以根据Tourlomousis等人，标题为“Integratedmethods for precision manufacturing of tissue engineering scaffolds”的美国专利申请号15/998,685(现为2021年8月3日授权的美国专利号11,078,459)(转让给与本申请相同的受让人)(其全部内容通过引用并入本文)中描述的熔融电写方法，从与10微米同样小的细丝(以及较大的细丝，例如但不限于范围为10到100微米的细丝)制造。电写方法打印具有多孔、细网格状结构的晶格子结构，其几何特征通常与细胞本身具有相同的尺寸尺度，使细胞能够形成与晶格结构的粘附。如本文所述，这允许通过调整打印的晶格子结构的微架构(即，几何形状)来控制所得的细胞形状。熔融电写(MEW)技术在Tourlomousis等人，标题为“Integrated methods for precision manufacturing of tissue engineeringscaffolds”的美国专利申请号15/998,685(现为2021年8月3日授权的美国专利号11,078,459)(转让给与本申请相同的受让人)(其全部内容通过引用并入本文)中进行了详细描述。该方法是极细量度的3D打印形式，其使用电场“静电纺丝”来绘制具有约10至约100微米的直径的纤维，同时经由3D打印精确地控制晶格子结构的几何形状(即，晶格几何形状)。相比之下，传统的3D打印仅使用不小于150微米的细丝来产生具有精确地控制的几何形状的多孔晶格几何形状。
如Tourlomousis等人，标题为“Integrated methods for precisionmanufacturing of tissue engineering scaffolds”的美国专利申请号15/998,685(现为2021年8月3日公布的美国专利号11,078,459)(转让给与本申请相同的受让人)(其全部内容通过引用并入本文)中所讨论的，熔融电写(MEW)技术允许精确控制具有细胞相关的几何特征尺寸的3D支架的多孔微架构，其提供扩增干细胞的形状和表型的控制。这些方法使得能够以可再生的和工业上可扩展的方式生成期望类型的支架几何形状。在一些实施方式中，该技术结合熔融静电纺丝和增材制造。该制造方法(下文中称为“TCK方法”)的实施方式可用于制造具有无与伦比的几何保真度和精度的支架网格。TCK方法的实施方式可用于制造新型支架设计，例如涉及具有一致的纤维直径、取向、排列和互联性的0-90和0-45度(等等)纤维架构。
TCK方法可利用熔融静电纺丝书写(MEW)来制造集成支架。在一些实施方式中，选择聚(e-聚己内酯)(PCL)用于MEW，因为它被美国食品和药物管理局批准用于体内应用，并且因为它是生物相容性的，可长期生物降解的，并且具有相对低和宽的熔融加工温度窗口(60°-90℃)。可以不受限制地使用任何合适的聚己内酯。例如，在一些实施方式中，可以使用具有平均分子量为45,600g/mol且多分散性为1.219的材料规格的PCL。例如，可以从英国沃灵顿的Perstorp Ltd获得实例PCL(Capa6500)。然而，也可以理解的是可以使用任何合适的生物聚合物，并且本公开的内容不限于聚己内酯。
例如，在一些实施方式中，PCL颗粒可以在120℃下使用聚四氟乙烯表面和雕刻机(Carver press)之间的铝垫片被模制成8mm和25mm的圆形盘，用于后续的流变学表征。在一些实施方式中，这可以用Rheometric Scientific(现为TA Instruments)的先进流变扩展系统(ARES)与25mm直径的不锈钢平行盘夹具结合来实现，用于小振幅振荡剪切(SAOS)和稳态扭转流动实验。流变仪的力再平衡传感器能够同时测量法向力和扭矩。流变仪的烘箱温度被控制在±0.1℃内。流变学表征实验可以在70℃、80℃和90℃下，并使用恒定的1mm间隙(gap)进行。
在一些实施方式中，可以建立高分辨率的热辅助MEW系统配置。工艺设计可以通过对生物材料基材的热流变加工特性以及控制在研究下的过程的流体动力学、热传递和静电多物理场现象的详细表征来引导。整个系统配置可基于三种限定的离散工艺体系进行分析。
首先，聚合物熔融供应体系可以包括玻璃鲁尔锁5ml注入器(诸如，从Hamilton,Reno,NV购买可得的注入器)和粘附至其的带有塑料轮毂的不锈钢针尖(诸如，从McMasterCarr,Elmhurst,IL可获得的带有塑料轮毂的不锈钢针尖)。使用工业热风枪(例如，Steinel,HG 2510ESD)可使聚合物熔融保持在均匀的熔融状态。此外，可编程的注入泵(诸如，从Harvard Apparatus,Holliston,MA获得的注入泵)可垂直安装，并用于通过调节注入器内活塞的速度来设置体积流量(流动精度在0.25％以内，并且再生性在0.05％以内)。可用红外FUR热像仪(诸如，PM 290、Inframetrics、Thermacam)监测注入器筒和毛细管尖部两者的温度。在自由流动体系下，高压电源(可从Gamma High Voltage Research,OrmondBeach,FL获得合适的电源)可用于在针尖和接地导电集电极之间应用电压电位。铝集电极可安装在x-y可编程载物台上(诸如，从ASI Applied Scientific Instrumentation,Eugene,OR可获得的载物台)，该载物台依次安装在实验室插孔上(例如，从NewportCorporation,Irvine,CA获得的)(参见图6A、6B和7-11)。在尖部和集电极板之间的距离可以使用垂直数字仪表(图6A、6B和7-11)进行监测，并使用垂直定位分辨率为0.5mm的实验室插孔的旋转旋钮手动设置。为了补偿可能影响过程的环境条件，可以将整个系统配置放置在具有包含在有机玻璃壳内的旋转装置的防振光学工作台上。此外，可以使用配备K型热电偶的万用表(诸如，可从Extech Instruments,Waltham,MA获得的万用表)监测壳内的温度和湿度值。
加热元件可包含工业热风枪(HG)，该工业热风枪具有可控气流(QHG)(0.002-0.008m3/s)和可调节空气温度(THG)设置(49°-649℃)。热风枪可安装在加热通道的入口处，该加热通道由聚(甲基丙烯酸甲酯)构造的透明腔室容纳(图10)。注入器可以穿过加热通道，并且注入器针尖的一小部分可以通过覆盖在腔室的顶部(ceiling)处创建的圆形开口的导电带到达腔室内部。加热隔热带可应用到加热通道的后壁和底部(floor)上，以最小化少热损失。由带覆盖的圆形开口的区域可以保持紧密密封，以避免热流空气沿旋转线体系的干扰。
注入器的表面可由于经由热风枪产生的强制对流的热传递而被加热，沿旋转线的环境温度条件由通过加热带的自由对流决定。热传递条件可以被校正，以便将容纳PCL熔融的注入器的表面处的温度保持为所期望的温度。例如，可确定对于QHG＝0.0017m3/s的空气流量和THG＝132℃的空气温度，在注入器表面的温度(Ts)可以被设置并保持在78±1℃(图7)。使用FUR摄像机的热成像可以确认注入器的表面处的温度在整个时间进程中的变化不超出Ts±1℃。
沿旋转线坐标z的热电偶测量(图8)，其中z＝0mm可被视为在尖部下的测量点(Tt＝40±5℃)，并且z＝30mm可被视为集电极板的表面上的测量点(Tc＝30±5℃)，表明存在指数衰减的温度曲线(图9)。由于玻璃的高热导率和注入器筒中容纳的聚合物熔融的小体积，可以假定聚合物熔融(To)的温度等于Ts，并且系统在1h后达到热平衡。后者也可以通过在2小时的时间进程中设置热风枪之后定期测量稳定的旋转线温度曲线来确认。以该方式，可以避免可产生温度依赖的聚合物粘度的变化的沿工艺体系高于5℃温度梯度的存在，并且因此避免沿工艺体系的流场变化。
如Tourlomousis等人，标题为“Integrated methods for precisionmanufacturing of tissue engineering scaffolds”的美国专利申请号15/998,685(现为2021年8月3日授权的美国专利号11,078,459)(转让给与本申请相同的受让人)(其全部内容通过引用并入本文)所说明的，基于热风枪的系统能够在材料头部和旋转线温度曲线内保持均匀加热，其更高的端部可以被设置接近生物聚合物(此处为PCL)的起始结晶温度。该能力可以提供打印具有亚微米直径的排列纤维的替代方式，该方式通过调整旋转线温度以便通过延迟的“飞行中”纤维凝固来诱导长时间的拉伸。
在打印之前，将纯生物聚合物(例如，PCL)颗粒装载入玻璃注入器(例如，Hamilton)中。然后，可以将注入器放置在实验室对流烘箱中并加热24小时，以除去可能影响熔融静电纺丝纤维的工艺稳定性和下游结构成型性的任何气泡。在确保聚合物熔融的均质性之后，可以将规定标称值(nominal)内径(21号-0.514mm)的针尖适配到注入器上。然后可以将具有附接的尖部的注入器放置在系统的材料头部中，其可以与加热元件一起在温度(T表面＝77.8℃)下预热。在开始打印之前，可以给系统至少1h以达到热平衡。
