CN117320758A - 用于组织分离的包含流体凝胶的组合物 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及流体凝胶形式的可注射组合物及其在内镜手术期间辅助组织切除的用途，其中将组合物注射到目标组织中以形成用于组织分离的垫层。组合物的方面可包括胶凝剂、改性剂、盐和水。组合物可通过将胶凝剂、改性剂、至少一种盐和水经由连续搅拌混合以获得流体凝胶溶液来制备，其中改性剂使得所述流体凝胶组合物能够通过内镜注射导管和针以显著降低的注射压力注射到胃肠组织的黏膜下层中，并生成高且耐久的垫层用于黏膜下层中持久的组织提升，用于注射辅助切除手术的应用。

Description

用于组织分离的包含流体凝胶的组合物
相关申请的交叉引用
本申请依据35 U.S.C.§119要求2021年3月24日提交的美国专利申请号17/211,037的优先权，其特此通过引用全文并入。
技术领域
总体上，本公开涉及流体凝胶形式的可注射组合物及其注射到靶组织中以在例如有需要的人患者的胃肠(GI)道中生成辅助内镜手术的垫层(cushion)的用途。
背景技术
内镜检查是一种允许通过使用称为内镜的专用管状器械对内部器官进行观察和动手术的程序，内镜通常配备有光源、摄影机和外科工具。其为了诊断和治疗目的最常用在胃肠(GI)系统中，以检测病理病变(包括息肉、化生性病变、发育不良性病变、癌前病变和肿瘤性病变)或对其进行干预。特别地，内镜黏膜切除术(EMR)和内镜黏膜下剥离术(ESD)是两种广泛进行的微创去除病理病变，尤其是那些无蒂、平坦和难以接近的病变的GI内镜外科手术。在EMR中，电外科热勒除器用于捕获、绞窄和去除靶组织。EMR主要用于去除小病变或分块去除1.5cm至2cm之间的较大病变，而作为相对较新的内镜技术，专门开发了ESD以通过使用手术用电刀沿病变边缘外侧5mm产生略微更深的切口以促进整块切除，来去除大于2cm的病变。在这两种技术中，将患病组织从下面的肌肉层有效提升和分离(特别是在大病变或在不易接近的位置的病变的情况下)对于成功的外科手术是必不可少的。最初应用机械分离，诸如抓握、牵拉、结扎和抽吸，但其通常与并发症相关，诸如穿孔、出血和对下面的肌肉层的损伤。因此，目前的临床方法是在黏膜下层下方注射流体，以将患病病变与黏膜层物理分离，并为随后的下面的肌肉层提供“安全垫层”，并在可以进行组织切除之前提高病变边缘的可见性，这也称为“注射和切割(inject-and-cut)”技术。
通过减少热损伤、穿孔和出血的风险，同时促进整块切除，黏膜下注射的使用对于大多数EMR技术，且尤其是成功的ESD是必不可少的。理想的注射溶液应满足以下要求以具有临床相关性：1)生物相容性。注射溶液应当是无毒的，没有外源性病原体，不引发组织炎症或引发最小的组织炎症，不诱导组织损伤，并且至少不妨碍后续的伤口愈合，并且应当容易地从体内消除。2)黏膜下提升和持续时间。注射溶液必须提供最大的黏膜下隆起高度，优选具有更陡峭和更清晰的边缘，并在整个外科手术中维持提升持续时间。3)可注射性。溶液必须使用标准内镜工具容易地注射到目标病变中。4)成本和可用性。注射溶液应当易于以有成本效益的方式生产，并且所有原材料均可以以合理的成本容易地获得。5)出血管理/控制。溶液优选具有固有止血能力。出血被报告为与EMR相关的主要并发症，并且在ESD期间和之后更常见，发生在4.5％-15.5％的病例中且风险随着病变尺寸而增加，并且手术后出血的风险仍然是个问题。同时，考虑到在手术期间遭遇的任何出血应该被迅速控制，溶液的固有止血性质还可以减少手术时间并有助于减轻由使用内镜电凝固工具引起的不便。
已经开发了各种可注射材料用于黏膜下层注射。盐水是临床上在内镜检查中最常使用的溶液，并且由于其无毒性、低成本和易用性而被认为是“金标准”。然而，它受困于快速耗散，并且通常需要重复注射，这导致手术困难和更高的不良反应风险。为了克服这种限制，随后使用由带电分子和天然/合成聚合物组成的高渗(例如高渗葡萄糖、甘油和右旋糖溶液)和粘性溶液(例如透明质酸钠、纤维蛋白原、明胶、羧甲基淀粉钠、羟丙基甲基纤维素和藻酸钠)，以便实现更大的提升高度以及更长的提升持续时间，但它们都具有其自身的优点和缺点。高渗溶液通常初始可以产生比生理盐水更高的垫层，但是当去除大于2cm的病变时，隆起持续时间仍不令人满意，并且倾向于引起组织损伤。透明质酸钠粘性溶液(例如Hyaltech Ltd,UK的SigmaViscTM和Seikagaku Corp.,日本的MucoUp)被报告具有高黏膜下提升以及较长的持续时间。然而，其应用通常受限于其高成本、高注射压力和低可用性，并且其可能潜在地促进与较高复发风险相关的癌细胞生长。纤维蛋白原溶液可以以合理的价格获得，并具有高粘度以产生持久的黏膜下隆起，但其受困于疾病传播的风险。羟丙基甲基纤维素的应用也受限于黏膜下注射后其可能引起的组织损伤。
具有高粘度的溶液或能够在注射后形成凝胶的溶液通常与更好的隆起性能相关，因为粘性溶液和凝胶不太倾向于扩散或被周围组织吸收。已经开发了用于延长的黏膜下层隆起的可注射凝胶，特别是多糖凝胶(优选具有剪切稀化性质)，诸如结冷胶(例如BostonScientific的OriseTMGel)和离子交联的藻酸盐凝胶。然而，溶液的高粘度损害其可注射性，这使得溶液难以流动穿过内镜注射装置或甚至具有阻塞内镜注射装置的风险。因此，需要精确调节溶液的粘度以平衡其隆起性能和可注射性，但目前可用的提供改善隆起而不影响可注射性的灵活性的方法有限。已经设计了“高压”生成装置(描述于Cook Medical的WO2011103245中)以辅助高粘性溶液的注射，但可能引入组织损伤的风险并增加内镜手术的不便。解决该问题的另一方式是使用纯化的逆向热敏聚合物(例如WO2009070793中公开的LeGoo-endoTM)，其在注射期间保持为低粘度的液体，并能够在注射到溶液达到体温的靶组织中之后原位胶凝，表现出高粘度。尽管改善了隆起，但逆向热敏聚合物可能在它们到达靶组织之前达到体温，由此在内镜管/导管中胶凝并堵塞，极大地损害了它们的可注射性。
鉴于此，设计了逆向热敏聚合物用于EMR注射，所述聚合物具有低于其临界胶凝浓度(CGC)的浓度，由此即使在体温下也将溶液维持在低粘度下，例如AriesPharmaceuticals,Inc的(公开于WO2015075024中)。/>溶液的主要组分是泊洛沙姆188，其是一种惰性且不可降解的聚醚，借助表面活性剂在水中形成乳液。在注射后，溶液变成粘性产物以提供长达60分钟的即时且持久的隆起，然而，当使用/>时可能容易形成气泡，由此使内镜视野模糊，并且其在体内的未知清除路径可能是另一个问题。更重要的是，最近对11名患者使用/>进行EMR和ESD手术的报告显示，/>对于EMR手术是安全和有效的，然而，在人体内的提升持续时间平均仅持续12.5分钟(范围：10-15分钟)，这比所要求保护的在猪模型中的60分钟提升持续时间短得多，由此大部分不足以完成通常持续60-140分钟的ESD手术。当使用/>时，ESD手术需要多次注射。内镜医生将4名患者中的3名使用/>进行ESD手术分级为中等困难，并且手术可能非常昂贵(每10mL 81美元)。猪模型与人试验之间的巨大差异可能提示，使用低浓度的泊洛沙姆188可能不能形成具有足以在人体内维持持久的提升的粘度的垫层。然而，简单地提高浓度以提高粘度将导致注射压力的提高，由此降低可注射溶液通过内镜工具的可注射性。平衡注射压力和粘度方面的此类冲突构成了开发用于临床EMR和ESD手术的理想的可注射溶液的重大挑战。
尽管已经取得了令人鼓舞的进展，但是目前没有液体、凝胶和乳状液形式的黏膜下注射溶液可以直接解决所有上述要求并使得能够在单一产品中方便地用于EMR和ESD二者。因此，迫切需要提供一种辅助内镜手术(特别是在EMR和ESD中)的溶液，该溶液是生物相容的、有成本效益的和容易获得的，易于注射同时提供高且持久的黏膜下隆起，并优选是止血的。
发明内容
总体上，本公开涉及流体凝胶形式的可注射组合物、制备此类组合物的方法、及其用于注射到人中以在内镜手术中，优选在息肉切除术、EMR和/或ESD手术中形成垫层的用途。
本公开提供了可注射组合物，其中所述可注射组合物包含至少一种胶凝组分(其为长链和亲水性多糖、蛋白或其衍生物)、至少一种作为一价或多价阳离子或阴离子的来源的盐、至少一种改性剂和水。
本公开提供了可注射组合物，其中所述可注射组合物以流体凝胶(一种流动的结构化液体类型)的形式配制。详细地，其中所述流体凝胶包含胶凝粒子的混悬液，所述胶凝粒子可经由粒子间相互作用微弱地保持在一起作为可流动、难以流动或甚至不可流动状态的粘性溶液，并且粒子间相互作用在搅拌、受剪切应力或以其它方式受扰动时可以容易地破坏，表现出触变行为或剪切稀化行为。