根据本公开的实施方式，在电写工艺期间要使用的操作条件没有特别的限制，并且可以根据工艺参数的无量纲分析以及所得的生物可打印性数字进行选择，如Tourlomousis等人，标题为“Integrated methods for precision manufacturing oftissue engineering scaffolds”的美国专利申请号15/998,685(现为2021年8月3日授权的美国专利号11,078,459)(转让给与本申请相同的受让人)(其全部内容通过引用并入本文)。该过程在Chang等人，“Melt electrospinning writing process guided by a“Printability Number”,ASME Journal of Manufacturing Science and Engineering,139,081004-1-15(2017).doi:10.1115/1.4036348中被进一步描述。
例如，如Tourlomousis等,标题为“Integrated methods for precisionmanufacturing of tissue engineering scaffolds”的美国专利申请号15/998,685(现为2021年8月3日授权的美国专利号11,078,459)(转让给与本申请相同的受让人)(其全部内容通过引用并入本文)中所讨论的，可以使用经典的量纲分析技术从工艺和系统特定的独立参数开始进行相关无量纲组的识别。采用以下定义。“n”是与工艺相关的自变量的数量。“j”是在n个变量中找到的基本量纲的数量。“Y”是需要同时考虑的变量的数量。“k”是可以识别以描述工艺的独立π项的数量并且等于n-j(即k＝n-j)。
自变量的总数n等于12。下表1列举了这些变量及其基本量纲，其中M代表质量(SI单位：千克)，L代表长度(SI单位：米)，T代表时间(SI单位：秒)，θ代表温度(SI单位：开尔文)，A代表电流(SI单位：安培)。
这个基本量纲的数量等于5，其中j′＝{L，M，T，A，θ}。接下来，通过假设j＝j′并扫描不形成无量纲乘积的j重复变量来确定j。规定数量的五个
表1自变量以及基本量纲列表：j＝{L，M，T，A，θ}
自变量导致以下自变量)＝{d，Q，Vp，Tl，y}。因此，可形成的独立无量纲π项的数量等于k＝n-j＝12-5＝7。以下步骤由πi，i＝1，2...7项组成。每项通过形成j重复变量与附加变量的幂乘积而形成。
P1项形成所遵循的程序如方程(1)所示：
(1)
然后，将各种量的量纲代入到方程(1)中，如方程(2)所示：
(2)
为了获得无量纲参数π，每个指数M、L、T等都需要变为零，从而产生线性代数方程组，方程(3)-(7)：
(3)a1+a2-3a3＝0
(4)-a3+a5＝1
(5)-2a2+4α3-2a5＝-1
(6)2a3＝0
(7)a4＝0
方程组的解决方案(方程(3)-(7))以及随后在方程(1)中的代入，产生无量纲项π1，如下表2所示。表2中所示的其余πi项的形成遵循相同的程序。因此，πi无量纲项的乘积组合可导致单个无量纲数π。
(8)Π＝Π1*Π2*...*Π7
表2无量纲πi，i＝1，2...，7项的列表：
代入表2中的每个单独的π项，产生下列无量纲π数，在本文中表示为N1：
(9)/>
为了将平移阶段速度UT作为独立参数解释，额外的无量纲组π8在方程(8)中用公式表示为另外的乘数：
(10)
产生下列N2项：
(11)
两个独立项N1和N2的公式和计算反过来使得能够分别在固定(UT＝0)和移动集电极(UT＞0)下进行工艺时，对可打印性进行研究。在前一种情况下，N1项是控制自由流动体系中聚合物熔融射流形成的独立工艺参数的函数。在后一种情况下，N2项额外考虑了平移阶段速度(UT)，这是一个定量影响接收基材上纤维形貌的工艺变量。可以肯定的是，初始N1项是为了确定自由流动体系中的平衡状态条件以确保稳定射流形成的初步程序步骤而限定的。在不存在该初步步骤的情况下，将N2直接应用于固定集电极可产生微不足道的为零的可打印性值。
接下来是一组无量纲化的方程，其使得能够识别可被调整为高效的可打印性的重要的无量纲组。
使用细丝近似法，并且通过聚焦于熔融静电纺丝稳定射流区域的一小部分，通过考虑影响射流剖面的各种力，可以得出一维动量平衡。射流受到以下影响：(a)库仑静电、粘性、弹性、表面张力和重力。假设沿从喷丝头的尖部往上到集电极的表面(距离，d)的路径轴对称，并使用表3中限定的特征量，可以使用下列无量纲方程的体系对熔融静电纺丝射流的动力学进行建模，其中R是射流半径除以仅在针尖外侧的特征射流半径Ro，v是射流速度除以特征速度vo，R是射流半径，并且质数表示相对于旋转线坐标z的导数：
A(1)质量守恒-连续性：
R2v＝1
A(2)动量守恒：
其中Re、Bo、Ca和Ep在表3中定义。
A(3)电荷守恒：
σ＝R
A(4)电场：
聚合物熔融的粘弹性是通过使用Giesekus模型来考虑的，该模型根据施加的变形来表示粘性聚合物应力τp，施加的变形由应变率张量γ表示。
A(5)
粘性聚合物应力τp表示材料由于在其变形过程中产生的法向应力而引起的弹性，并且应变率张量γ由速度梯度及其倒数之和给出。基于测试的测粘流动的每种类型的相应流变材料函数，通过拟合实验原始数据确定的Giesekus模型的输入参数如下：np表示聚合物粘度参数，λ弛豫时间，以及a流动因子，这是与组成聚合物分子上的各向异性布朗运动和/或流体动力阻力相关的参数。
粘性聚合物应力张量τp的无量纲组成(nondimensional components)是基于轴对称圆柱坐标中的本构Giesekus模型(方程(1))给出的：
A(6)
A(7)
使用上述方程计算的这些无量纲数在下表3中进一步总结。
表3基于控制方程获得的特征量以及非量纲数
打印工艺的启动需要：(a)液滴出现，(b)成功的泰勒锥形成，以及(c)随后出现带电射流，该射流在自由流动体系中静电吸引穿过旋转线坐标。所有现象都取决于施加在聚合物熔融射流上的力的相对重要性。
下游拉力(诸如引力和静电库仑力)分别与键(Bo)数和静电力参数(Ep)有关。上游阻力(诸如粘性、弹性和表面张力)与雷诺(Re)数、狄勃拉(De)数和毛细管(Ca)数有关。根据静电纺丝操作原理，当静电力克服毛细管力时，发生泰勒锥形成。聚合物熔融射流的射流起始和静电吸引强烈依赖于聚合物熔融的粘弹性。如果重力以及由射流-环境空气界面处的电荷的积累引起的静电拉力克服了施加于聚合物熔融上的粘性和弹性应力，则发生射流起始。因此，建议的可打印数应当假定由一组独立的材料、工艺和几何相关的参数限定的域内的值，打印工艺可在该域内实现。
可以基于可测量的聚合物特性和可控的工艺参数进行维度分析。与标准工程实践一致，简化的无量纲数可通过求出公式化无量纲数的乘积得出。例如，可基于上述详细描述的程序公式化七个无量纲组(π1，2...7)。为此，方程(9)给出的N1数可以被定义为固定式集电极的“可打印数”，并表示为NPR，1：
(12)
其中表示聚合物粘度的熔化温度依赖性，并且假设仅在针尖外侧的特征射流半径R0等于针尖直径。
Giesekus模型的材料函数可用于实验数据的非线性拟合和确定待加工的聚合物熔融的模型特定输入参数。对于在MEW加工过程中的特定PCL，在广泛的频率范围内，损耗模量G"(即，作为热量耗散的能量)的值已被显示高于储能模量G'(即，作为弹性能量存储的能量)的值。在线性粘弹性区域，即，在熔融静电纺丝书写工艺的相对低流量条件下(<50μL/h)会遇到相对小的应变和应变速率，聚合物熔融的剪切粘度可以被认为是牛顿粘度(即，零剪切粘度，)。达至剪切速率为10s-1，PCL的剪切粘度是恒定的。在线性粘弹性区域，熔融的单轴延伸粘度(即，特鲁顿粘度)等于牛顿(零剪切)粘度/>的三倍。
(13)ηp(Tm)＝3o(Tm)
将特鲁顿粘度代入到方程(12)中，产生下列可打印数NPR，1：
(14)
使用阿伦尼乌斯型方程拟合从三种不同熔融温度(Tm＝70、80和90℃)的流变数据中获得的零剪切粘度，以获得流动的活化能(ΔH/Rig)(SI:K)
(15)
其中ΔH是活化能(SI：J/mol)，Rig是通用气体常数(SI：J/K mol)，以及T参考是参考温度。将方程(15)代入到方程(14)中产生下列可打印数NPR,1的定义：
(16)
对于PCL的熔融范围(70℃≤Tm≤90℃)和一组规定的典型工艺和材料参数，可以使用方程(16)计算NPR，1。材料参数的值(总结在下表4中)来源于文献或通过拟合用于支架制造工艺中的PCL的流变数据。为了确保NPR假定值在有效域内，每个范围都是基于先前报道的研究确定的，其中PCL已通过MEW的方式成功处理，并且用目前公开的MEW系统进行验证。因此，对于21号针尖直径(Dt＝2·R0)、10mm至30mm的集电极距离(d)和施加的电压电位的范围(10kV≤VP≤15kV)，可应用一定范围的体积流量(25μL/h≤Q≤50μL/h)。
表4使用的PCL的材料特性
归一化的NPR，1是通过将计算的NPR，1值，除以限定由材料的熔融范围T参考＝70℃和Q最大＝50μL/h界定的可打印性窗口的下限的NPR，1值来获得。贮液器内的聚合物熔融的温度(T0)相对于参考温度(T参考＝70℃)进行归一化，即T*＝To/T参考。T*＝Tm/T参考，因为T0假定熔融温度值(Tm)。可打印性窗口被看出显著取决于体积流量，其中与在较大Q(50μL/h)处获得的NPR，1值相比，较小的Q值(25μL/h)产生显著更大的NPR，1值。该趋势与最近的现象学观察结果一致，这些观察结果反映了在低体积流量下通过MEW的方式进行稳定打印。随着每个可打印性窗口内T*增加，由于聚合物熔融粘度的阿伦尼乌斯温度依赖性，NPR，1呈指数增加，这意味着对于更高的熔融温度条件，可更有效地对材料进行静电纺丝。该关系表明，对于规定的Dt、Q和Vp设置，与接近材料熔融温度范围的较低端的熔融温度条件相比接近材料熔融温度范围的较高端(对于PCL，为90)的熔融温度条件使得能够更早地出现液滴，因为增加了针尖内侧体积流量。
NPR，1公式(方程(16))表明电场强度(Vp/d)和体积流量(Q)是对于高效可打印性(具有一致的量纲特征的纤维网格打印)的关键独立参数，前提是聚合物熔融供应体系中的熔融和环境条件以及自由流动体系中沿旋转线的温度曲线在每次打印事件过程中不被显著干扰。NPR，1量度为NPR,1～1/Q和NPR,1～Vp/d。这验证了衍生数的物理意义，该数表达了静电、粘性和惯性力对稳定静电纺丝条件的关键组合作用，如先前对于基于溶液的静电纺丝系统所证明的。此外，所有无量纲组都是Q依赖的惯性项的函数(参见上文表3)。因此，NPR，1和每个无量纲数之间的函数关系可对于规定的Q范围和跨越Vp范围的三个不同Vp值进行计算。结果可绘制为N*PR，1作为Re、Ca、De和Ep数的函数，其揭示了在规定的熔融条件后，可以为每个Vp设置限定一个独一无二的可打印性窗口。
除了可打印数外，还可优化或定制额外的工艺参数，以实现可接受或优化的打印。例如，正如Tourlomousis等人，标题为“Integrated methods for precisionmanufacturing of tissue engineering scaffolds”的美国专利申请号15/998,685(现为2021年8月3日公布的美国专利号11,078,459)(转让给与本申请相同的受让人)(其全部内容通过引用并入本文)中所讨论的，Vp和Q也可以被定制或优化。这些工艺参数的此类定制或优化可旨在消除在非平衡加工条件下观察到的扰动。例如，定制或优化后，可达到平衡状态，即一种在打印过程中下游拉力和上游阻力平衡的状态。
为了定制这些参数，作为第一步，可将集电极移动更接近针尖(例如，d＝15mm)以增加电场强度。当尖部到集电极的距离d≤10mm时，由于过量的电离空气分子和干燥的环境条件(湿度<25％)，可发生拱效应。在此类相对小的距离(d)下，对于≥15kV的施加的电压，拱效应可变得更加明显。通过减小距离(d)，更高的电场强度促进在尖部处拉伸收集的过量材料。然而，仅仅减小距离(d)可能不足以消除周期性扰动。为了进一步消除扰动并达到平衡条件，可能还需要减小体积流量(Q)。这可通过Q依赖的惯性力相对于Vp依赖的静电力的相对重要性来表明，如在方程(16)中表示的NPR,1公式所引导的。体积流量降低至Q＝25μL/h可导致在针尖正下方形成泰勒锥。然而，接近集电极板可发生混沌射流运动，并且可能无法实现稳定的射流。为了消除不稳定性并建立平衡状态条件，可将施加的电压电位降低到11.5kV，在30min的时间段内产生稳定的锥形射流形成，在此之后可开始打印过程，并且可打印晶格子结构。
然而，在一些实施方式中，除了定制或优化上述参数外，还可以调整或优化平移载物台速度以确定临界载物台速度(UCR)，在该临界阶段速度下，排列的纤维可沉积在平移集电极(translating collector)上。在较低的速度(例如，2-8mm/s)下，随机纤维沉积可产生非编织结构，其典型特征是具有多个融合点的重叠纤维。在中间平移速度(例如，8-83mm/s)下，可实现可重复的卷绕结构，其重叠的频率随着载物台速度的增加而单调降低。当平移载物台速度达到83mm/s时，可在集电极上打印平均直径Df＝23±1.5μm(微米)的良好排列的纤维。应该注意的是，平移载物台速度的变化可影响纤维的下拉(drawdown)，因此所产生的牵引力的变化可潜在地扰乱平衡条件，尤其是在UT＞＞UCR下。因此，平移载物台速度的优化可以与NPR,1的调整或优化一起进行。为此，UT可在维度分析中作为附加独立参数并入，并且当集电极移动时，可将导出的N2项(方程(11))作为可打印数。修改的可打印数表示为NPR，2，并且其最终形式可通过将NPR，1乘以π8项来获得。
(17)
将计算出的NPR,2值(基于方程(17))除以NPR,1值(基于方程(16))，可得到归一化的可打印数，其中N*PR,2，NPR,1值限定由材料的熔融范围T参考＝70℃和Q最大＝50μL/h界定的可打印性窗口的下限。对于每种纤维形式可计算出归一化的可打印数N*PR,2，其中当UT被调整到其临界值(UT＝UCR)时实现最佳可打印性。
随着这种设置和这些计算，可以制作交织的纤维网格用作生物支架(例如，晶格子结构)。具有编织和非编织结构的分层网格可使用各种N*PR，2设置来制造。具有“0-90度”和“0-45-135-90度”孔隙架构的编织网格可使用优化的和非优化的N*PR，2设置来制造。当N*PR，2未被优化时，可观察到不规则的结构。例如，这在图12中显示，该图是在N*PR，2＝31.9，其中UT＝25mm/s<UCR下获得的。当N*PR，2通过独立地调整载物台速度(UT＝85mm/s≥UCR)同时忽略自由流动体系中的平衡条件而增加到57.63时，可观察到具有可变平均纤维直径(Df＝27±14μm)的排列结构，如图13所示。在另一方面，可产生精确打印包括具有均匀平均直径(Df＝23μm±3.7μm)的良好排列的纤维的网格结构，用于N*PR，2＝106的最佳可打印数。在这种最佳可打印性设置下产生的纤维如图14-18所示，承载平衡状态条件的标志，随后在其临界值处对UT适当调整。
根据本公开的实施方式，晶格子结构可基于来自可编程多模块组织制造数据库的数据(如下进一步描述的)组装成生物材料基材模块100，以制造设计为产生所期望的细胞形状和/或长期组织形成的生物材料基材模块100。例如，具有至少一个不同的几何参数的多个不同的晶格子结构110可根据来自可编程的多模块组织制造数据库的信息来组装，以便创建设计为产生特定的细胞形状、细胞形状的组合、组织类型或组织类型的组合的生物材料基材模块100。类似地，多个不同的生物材料基材模块100可根据来自可编程的多模块组织制造数据库的信息来组装，以便创建设计为产生组织类型的特定组合的多模块生物材料基材200。这些生物材料基材模块100和多模块生物材料基材200可用于直接形成复杂的组织形成(包括，例如器官结构)，例如，如图4所示的“界面组织”(具有产生软组织例如软骨的一层，以及产生较硬的组织例如松质骨或皮质骨的第二层)，或多层组织形成，例如，在图5中(例如，产生内皮形成的内皮细胞层，即生成管腔状结构时血管内里的形成)，以及由干细胞分化成其它表型而获得的组织生成的用于肌肉和弹性膜的附加层)。
晶格子结构110可通过任何合适的手段或方法而不受限制来组装或连接以形成生物材料基材模块100。类似地，生物材料基材模块100可通过任何合适的手段或方法而不受限制来组装或连接以形成多模块生物材料基材200。然而，在一些实施方式中，晶格子结构110可根据以上描述的方法(以及在Tourlomousis等人，标题为“Integrated methods forprecision manufacturing of tissue engineering scaffolds”的美国专利申请号15/998,685(转让给与本申请相同的受让人)(其全部内容通过引用并入本文)中描述的方法)来制造(例如，打印)。这些晶格子结构110然后可以以任何方式组装或连接以形成生物材料基材模块100，并且生物材料基材模块100然后可组装或连接以形成多模块生物材料基材200。可替选地，可编程的多模块组织制造数据库可用于生成模板(或指令)，用于直接制造或打印生物材料基材模块100或多模块生物材料基材200，从而省去“组装”或“连接”多个晶格子结构110以形成生物材料基材模块100，或“组装”或“连接”多个生物材料基材模块100以形成多模块生物材料基材200的需要。通过这种方式，整个生物材料结构(即，具有多个晶格子结构或多个生物材料基材模块)可通过系统地改变打印(或制备)工艺的参数来无缝地实现，从而以连续、无缝的方式制造生物材料结构。
晶格子结构110、生物材料基材模块100和多模块生物材料基材200可具有任何三维形状，而不受限制。事实上，尽管在图2B-D和图3B中显示为通常的矩形或立方体形状，但本公开并不局限于此类形状，并且可以使用任何形状，例如，其它宏观形状，包括但不限于圆柱形、三角形、球形、曲线形状和抽象形状。
如上文一般性地所讨论的，可编程的多模块组织制造数据库可用于为生物材料基材模块100或多模块生物材料基材200创建模板。在一些实施方式中，例如，如图1中一般性地所示的，确定创建特定组织结构或形成所需的生物材料基材模块100或多模块生物材料基材200的结构的方法包括生成(或访问)晶格子结构数据库，以及从晶格子结构数据库中的信息和关于意在使用生物材料结构制造的组织或组织形成的信息生成生物材料结构图(例如，数字模型或图谱)。形成所期望的组织形成(或器官)所需的生物材料结构的结构图谱(或数字模型)可以通过绘制组织形成的不同区域所需的每种类型的组织来构建，并将数据库识别的每种组织类型相应的晶格子结构(或其他生物材料结构)数字化地组装到适当的组织形成中，以模拟所期望的组织形成。由于数据库容纳与特定细胞表型或长期组织类型相关的生物材料结构几何数据，因此该数据库可以以这种方式数字化地构建图谱(或数字模型)，其然后可用于物理地构建生长模拟组织形成所需的生物材料结构。如本文其他地方所公开的，该数字图谱(或模型)可用作打印图谱(或指令)，用于通过例如3D打印机直接打印，或用作手动组装或构建完成由图谱(或模型)定义的生物材料结构所需的组成晶格子结构或生物材料基材模块的指令。如本文中使用的，术语“生物材料结构”指的是本文中描述的用于生长细胞和/或组织(例如，组织形成，包括例如器官结构)的结构，并且可以指本文中公开的晶格子结构、生物材料基材模块100和多模块生物材料基材200。由于创建所期望的细胞或组织所需的结构可不同，术语“生物材料结构”旨在表示由来自数据库的信息和细胞或组织信息所决定的所需结构，可以是本文中公开的晶格子结构、生物材料基材模块或多模块生物材料基材或这些的组合中的任意一种。