本公开提供了可注射流体凝胶组合物，其中所述可注射组合物包含至少一种胶凝组分，所述胶凝组分是长链和亲水性的多糖、蛋白或其衍生物，其特征在于它们分散在水中时形成粘性分散体和凝胶的性质。
可注射流体凝胶组合物包括至少一种改性剂，其中所述改性剂可以通过部分阻断或桥接胶凝粒子形成期间凝胶组分链之间的相互作用、或凝胶组分链和盐之间的相互作用、或相邻粒子之间、或粒子和盐之间的相互作用来影响胶凝组分的胶凝。其同时赋予调节组合物性质(诸如疏水性)，以便复杂精细地平衡组织隆起性能和流体凝胶可注射性的灵活性。
本公开提供了一种可注射流体凝胶组合物，其包括至少一种胶凝组分和至少一种改性剂，并且其中所述胶凝组分和改性剂在水中是相容的，其在分子水平上可混溶或可容易地分散在水中。
本公开提供了一种可注射流体凝胶组合物，其包含至少一种作为一价或多价阳离子或阴离子的来源的盐。盐的引入在一些实施方案中可以提供离子以诱导胶凝粒子的形成。在一些实施方案中，盐可用于调节溶液渗透压或离子强度。在一些实施方案中，可以添加有机盐以调节组合物pH或胶凝剂的交联能力或胶凝粒子之间的交联能力。
在一些方面，可注射组合物可包括另外的药剂，诸如药学上可接受的着色剂，以辅助鉴定黏膜下层和靶病变的侧缘。
根据某些方面，可注射组合物可包括治疗剂(诸如瑞巴派特(rebamipide))以帮助伤口愈合，或光敏剂(诸如血卟啉、间四(羟基苯基)二氢卟酚(Mesotetra(hydroxyphenyl)chlori,mTHPC)、莫特沙芬镥(motexafin lutetium)、钯多泊芬(padoporfin)等)以经由光动力疗法治疗癌症。
另外或备选地，可注射组合物可具有固有止血能力，其可以源自胶凝组分、改性剂、盐或其组合。
本公开还考虑了用于制备可注射流体凝胶组合物的方法。例如，一种示例性方法可包括在连续搅拌下将盐添加到包含胶凝组分和改性剂的混合物中以获得可注射流体凝胶溶液。另一示例性方法可包括首先加热盐、胶凝组分和改性剂的混合物，随后在连续搅拌下冷却以产生可注射流体凝胶溶液。
在另一方面，本公开还提供了将所述可注射组合物施用于人以用作内镜手术中的隆起剂或垫层剂的方法。作为用于说明的一个实例，方法可包括将可注射组合物转移到容器中，优选转移到注射器中，其中组合物在注射前保持为流体凝胶的形式；并且注射所述组合物导致流体凝胶在组织部位处积聚，其中所述组合物变为粘性凝胶或胶凝产物(例如由于组织部位处降低的剪切应力)以提供垫层。
本公开的目的之一是提供具有低注射压力和/或改善的组织隆起性能的注射组合物，其可以为实施内镜手术，诸如EMR和/或ESD手术提供有利条件。在本公开的示例性实施方案中，通过包含调节流体凝胶性质以调节注射压力并维持延长的垫层性能的改性剂的组合物来实现该目的。
本公开的另一目的是提供具有止血性质的可注射组合物，用于内镜手术期间或之后的出血控制。
附图说明
图1示出了与注射1mL生理盐水相比注射1mL的测试样品2(TS-2)之后，结肠样品的黏膜下层中的垫层的形态。
图2示出了在结肠样品的黏膜下层中，在注射添加0.001％的亚甲基蓝的测试样品2(TS-2)、钙交联的藻酸钠流体凝胶(SA+Ca2+)和盐水之后15分钟稠化和流动性较差的产物的形成。
图3示出了在猪胃样品的黏膜下层中，在注射添加0.001％的亚甲基蓝的测试样品2(TS-2)之后稠化和流动性较差的产物的形成。
图4A示出了在用25mL生理盐水冲洗之前和之后，在注射灭菌的测试样品24(TS-24)之后获得的稠化和流动性较差的产物；图4B示出了在生理盐水中浸泡18小时后稠化和流动性较差的产物消失。
图5示出了在注射到结肠组织的黏膜下层后，与0.4％的透明质酸钠(HA)和生理盐水相比，测试样品2(TS-2)的隆起持续时间长达90分钟。
图6A示出了使用内镜针在新鲜猪组织上离体注射测试样品21(TS-21)以进行黏膜下提升；图6B描绘了在注射到近端胃中之前形成的黏膜下垫层的图像；并且图6C描绘了在注射到近端胃中之后的图像。
图6D和6E各自描绘了分别在注射到食管中之前和之后形成的黏膜下垫层的图像。
图6F描绘了在应用内镜勒除器的情况下食管垫层的图像。
图6G描绘了在切除后由夹子部分闭合的食管伤口的图像。
图7描绘了证明测试样品22(TS-22)的可恢复剪切稀化概况的示例性数据。
图8描绘了测试样品23(TS-23)的示例性剪切稀化曲线。
图9描绘了灭菌的测试样品23(TS-23)中胶凝粒子的示例性显微图像。
图10描绘了测试样品3(TS-3)的直接接触的示例性细胞毒性评估。
图11A和11B各自描绘了示出与PBS相比，测试样品3和4(TS-3和TS-4)的全血凝固时间的示例性数据。图11A描绘了全血凝固的代表性图像，并且图11B描绘了凝固时间的比较(n＝5)。
图12描绘了与PBS和市售的Orise Gel黏膜下提升剂相比，灭菌的测试样品24(TS-24)的示例性止血性质(n＝4)。
参照前述附图，参照以下非限制性实施例可以更好地理解本公开。
具体实施方式
通过参考以下详述和实施例以及它们之前和之后的描述，可以更容易地理解本文中描述的实施方案。然而，本文中描述的要素、设备和方法不限于详述和实施例中呈现的具体实施方案。应当认识到，这些实施方案仅仅是本公开的原理的说明。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，许多修改和改编对于本领域技术人员将是显而易见的。
除非另行明确说明，本文中公开的所有范围也被认为包括该范围的端点。例如，“5至10”、“从5至10”或“5-10”的范围通常应被认为包括端点5和10。
此外，当短语“最多达”与量(amount)或量(quantity)结合使用时，应理解该量至少是可检测的量(amount)或量(quantity)。例如，以“最多达”指定量的量存在的材料可以从可检测的量和最多达并包括指定量存在。
本公开提供了可注射组合物、制备此类组合物的方法及其用于注射到人组织中以在内镜手术(优选EMR和/或ESD手术)中形成垫层的用途。可注射组合物是生物相容的、有成本效益的且容易获得的。所述组合物因其低注射压力而易于注射，同时提供高的、持久的黏膜下隆起和止血功能。
包含至少一种胶凝组分、至少一种改性剂、至少一种盐、任选的着色剂或治疗剂、以及水的流体凝胶形式的本发明的可注射组合物出乎意料地能够在黏膜下注射后形成高且持久的垫层以辅助内镜手术，优选EMR和/或ESD手术。
如本领域中公知的那样，在黏膜下注射后提高溶液的流动阻力(粘度)和/或其形成缠结网络(凝胶形成)的能力是实现高且持久的隆起性能的关键。因此，长链生物聚合物(多糖和蛋白)，尤其是多糖，作为常见于食品和化妆品的公知的增稠剂和胶凝剂，在以黏膜下注射施加时，通常以高浓度制备，或者以添加交联剂的缠结网络的形式制备，以诱导粘度的显著提高。然而，单独使用多糖或与交联剂(诸如盐)组合使用多糖不能完全满足EMR/ESD的需要，因为通过单独使用多糖或与溶液或本体凝胶形式的交联剂组合使用多糖来平衡合理的可注射性同时维持足够的提升性能是一个挑战。
可以在胶凝期间剪切多糖以产生流体凝胶结构(即胶凝粒子在非胶凝连续介质中的混悬液)的发现可以拓宽这些胶凝剂在黏膜下/黏膜注射区域中的潜在应用。流体凝胶在性能和流变性质方面具有广泛的变化，不同于上述粘性液体和交联凝胶，这取决于生物聚合物(例如多糖、蛋白类型或混合组分)的选择、所用生物聚合物的浓度、盐的选择和盐浓度(如果胶凝是离子介导的话)以及加工条件(与粒子尺寸和粒子相互作用的程度直接相关)。用于内镜应用的流体凝胶的最具吸引力的流变性质之一是它们的触变和/或剪切稀化行为，其特征在于当施以临界剪切应力时粘度降低，并且在于它们在移除剪切应力后恢复其粘度的能力。
触变和剪切稀化行为可以解释如下：当流体凝胶中的凝胶分数足够高时，凝胶粒子相互作用并且甚至紧密堆积以在有或没有交联剂的情况下形成缠结网络，由此产生粘性但可流动的流体凝胶、难以流动的流体凝胶或甚至不可流动的流体凝胶。由于在剪切应力下(诸如在注射期间)特定相互作用的破坏，粘性流体凝胶经历剪切稀化转变，由此使得能够通过内镜注射导管和针进行注射。在注射力或剪切应力移除后，特定相互作用重新建立，并且流体凝胶回到粘性状态或难以流动状态或不可流动状态。
在黏膜下层提升的情况下，出乎意料地发现，一旦注射到受限的黏膜下层(空间)中，包含单独的胶凝剂或包含胶凝剂以及交联剂的粘性流体凝胶组合物会变得流动性较差、难以流动或甚至不可流动，这取决于流体凝胶浓度。如本领域技术人员将认识到的那样，当与将触变材料注射到不受限空间中相比时，此类结果是预料不到且不明显的。此类预料不到的粘度提高或增稠效果(而不是简单地回到触变流体凝胶的原始粘性状态)有利于组织隆起，由此其被认为是内镜手术中的显著优点。我们推断，在受限的黏膜下空间中，凝胶粒子之间的相互作用以及凝胶粒子和周围组织之间的相互作用增强，导致增强的粘度。尽管尚未完全了解黏膜下层中此类预料不到的粘度转变的机制，但是流体凝胶的这种引人关注的现象表明流体凝胶可以用作EMR或ESD手术中黏膜下注射的良好候选物。然而，为了维持良好的组织隆起，包含单独的胶凝剂或包含胶凝剂以及交联剂的流体凝胶的浓度必须足够高，这导致粘性流体凝胶组合物通过包含内镜导管和内镜针的内镜注射工具的可注射性差。尽管通过降低流体凝胶浓度来降低溶液粘度可以改善可注射性，但是不可避免地牺牲了组织隆起能力或导致组织隆起时间短。
根据本公开的改性剂可以通过部分介导(阻断或桥接)凝胶粒子形成期间胶凝组分链之间的相互作用、凝胶粒子形成期间胶凝组分聚合物链和盐(或交联剂)之间的相互作用、相邻粒子之间的相互作用和/或粒子和盐之间的相互作用来影响胶凝组分的胶凝，所述改性剂被引入流体凝胶组合物中。出乎意料地发现，根据本公开的示例性流体凝胶组合物可包含一种或多种改性剂，其用于部分或完全介导胶凝组分聚合物链和盐(或交联剂)之间的相互作用、相邻粒子之间的相互作用和/或粒子和盐之间的相互作用。以这种方式，本公开的实施方案可以表现出降低的粘度，并由此表现出降低的注射压力。还引人关注地发现，流体凝胶一旦注射到受限的黏膜或黏膜下层就变得更粘稠或稠化，这提供了持久的组织提升。不受任何特定理论的束缚，据推断在受限的黏膜下空间中，改性剂可以调节流体凝胶性质，诸如疏水性、电荷分布和/或官能团的存在，导致增强的相邻粒子之间的相互作用、增强的粒子和盐之间的相互作用和/或增强的粒子和黏膜下细胞外基质之间的相互作用。此类流体凝胶组合物可以提供显著的优点，因为其通过使得能够更容易地注射同时在内镜应用中维持更高和/或更持久的黏膜下垫层以更好地促进接下来的内镜切除和/或剥离手术，解决了开发EMR溶液方面的上述挑战。
因此，根据本公开的流体凝胶组合物优选在通过内镜导管和针注射之前和期间，在室温至体温范围内的温度下保持可流动状态。
还出乎意料地发现，本公开的示例性流体凝胶组合物，诸如包含至少一种胶凝组分、至少一种改性剂、至少一种盐以及水的那些，可通过引入改性剂而表现出降低的注射压力，同时还在注射到黏膜或黏膜下组织中后维持持久的组织隆起(例如与盐水溶液相比)。
示例性流体凝胶组合物的方面可包括当使用通常用于内镜手术的注射工具时不大于50psi，优选低于30psi，且更优选低于20psi的注射压力，所述注射工具诸如与工作长度最高达2700mm且通道尺寸小于2.8mm的导管连接的针直径为21-26号(gauge)的内镜注射针。例如，在一些实施方案中，当使用如本文中公开的内镜注射针时，流体凝胶组合物可具有在50psi至2psi范围内的注射压力，诸如在40psi至5psi、30psi至5psi、或20psi至10psi范围内的注射压力。
根据本公开，示例性流体凝胶组合物可以表现出剪切稀化行为，其中流体粘度在剪切应变下降低，其中剪切稀化指数为1至20，且优选2至12。在一些实施中，用于确定剪切稀化指数的方法由ASTM标准D2196定义。例如，剪切稀化指数可以定义为低转速下的表观粘度与高转速下的表观粘度的比率，并且所述高转速是低转速的10倍。
根据本公开，示例性流体凝胶组合物可包含一种或多种止血组分。
组分(A)：胶凝组分
根据本公开，组合物包含至少一种胶凝组分(诸如多糖)，其可用于通过在生物聚合物经历构象转变和随后的聚集时向生物聚合物溶液施加足够高能的流场来制备流体凝胶。其中所述胶凝组分优选是生物相容的和止血的。其包括热可逆和热不可逆的多糖，所述多糖可以是直链的或支链的、离子的或中性的、以及纯天然的或改性的。用于流体凝胶制备的胶凝剂的非限制性实例包括藻酸盐、黄原胶、k-卡拉胶、结冷胶、瓜尔胶、刺槐豆胶、果胶、羧甲基淀粉、羟乙基淀粉、壳聚糖和琼脂糖。其中，优选实例是藻酸盐。
在一些实施方案中，组合物还可包含蛋白及其衍生物作为至少一种胶凝组分，其可用于通过在生物聚合物经历构象转变和随后的聚集时向生物聚合物溶液施加足够高能的流场来制备流体凝胶。其中所述蛋白优选是生物相容的。蛋白的非限制性实例包括明胶和乳清蛋白。
藻酸盐是一种从褐藻中提取的天然直链多糖，并且是由两种单体——聚-β-甘露糖醛酸(M)和聚-α-L-古洛糖醛酸(G)——构成的杂聚链。二价阳离子，诸如Ca2+、Mg2+、Zn2+和Ba2+的添加以及所述二价阳离子与藻酸盐链的结合，优选与藻酸盐的G嵌段的结合，导致凝胶的形成。藻酸盐流体凝胶可通过在剪切下将活性形式的二价阳离子直接引入藻酸盐溶液中来获得。此外，藻酸盐已经用作伤口敷料中的止血剂，主要通过加速纤维蛋白形成，并且如果通过钙离子交联的话经由充当钙供体，由此加速血小板活化和全血凝固。
藻酸盐包括藻酸及其一价盐，诸如藻酸钠、藻酸钾、藻酸丙二醇酯和藻酸铵。其中，优选实例是藻酸钠和藻酸钾。
从不同来源提取的藻酸盐在M和G含量方面不同，并且M/G比率极大地影响藻酸盐的凝胶能力和凝胶强度。在一些实施方案中，藻酸盐的M/G比率范围可从0.45至3.35，优选从0.6至2.0，更优选从0.8至1.6。
在一些实施方案中，流体凝胶组合物可包含0.05至6.5w/v％的藻酸钠或优选0.1％至3.6w/v％的藻酸钠，或更优选0.125％至1w/v％的藻酸钠。
在一些实施方案中，本文中描述的藻酸钠可具有5至1500厘泊(cP)，优选100cP至700cP，更优选300至600cP的粘度(在1w/v％，20℃下)。
组分(B)：改性剂
根据本公开，流体凝胶组合物包含至少一种改性剂，其与胶凝组分(A)相容并能够影响胶凝组分(A)的胶凝过程。所述改性剂可以影响胶凝粒子形成期间的聚合物链间相互作用和/或可以影响粒子间相互作用。其中所述改性剂优选是生物相容的和止血的。所述改性剂包括亲水性合成聚合物、亲水性天然聚合物和两亲性聚合物。亲水性合成聚合物的非限制性实例包括聚(乙二醇)(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚丙烯酸(PAA)、聚(甲基丙烯酸)和亲水性聚酯，并且两亲性聚合物的非限制性实例包括聚(环氧乙烷)(PEO)-聚(环氧丙烷)(PPO)-聚(环氧乙烷)(PEO)嵌段共聚物和两亲性聚酯。所述改性剂还包括天然寡聚物和/或低分子量多糖。非限制性实例包括寡古洛糖醛酸，从藻酸盐提取的古洛糖醛酸嵌段(18)、寡甘露糖醛酸(从藻酸盐提取的甘露糖醛酸嵌段)、寡糖醛酸(从果胶提取的糖醛酸嵌段(19))和低分子量壳聚糖。
其中，优选的改性剂是具有丰富侧基的全合成聚酯，其中所述合成聚酯经由一种高反应性多羧酸、至少一种亲水性二醇和/或与至少一种疏水性二醇和/或至少一种两亲性二醇的缩聚来合成。所述合成聚酯易于合成，并且可以是亲水的或两亲的，这取决于引入何种二醇。其还通过改变与三羧酸反应的单体或通过调节疏水性二醇和亲水性二醇的比率来赋予调节组合物性质(诸如疏水性)的灵活性，由此复杂精细地平衡隆起性能和可注射性。所述合成聚酯还具有丰富的侧基，诸如羧基基团，其可以赋予强的钙结合能力以允许将更多的钙离子(一种公知的止血剂)递送到黏膜下层中，由此减少内镜切除期间的凝血时间并降低术后出血的风险。此外，丰富的游离侧基可以经由在侧基和周围组织之间形成氢键和静电键赋予组合物黏膜粘附性质。最后，三羧酸的高反应性允许通过使其与多种可供选择的单体反应而将带电部分或其它功能(例如抗氧化性质和抗微生物性质)和成像能力(例如荧光成像和光声成像)或光吸收能力引入聚合物中。
在一些实施方案中，所述改性剂通过使高反应性多羧酸、至少一种亲水性二醇和/或与至少一种疏水性二醇和/或至少一种两亲性二醇反应来合成，其中所述高反应性多羧酸具有用于聚合物链延长的多个反应位点，并表现出用于增强的与胶凝组分、盐和/或周围组织的相互作用的有价值的侧基。所述多羧酸可以是三羧酸和/或四羧酸或其组合，包括但不限于乌头酸、丙烷-1,2,3-三羧酸、松蕈酸、柠檬酸、异柠檬酸、均苯三甲酸、呋喃四甲酸、联苯基-3,3′,5,5′-四甲酸、双(环丙烷)-2,2',3,3'-四甲酸、1,2,3,4-丁烷四羧酸、1,2,3,4-环丁烷四甲酸和(+)-(18-冠醚-6)-2,3,11,12-四甲酸。
在一些实施方案中，所述改性剂通过使高反应性多羧酸与至少一种亲水性二醇反应来合成。在所述改性剂合成中使用的至少一种亲水性二醇有助于与三羧酸形成聚合物链，使得所得聚合物改性剂能够溶解或均匀分散在水中。亲水性二醇的非限制性实例包括1,4-丁二醇、1,6-己二醇、聚(乙二醇)(PEG)、癸二酸-1,2-丙二醇酯和聚(乙烯醇)及其任意组合。