晶格子结构数据库可以通过高通量筛选和探索晶格子结构的各种各样潜在的晶格几何形状来生成，其在Tourlomousis等人，标题为“Integrated methods for precisionmanufacturing of tissue engineering scaffolds”的美国专利申请号15/998,685(转让给与本申请相同的受让人)(其全部内容通过引用并入本文)中描述。根据本公开的实施方式，数据库可通过具有任意数量的晶格几何形状的众多晶格子结构的参数设计和模拟来生成。在数据库内，晶格子结构可以通过它们的纤维直径、纤维间距和层间角来表征。严格控制这3个几何参数的能力允许设计和制造跨越大范围局部和机械性能的晶格子结构。
为了使数据库能够预测细胞形状或组织形成，数据库将晶格子结构几何形状与每个晶格子结构的代表性单细胞形状的形态特征相关联。例如，在一些实施方式中，数据库的生成还包括制造具有代表性的晶格子结构(具有各种不同的几何形状)的集(或数)，以及用干细胞(例如，来自各种来源的间充质干细胞和/或诱导多能干细胞)接种所制造的晶格子结构。在一些实施方式中，不使用化学溶剂制造晶格子结构，并且不添加生物活性分子接种干细胞。然后将每个晶格子结构在24小时内的代表性的单细胞形状的形态特征记录在数据库中，从而将晶格子结构几何形状与单细胞形状的相应形态特征相关联(或映射)。计量工具可应用于在培养的24小时内确定细胞形状，并且阳性和阴性表面标志物可用于跟踪细胞表型作为培养时间的函数。
将晶格子结构几何形状和相应的细胞表型相关联的数据库作为识别(或预测)什么晶格子结构形状(或几何形状)将生成什么细胞表型的库运行。数据库还可存储有关细胞表型的稳定性窗口的信息。
为了进一步增强数据库，在最初24小时后进一步监测接种的晶格子结构，并在数据库中记录和关联每个晶格子结构的长期组织形成的基因表达和分化。再次，在一些实施方式中，没有使用生物活性材料或分子。如本文所使用的，术语“生物活性”(如在“生物活性材料或分子”中)指的是在生物活性材料或分子与组织的界面处引起特定生物反应(其导致组织与生物活性材料或分子之间形成键)的材料或分子。在一些实施方式中，仅对应于产生一般性地均匀组织形成反应的晶格子结构的数据被添加到数据库中。通过这种方式，数据库使得能够绘制具有单细胞形状和长期组织形成的晶格子结构。
数据库的生成在上文和Tourlomousis等人，标题为“Integrated methods forprecision manufacturing of tissue engineering scaffolds”美国专利申请号15/998,685(转让给与本申请相同的受让人)(其全部内容通过引用并入本文)中被详细描述，并且因此在此不再重复。然而，作为一般性讨论，共聚焦荧光显微镜用于观察在预制晶格子结构上培养的细胞的单细胞测量结果。被探测的特征的实例包括附着位点或“焦点粘附”的大小、位置和分布，即各种细胞(包括间充质干细胞)在具有各种多孔几何形状的基材上培养时产生的基于亚细胞蛋白质的复合物。使用人工智能方法对培养下的细胞的大量结果图像进行分析和分类，以将细胞和亚细胞特征及其变异性与表现出不同的纤维间距和排列的各种几何微环境相关联。量化焦点粘附的可测量特征，机器学习算法能够对在培养过程中细胞呈现的形状进行分类。具体地，先进的制造方法用计量框架进行生物学鉴定，该计量框架对各种基材维度和架构下的细胞受限状态进行建模和分类。例如，参见例如Tourlomousis等人，标题为“Integrated methods for precision manufacturing of tissueengineering scaffolds”的美国专利申请号15/998,685(转让给与本申请相同的受让人)(其全部内容通过引用并入本文)第0088段及随后段落。
事实上，如Tourlomousis等人，标题为“Integrated methods for precisionmanufacturing of tissue engineering scaffolds”的美国专利申请号15/998,685(转让给与本申请相同的受让人)(其全部内容通过引用并入本文)中更具体地讨论的，可以使用定量和可靠地表征细胞位置矢量和细胞形状的测量的方法生成数据库。计量方法的框图描绘在图19中。表征方法的实施方式使得能够在高通量的条件下对许多细胞进行快速和可靠的分析和表征。表征方法的实施方式包括对细胞进行免疫荧光标记，用于识别随后的3-D图像采集的结构和功能特征，其中功能特征包括细胞表面标志物。表征方法的实施方式进一步包括图像分析和用于分析免疫荧光标记的细胞特征的自动算法(图20)，并生成细胞位置和形状分布(其然后与细胞表型(例如，干细胞表型)相关联)的统计。
该方法的实施方式在下文中称为“SIT”分类方法。在本公开的实施方式中，SIT分类方法被整合到发现适当的几何形状以在接种的细胞扩增期间生成所期望的细胞形状和表型的总体方法中。
根据实施方式，细胞的图像可经由定量的荧光共聚焦显微镜生成。采集此类图像如图21-24所示，其中显示了整个细胞的非分割视图、仅细胞体的分割视图、仅核体的分割视图以及仅展示细胞的焦点粘附的视图。
在一些实施方式中，焦点粘附(FA)计量框架允许限定在细胞水平上建模FA蛋白的分布的指标。可以理解为包括三个阶段，如图20所阐释的。
首先是数据采集阶段，其中样品是用配备有3条激光线的高分辨率共聚焦显微镜以63X放大倍率获得的图像，并以0.1μm步长穿过样本的厚度来扫描样本。通过这种方式，可以为每个细胞生成3组灰度原始图像，其对应于感兴趣的细胞和亚细胞特征：例如，FA、肌动蛋白微丝和细胞核，如图21-24所描绘的。
在图像处理阶段的过程中，可使用算法工作流程，其中可在每个原始灰度荧光图像中自动检测和分割FA，从而允许在xyz笛卡尔坐标系内对在一个细胞内的所有FA进行3D体积重建。
图像处理算法程序允许开发关键的细胞和亚细胞焦点粘附形态和分布指标，其对于根据本公开的实施方式将所开发的分类方法训练和应用于各种细胞类型是有用的。结果描绘在图25-33中。在建模阶段期间，可以限定描述蛋白质的分布特征的指标。这些指标的值有可能是在每个样本内整个细胞群的FA代表值。
在实施方式中，可以根据算法检测和分割焦点粘附。最初，可以使用阈值和过滤技术从着色为绿色的原始灰度图像中生成细胞体。然后，可以在检测的感兴趣的区域内检测并准确地分割单个FA。具体而言，“Clahe”代表“对比度受限适应直方图均衡”，可用于跨越处理图像均衡图像亮度和对比度。
在一些实施方式中，可执行阈值步骤，该步骤基于像素是否高于或低于某个像素值，自动将像素指定为黑色或白色。
在一些实施方式中，可执行扩张步骤，其中如果白色像素被许多大于或等于特定值的黑色像素包围，则可将它们除去。
在一些实施方式中，可执行侵蚀步骤，其中可以以与在扩张步骤中去除白色像素相同的方式去除黑色像素。
在一些实施方式中，可执行拒绝特征步骤(a reject features step)，其中可去除对应于白色或黑色像素的无限区域。
在一些实施方式中，可应用维纳滤波器，其减少稀疏噪声同时保留边缘。
在一些实施方式中，可执行快速傅里叶变换以减少背景噪声和伪影。
可对算法的输出执行手动审查，以验证算法的准确性。
不仅对FA通道，而且对肌动蛋白微丝和DAPI通道遵循相同的图像处理算法工作流程，允许对每个特征进行3-D体积重建。然后可将它们合并成复合图像，用于目视检查。
为SIT算法开发了两个指标。特别地，对于2-D培养皿对照和3-D限制的和悬浮状态(即0-45°支架)系统，记录了在焦点粘附和细胞核质心之间的径向欧几里德距离。基于欧几里德距离进行频率分布建模。开发了函数来表征径向欧几里德距离与在此类距离内FA的频率之间的关系。从该E-函数中，斜率被作为E斜率参数。这个E-斜率参数的增加与更多更接近核的FA的形成有关。
还对每个焦点粘附与其最近邻近的距离进行了类似的频率分布建模。基于最邻近的距离与该范围内的焦点粘附的频率之间的关系生成G函数。较小的G函数值与个体/单细胞水平处更聚合的FA模式相关。
形态分析发现，在将熔融静电纺丝书写支架与传统对照(即，随机静电纺丝网格和玻璃介质)进行比较时，FA数和FA的总面积没有统计学意义。然而，用于MEW支架的FA尺寸更高。此外，在该实验中FA的纵横比与细胞形状的椭圆度相关。
还发现的是，尽管随机纤维基材确实具有更大的坚固性，但在四种条件之间的细胞面积没有统计学差异。不受任何特定理论的约束，这被认为是由于这些纤维引入了随机的候选细胞附着，导致更多的褶皱细胞形状。同时，0-45°MEW打印的支架锯出(saw)具有独特细胞附着点的三角形细胞形状。因此，MEW实施方式锯出较低的矩形度和椭圆度。