在一些实施方案中，所述改性剂通过使高反应性多羧酸与至少一种如上所述的亲水性二醇和/或至少一种疏水性二醇反应来合成。在所述聚合物改性剂合成中使用的至少一种疏水性二醇可以调节聚合物的疏水性，其通过防止水扩散而有利于延长的黏膜下隆起。疏水性二醇的非限制性实例包括不同碳长度的脂族二醇，诸如1,8-辛二醇、1,10-癸二醇、聚(丙二醇)(PPG)、1,12-十二烷二醇、聚己内酯(PCL)二醇和聚丙交酯(PLA)二醇及其任意组合。
在一些实施方案中，所述改性剂通过使高反应性多羧酸与至少一种两亲性二醇(诸如PEG-PPG-PEG共聚物)反应来合成。
在一些实施方案中，亲水性二醇与疏水性二醇的摩尔比范围可从10:0至0:10，优选从9:1至5:5。
在一些实施方案中，可以在所述改性剂合成中引入带正电荷的部分以调节所得聚合物链的电荷分布和电荷密度。非限制性实例包括带正电荷的氨基酸(诸如赖氨酸和精氨酸)、N-甲基二乙醇胺(MDEA)或其任意组合。
在一些实施方案中，可以在所述改性剂合成中使用含磷酸的二醇以调节电荷密度并调节所得聚合物与胶凝组分(A)的离子相互作用。非限制性实例包括磷酸化氨基酸(诸如磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸和磷酸酪氨酸)、β-甘油磷酸酯或其任意组合。
在一些实施方案中，所述改性剂的分子量范围可从500至20,000Da，优选从600至15,000Da，且更优选从800至10,000Da。
在一些实施方案中，流体凝胶组合物包含0.001至10w/v％的改性剂或优选0.05％至8w/v％的改性剂，或更优选0.25％至5w/v％的改性剂。
组分(C)：盐
根据本公开，可注射流体凝胶组合物包含至少一种作为一价、二价或多价阳离子和/或阴离子的来源的盐，其中所述至少一种盐与胶凝组分以及改性剂相容，并且优选是生物相容的和止血的。
在一些实施方案中，二价阳离子的引入介导组分(A)的胶凝，诸如Ca2+、Sr2+、Zn2+、Mn2+、Co2+、Ni2+、Cd2+和Ba2+，其表现出对组分(A)(诸如藻酸盐聚合物链)的高亲和力。在所有阳离子中，从有效介导藻酸钠的胶凝及其在止血过程中的作用的角度来看，Ca2+是优选的。钙盐的非限制性实例包括氯化钙、乳酸钙、葡萄糖酸钙、四硼酸钙、柠檬酸钙、硫酸钙、甘油磷酸钙和磷酸氢钙。
在一些特定实施方案中，当藻酸盐用作组分(A)时，钙盐的浓度范围可从0.006至0.9w/v％，优选从0.01至0.4w/v％，更优选从0.014至0.12w/v％。
在一些实施方案中，可以添加与组合物相容的溶解在水中的一价阳离子或所有阴离子以调节组合物的渗透压或离子强度。适于组合物的一价阳离子包括但不限于钠盐和钾盐及其任意组合，而可适于组合物的阴离子包括但不限于氯离子、磷酸根、碳酸根、碳酸氢根和硫酸根及其任意组合。在所有阳离子中，钠盐是优选的。钠盐的非限制性实例包括氯化钠、碳酸氢钠、磷酸氢二钠、硫酸钠、葡萄糖酸钠、乳酸钠、柠檬酸钠、甘油磷酸钠。
在一些实施方案中，可加入与组合物相容的有机盐或其酸形式以调节组合物pH、离子强度或组分(A)的交联能力。有机盐或其酸形式可包括但不限于柠檬酸盐或柠檬酸、马来酸盐或马来酸、谷氨酸盐或谷氨酸(glutaric acid)、草酸盐或草酸、乳酸盐或乳酸、葡萄糖酸盐或葡萄糖酸以及酒石酸盐或酒石酸，或其任意组合。
上述组分(C)可以单独使用或作为两种或更多种的组合使用。例如，可以加入一定浓度的氯化钙以介导组分(A)的胶凝，同时可以加入一定浓度的氯化钠以调节所得组合物的渗透压。
组分(D)：水
根据本公开，将上述组分溶解在作为组分(D)的水中，并且所述水优选为无菌纯化水、或蒸馏水、或去离子水，不含病原体且不含内毒素。
其它组分
在一些实施方案中，组合物可另外包含一种或多种其它组分，诸如着色剂、防腐剂、消泡剂、稳定剂、抗氧化剂、光敏剂或治疗剂，其与组合物相容并且对于生物医学用途而言是生物相容的。
在一些方面，组合物可另外包含着色剂以辅助鉴定黏膜下层和靶病变的侧缘。所述着色剂包括靛蓝胭脂红、亚甲基蓝(MB)、卢戈氏碘液、甲苯胺蓝、甲酚紫、刚果红、酚红、吲哚菁绿(ICG)或美国FDA用于食品和内服药用途的着色添加剂有效清单中列出的FD&C着色添加剂。在一些方面，吲哚菁绿(ICG)的添加还可有助于病理病变的荧光和光声成像辅助切除。
在一些方面，组合物可另外包含荧光染料以经由荧光成像辅助鉴定黏膜下层，其中所述荧光染料包括但不限于呫吨衍生物(诸如荧光素和罗丹明)、花青衍生物(诸如花青、吲哚菁绿(ICG))、量子点、和通过使柠檬酸(CA)和含胺化合物(诸如不同的氨基酸)反应来合成的一类小分子荧光染料。在一些情况下，所述荧光染料是CA-Cys，其为一种通过使柠檬酸和半胱氨酸反应来合成的荧光染料，其中所述CA-Cys在添加到组合物中时不仅提供使得能够进行荧光成像的强荧光，还可以起作为胶凝组分的藻酸盐的交联剂的作用。
在另一些方面，组合物可另外包含磷光材料以经由磷光成像辅助鉴定黏膜下层，其中所述磷光材料包括但不限于硫化锌、铝酸锶或有机磷光材料。
在另一些方面，组合物可包含另外的治疗剂以促进内镜手术后的后续伤口愈合，诸如包含肾上腺素以进一步预防术后出血、包含质子泵抑制剂或瑞巴派特以在胃切除手术后促进伤口愈合同时预防溃疡形成、包含化学治疗剂以预防癌症复发、包含抗生素以预防感染、或包含抗炎剂以预防术后炎症。在一些方面，治疗剂可以是光敏剂(诸如血卟啉、间四(羟基苯基)二氢卟酚(mTHPC)、莫特沙芬镥、钯多泊芬等)以经由光动力疗法治疗癌症。
制备组合物的方法
本公开还包括制备可注射流体凝胶组合物的方法，在一些情况下，其中该方法包括制备流体凝胶组合物；组合物的灭菌；将溶液转移到注射器中，其中组合物在注射前保持流体凝胶的形式；以及通过内镜针将流体凝胶形式的组合物从注射器注射到靶组织，其中组合物变成粘性凝胶或弱凝胶样产品以提供垫层，诸如黏膜下流体垫层。
在一些实施方案中，通过在连续搅拌(例如使用夹套针式搅拌器(jacketed pin-stirrer)或磁力搅拌器)下，直接在水中直接混合组分(A)、(B)、(C)和任选的所述其它组分以获得可注射流体凝胶溶液来制备流体凝胶组合物。
在另一些实施方案中，在连续搅拌(例如使用夹套针式搅拌器或磁力搅拌器)下，将作为组分(C)的盐溶液加入到组分(A)、(B)和任选的所述其它组分的混合物中以获得可注射流体凝胶溶液。
在另一些实施方案中，首先将作为组分(C)的盐溶液与作为组分(B)的聚合物改性剂混合，随后在连续搅拌(例如使用夹套针式搅拌器或磁力搅拌器)下，将混合物加入到组分(A)和任选的所述其它组分中以获得可注射流体凝胶溶液。
在另一些实施方案中，通过首先将组分(B)与其它组分(诸如着色剂)混合，随后加入组分(A)以形成均匀溶液，接着在连续搅拌下加入作为组分(C)的盐溶液以获得可注射流体凝胶溶液来制备流体凝胶组合物。
在另一些实施方案中，通过在水中加热组分(A)、(B)和(C)混合物，接着在连续搅拌下逐渐降低混合物温度以获得可注射流体凝胶溶液来制备流体凝胶组合物。
在另一些实施方案中，通过在水中加热组分(A)和(B)混合物，接着逐渐降低混合物温度并随后在连续搅拌下加入组分(C)以获得可注射流体凝胶溶液来制备流体凝胶组合物。
在另一些实施方案中，通过在水中加热组分(A)，接着逐渐降低溶液温度并随后在连续搅拌下加入组分(B)和(C)以获得可注射流体凝胶溶液来制备流体凝胶组合物。
在一些实施方案中，组合物可以以液体形式提供，其中所有组分混合、灭菌并预填充在注射器中。
在另一些实施方案中，组合物可以以液体形式提供，其中所有组分混合、灭菌并预填充在安瓿中。
在另一些实施方案中，组合物可以以液体形式提供，其中所有组分混合、预填充在注射器或安瓿中、并最终灭菌。
在另一些实施方案中，组合物可以以冻干粉末的形式提供，其中所有组分混合、灭菌并填充在一个容器中，所述冻干粉末与另一容器中的灭菌水组合。在内镜手术中施用之前，通过注射器转移无菌水以溶解冻干粉末。
在另一些实施方案中，组合物可以以两部分制剂(two-part formulation)的形式提供，其中制剂的部分(1)可以以液体或冻干粉末的形式提供，其中包含胶凝剂，灭菌并填充在一个容器中，而制剂的部分(2)可以以液体或冻干粉末的形式提供，其中改性剂和盐混合、灭菌并填充在另一容器中。在内镜手术中施用之前，将在水中进行制剂的两个部分的预混合。
在另一些实施方案中，组合物可以以两部分制剂的形式提供，其中制剂的部分(1)可以以液体或冻干粉末的形式提供，其中胶凝剂和改性剂混合、灭菌并填充在一个容器中，而制剂的部分(2)可以以液体或冻干粉末的形式提供，其中包含盐，灭菌并填充在另一容器中。在内镜手术中施用之前，将在水中进行制剂的两个部分的预混合。期望根据任何合适的方法对组合物进行灭菌，所述方法没有特别限制。非限制性实例包括γ辐照、环氧乙烷灭菌、UV辐照、电子束灭菌、过滤和高压灭菌。
使用组合物的方法
本公开还提供了一种将组合物用于内镜手术的方法，所述方法包括注射粘性流体凝胶组合物，该粘性流体凝胶组合物在进入人的靶组织，优选进入GI道的黏膜下层后保持为粘性流体凝胶状态，并优选在进入靶组织后变成甚至更粘稠的凝胶。更详细地，使用内镜注射工具将流体凝胶组合物注射至靶组织以便形成垫层来辅助随后的切除或剥离手术，其中所述内镜注射工具包括有效长度为1000mm或更大，优选从1500至2500mm的管和直径为21-26号的标准内镜注射针。
在一些实施方案中，使用组合物的方法可包括将水加入到冻干粉末形式的组合物中，充分混合所有组分以获得均匀溶液，将溶液转移到可与内镜注射工具连接的注射器中，使用内镜注射工具将组合物溶液注射到靶组织以便形成垫层来辅助随后的切除或剥离手术，其中所述内镜注射工具包括有效长度为1000mm或更大，优选从1500至2500mm的管和直径为21-26号的标准内镜注射针。
在另一些实施方案中，使用组合物的方法可包括充分混合制剂的两个部分以获得均匀溶液，将溶液转移到可与内镜注射工具连接的注射器中，使用内镜注射工具将组合物溶液注射到靶组织以便形成垫层来辅助随后的切除或剥离手术，其中所述内镜注射工具包括有效长度为1000mm或更大，优选从1500至2500mm的管和直径为21-26号的标准内镜注射针。
在本公开的优选应用中，通过内镜针将组合物注射到人的靶组织中以提升靶组织层，其中所述靶组织层包括黏膜下层、黏膜层和上皮层。所述组合物的靶向和优选的应用部位包括沿GI道的食管、胃、十二指肠、小肠、盲肠、结肠和直肠。
此外，本公开的实施方案还可以应用于除GI内镜手术外的许多手术，其中所述手术包括其中需要组织分离的口腔手术、泌尿科手术、整形手术或开放式侵入性手术。
本公开的优点
鉴于前述公开内容，与现有组合物相比，示例性实施方案可提供一个或多个优点。这些优点可包括粘性流体凝胶组合物：在注射期间表现出触变行为或剪切稀化行为；在注射之前和期间保持可流动状态以易于注射；在注射后凝固成更粘稠的流体凝胶或垫层；并且一旦注射到受限的黏膜下层中，在1-15分钟内表现为流动性更差、难以流动或甚至不可流动的状态，用于持久的组织隆起。
示例性实施方案的另一优点可包括通过调节组分(A)与组分(B)的比例来改变注射压力以使其在合适的范围内，优选小于20psi。
示例性实施方案的另一优点可包括通过调节组分(A)与组分(C)的比例来调节组分(A)的胶凝能力、所得组合物的粘度和/或止血性质或其组合。
以下实施例展示了本公开的实施方案的各方面。这些实施例并非意味着将实施方案仅限于本文中的此类实施例，而是示出了一些可能的实施。
示例性实施
本公开的示例性实施可包括具有止血功能的剪切稀化流体凝胶组合物，其包括：胶凝剂、盐、改性剂和水，其中所述组合物在剪切期间处于可流动状态，并且在剪切移除后变成粘性流体凝胶或变成流动性差得多、难以流动或甚至不可流动的凝胶，并且其中胶凝剂、改性剂、盐或其组合表现出止血功能，并且其中所述改性剂降低组合物的注射压力并同时维持流体凝胶的足够高浓度。
一些示例性组合物的一个方面可包括可通过在连续搅拌下混合一种胶凝剂、至少一种盐、至少一种改性剂和水来制备的组合物。
一些示例性组合物的另一方面可包括，其中所述组合物具有低于50psi，优选低于30psi，更优选低于20psi的注射压力。
一些示例性组合物的又一方面可包括，其中所述组合物具有1至20，且优选2至12的剪切稀化指数。
对于根据本公开的一些示例性组合物，胶凝剂可包括至少一种多糖或至少一种蛋白，其中至少一种多糖是黄原胶、k-卡拉胶、结冷胶、瓜尔胶、刺槐豆胶、果胶、羧甲基淀粉、羟乙基淀粉、藻酸盐、壳聚糖、琼脂糖或其组合，并且其中至少一种蛋白是乳清蛋白、明胶或二者。在某些实施中，至少一种多糖选自藻酸盐和壳聚糖，和/或至少一种蛋白是明胶。
另外或备选地，对于根据本公开的一些示例性组合物，胶凝剂可以以0.05至6.5w/v％的浓度存在。
另外或备选地，对于根据本公开的一些示例性组合物，改性剂可包括亲水性聚合物、两亲性聚合物或二者。例如，在某些实施中，改性剂可包括亲水性聚合物，并且亲水性聚合物可以是聚(乙二醇)(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚丙烯酸(PAA)、聚(甲基丙烯酸)、亲水性合成聚酯或其组合。在一些实施中，改性剂可包括两亲性聚合物，并且两亲性聚合物可以是聚(环氧乙烷)(PEO)-聚(环氧丙烷)(PPO)-聚(环氧乙烷)(PEO)嵌段共聚物((PEO)a-(PPO)b-(PEO)a，其中a＝2-80和b＝15-27)、两亲性合成聚酯或其组合。
根据一些示例性实施，亲水性合成聚酯的方面可包括通过使多羧酸(PCA)与选自以下的至少一种亲水性二醇(DPHO)反应来制备亲水性合成聚酯：1,4-丁二醇、1,6-己二醇、聚(乙二醇)(PEG)、癸二酸-1,2-丙二醇酯、或聚(乙烯醇)或其任意组合。此外，在某些实施中，所述亲水性合成聚酯可具有范围从500至20,000Da，优选从600至15,000Da，且更优选从800至10,000Da的分子量。
根据一些示例性实施，两亲性合成聚酯的方面可包括通过使多羧酸(PCA)与选自1,8-辛二醇、聚(丙二醇)(PPG)、聚己内酯(PCL)二醇或聚丙交酯(PLA)二醇的至少一种疏水性二醇(DPHO)、选自1,4-丁二醇、1,6-己二醇、聚(乙二醇)(PEG)、癸二酸-1,2-丙二醇酯或聚(乙烯醇)或其组合的至少一种亲水性二醇(DPHO)反应来制备两亲性合成聚酯。此外，在某些实施中，所述两亲性合成聚酯可具有范围从500至20,000Da，优选从600至15,000Da，且更优选从800至10,000Da的分子量。
对于本公开的实施，多羧酸可包括以下三羧酸和四羧酸中的一种，包括但不限于乌头酸、丙烷-1,2,3-三羧酸、松蕈酸、柠檬酸、异柠檬酸、均苯三甲酸、呋喃四甲酸、联苯基-3,3′,5,5′-四甲酸、双(环丙烷)-2,2',3,3'-四甲酸、1,2,3,4-丁烷四羧酸、1,2,3,4-环丁烷四甲酸和(+)-(18-冠醚-6)-2,3,11,12-四甲酸或其组合。
示例性实施的一个方面可包括其中所述改性剂以低于10w/v％的浓度存在的组合物。改性剂可以以0.1％至10w/v％，诸如0.25％至5w/v％的浓度存在。
根据某些实施的方面，至少一种盐可包括与所述胶凝组分相容的一价、二价和/或多价阳离子或阴离子的一种或多种。例如，在一些实施中，至少一种盐可包括钠盐(一价阳离子)、钙盐(二价阳离子)或二者。
更特别地，示例性钠盐可包括氯化钠、碳酸氢钠、磷酸氢二钠、硫酸钠、葡萄糖酸钠、乳酸钠、柠檬酸钠、甘油磷酸钠。示例性钙盐可包括氯化钙、乳酸钙、葡萄糖酸钙、四硼酸钙、柠檬酸钙、硫酸钙、甘油磷酸钙和磷酸氢钙。
包括至少一种盐的实施的一个示例性方面可包括所述至少一种盐以低于0.9w/v％的浓度存在的组合物。作为用于说明的实例，组合物可包含至少一种盐，其是浓度为0.01至0.4w/v％的氯化钙。
在一些示例性实施中，组合物可进一步包含着色剂。着色剂的几种非限制性实例可包括亚甲基蓝、靛蓝胭脂红、卢戈氏碘液、或吲哚菁绿、甲苯胺蓝、甲酚紫、刚果红、酚红、美国FDA用于食品和内服药用途的着色添加剂有效清单中列出的FD&C着色添加剂、或其组合。
备选或另外地，在一些示例性实施中，组合物可进一步包括以下的一种或多种：光致发光剂、防腐剂、消泡剂、稳定剂、抗氧化剂、光敏剂、治疗剂或其组合。
例如在某些实施中，组合物至少可包括光致发光剂，其中光致发光剂是呫吨衍生物、花青衍生物、量子点、硫化锌、铝酸锶或小分子荧光染料，并且其中小分子荧光染料通过使柠檬酸与含胺化合物反应来制造。
示例性组合物的方面可包括，其中所述组合物可通过针注射，并且其中针是市售内镜针。
另一示例性实施可包括制造用于注射到人的靶组织中的可注射流体凝胶组合物的方法，该方法包括：在连续搅拌下产生混合物，该混合物包含至少一种胶凝组分和改性剂。
制造可注射流体凝胶的示例性方法的一个方面可包括将盐添加到混合物中或以其它方式制备混合物以进一步包括盐。
制造可注射流体凝胶的示例性方法的其它方面可包括将混合物从连续搅拌中移除；冷冻干燥混合物以产生冻干粉末；和添加水以再溶解冻干粉末。
一种另外的示例性实施可包括在内镜手术中使用可注射流体凝胶组合物的方法，该方法包括：将本公开中描述和/或考虑的任何示例性流体凝胶组合物施用于人的靶组织，其中组合物变成粘性凝胶样或胶凝物质以提供持久的组织隆起和止血功能。