对于上述从形态学计算的7个指标，开发了细胞形状表型的7-D笛卡尔坐标系，其中每个轴代表特征指标。选择a)整体(在细胞群上)E斜率(“I”)，b)矩形度(“II”)，c)整体(在细胞群上)平均G函数(“III”)，d)FA尺寸(“IV””)，e)FA纵横比(“V”)，f)椭圆度(“VI”)，和g)细胞面积(“VII”)作为七维参数。在该代表中，每个点代表一个单细胞特征向量，其中7个元素对应于特定细胞的计算指标。所有指标都使用Z得分函数进行归一化，所述Z得分函数将所有指标值集中中并缩放至平均值和单位标准偏差分别为零。每个细胞群的变换的指标向量是多维数据集，以使用MATLAB中的分类学习包训练具有线性核心的支持向量机(SVM)。线性核心SVM是一种监督式机器学习算法，其可以通过找到将所有数据点分成以下的最佳超平面来对数据进行分类：a)代表处于2-D非受限状态的细胞的类别(A类)，以及b)代表处于3-D受限状态的细胞的类别(D类)。SVM算法的最佳超平面被认为是两个类别之间具有最大余量的超平面，其中余量是平行于没有内部数据点的超平面的板材的最大宽度。
线性核心SVM的预测精度可以使用5-折交叉验证方案进行评估，以防止过度拟合。本文，数据被随机划分为5个折叠，对于每个折叠，方案使用折叠外观测值训练线性SVM，并使用折叠内数据评估模型性能。分类准确度被定义为每个折叠的正确分类数据的平均百分比，并用作分类器预测性能的指标。
机器学习任务的结果，其是对每个支架建模的细胞形状表型的分类，如图34-39所示。虽然对每个指标的判别信息的初步评估提供关于跨越每个细胞群和每个细胞群内的细胞形状表型差异的有价值的见解，但直接从单细胞形态推断基材维度和架构的能力仍有待验证。为了实现这一点，单细胞多维度数据集被用于训练所选的机器学习算法，目的是通过同时考虑所有特征来区分四个不同的类别。类别说明描绘在下表5中，其中描绘了所有基材维度和形貌以及细胞受限状态：
表5
执行三种不同的分类任务。绘制了缩放指标的组合，以允许更容易地评估结果(图34-39)。基于分类准确性评估分类器用每个分类任务的训练集之外的数据进行令人满意的操作的能力。最初，通过考虑所有制造的基材上的细胞形态来尝试多类别分类问题(图36和37)。分类器表现出低的分类准确度(67％)，这(不受任何特定理论的约束)可以通过B类的大的类内方差来解释。通过去除B类，分类准确度提高到90.6％，这表明训练的分类器可以严格根据其特征向量特性来高准确度地预测细胞起源的基材。显著地，当通过组合与平面或静电纺丝SES基材相对应的所有类别来运行二元分类任务时，其包括“有噪声的”B类对D类，分类准确度水平保持在约93％。因此，证明了3-D微型精密堆叠的基材促进了在细胞以及亚细胞FA水平上形态学上突出的受限和悬浮状态。
得出结论，MEW基材可促进较少迁移的早期细胞形状表型反应，其是受限和悬浮状态的表征。这些反应与平面和静电纺丝SES基材上更活跃的运动细胞所采用的受限状态不同。在前一种情况下，细胞趋于在细胞体内发展更大且较不细长的成熟FA的聚集模式。细胞的整体形状由基材的多孔微架构(例如，三角形多孔微架构)决定。在后一种情况下，细胞趋于在更椭圆形的细胞体内发展成熟FA的更分散的模式。跨越2-D基材，所得细胞受限的程度似乎受纤维覆盖的程度的调节，其中对照基材上的细胞(纤维覆盖为0％)处于非限制状态。最后，基材关于纤维直径和孔径分布的结构异质性决定了限定的形态和蛋白质分布指标的方差，其中MEW I 0-45°和SES-3min基材分别显示出最多和最不均匀的单细胞形态的群体。
TCK制造方法的实施方式与SIT分类方案的实施方式的整合使得能够发现干细胞保存其形状和表型的程度和持续时间，从而促进使用支架或生物反应器基材的几何形状作为工具来操纵干细胞的形状和表型。根据本公开的实施方式的分类方法的工业开发概念的示意图，进一步包括图40中所描绘的的反馈和前馈控制方法，用于具有根据本公开的方法靶向和实现的表型的干细胞的可编程扩增和收获。通过此类手段，可以通过定制在此类疗法实施期间使用的支架和生物反应器的几何形状来显著改善干细胞疗法。
使用成纤维细胞作为模型细胞系统或干细胞替代物，研究粘附细胞的机械传感反应作为可变基材维度(2D与3D)和多孔几何形状(或微架构)(随机取向的“非编织”与精密堆叠的“编织”)的函数。使用共聚焦荧光显微镜结合自动化单细胞生物图像数据分析工作流程对单细胞受限状态进行建模，该工作流程提取了整个细胞和亚细胞焦点粘附蛋白特征的定量指标。提取的多维数据集被采用以训练机器学习算法以对细胞形状表型进行分类，如上文以及Tourlomousis等人，标题为“Integrated methods for precisionmanufacturing of tissue engineering scaffolds”的美国专利申请号15/998,685(转让给与本申请相同的受让人)(其全部内容通过引用并入本文)的第0088段及随后段落中所讨论的。
在培养下细胞获得的形状与它们附着其上的晶格子结构的几何形状(或架构)直接相关。细胞呈现出独特的受限状态，这些受限状态由规定的晶格子结构维度和多孔几何形状(或微架构)强加，其中与非编织纤维基材相比，编织MEW基材促进了最高的细胞形状均质性。与在具有相似细丝直径的非编织、随机结构基材上培养细胞时观察到的细胞形状的多样性相反，根据本公开的实施方式，由直径小至10微米(或具有约10至约100微米的细丝直径)的细丝构成的晶格子结构可实现高度的细胞形状均匀性。
免疫荧光成像可用于生成阳性和阴性细胞表面标志物表达，以表征间充质干细胞的表型或可观察到的生物学结果。这种免疫荧光成像表明，当使用具有随机的、“不受控制的”网格结构的晶格子结构时，间充质干细胞失去其特征表型并在培养的一周内分化。表型的这种快速丧失会降低MSC的扩增潜力，以及引入控制MSC群体的纯度和均质性的问题。免疫荧光阳性和阴性表面标志物还表明，在由细丝(即直径约为10μm)构建的具有均匀晶格结构的多孔网格(即晶格子结构)上培养的间充质干细胞在不分化的情况下增殖(即“保持其干性”)，其持续时间显著长于在具有随机非编织几何形状的基质上可实现的持续时间。免疫荧光成像还证实了晶格几何形状的类型影响细胞形状和功能“表型”。
这些用于生成数据库的程序也证实了具有均匀细胞形状的细胞群的可实现性。这在生物医学研究和基于细胞的疗法中是有用的，因为细胞形状控制着细胞功能，并且根据本公开的实施方式的晶格子结构、生物材料结构和方法可用于以前所未有的精度和可再生性设计和量化细胞反应。
根据本公开的实施方式，晶格子结构(具有无数晶格几何形状)的该数据库及其在接种干细胞的表型中的相应时间依赖的变化可用于设计和构建功能分级的生物材料结构(例如，生物材料基材模块100或多模块生物材料基材200)。功能分级的生物材料结构可更好地模拟在天然组织中观察到的某些重要梯度。
事实上，使用数据库中的相关信息(即，将特定晶格子结构与特定单细胞形状和特定长期组织形成相关联的数据)，可基于所期望的组织形成设计相关的生物材料结构。例如，在一些实施方式中，可以设计和制造生物材料基材模块100。在一些实施方式中，例如，数据库中的相关信息可用于确定需要各种晶格子结构的哪些组合来生成所期望的组织或器官类型。在一些实施方式中，在设计的组合中的至少两个晶格子结构具有不同的晶格几何形状。如本文所使用的，表述“不同的晶格几何形状”指的是具有至少一个不同的几何参数(例如，不同的层间角、不同的纤维直径或不同的纤维间距)的两个晶格(或晶格子结构)。因此，可以理解两个晶格(或晶格子结构)可具有一个或多个相同的几何参数，但仍然具有不同的晶格几何形状(只要至少一个参数不同)。作为实例，如图2A中所示，在一些晶格子结构组合中，两个或多个晶格子结构(在附图中表示为架构#1-3或A1、A2和A3)可具有相同的层间角，但纤维直径和/或纤维间距不同。这可导致组织和/或器官标度的生物材料基材模块100具有导致多种组织类型(例如，图2B至2D中所示)的结构梯度(其由图2B(其中结构刚度从上到下增加(并且因此，孔隙率降低))，2C(其中结构刚度从左到右增加(并且因此，孔隙率降低))和2D(其中结构刚度从前到后增加(并且因此，孔隙率降低))中的箭头所示。具体地，组分晶格子结构(或其区域)的不同结构刚度(或孔隙率)导致不同的细胞表型，其导致在所得生物材料基材模块100上生长或形成多种组织类型。例如，图2B中箭头所示的结构梯度指示从上到下变化的细胞形状和所得组织类型的靶向控制，以及图2C中的结构梯度指示从左到右变化的细胞形状和所得组织类型的靶向控制。并且图2D中的结构梯度指示从前到后变化的细胞形状和所得组织类型的靶向控制。
如本文所使用的，术语“结构刚度”表示由生物材料结构的几何特征和生物材料结构中细丝的排列赋予的生物材料结构的物理刚度，并且不是指构成细丝的材料的固有刚度。事实上，生物材料结构的几何特征(例如，细丝直径、细丝间距离和细丝取向)限定了生物材料结构的孔隙率，并且该孔隙率影响生物材料结构的结构刚度。具体地，随着孔隙率增加，结构刚度降低，反之亦然。