使用可注射流体凝胶组合物的方法的一个方面可包括，其中施用组合物使用针直径为21至26号的内镜注射针进行。
再一些示例性实施如下。
实施1.具有止血功能的剪切稀化流体凝胶组合物，其包含：胶凝剂、盐、改性剂和水，其中，在一些情况下，所述组合物在剪切期间处于可流动状态，并且在剪切移除后变成粘性流体凝胶或变成流动性差得多、难以流动或甚至不可流动的凝胶(诸如本公开中进一步描述的)，并且其中胶凝剂、改性剂、盐或其组合表现出止血功能(诸如本公开中进一步描述的)，并且其中，在一些情况下，所述改性剂降低组合物的注射压力并同时维持流体凝胶的足够高浓度(诸如本公开中进一步描述的)。在一些情况下，与不包括改性剂的相同或相似组合物相比，当如本文中所述测量时，改性剂通过降低组合物的注射压力改善了组合物的可注射性。
实施2.根据实施1的组合物，其中所述组合物通过在连续搅拌下混合一种胶凝剂、至少一种盐、至少一种改性剂和水来制备。
实施3.根据实施1或2的组合物，其中所述组合物具有低于50psi，优选低于30psi，更优选低于20psi的注射压力。
实施4.根据实施1-3任一项的组合物，其中所述组合物具有1至20，且优选1至12的剪切稀化指数。
实施5.根据前述实施任一项的组合物，其中所述胶凝剂包含至少一种多糖或至少一种蛋白，其中至少一种多糖是黄原胶、k-卡拉胶、结冷胶、瓜尔胶、刺槐豆胶、果胶、羧甲基淀粉、羟乙基淀粉、藻酸盐、壳聚糖、琼脂糖或其组合，并且其中至少一种蛋白是乳清蛋白、明胶、胶原、白蛋白或前述两种或更多种的组合。
实施6.根据实施5的组合物，其中所述至少一种多糖选自藻酸盐和壳聚糖，或其中所述至少一种蛋白是明胶。
实施7.根据前述实施任一项的组合物，其中所述胶凝剂0.05至6.5w/v％的浓度存在。
实施8.根据前述实施任一项的组合物，其中所述改性剂包含亲水性聚合物、两亲性聚合物或二者。
实施9.根据实施8的组合物，其中改性剂包含所述亲水性聚合物，并且亲水性聚合物是聚(乙二醇)(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚丙烯酸(PAA)、聚(甲基丙烯酸)、亲水性合成聚酯或其组合。
实施10.根据实施8的组合物，其中改性剂包含所述两亲性聚合物，并且两亲性聚合物包括聚(环氧乙烷)(PEO)-聚(环氧丙烷)(PPO)-聚(环氧乙烷)(PEO)嵌段共聚物((EO)a-(PO)b-(EO)a，其中a＝2-80和b＝2-80)、两亲性合成聚酯或其组合。
实施11.根据实施9的组合物，其中所述亲水性合成聚酯通过使多羧酸(PCA)与选自以下的至少一种亲水性二醇(DPHO)反应来制备：1,4-丁二醇、1,6-己二醇、聚(乙二醇)(PEG)、癸二酸-1,2-丙二醇酯、或聚(乙烯醇)或其任意组合，并且其中所述亲水性合成聚酯具有范围从500至20,000道尔顿(Da)，优选从600至15,000Da，且更优选从800至10,000Da的重均分子量。
实施12.根据实施10的组合物，其中所述两亲性合成聚酯通过使多羧酸(PCA)与选自1,8-辛二醇、聚(丙二醇)(PPG)、聚己内酯(PCL)二醇或聚丙交酯(PLA)二醇的至少一种疏水性二醇(DPHO)、选自1,4-丁二醇、1,6-己二醇、聚(乙二醇)(PEG)、癸二酸-1,2-丙二醇酯或聚(乙烯醇)或其组合的至少一种亲水性二醇(DPHO)反应来制备，并且其中所述两亲性合成聚酯具有范围从500至20,000Da，优选从600至15,000Da，且更优选从800至10,000Da的分子量。
实施13.根据实施12的组合物，其中所述多羧酸包括以下三羧酸和四羧酸中的一种，包括但不限于乌头酸、丙烷-1,2,3-三羧酸、松蕈酸、柠檬酸、异柠檬酸、均苯三甲酸、呋喃四甲酸、联苯基-3,3′,5,5′-四甲酸、双(环丙烷)-2,2',3,3'-四甲酸、1,2,3,4-丁烷四羧酸、1,2,3,4-环丁烷四甲酸和(+)-(18-冠醚-6)-2,3,11,12-四甲酸或其组合。
实施14.根据前述实施任一项的组合物，其中所述改性剂以低于10w/v％的浓度存在。
实施15.根据实施14的组合物，其中所述改性剂以0.25％至5w/v％的浓度存在。
实施16.根据前述实施任一项的组合物，其中所述至少一种盐包括与所述胶凝组分相容的一价、二价、多价阳离子或阴离子的一种或多种。
实施17.根据前述实施任一项的组合物，其中所述至少一种盐包括钠盐、钙盐或二者、镁盐、铜盐、锌盐或前述两种或更多种的组合。
实施18.根据实施17的组合物，其中所述钠盐包括氯化钠、碳酸氢钠、磷酸氢二钠、硫酸钠、葡萄糖酸钠、乳酸钠、柠檬酸钠或甘油磷酸钠，并且其中所述钙盐包括氯化钙、乳酸钙、葡萄糖酸钙、四硼酸钙、柠檬酸钙、硫酸钙、甘油磷酸钙或磷酸氢钙，并且其中所述镁、铜或锌盐包括氯化镁、氯化铜(CuCl2或CuCl)或氯化锌。
实施19.根据前述实施任一项的组合物，其中所述至少一种盐以低于0.9w/v％的浓度存在。
实施20.根据实施18所述的组合物，其中所述至少一种盐包括浓度为0.01至0.4w/v％的氯化钙。
实施21.根据前述实施任一项的组合物，其中所述组合物进一步包含着色剂。
实施22.根据实施21所述的组合物，其中所述着色染料包括亚甲基蓝、靛蓝胭脂红、卢戈氏碘液或吲哚菁绿、甲苯胺蓝、甲酚紫、刚果红、酚红、美国FDA用于食品和内服药用途的着色添加剂有效清单中列出的FD&C着色添加剂、或其组合。
实施23.根据前述实施任一项的组合物，其中所述组合物进一步包含以下的一种或多种：光致发光剂、防腐剂、消泡剂、稳定剂、抗氧化剂、光敏剂、治疗剂或其组合。
实施24.根据实施23的组合物，其中组合物至少包含光致发光剂，其中光致发光剂是呫吨衍生物、花青衍生物、量子点、硫化锌、铝酸锶或小分子荧光染料，并且其中小分子荧光染料通过使柠檬酸与含胺化合物反应来制造。
实施25.根据前述实施任一项的组合物，其中所述组合物可通过针注射，并且其中针是市售内镜针。
实施26.制造用于注射到人的靶组织中的可注射流体凝胶组合物的方法，所述方法包括在连续搅拌下产生混合物，其中混合物包含至少一种胶凝组分和改性剂。
实施27.实施26的制造可注射流体凝胶的方法，其中混合物进一步包含盐。
实施28.实施27的制造可注射流体凝胶的方法，其进一步包括：将混合物从连续搅拌中移除；冷冻干燥混合物以产生冻干粉末；和添加水以再溶解冻干粉末。
实施29.在内镜手术中使用可注射流体凝胶组合物的方法，该方法包括：将实施1-25任一项的组合物施用于人的靶组织，其中所述组合物变成粘性凝胶样或胶凝物质以提供持久的组织隆起和止血功能。
实施30.实施29的使用可注射流体凝胶的方法，其中施用组合物使用针直径为21至26号的内镜注射针进行。
以下提供了其它非限制性实施例。
实施例
实施例1：组合物1制备
通过改变作为组分(A)的藻酸钠(Kimica Corporation)与作为组分(C)的氯化钙的比率来制备表1中的测试样品(TS)1-5。具体地，为了制备测试样品，使用去离子水将藻酸钠和改性剂xxy84(在实施例3中说明)溶解在合适的容器中。随后，逐滴添加氯化钙溶液并在搅拌下连续混合以获得均匀且粘性的流体。亚甲基蓝可以以0.001％的浓度添加到TS1-5中作为着色剂。
表1用于制备测试样品(TS)1-5的每种组分的最终浓度.
实施例2：组合物2制备
通过改变作为组分(A)的藻酸钠(Kimica Corporation)与作为组分(B)的改性剂xxy84(在实施例3中说明)的比率来制备测试样品(TS)6-10。每种组分的最终浓度列举在下表2中。具体地，在合适的容器中，将与改性剂xxy84一起或不与改性剂xxy84一起的藻酸钠在去离子水中溶解并连续混合。随后，在搅拌下加入氯化钙溶液以获得均匀且粘性的溶液。亚甲基蓝可以以0.001％的浓度添加到TS 6-10中作为着色剂。
表2用于制备测试样品(TS)6-10的每种组分的最终浓度.
实施例3：改性剂的合成
通过根据表3，经由方便的一锅法缩聚，使多羧酸与1,8-辛二醇或PCL-500或PCL-1000和PEG-200和/或β-甘油磷酸酯反应来合成具有不同的疏水性二醇(1,8-辛二醇或聚己内酯二醇(PCL-500或PCL-1000))与亲水性二醇(聚乙二醇(PEG)或β-甘油磷酸酯)比率的改性剂。具体地，为了合成改性剂，将柠檬酸和不同摩尔比的疏水性二醇和亲水性二醇在烧瓶中于160℃下熔融。将混合物于145℃下在连续搅拌下反应以制备xxy51、xxy75、xxy77、xxy82、xxy84、CPP-2和CPP-4的预聚物。
表3用于改性剂的合成的每种单体的摩尔比.