数据库中的相关信息还可(或可替选地)用于设计和制造多模块生物材料基材200。应当理解的是多模块生物材料基材200的设计和制造不需要事先设计和制造一个或多个生物材料基材模块100，并且多模块生物材料基材200可直接设计，而不需要中间模块100设计。此外，虽然均质和异质生物材料基材模块100是由晶格子结构110的组合构成的，但多模块生物材料基材200可以由生物材料基材模块100的组合(例如，图3B中的模块100a至100d)构成，或者由生物材料基材模块100和单个晶格子结构110的组合构成。例如，如上一般性地讨论的，多模块生物材料基材200可包括：多个相同或不同的异质生物材料基材模块；多个均质的生物材料基材模块(其中至少两个彼此不同)；异质生物材料基材模块和均质生物材料基材模块的组合；异质生物材料基材模块和单个晶格子结构的组合；均质生物材料基材模块和单个晶格子结构的组合；或异质生物材料基材模块、均质生物材料基材模块和单个晶格子结构的组合。通过这种方式，多模块生物材料基材200可贯穿整个结构具有各种各样的分级的或以其他方式不同的几何形状，导致各种各样的组织类型和组织形成(包括，例如，器官结构)。例如，如图3A一般性地所示的，在一些实施方式中，多模块生物材料基材200可通过组合各种生物材料基材模块100和/或从数据库中已知的其它晶格子结构100来设计和制造，以长期诱导特定的代表性单细胞形状和特定的长期组织类型。如图3B所示，这可以导致具有结构梯度(如与生物材料基材模块100a相关的箭头所示，该模块内的结构刚度从左到右增加(并且因此，孔隙率降低))以及可产生多种组织类型的不同的晶格几何类型的组织和/或器官标度的生物材料结构。因此，利用数据库中的相关性，可以基于所期望的组织类型或形成来设计和制造各种生物材料结构，并且这可以以可编程的方式完成。
作为根据本公开的实施方式的生物材料结构的组织能力的进一步阐释，图4阐释了使用两种不同的晶格子结构来创建异质生物材料基材模块。这种异质模块用于形成包括一侧较软的组织和另一侧较硬的组织的“界面组织”。如所示的，异质模块的整体结构包括具有不同晶格几何形状的两个独特的晶格子结构。还如所示的，所描绘的异质模块被设计以创建在一侧具有软骨细胞并且在另一侧具有成骨细胞的特定的骨-软骨界面组织。
事实上，将干细胞接种在异质模块的两个独特的晶格子结构的表面5和6上可导致24小时内细胞形状的差异，以及在培养至汇合时不同的细胞表型。在该实例中，由第一晶格子结构的几何形状(在图4中表示为5)生成的组织构建体可引导干细胞向“软骨细胞分化”的分化，而由第二晶格子结构的几何形状产生的组织构建体(在图4中表示为6)可引导干细胞向“成骨细胞分化”的分化。在培养后，组织构建体可成为其中一侧(即5)具有软组织(例如软骨)并且另一侧(即6)具有硬组织(例如松质骨或皮质骨)的“界面组织”。
如从阐释中可以看出的，用于构建生物材料结构的晶格几何形状的类型的系统变化可以在接种时导致一系列的细胞形状，以及具有“表型”梯度的组织，使得能够构建复杂的组织形成(包括例如，器官结构)。例如，根据本公开的实施方式的生物材料结构可使用来自数据库的信息来构建，以产生模拟图5中所示的复杂天然组织形成的组织形成。根据一些实施方式，数据库可用于构建一种构建模拟组织形成所需的多模块生物材料基材的数字模型(或图谱)。例如，此类生物材料结构可包括具有可导致干细胞分化为内皮细胞的晶格几何形状的内部晶格子结构(或生物材料基材模块)。该内部晶格子结构(或生物材料基材模块)可使得能够形成内皮细胞(即，当生成管腔状结构时血管的内壁)。并且额外的晶格子结构(或生物材料基材模块)可与内部(内皮)晶格子结构组装在一起，并被设计为导致干细胞分化为不同的表型(例如，形成肌肉和弹性膜所需的那些表型)。如从该阐释中可以看出的，根据本公开的实施方式的结构和方法可用于通过系统地改变生物材料结构内的晶格几何形状来形成复杂的组织和组织形成(包括例如器官结构)，以产生所期望的细胞表型。
如本文所述，这种跨越3D生物材料结构的长度、宽度和高度设计细胞指导的有益的几何/生物物理线索(cues)的能力可用于广泛的领域，包括但不限于用于基于细胞的疗法的新型细胞扩增平台、用于筛选药物/疫苗毒性和功效的器官芯片平台、体外疾病/生理模型、可用作为用于引导病灶内健康组织形成的植入物的非细胞生物材料结构、以及组织块/组织界面和/或器官类似物的生物工程的开发。事实上，更好地控制干细胞分化为特定细胞类型的能力使得能够产生分化的细胞，这些细胞可用于目的在于基于细胞的疗法来治疗例如心脏病、糖尿病、视力和听力损失、创伤性脊髓损伤、杜氏肌营养不良症等的研究。
生物材料结构的机械性能和/或细胞反应的进一步定制也可以通过添加填料和/或添加剂来实现，类似于创建传统的刚度梯度(如上所一般性地描述的)。任何合适的此类填料和/或添加剂都可不受限制地用于该目的，并且这些填料和/或添加剂的并入在Erisken等人，“Functionally graded electrospun polycaprolactone andβ-tricalciumphosphate nanocomposites for tissue engineering applications”，Biomaterials,第29卷，第4065-4073页(2008)(其全部内容通过引用并入本文)中进行了详细描述文。例如，如Erisken等人，“Functionally graded electrospun polycaprolactone andβ-tricalcium phosphate nanocomposites for tissue engineering applications”，Biomaterials,第29卷，第4065-4073页(2008)(其全部内容通过引用并入本文)所指出的，填料/添加剂的非限制性实例可以包括β-磷酸三钙、羟磷灰石、碳酸钙、碳纳米管、水凝胶、蛋白质、胶原蛋白、聚乙醇酸、聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)、透明质酸、磷酸钙、纤维蛋白、生物活性玻璃等。在一些实施方式中，填料/添加剂包括β-磷酸三钙。
当将上述结构梯度一起考虑时，填料/添加剂的浓度也没有特别限制，并且可以是任何适于实现所期望的机械性能和细胞反应的浓度。然而，在一些实施方式中，如Erisken等人，“Functionally graded electrospun polycaprolactone andβ-tricalciumphosphate nanocomposites for tissue engineering applications”，Biomaterials，第29卷，第4065-4073页(2008)(其全部内容通过参考并入本文)中所指出的，填料/添加剂可以以按重量计约0至约15％的浓度提供。此外，填料/添加剂可以以浓度梯度存在，其中填料/添加剂的浓度跨越整个生物材料结构变化。填料/添加剂在沿梯度上任意一点的浓度也可从按重量计约0至约15％变化，但本公开并不局限于此。
此外，由于填料/添加剂还有助于生物材料结构的细胞反应，根据本公开的实施方式，数据库还可存储填料/添加剂材料和浓度(或浓度梯度)数据。数据库可将该填料/添加剂和浓度数据与上述数据相关联，即将预测的细胞分化类型或预测的长期组织结构与具有特定的几何参数的晶格子结构相关联，以产生形成所期望的组织类型或器官结构所需的生物材料结构和填料/添加剂材料和浓度(或浓度梯度)的组合的数字模型或指令。
此外，如本文所述，通过定制生物材料结构的不同的几何形状(例如，晶格子结构、生物材料基材模块、和/或多模块生物材料基材)诱导的功能性可从在实验室环境中(体外)用细胞接种的生物材料结构获得的可编程细胞反应扩展到宿主生物体(体内)(其可以是动物或人类)中的可编程细胞反应。这些体内细胞反应可例如通过将设计的非细胞生物材料结构植入宿主生物体中来实现。如本文所述，非细胞生物材料结构可被设计(或定制)以引导植入后生物材料结构周围健康组织的生长。如本文所述，该设计(或定制)可以通过定制晶格几何类型以在体内生长靶组织(即其中植入生物材料结构的组织)来实现，其方式与晶格几何类型被设计(或定制)用于在体外生物材料结构上生长组织的方式相同。
智能地定制生物材料结构的细胞指导的几何/生物物理线索的能力也使得可植入的生物材料结构的设计能够最小化或避免宿主生物体的“异物反应”，这通常将植入的医疗设备封装在纤维化膜中。该“异物反应”是本领域普通技术人员所熟知的，并且在Grainger，“All charged up about implanted biomaterials”，Nature Biotechnology，第31卷，第6期，第507-509页(其全部内容通过引用并入本文)中进行了一般性地描述。然而，植入物与宿主组织的机械匹配可最小化或防止异物反应，如Carnicer-Lombarte等人，“Mechanicalmatching of implant to host minimises foreign body reaction”，https://doi.org/ 10.1101/829648(预印本出版物)(其全部内容通过引用并入本文)中讨论的。因此，在本公开的一些实施方式中，生物材料结构的几何形状和多孔微架构可被调整/定制以防止或最小化异物反应。例如，几何形状和多孔微架构不仅可被设计为在体内生长特定的靶组织，还可以被定制以匹配靶组织的机械或弹性模数(和/或其他机械性能，例如表面刚度)。
植入后的质量损失是设计有效生物材料植入物的另一个挑战，如Hutmacher，“Scaffolds in tissue engineering bone and cartilage”，Biomaterials，第21卷，第2529-2543页(2000)中描述的。然而，机械性能(例如，弹性模数)的匹配为生物材料结构提供了足够的初始机械强度，以替代宿主生物体中缺失或受损的靶组织，同时还允许植入物的降解速率与组织生长和靶组织的成熟速率相兼容。例如，参见Woodruff等人，“Bonetissue engineering:from bench to bedside”，Materials Today，第15卷，第10期，第430-435页，2012年10月，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方式中，生物材料结构的机械性能(例如，弹性模数)可通过单独调整生物材料结构的几何形状(或结构梯度)来定制以匹配靶组织的那些机械性能(并且从而最小化或防止异物反应)。然而，根据一些实施方式，生物材料结构也可被涂覆在具有匹配靶组织的机械或弹性模数的材料中。这些涂覆材料和技术也是本领域普通技术人员所已知的，并且任何合适的此类材料和技术都可不受限制地用于该目的。例如，可使用Carnicer-Lombarte等人，“Mechanical matching of implant to host minimises foreign bodyreaction”，https://doi.org/10.1101/829648(预印本出版物)中公开的那些材料和技术。此类合适的涂覆材料的一些非限制性实例包括硅树脂、聚合物(例如，聚丙烯酰胺)、水凝胶、胶原蛋白等。涂覆的厚度没有特别地限制，但应当足够厚以有效地将植入物(即，生物材料结构)的表面机械性能与靶组织的表面机械性能相匹配。在一些实施方式中，例如，涂覆的厚度可以是约50微米至约150微米，例如约100微米。
虽然已经阐释和描述了本公开的某些示例性实施方式，但本领域普通技术人员将认识到，在不脱离本公开以及其等同物(如在本说明书前面的权利要求中所限定的那样)的精神和范围的情况下，可以对所描述的实施方式进行各种更改和修改。例如，尽管某些组件可以以单数形式描述，即“一个”晶格子结构、“一个”生物材料基材模块等，但根据本公开内容，这些组件中的一个或多个/一种或多种可以任意组合使用。
此外，尽管某些实施方式被描述为“包括/包含/含有(comprising)”或“包括/包含/含有”(including)特定的组件，但“基本上由列出的组件组成”或“由列出的组件组成”的实施方式也在本公开的范围之内。例如，虽然本发明的实施方式被描述为包括晶格子结构的组合或生物材料基材模块的组合，但基本上由这些组件组成或由这些组件组成的实施方式也在本公开的范围之内。例如，生物材料基材模块可基本上由多个晶格子结构组成。在该上下文中，“基本上由……组成”意味着任何附加组件都不会实质性地影响生物材料基材模块的化学、生物化学、物理、生物物理或生物生理特性。
如本文中使用的，除非另外明确规定，否则所有数字，诸如表示数值、范围、量或百分比的数字，均可以读作好像前面加了词“约”，即使该术语没有明确出现。此外，词“约”用作近似的术语，并且不是程度的术语，并反映与测量、有效数字和可替代性相关联的变化的半影(penumbra)，所有这些都如本公开所属领域的普通技术人员所理解的。本文中所叙述的任何数字范围旨在包括其中包含的所有子范围。复数涵盖单数，反之亦然。当给出范围时，这些范围的任何端点和/或在这些范围内的数字都可以在本公开的范围内组合。除非相反地明确指出，否则术语“包括/包含/含有(including)”和类似术语意味着“包括但不限于”。
尽管本文中叙述的数字范围和参数可能是近似值，但实施例中叙述的数值已尽可能精确地如实际上精确地进行了报道。然而，任何数值固有地含有某些误差，这些误差必然是由其各自测试测量中发现的标准差引起的。本说明书和权利要求书中使用的词“包括/包含/含有(comprising)”及其变体并不限制本公开内容排除任何变体或添加。

Claims (28)

1.一种用于干细胞增殖的生物材料结构，生物材料结构包括至少一种晶格子结构，生物材料结构具有结构梯度，其中生物材料结构的一个或多个几何特征在三维空间中沿生物材料结构的至少一个维度变化。
2.根据权利要求1所述的生物材料结构，其中至少一种晶格子结构包括至少第一和第二晶格子结构。
3.根据权利要求2所述的生物材料结构，其中生物材料结构的结构梯度由具有至少一个不同的几何参数的第一和第二晶格子结构实现。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的生物材料结构，其中至少一种晶格子结构、第一和第二晶格子结构、或生物材料结构由直径为约10微米至约100微米的细丝构成。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的生物材料结构，其中，至少一种晶格子结构、至少第一和第二晶格子结构、或生物材料结构包含：
组装成第一生物材料基材模块的第一多个晶格子结构；和
组装成第二生物材料基材模块的第二多个晶格子结构，
组装成多模块生物材料基材的第一和第二生物材料基材模块。
6.根据权利要求5所述的生物材料结构，其中第一生物材料基材模块的第一多个晶格子结构中的至少两个具有至少一个不同的几何参数。
7.根据权利要求5或6所述的生物材料结构，其中第二生物材料基材模块的第二多个晶格子结构中的每一个都具有相同的几何参数。
8.根据权利要求5所述的生物材料结构，其中：
第一生物材料基材模块的第一多个晶格子结构中的每一个都具有相同的几何参数；
第二生物材料基材模块的第二多个晶格子结构中的每一个都具有相同的几何参数；和
第一生物材料基材模块的第一多个晶格子结构和第二生物材料基材模块的第二多个晶格子结构具有至少一个不同的几何参数。
9.根据权利要求1-4中任一项所述的生物材料结构，其中至少一种晶格子结构、至少第一和第二晶格子结构、或生物材料结构包含：
组装成第一生物材料基材模块的第一多个晶格子结构；和
第二晶格子结构，
组装成多模块生物材料基材的第一生物材料基材模块和第二晶格子结构。
10.根据权利要求9所述的生物材料结构，其中第一生物材料基材模块的第一多个晶格子结构中的至少两个具有至少一个不同的几何参数。
11.根据权利要求9所述的生物材料结构，其中第一生物材料基材模块的第一多个晶格子结构中的每一个都具有相同的几何参数。
12.一种制造被设计为生长模拟天然组织形成或天然器官结构的特定组织形成或器官结构的生物材料结构的方法，所述方法包括：
从数据库中生成生物材料结构的数字模型，所述数据库将预测的细胞分化类型或预测的长期组织结构与具有特定几何参数的晶格子结构相关联，所述数字模型包括：
至少一种晶格子结构，其被识别为具有结构梯度，所述结构梯度根据需要由数据库识别为形成模拟天然组织形成或天然器官结构所需的每种组织类型，所述结构梯度使得生物材料结构的一个或多个几何特征在三维空间中沿生物材料结构的至少一个维度变化；和/或
晶格子结构的组合，其根据需要由数据库识别为形成模拟天然组织形成或天然器官结构所需的每种组织类型，以及
使用数字模型构建或打印生物材料结构。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，数字模型包括至少一种具有结构梯度的晶格子结构、不同晶格子结构的组合、不同生物材料基材模块的组合、或至少一种晶格子结构和至少一种生物材料基材模块的组合。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中使用数字模型构建或打印生物材料结构包括使用数字模型作为指令或模板3D打印生物材料结构。
15.根据权利要求12或13所述的方法，其中使用数字模型构建或打印生物材料结构包括使用数字模型作为指令或模板手动连接或组装生物材料结构。
16.一种在生物材料结构上调整早期单细胞形状的方法，所述方法包括改变生物材料结构的物理特性以引导长期组织功能，其中早期单细胞形状是在细胞接种后24小时形成的单细胞形状。
17.根据权利要求16所述的方法，其中改变生物材料结构的物理特性包括赋予生物材料结构以结构梯度，其中生物材料结构的一个或多个几何特征在三维空间中沿生物材料结构的至少一个维度变化。
18.根据权利要求16所述的方法，其中生物材料结构包括至少一种晶格子结构，并且改变生物材料结构的物理特性包括赋予至少一种晶格子结构以结构梯度，其中晶格子结构的一个或多个几何特征在三维空间中沿至少一个维度变化。
19.根据权利要求16-18中任一项所述的方法，其中至少一种晶格子结构或生物材料结构包括至少第一和第二晶格子结构。
20.根据权利要求19所述的方法，其中生物材料结构的结构梯度由具有至少一个不同的几何参数的第一和第二晶格子结构实现。
21.根据权利要求16-19中任一项所述的方法，其中至少一种晶格子结构、第一和第二晶格子结构或生物材料结构均由直径为约10微米至约100微米的细丝构成。
22.根据权利要求16-21中任一项所述的方法，其中至少一种晶格子结构、至少第一和第二晶格子结构、或生物材料结构包括：
组装成第一生物材料基材模块的第一多个晶格子结构；和
组装成第二生物材料基材模块的第二多个晶格子结构，
组装成多模块生物材料基材的第一和第二生物材料基材模块。
23.根据权利要求22所述的方法，其中第一生物材料基材模块的第一多个晶格子结构中的至少两个具有至少一个不同的几何参数。
24.根据权利要求22或23所述的方法，其中第二生物材料基材模块的第二多个晶格子结构中的每一个都具有相同的几何参数。
25.根据权利要求22所述的方法，其中：
第一生物材料基材模块的第一多个晶格子结构中的每一个都具有相同的几何参数；
第二生物材料基材模块的第二多个晶格子结构中的每一个都具有相同的几何参数；和