实施例4：组合物3制备
在制备根据表4的组合物时，通过添加实施例3中合成的改性剂来制备测试样品(TS)11-13。具体地，在合适的容器中，将藻酸钠(Kimica Corporation)、改性剂xxy77、xxy82或xxy84与氯化钙一起在去离子水中在磁力搅拌下溶解并连续混合，以获得均匀且粘性的溶液。亚甲基蓝可以以0.001％的浓度添加到TS11-13中作为着色剂。
表4用于制备测试样品(TS)11-13的每种组分的最终浓度
实施例5：组合物4制备
根据表5制备添加有荧光剂吲哚菁绿(ICG)的测试样品(TS)14。具体地，在合适的容器中，将藻酸钠(Kimica Corporation)、改性剂xxy84和氯化钙在去离子水中在搅拌下溶解并连续混合以获得均匀且粘性的溶液。接着，加入ICG并剧烈混合以产生绿色着色，其强荧光发射可以在600-850nm的波长下被激发。
表5用于制备测试样品(TS)14的每种组分的最终浓度
实施例6：组合物5制备
根据表6制备测试样品(TS)15-17。具体地，在合适的容器中，将藻酸钠(KimicaCorporation)和氯化钙在去离子水中在搅拌下溶解并连续混合，接着加入并完全溶解泊洛沙姆188(Fisher Scientific)以获得均匀且粘性的溶液。
表6用于制备测试样品(TS)15-17的每种组分的最终浓度
实施例7：组合物6制备
根据表7制备测试样品(TS)18和19。具体地，在合适的容器中，将藻酸钠(KimicaCorporation)、低分子量的聚乙烯醇(PVA)(Fisher Scientific；平均MW 10,000-26,000Da)和四硼酸钙(钙离子可以介导藻酸钠的交联，同时硼酸根离子将有助于具有丰富-OH基团的PVA链之间的络合)在去离子水中在搅拌下完全溶解并连续混合过夜以获得均匀且粘性的溶液。
表7用于制备测试样品(TS)18和19的每种组分的最终浓度
实施例8：组合物7制备
根据表8制备测试样品(TS)20-24。具体地，在合适的容器中，将藻酸钠(KimicaCorporation)与改性剂xxy84/CPP-2/CPP-4一起在去离子水中完全溶解并连续混合。随后，在搅拌下加入氯化钙溶液以获得均匀且粘性的溶液。亚甲基蓝可以以0.001％的浓度添加到TS 20-24中作为着色剂。
表8用于制备测试样品(TS)20-24的每种组分的最终浓度
实施例9：组合物8制备
根据实施例8制备测试样品(TS)20。随后，将添加有0.001％亚甲基蓝的测试样品20溶液完全冷冻干燥以获得冻干粉末形式的组合物，其将通过加入水完全再溶解并经由涡旋连续混合。
实施例10：组合物9制备
根据表9制备测试样品(TS)25。具体地，在合适的容器中，首先将壳聚糖完全溶解在10v/v％乙酸中，并将含有β-甘油磷酸酯(xxy51)的改性剂溶解在去离子水中。接着，将壳聚糖和改性剂冷却至4℃，接着将改性剂溶液逐滴添加到放置在冰浴中的壳聚糖溶液中。加入1M预冷却的碳酸氢钠以将溶液pH调节至达到7.2-7.4。随后，在剧烈和连续的搅拌下将混合物温度缓慢升至37℃。
表9用于制备测试样品(TS)25的每种组分的最终浓度
实施例11：组合物10制备
根据表10制备测试样品(TS)26。具体地，在合适的容器中，将明胶(B型；低bloom)在60℃下溶解在水中，同时将壳聚糖溶解在1v/v％乙酸中。接着，在60℃下将壳聚糖溶液加入到明胶溶液中并充分混合。随后，在搅拌下将混合物温度逐渐冷却至4℃，接着加入1M预冷却的碳酸氢钠以将溶液pH调节至达到7.2-7.4。随后，在剧烈和连续的搅拌下加入氯化钠，将混合物温度升至室温。
表10用于制备测试样品(TS)26的每种组分的最终浓度
实施例12：注射压力测试
测试样品的注射压力使用与工作长度为2300mm且通道尺寸为2.8mm的管/导管连接的具有4mm、23号针的标准内镜注射器(Olympus,NM-400U-0423)测量。将填充有实施例1和实施例2中制备的测试样品的塑料注射器放置在注射泵(New Era 9000)上，该注射泵通过三通鲁尔锁旋塞阀与Olympus内镜注射器和压力计连接。在5mL/分钟的泵浦速率下，当通过内镜导管和针的稳定溶液流动发生时，记录压力计上的注射压力读数。测试在室温下进行。
表11测试样品(TS)1-5的注射压力
如表11中所示，显而易见的是，当改性剂浓度保持恒定时，可以通过改变藻酸钠(A)与氯化钙(C)的比率来有效地调节注射压力。此外，如表12中所示，改性剂xxy84的浓度从0％提高到2％，注射压力从38psi显著降低到9.2psi。在SA和Ca2+的浓度不变的情况下，改性剂的加入可以明显降低相应组合物的注射压力。
表12通过改变改性剂浓度制备的所选测试样品的注射压力
使用10mL注射器和与工作长度为2300mm且通道尺寸为2.8mm的管连接的针直径为23号且针长度为4mm的标准内镜注射器(Olympus，NM-400U-0423)，用手手动确定上述测试样品的可注射性。表13中提供了对所选测试样品的可注射性的评估。还包括以0.4％和0.24％溶解在去离子水中的市售透明质酸钠(HA)以及生理盐水作为参考。
当注射压力达到40psi或更高时，诸如0.4％透明质酸钠(HA)，难以通过用手手动推动注射器活塞来注射，并且溶液只能作为不连续流而不是稳定的连续流射出。与本领域报道的一致的是，高分子量(150至300万Da)的0.4％HA通常难以使用内镜注射器注射，因此在注射前需要进一步稀释。当HA溶液稀释至0.24％时，注射压力为26.8psi，其接近本领域中市售HA溶液(SigmaViscTM)的报道的注射压力值(21)。如手动确定的那样，0.24％HA使用内镜注射器略微难以注射，但仍然是可注射的，并且溶液能够连续射出。对于测试样品(TS)6和测试样品(TS)16，它们的注射压力为大约38psi，且溶液难以注射，但是如果足够用力地推动注射器活塞，则仍可通过内镜针连续注射。最后，当注射压力低于20psi时，诸如测试样品(TS)7、4和3，通过手动推动注射器，测试样品易于通过23号针注射。更重要的是，证实了改性剂(TS-10)在改善溶液可注射性方面比泊洛沙姆(TS-16)有效。
因此，如根据上述方法测量的，示例性组合物的注射压力可以调节至低于50psi的值，诸如低于30psi的值，和在一些实施中低于20psi的值。
表13与透明质酸钠和盐水对照的可注射性相比用手手动确定的所选测试样品的可注射性
实施例13：在离体猪胃和结肠试样上的测试
将冷冻的猪结肠和胃组织在维持在37.0℃±0.5℃的水浴中解冻，并随后切割5cm×5cm正方形部分的组织并用钉子在检查软木板上拉平。随后将测试样品(TS)2、灭菌的测试样品(TS)24、生理盐水和含有0.001％亚甲基蓝的生理盐水通过与常规25号针连接的5mL注射器注射到切割的猪胃/结肠的正方形试样的黏膜下层中，且注射体积为1mL±0.1mL。如图1中所示，与通过注射生理盐水获得的垫层相比，通过将1mL的TS-2注射到结肠组织中获得了具有陡峭和清晰边缘的更像球形和更高的垫层，并且此类具有清晰边缘的高垫层将有利于辅助随后的切除手术。
同时，将添加有0.001％亚甲基蓝的TS-2与具有相同量的亚甲基蓝的离子交联藻酸钠流体凝胶(0.175％ SA+0.028w/v％Ca2+)和盐水一起注射，以更好地观察垫层形态和在黏膜下层中形成的产物。在注射测试样品后15分钟，用解剖刀切开黏膜下垫层，并观察保持在黏膜下层中的最终蓝色产物。如图2中所示，出乎意料地发现，在注射前处于可流动状态的TS-2形成表现出稠化和流动性较差的状态的蓝色垫层，其保持在结肠组织的黏膜下空间中。离子交联的藻酸钠流体凝胶在注射后也形成类似的稠化垫层，并且相比之下，一旦切开垫层，盐水立即从黏膜下空间泄漏。此外，通过使用TS-2和藻酸钠流体凝胶可以观察到蓝色垫层的更受限的边缘，与之相比，盐水组中的表现出更分散的图案。在注射到猪胃组织后，也观察到具有陡峭和清晰边缘的为合意的球形的垫层(图3)，并且更重要的是，在15分钟后，注射的TS-2在黏膜下空间中始终形成稠化和流动性较差的产物，据信这有利于持久和延长的隆起。此外，在将垫层切开后，如图4A中所示，将灭菌的TS-24注射到结肠组织中也形成稠化的凝胶产品。在使用标准内镜针，用25ml盐水冲洗凝胶产物后，大部分蓝色垫层保留在切除部位覆盖剥离伤口，但在盐水中浸泡18小时后凝胶完全消散(图4B)。这指示形成的稠化产物在冲洗时抵抗被动扩散并提供相对稳定的伤口保护的能力。
实施例14：隆起持续时间测试
将冷冻的结肠组织在维持在37.0℃±0.5℃的水浴中解冻，并随后切割5cm×5cm正方形部分的组织并用钉子在检查软木板上拉平。随后分别将测试样品、生理盐水和0.4％透明质酸钠溶液(HA；Acros Organics；MW：1,700,000Da)通过与常规25号针连接的5mL注射器注射到猪结肠的黏膜下层中，且注射体积为1mL±0.1mL。在注射后，将针从试样中移除。在注射后5、10、15、20或30、45、60、75和90分钟记录形成的黏膜下垫层的形态和初始高度以及高度的变化。
在图2中可以观察到，初始处于可流动状态的测试样品(TS)2在注射到结肠组织的受限黏膜下层中之后可以产生稠化的流动性较差的产物。出乎意料的是，注射压力为14.4psi的TS-2产生的黏膜下垫层的隆起高度和90分钟隆起持续时间与具有43.4psi的高得多的注射压力的0.4％HA的相当(图5)。由TS-2和0.4％HA产生的垫层的初始高度和持续时间也明显优于使用生理盐水的。与0.4％HA相比，TS-2的隆起性能相当，同时具有实质上降低的注射压力，这具有很大的优势，尤其是对于内镜黏膜下注射应用。
此外，还评估了具有不同的疏水性二醇与亲水性二醇的比率的改性剂可如何影响黏膜下隆起，其结果显示于表14中。结果表明，与例如TS-11和12相比，在改性剂的组成中提高疏水性1,8-辛二醇的比率，诸如xxy84(TS-13)，或使用更长链的疏水性二醇，诸如CPP-2(TS-21)，有效地改善了生成的垫层的初始隆起高度和持续时间。这可能是因为组合物中提高的疏水性有助于防止垫层内的水分子向周围组织消散。
已经证明了使用内镜针将TS-21注射到新鲜回收的猪胃肠(GI)组织(包括食管和近端胃)中用于黏膜下提升的可行性。如图6中所示，2mL的TS-21成功地在近端胃上和食管组织上产生了优选的黏膜下垫层。勒除器可以容易地放置在形成的垫层上。在切除后，剩余的材料不妨碍使用内镜夹闭合切除部位。
表14在注射1mL测试样品后在离体结肠组织上形成的垫层的高度
实施例15：流变性和表观粘度测试
为了理解流变行为，使用具有60mm平板几何形状的TA Instrument的Discovery系列流变仪进行测试样品(TS)22的步进应变测量(step-strain measurement)。测试经由施加1％的低应变2分钟在6.3rad/s-1下开始。经由施加300％应变2分钟来诱导剪切稀化。随后将应变放松至1％持续2分钟以使流体凝胶恢复。作为结果(图7)，流体凝胶形式的TS-22在低应变(1％)下表现得像凝胶，并且储能模量随着应变的提高而突然降低，表现出液体行为，这是由于粒子间相互作用的破坏和随剪切应力提高而更大程度的粒子取向引起的。随着应变从300％降低到1％，观察到储能模量的快速恢复，这是由粒子间相互作用的恢复(液体行为：储能模量<损耗模量；固体行为：储能模量>损耗模量)引起。
通过使用Brookfield旋转粘度计测试流体凝胶组合物的表观粘度来进一步证实流体凝胶组合物的剪切稀化性质。具体而言，将适当量的TS-23装载到粘度计中，并通过启动转子的旋转开始测试，并记录表观粘度和扭矩读数。随后逐步提高转速，并记录每个速度下的粘度和扭矩读数。在测试完成后，绘制粘度相对于转速的剪切稀化图，并可以根据ASTMD2196，通过将低转速下的表观粘度除以10倍速度下的粘度来确定剪切稀化指数。典型的速度组合是0.6和6rpm、6和60rpm、10和100rpm。所得粘度比是在该转速范围内剪切稀化程度的指数，比率越高，指示剪切稀化越大。图8表现了TS-23的典型剪切稀化行为，其中转速提高导致表观粘度的突然降低。这对内镜注射应用来说是非常期望的性质。此外，TS-23的剪切稀化指数确定为在6.28-8.9范围内。
实施例16：胶凝粒子的显微图像
利用光学显微镜观察灭菌的TS-23和TS-24中的悬浮胶凝粒子，以证实流体凝胶组合物中胶凝粒子的形成。如图9中所示，观察到在灭菌的TS-23中产生的胶凝粒子大部分是球形的。然而，在TS-24中也观察到杆状凝胶粒子形态。
实施例17：细胞毒性测试
根据ISO 10993-5评估由作为代表性制剂的测试样品(TS)-3的直接接触引起的对L929细胞的体外细胞毒性。具体地，将滤片(Fisher scientific；Ap2501000；d＝1cm,表面积＝0.785cm2)充分浸泡在测试样品-3溶液或DI水中以吸收测试样品或DI水。接着，将滤片放置于在12孔板中培养的L929细胞的亚汇合层(>80％汇合度)的顶部以使测试样品与下方细胞直接接触。24小时后，移除滤片，并根据制造商的说明书通过细胞计数试剂盒(CCK)-8测量细胞活力。
如图10中所示，与测试样品-3直接接触24小时后细胞活力的降低为6％，小于30％，因此，测试样品-3被认为是非细胞毒性的。
实施例18：止血测试
通过全血凝固测定评估测试样品的止血性质。为了确定凝固时间，向10mL柠檬酸盐血中添加1mL的0.1M氯化钙(CaCl2)来激活凝固反应。在涡旋10秒后，将100μL血液样品添加到48孔板中，每个孔10μL样品。在所选时间点(3、4、5、6、7和8分钟)处，用PBS洗涤每个孔以停止凝固。随后重复洗涤凝块直至溶液变澄清。最终凝固时间定义为在孔中形成均匀凝块而在随后的孔中凝块尺寸不变的时间。
还通过分光光度法测量血液样品的相对吸光度来进行全血凝固测定。在2mL离心管中，加入20μL灭菌的TS-24和200μL柠檬酸盐牛血并混合在一起。向试管中加入20μL的0.1M氯化钙(CaCl2)来激活凝固反应并涡旋10秒。在所选的时间点(6、8、10、12、14、16和18分钟)处，将1mL的DI水添加到相应的试管中以裂解未捕集在凝块中的红细胞。接着，将200μL溶液转移到96孔板中并在540nm下测量。
根据图11，仅添加PBS的对照组的凝固时间为6分钟，而TS-3的加入使凝固时间提前至约5.5分钟。此外，通过提高组合物中的钙离子浓度，例如通过使测试样品3的钙浓度加倍，测试样品4的血液凝固进一步加速至在5分钟时完成。一致地，在裂解红细胞后，发现与Orise凝胶和PBS对照组相比，TS-24在灭菌后在所有时间点均诱导加速的血液凝固(图12)，这支持了本公开中提供的组合物表现出在切除手术期间或之后可有利于血液控制的止血性质的观点。

Claims (29)

1.具有止血功能的剪切稀化流体凝胶组合物，其包含：
胶凝剂，
盐，
改性剂，和
水，
其中所述组合物具有低于50psi的注射压力。
2.权利要求1所述的组合物，其中所述改性剂通过降低所述组合物的注射压力改善所述组合物的可注射性。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物具有低于30psi的注射压力。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物具有1至20，且优选1至12的剪切稀化指数。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述胶凝剂包含至少一种多糖或至少一种蛋白，其中
所述至少一种多糖是黄原胶、k-卡拉胶、结冷胶、瓜尔胶、刺槐豆胶、果胶、羧甲基淀粉、羟乙基淀粉、藻酸盐、壳聚糖、琼脂糖或其组合，并且其中
所述至少一种蛋白是乳清蛋白、明胶、胶原、白蛋白或前述两种或更多种的组合。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述至少一种多糖选自藻酸盐和壳聚糖，或其中所述至少一种蛋白是明胶。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述胶凝剂0.05至6.5w/v％的浓度存在。
8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述改性剂包含亲水性聚合物、两亲性聚合物或二者。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述改性剂包含所述亲水性聚合物，并且所述亲水性聚合物是聚(乙二醇)(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚丙烯酸(PAA)、聚(甲基丙烯酸)、亲水性合成聚酯或其组合。
10.根据权利要求8所述的组合物，其中所述改性剂包含所述两亲性聚合物，并且所述两亲性聚合物包括聚(环氧乙烷)(PEO)-聚(环氧丙烷)(PPO)-聚(环氧乙烷)(PEO)嵌段共聚物((EO)a-(PO)b-(EO)a，其中a＝2-80和b＝2-80)、两亲性合成聚酯或其组合。
11.根据权利要求9所述的组合物，其中所述亲水性合成聚酯通过使多羧酸(PCA)与选自以下的至少一种亲水性二醇(DPHO)反应来制备：1,4-丁二醇、1,6-己二醇、聚(乙二醇)(PEG)、癸二酸-1,2-丙二醇酯、或聚(乙烯醇)或其任意组合，并且其中所述亲水性合成聚酯具有范围从500至20,000Da，优选从600至15,000Da，且更优选从800至10,000Da的分子量。
12.根据权利要求10所述的组合物，其中所述两亲性合成聚酯通过使多羧酸(PCA)与选自1,8-辛二醇、聚(丙二醇)(PPG)、聚己内酯(PCL)二醇或聚丙交酯(PLA)二醇的至少一种疏水性二醇(DPHO)、选自1,4-丁二醇、1,6-己二醇、聚(乙二醇)(PEG)、癸二酸-1,2-丙二醇酯或聚(乙烯醇)或其组合的至少一种亲水性二醇(DPHO)反应来制备，并且其中所述两亲性合成聚酯具有范围从500至20,000Da，优选从600至15,000Da，且更优选从800至10,000Da的分子量。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述多羧酸包括以下三羧酸和四羧酸中的一种，包括但不限于乌头酸、丙烷-1,2,3-三羧酸、松蕈酸、柠檬酸、异柠檬酸、均苯三甲酸、呋喃四甲酸、联苯基-3,3′,5,5′-四甲酸、双(环丙烷)-2,2',3,3'-四甲酸、1,2,3,4-丁烷四羧酸、1,2,3,4-环丁烷四甲酸和(+)-(18-冠醚-6)-2,3,11,12-四甲酸或其组合。
14.根据权利要求1所述的组合物，其中所述改性剂以低于10w/v％的浓度存在。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述改性剂以0.25％至5w/v％的浓度存在。
16.根据权利要求1所述的组合物，其中所述至少一种盐包括与所述胶凝组分相容的一价、二价、多价阳离子或阴离子的一种或多种。
17.根据权利要求1所述的组合物，其中所述至少一种盐包括钠盐、钙盐、镁盐、铜盐、锌盐或前述两种或更多种的组合。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述钠盐包括氯化钠、碳酸氢钠、磷酸氢二钠、硫酸钠、葡萄糖酸钠、乳酸钠、柠檬酸钠或甘油磷酸钠，并且其中所述钙盐包括氯化钙、乳酸钙、葡萄糖酸钙、四硼酸钙、柠檬酸钙、硫酸钙、甘油磷酸钙或磷酸氢钙，并且其中所述镁、铜或锌盐包括氯化镁、氯化铜(CuCl2或CuCl)或氯化锌。
19.根据权利要求1所述的组合物，其中所述至少一种盐以低于0.9w/v％的浓度存在。
20.根据权利要求18所述的组合物，其中所述至少一种盐包括浓度为0.01至0.4w/v％的氯化钙。
21.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物进一步包含着色剂。
22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述着色染料包括亚甲基蓝、靛蓝胭脂红、卢戈氏碘液或吲哚菁绿、甲苯胺蓝、甲酚紫、刚果红、酚红、美国FDA用于食品和内服药用途的着色添加剂有效清单中列出的FD&C着色添加剂、或其组合。
23.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物进一步包含以下的一种或多种：光致发光剂、防腐剂、消泡剂、稳定剂、抗氧化剂、光敏剂、治疗剂或其组合。
24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述组合物至少包含光致发光剂，其中所述光致发光剂是呫吨衍生物、花青衍生物、量子点、硫化锌、铝酸锶或小分子荧光染料，并且其中所述小分子荧光染料通过使柠檬酸与含胺化合物反应来制造。
25.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物可通过针注射，并且其中所述针是市售内镜针。
26.制造用于注射到人的靶组织中的可注射流体凝胶组合物的方法，所述方法包括：
在连续搅拌下产生混合物，其中所述混合物包含至少一种胶凝组分和改性剂。
27.权利要求26所述的制造可注射流体凝胶的方法，其中所述混合物进一步包含盐。
28.权利要求27所述的制造可注射流体凝胶的方法，所述方法进一步包括：
将所述混合物从连续搅拌中移除；
冷冻干燥所述混合物以产生冻干粉末；和
添加水以再溶解所述冻干粉末。
29.在内镜手术中使用可注射流体凝胶组合物的方法，所述方法包括：
将权利要求1所述的组合物施用于人的靶组织，其中所述组合物变成粘性凝胶样或胶凝物质以提供持久的组织隆起和止血功能。
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