第一生物材料基材模块的第一多个晶格子结构和第二生物材料基材模块的第二多个晶格子结构具有至少一个不同的几何参数。
26.根据权利要求16-21中任一项所述的方法，其中至少一种晶格子结构或至少第一和第二晶格子结构中的每一个包括：
组装成第一生物材料基材模块的第一多个晶格子结构；和
第二晶格子结构，
组装成多模块生物材料基材的第一生物材料基材模块和第二晶格子结构。
27.根据权利要求26所述的方法，其中第一生物材料基材模块的第一多个晶格子结构中的至少两个具有至少一个不同的几何参数。
28.根据权利要求26所述的方法，其中第一生物材料基材模块的第一多个晶格子结构中的每一个都具有相同的几何参数。
CN202280035436.7A 2021-03-19 2022-03-21 用于可编程组织和器官生物制造的功能性分级生物材料结构 Pending CN117321187A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163163703P 2021-03-19 2021-03-19
US63/163,703 2021-03-19
PCT/US2022/021200 WO2022198135A1 (en) 2021-03-19 2022-03-21 Functionally graded biomaterial structures for programmable tissue and organ biofabrication

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117321187A true CN117321187A (zh) 2023-12-29

Family

ID=81326205

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280035436.7A Pending CN117321187A (zh) 2021-03-19 2022-03-21 用于可编程组织和器官生物制造的功能性分级生物材料结构

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20240166982A1 (zh)
EP (1) EP4308683A1 (zh)
CN (1) CN117321187A (zh)
WO (1) WO2022198135A1 (zh)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11078459B2 (en) * 2017-08-15 2021-08-03 The Trustees Of The Stevens Institute Of Technology Integrated methods for precision manufacturing of tissue engineering scaffolds
EP3921405A1 (en) * 2019-02-05 2021-12-15 Corning Incorporated Woven cell culture substrates
CN109676915B (zh) * 2019-02-15 2022-02-15 复旦大学 一种车轮状多孔支架及其制备方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP4308683A1 (en) 2024-01-24
US20240166982A1 (en) 2024-05-23
WO2022198135A1 (en) 2022-09-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Baptista et al. Overlooked? Underestimated? Effects of substrate curvature on cell behavior
Nguyen et al. Cardiac tissue engineering: state-of-the-art methods and outlook
US20240158758A1 (en) Continuously bioprinted multilayer tissue structure
Dixon et al. Bioinspired three-dimensional human neuromuscular junction development in suspended hydrogel arrays
Haycock 3D cell culture: a review of current approaches and techniques
Desroches et al. Functional scaffold-free 3-D cardiac microtissues: a novel model for the investigation of heart cells
CA2893971C (en) Cardiac tissue constructs and methods of fabrication thereof
Yang et al. Elongation of axon extension for human iPSC-derived retinal ganglion cells by a nano-imprinted scaffold
Norris et al. Emulsion-templated microparticles with tunable stiffness and topology: Applications as edible microcarriers for cultured meat
KR20170003918A (ko) 전자기 방사선을 이용한 조직 및 재료의 제조를 위한 방법, 장치, 및 시스템
US20210395675A1 (en) Integrated methods for precision manufacturing of tissue engineering scaffolds
Suh et al. Electrospun scaffolds and induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiac tissue engineering applications
Katiyar et al. Stretch growth of motor axons in custom mechanobioreactors to generate long‐projecting axonal constructs
WO2006023136A2 (en) A neural stem cell-collagen-bioreactor system to construct a functional embryonic brain-like tissue
US20120219981A1 (en) Mechanical stretching device
Xin et al. Analysis of multiple types of human cells subsequent to bioprinting with electrospraying technology
Ramos-Rodriguez et al. The use of microfabrication techniques for the design and manufacture of artificial stem cell microenvironments for tissue regeneration
Ren et al. Biomanufacturing of 3D tissue constructs in microgravity and their applications in human pathophysiological studies
CN117321187A (zh) 用于可编程组织和器官生物制造的功能性分级生物材料结构
CN114181904B (zh) 模拟骨物理特征的肿瘤细胞三维培养支架及其制备与应用
Wightman et al. From mammalian tissue engineering to 3D plant cell culture
Kistamás et al. Multifactorial approaches to enhance maturation of human iPSC-derived cardiomyocytes
Zhu et al. Engineered Human Organoids for Biomedical Applications
Pahnke et al. Spatial and electrical factors regulating cardiac regeneration and assembly
CN109125803A (zh) 一种导电型分区式聚丙烯腈脊髓导管的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination