CN117309727A - 分选不同亚型细胞的方法以及鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物学领域，涉及分选不同亚型细胞的方法以及鉴定方法，具体地，涉及利用流式细胞术进行不同亚型细胞的分选的方法，以及利用多组学技术对不同亚型细胞进行鉴定的方法。具体地，所述分选不同亚型细胞的方法，包括如下步骤：(1)获取待区分亚型的目标细胞；(2)确定目标细胞群落的范围；(3)在步骤(2)的范围中划分分选框；(4)收集所需分选框内的细胞。本发明的方法能够准确精密地区分不同亚型的细胞，有效地弥补了现有方法的不足，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物学领域，涉及分选不同亚型细胞的方法以及鉴定方法，具体地，涉及利用流式细胞术进行不同亚型细胞的分选的方法，以及利用多组学技术对不同亚型细胞进行鉴定的方法。
背景技术
不同的细胞在生命体内执行不同的作用，它们根据不同的特性(例如生理、生化、免疫、遗传或分子生物学性状等)可区分为不同的表型。认识和区分它们，对于理解细胞在生理和疾病下表现的宿主反应有重要的作用。
流式细胞术不仅可以同时检测细胞的生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状等表型，还可以通过充电分选技术以实现多种特定表型细胞的分离，从而高通量地辨别和获取不同表型的细胞。经过数十年的发展，流式细胞术已经成为高效、快速的经典方法，并可实现单细胞层面的分析。但是，对于同一表型的细胞，仍然可能存在着分子组成和功能上的不同，因而可以被认为属于不同的亚型。比如，同样是血液中的B淋巴细胞，它们的正在执行的任务可能不同，这表明它们内部的分子一定存在着差异。
蛋白质组学是以蛋白质为基本研究对象，用系统生物学的方法，研究生物体的细胞、组织的组成和变化规律的科学。蛋白质组可以系统地定量成千上万种蛋白在不同样本中的表达，从而高通量、高深度地对研究对象进行分析。经过二十来年的发展，蛋白质组学已经大规模地应用于生物和临床研究领域。
目前，对于不同亚型的细胞的区分，仍然缺少有效的技术手段。
发明内容
本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，惊奇地发现，通过流式分选术对同一表型的细胞，根据理化性质(FSC/SSC参数等)的差异进行分选、并通过蛋白质组和/或其它多组学技术来表征它们的蛋白组成差异，能够对细胞亚型实现更准确精密的区分，有效弥补现有方法的不足。由此提供了下述发明：
本发明的一个方面涉及一种分选不同亚型细胞的方法，包括如下步骤：
(1)获取待区分亚型的目标细胞；
(2)确定目标细胞群落的范围；
(3)在步骤(2)的范围中划分分选框；
(4)收集分选框内的细胞。
在本发明的一些实施方式中，所述的分选不同亚型细胞的方法，其中，步骤(1)中，通过流式细胞术获取所述目标细胞。
在本发明的一些实施方式中，所述的分选不同亚型细胞的方法，其中，将细胞悬液上样到流式细胞仪中，通过调节前向散射光(FSC) 的筛选范围、侧向散射光(SSC)的筛选范围、和/或根据荧光响应强度，来保留待区分亚型的目标细胞(图1A)。
在本发明的一些实施方式中，所述的分选不同亚型细胞的方法，其中，所述细胞悬液来源于哺乳动物的体细胞(somatic cell)、血细胞(blood cell)、细胞系来源的细胞、或新鲜组织(fresh tissue)；
优选地，对细胞进行荧光染色处理。用于活细胞荧光激活细胞分选(FACS)。
从来源样本中提取获得细胞悬液。
可在显微镜下观察和估算细胞的大小、以确定流式分选中使用的喷嘴大小。
在本发明的一些实施方式中，所述的分选不同亚型细胞的方法，其中，步骤(2)中，通过筛除细胞碎片的部分和边缘区域确定目标细胞群落的范围。
其在本发明的一些实施方式中，所述的分选不同亚型细胞的方法，中，步骤(3)中，根据FSC、SSC和/或荧光响应强度划分分选框；优选地，分选框的前向散射光范围、侧向散射光范围和/或荧光响应强度小于步骤(2)中的范围的前向散射光范围、侧向散射光范围和/或荧光响应强度。
在本发明的一些实施方式中，所述的分选不同亚型细胞的方法，步骤(3)中，所述分选框的数目大于1个，优选大于8个，例如为 10-100个、20-80个、30-75个、40-75个、9个、16个、25个、36个、 49个、64个、81个或100个。
分选框是对划定范围的细分。特别地，当步骤(2)中的划定范围相当于一个分选框时，步骤(2)和步骤(3)成为一个步骤。
所述分选框是重合或者不重合的，优选不重合的。
所述分选框的大小相同或不同。
本发明中，定义每个分选框为一个PIXEL。本发明的分选不同亚型细胞的方法也简称为PIXEL法。
在目标细胞的范围内，划定更小范围的FSC、SSC和/或荧光响应强度，以形成分选框(gate)。不同分选框内的细胞，它们的物理、化学参数皆有差异，包括：FSC的不同、SSC的不同、和/或荧光响应强度的不同等。
在目标细胞范围内设置若干个不重合的分选框(各个分选框的大小可以相同或不同)，分选框数目一般大于8，根据实验需求和样本中的细胞分布来确定(图1B，可在软件的界面操作)。
在本发明的一些实施方式中，所述的分选不同亚型细胞的方法，其中，步骤(4)中，收集每一个分选框内的细胞或者部分分选框内的细胞。可以根据具体需要选择收集全部还是部分分选框内的细胞。
对于每个分选框进行细胞分选(收集细胞)。分选出的细胞数目一般在1到1E5的范围内，根据实验需求和样本中的细胞总数来确定。
对于细胞的收集可选96孔板或384孔板模式，每个孔收集来自一个分选框的细胞，以实现对于划出的所有分选框内细胞进行一步收集 (收集优选在流式细胞仪进行)。也可以使用单管模式，每次收集一个分选框内的细胞。
用于收集的孔板或单管内，可提前加入缓冲液。缓冲液根据后续实验设计，可选细胞裂解缓冲液，如8mol/L的尿素试剂；或蛋白酶抑制剂缓冲液，如溶在50mmol/L的碳酸氢铵溶液中的1倍浓度的蛋白酶抑制剂。也可不加入缓冲液。
PIXEL本意为像素，表意各分选框；PIXEL也是Proteome In X cELls的缩写，表意为X个细胞的蛋白质组。几种类似的方法包括 MIXEL，全称为Metabolome In X cELls，表意为X个细胞的代谢组； GIXEL,全称为Genome In X cELls，表意为X个细胞的基因组，等等。它们在该步骤的原理和操作与PIXEL法相同，也属于保护范围内。
对每个分选框内的细胞进行一个或多个组学分析(图1C)。
在本发明的一些实施方式中，所述的分选不同亚型细胞的方法，其中，步骤(4)中，单个分选框内收集1至1E5个细胞。
在本发明的一些实施方式中，所述的分选不同亚型细胞的方法，其中，所述细胞是人乳腺鳞状癌细胞HCC1806。
在本发明的一些实施方式中，所述的分选不同亚型细胞的方法，其中，所述细胞是人PBMC细胞(人外周血单个核细胞)。
本发明的另一方面涉及一种对不同亚型细胞进行鉴定的方法，包括如下步骤：
对本发明中任一项所述的分选不同亚型细胞的方法的步骤(4)中收集的细胞进行组学分析。
在本发明的一些实施方式中，所述的对不同亚型细胞进行鉴定的方法，其中，所述组学分析为蛋白质组学分析、代谢组学分析或基因组学分析。
对分选细胞进行样本制备，得到可进行检测分析的样本。必选蛋白质组实验，可选代谢组实验或基因组实验。
对于蛋白质组实验，细胞样本处理包括细胞裂解、蛋白质孵化、蛋白质酶解、纯化四个主要步骤；除蛋白质酶解外，都可以根据实际需要做添加或删除。
裂解步骤通过破碎或溶解细胞膜，使目标样本细胞内和细胞壁的蛋白暴露。可以通过机械裂解法、化学裂解法或酶裂解法等进行处理。对于已经预处理的样本，此步骤可以省略。
蛋白质孵化将来自目标样本的蛋白中二硫键打开、并键合上烷基基团，以破环其二级结构，为充分酶解做准备。常用的还原化试剂有非硫醇还原剂(三(2-羧乙基)膦盐酸盐等)、硫醇类还原剂(二硫苏糖醇等)；烷基化试剂有碘乙酰胺等。在部分实验条件(如在裂解步通过机械应力已经打开二硫键)和要求(如研究对象包括蛋白中的二硫键)下，蛋白质的孵化步骤可以省略。
蛋白质酶解将目标样本的蛋白按序列的特点位点进行水解。根据实验目的，可以选用如：胰蛋白酶、胞内蛋白酶Lys-C或其他可有效处理特异性氨基酸序列位点的水解酶，也可能有多种酶的联用。得到的产物是分选细胞的多肽溶液。不拘于理论的限制，孵化和酶解的目的是把蛋白样本制备成可以用质谱分析的多肽形式。
纯化将样本中引入的盐分和杂质除去。一般情况下，使用多肽脱盐柱或滤膜进行处理；也可以在第五步使用的液相色谱系统中采用线上除盐的方案。若反应体系中未引入或仅少量引入盐分和杂质，该步骤可以省略。
若使用96孔板或384孔板的体系，可以在一次样本实验中高通量地处理多个样本；也可以使用自动化移液工作站、微流控系统等装置来自动化上述步骤。
若实验需要较高的检测深度，可在完成上述步骤后，增加分馏的操作，对获得的分选细胞的多肽溶液进行根据理化性质分级。
对于代谢组实验，实验流程分为细胞裂解、代谢物分离、脱盐；对于基因组实验，实验流程分为细胞裂解、基因分离、基因扩增。可根据实验需求来确定是否进行；实验方法可以根据实验者的需求来设计。
在本发明的一些实施方式中，所述的对不同亚型细胞进行鉴定的方法，其中，蛋白质组学分析包括细胞样本处理、高效液相色谱和质谱。
通过液相色谱对多肽溶液进行梯度分离和洗脱后、采用质谱进行信号数据采集。液相色谱可以采用预柱-分析柱串联模式或分析柱模式；质谱通常采用串联模式。可以根据实验所需以确定数据采集模式、采集分辨率、和各项参数。
不拘于理论的限制，蛋白质组经过样本制备后获得的样本可能包含来自高达数以千计的蛋白的多肽。因此，直接打质谱会造成信号冗杂。因此，使用液相对这些多肽进行梯度分离，每个单位时间下只有一部分多肽被洗脱，然后进入质谱中进行分析。在样本包含的多肽数目或者来源较少的情况下，也可以直接进行质谱分析。
对得到的质谱文件进行数据分析。可采用商业化蛋白质组分析软件如ProteomeDiscoverer(Thermo Fischer)等，或学术软件如DIA-NN 等进行分析。得到的结果是包括蛋白种类、和它们在各PIXEL样本(一个分选框作为一个样本)中的定量或半定量数据矩阵(使用各蛋白在质谱中的响应，来作为它们的相对表达量)。
在本发明的一些实施方式中，所述的对不同亚型细胞进行鉴定的方法，其中，所述细胞样本处理包括细胞裂解、蛋白质孵化、蛋白质酶解、蛋白质纯化。
在本发明的一些实施方式中，所述的对不同亚型细胞进行鉴定的方法，包括对获得的蛋白质组的结果进行分析，获得各分选框样本中的蛋白质差异和/或相似度的步骤；
优选地，所述分析为无监督降维分析或差异蛋白统计；
优选地，所述无监督降维分析为主成分分析或t-SNE；
优选地，所述差异蛋白统计分析为t-test或ANOVA。
对获得的蛋白质组结果分析，看各PIXEL样本中的蛋白质差异。建议用如下方法进行数据解读：
通过无监督降维分析，如主成分分析、t-SNE等，看不同PIXEL 样本间的差异和相似度；
通过差异蛋白统计分析(如：t-test等，即比较该组中的哪些蛋白相较于其他组出现了升高或降低。使用数学就可以得到。可以用代码分析，也有公开的计算公式)，看存在差异的PIXEL样本的蛋白表达；
联合蛋白解读(即：对结果的分析。通过查阅文献，来分析这些蛋白的功能、作用，从而对它们的表达量差异做解释)，对差异蛋白进行分析，筛选出最具特征的蛋白(结合生物学知识等，找到统计学上有差异、生物学上可解释的蛋白)作为区分不同PIXEL的生物标记物。
最终获得的结果，可以实现通过蛋白质的表达与否、以及表达量的多少，实现不同分选框内的细胞亚型区分。通过不同分选框，物理上已经将不同亚型的细胞区分开了，所谓的“蛋白质的表达与否、以及表达量的多少”，是对已经区分开的细胞亚型进行注解。
数据解读步骤中，也可以考虑使用机器学习等算法帮助数据分析和蛋白筛选。
数据解读步骤中，也可结合基因组、代谢组等多组学数据，帮助区分。
在本发明的一些实施方式中，所述的对不同亚型细胞进行鉴定的方法，还包括如下步骤：
根据组学分析的结果对本发明中任一项所述的分选不同亚型细胞的方法进行验证。
获得一批独立实验下分选出的细胞，获得的蛋白结果，对这些细胞进行区分。根据它们在流式细胞术中的分布，验证区分的正确性。
本发明中，术语“细胞表型”是涉及基因和蛋白表达的多个细胞过程的集合体，这些过程导致细胞特定的形态和功能。一种细胞表型下可能包括多种细胞亚型。
本发明中，术语“细胞亚型”是同一类细胞内、因基因蛋白等内部差异、而产生的不同子分类。
本发明中，术语“宿主反应”是指在不同生理和疾病条件下发生的体内变化。举例：得新冠后，体内会募集大量免疫细胞，也会产生抗体。细胞在此功能中起到一系列调节作用。细胞表型不同，在生理和疾病下表现的宿主反应也不同。
本发明中，术语“细胞群落”是指在一定时间和一定空间上的细胞分布。
发明的有益效果
本发明取得了如下的技术效果(1)-(5)项中的一项或多项：
(1)不需要对目标细胞进行多重染色或标记，方便、经济。
(2)能够完成对目标细胞数百种亚型的同步分选和分析、通量高。
(3)能够完成数千种目标细胞蛋白的定性和定量，深度高、准确性高。
(4)可以根据研究者的需求来划定目标细胞和确定实验数目，灵活度高。
(5)能够兼容现有的所有细胞分选模式、蛋白质组实验流程、和数据分析方案，扩展性强。
附图说明
图1A：对目标细胞群落划定范围。
图1B：对图1A划定的范围内的细胞使用PIXEL法划分分选框。每个框(小格)代表一个分选框。
图1C：对每个分选框内的细胞进行多组学分析。不同颜色(或不同灰度)代表不同的组学分析。
图2A：对HCC1806细胞群落划定分选范围。
图2B：对范围内的HCC1806细胞使用PIXEL法划分分选框。每个小框代表一个分选框。
图2C：PIXEL划分程式(方法)一，9格。
图2D：PIXEL划分程式(方法)二，64格。
图3A：对人源PBMC细胞群落划定分选范围、圈取淋巴细胞群落。
图3B：对人源PBMC细胞群落划定分选范围、圈取单核细胞群落。
图3C：淋巴细胞和单核细胞的蛋白鉴定量统计。误差线来自三次技术重复实验的计算。
图3D：淋巴细胞和单核细胞的蛋白定量结果分析。使用pearson 相关性分析；a bc分别表示三次技术重复。
图3E：淋巴细胞和单核细胞的蛋白标记物分析。横轴表示蛋白基因名，纵轴为蛋白标记物的质谱信号响应。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：对人乳腺鳞状癌细胞系HCC1806的PIXEL法分选
1.实验材料和仪器
HCC1806细胞系
Sony MA900流式分选仪
光学显微镜
试剂及耗材
PBS,1x
96孔板
2.实验步骤
1)细胞准备
取出培养的HCC1806细胞，显微镜下观察形态，确认正常后使用1x浓度的PBS清洗三次，转移至流式管中。不使用染料染色；预备用Sony MA900流式分选仪进行细胞分选。
2)PIXEL法细胞筛选。
仪器准备操作的流程同仪器说明书。在选择框时，首先筛除细胞碎片的部分和边缘区域(图2A)，得到目标细胞区域；第二步对目标细胞区域进行PIXEL分格(图2B)。在此实施例中，设定两种方法，方法一对区域分为大小相同的9格(图2C)；方法二对区域分为大小相同的64格(图2D)(每个格也可以设置为大小不同)。
开启分选过程，细胞按设定分格进行分离，并分选至不加入缓冲液的96孔板中。方法一中，对于每个PIXEL框，预设分选10000个 HCC1806细胞。
3.实验结果
本实验获得了精准计数的、不同FSC和SSC参数的9个10000 个HCC1806细胞群。通过本实验，从操作上证实了PIXEL分选法在流式细胞仪器上实现的可行性。
实施例2：对PBMC的PIXEL-MS法蛋白质组分析
本实施例提供了对PBMC细胞(peripheral blood mononuclear cell，外周血单个核细胞)进行PIXEL-MS法蛋白质组分析的过程，证明本发明的方法可以实现包括蛋白质组分析在内的多种下游高通量分析。
1.实验材料和仪器
商品化的人源PBMC，已通过伦理审查
Sony MA900流式分选仪
Bruker timsTOFpro质谱仪
Bruker nanoElute高效液相色谱
Labcondo旋转干燥仪
Eppendorf离心机
试剂及耗材
PBS,1x
96孔板
Waters RapiGest裂解液
三(2一氯乙基)磷酸酯TCEP还原剂
碘乙酰胺IAA烷基化试剂
胰蛋白酶Trypsin
Thermo Spin Tip蛋白除盐柱
三氟乙酸
乙酸
乙腈
软件：蛋白质组数据分析软件DIA-NN。
2.实验步骤
1)细胞准备
复苏冻存的人源PBMC细胞，显微镜下观察形态，确认正常后使用1x浓度的PBS清洗三次，转移至流式管中。不使用染料染色；预备用Sony MA900流式分选仪进行细胞分选。
2)细胞筛选
仪器准备操作的流程同仪器说明书。选择特征为淋巴细胞和单核细胞的细胞亚群。分别划定目标细胞亚群的范围(图3A、图3B)。使用96孔板模式进行分选，开启分选过程。细胞按设定分选框进行分离，并分选至不加入缓冲液的96孔板中。
3)蛋白质组实验
取出5000个单核细胞(PIXEL,X＝5000)三组(各组取自相同的分选框；作为技术重复)、和10000个淋巴细胞(PIXEL,X＝10000) 三组(各组取自相同的分选框；作为技术重复)，分别进行蛋白质组实验。
将获得的细胞进行冻干处理；之后加入20μL 0.1％RapiGest裂解液，于60℃下，600rpm涡旋孵化30分钟。对于裂解产物，加入1μL 100mM TCEP还原剂，于37℃下，600rpm涡旋孵化45分钟；加入1μL 800mM IAA烷基化试剂，于25℃避光条件下，600rpm涡旋孵化45 分钟。之后加入酶/底物比例为1/2.5的胰蛋白酶，于37℃下，600rpm 涡旋过夜。加入1μL 10％三氟乙酸终止反应。酶解产物使用除盐柱进行除盐，得到的产物在旋转干燥仪中，于45℃下旋干。使用12.5μL 质谱缓冲液A(100％水，0.1％乙酸)进行复溶。
4)数据采集和分析
对复溶后的多肽样本，使用高效液相色谱串联高分辨质谱进行分析。对于单核细胞组，取4μL上样；对于淋巴细胞组，取2μL上样。使用30分钟有效梯度、反相亲和色谱。具体色谱条件：流动相A相由100％水及0.1％甲酸构成；流动相B相由20％水,80％乙腈，0.1％甲酸构成。所用试剂均为质谱级。在30分钟的有效梯度内，质谱缓冲液B占比从2％上升到40％。此后，质谱缓冲液B占比在2分钟内上升至80％，并保持5分钟以冲洗色谱柱。使用数据非依赖型采集模式收集质谱数据，其中一级质谱分辨率为60000，二级质谱分辨率为30000。
对于采集获得的数据，使用DIA-NN软件，采用不依赖库 (library-free)模式进行分析；参考文件选用人源的fasta，包含20385 个蛋白。
3.实验结果
如图3C至图3E所示。
结果显示，单核细胞和淋巴细胞分别鉴定了平均3516和3832种蛋白(图3C)，远超过了当前流式细胞术可达到的蛋白靶点数目(当前流式细胞术可达到的蛋白靶点数目不同仪器有区别，一般20个以内)；单核细胞和淋巴细胞在三次生物重复实验下的定量结果相关性 (皮尔森相关系数)分别为平均0.96和0.91(图3D)，体现了方法的可重复性和稳定性；而单核细胞和淋巴细胞之间的定量结果相关性平均约为0.6，体现了这两种细胞群落的差异性。
鉴定结果中包括了一系列已知的血细胞标记物，其中：
CD14和CD163属于单核细胞群落的特征标记物，它们在单核细胞的三次实验中都重复鉴定到、而在淋巴细胞中没有鉴定到(图3E)；
CD3(CD3D,CD3E,CD3G)和CD4属于淋巴细胞细胞群落中B 细胞和T细胞的特征标记物，它们在淋巴细胞的三次实验中都重复鉴定到，而在单核细胞中没有鉴定到；
CD47和CD48是非特异性的细胞标记物，它们在所有细胞中都被重复鉴定到。
结果表明，本发明的方法能够实现对细胞亚型的精确区分和鉴定。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (13)
1.一种分选不同亚型细胞的方法，包括如下步骤：
(1)获取待区分亚型的目标细胞；
(2)确定目标细胞群落的范围；
(3)在步骤(2)的范围中划分分选框；
(4)收集分选框内的细胞。
2.根据权利要求1所述的分选不同亚型细胞的方法，其中，步骤(1)中，通过流式细胞术获取所述目标细胞。
3.根据权利要求2所述的分选不同亚型细胞的方法，其中，将细胞悬液上样到流式细胞仪中，通过调节前向散射光的筛选范围、侧向散射光的筛选范围、和/或根据荧光响应强度，来保留待区分亚型的目标细胞。
4.根据权利要求3所述的分选不同亚型细胞的方法，其中，所述细胞悬液来源于哺乳动物的体细胞、血细胞、细胞系来源的细胞、或新鲜组织；
优选地，对细胞进行荧光染色处理。
5.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的分选不同亚型细胞的方法，其中，步骤(2)中，通过筛除细胞碎片的部分和边缘区域确定目标细胞群落的范围。
6.根据权利要求1至5中任一权利要求所述的分选不同亚型细胞的方法，其中，步骤(3)中，根据前向散射光、侧向散射光和/或荧光响应强度划分分选框；
优选地，分选框的前向散射光范围、侧向散射光范围和/或荧光响应强度小于步骤(2)中的范围的前向散射光范围、侧向散射光范围和/或荧光响应强度；
优选地，所述分选框的数目大于8个，例如为10-100个、20-80个、30-75个或40-75个。
7.根据权利要求1至6中任一权利要求所述的分选不同亚型细胞的方法，其中，步骤(4)中，单个分选框内收集1至1E5个细胞。
8.一种对不同亚型细胞进行鉴定的方法，包括如下步骤：
对权利要求1至7中任一权利要求所述的分选不同亚型细胞的方法的步骤(4)中收集的细胞进行组学分析。
9.根据权利要求8所述的对不同亚型细胞进行鉴定的方法，其中，所述组学分析为蛋白质组学分析、代谢组学分析或基因组学分析。
10.根据权利要求9所述的对不同亚型细胞进行鉴定的方法，其中，蛋白质组学分析包括细胞样本处理、高效液相色谱和质谱。
11.根据权利要求10所述的对不同亚型细胞进行鉴定的方法，其中，所述细胞样本处理包括细胞裂解、蛋白质孵化、蛋白质酶解、蛋白质纯化。
12.根据权利要求9至11中任一权利要求所述的对不同亚型细胞进行鉴定的方法，包括对获得的蛋白质组的结果进行分析，获得各分选框样本中的蛋白质差异和/或相似度的步骤；
优选地，所述分析为无监督降维分析或差异蛋白统计；
优选地，所述无监督降维分析为主成分分析或t-SNE；
优选地，所述差异蛋白统计分析为t-test或ANOVA。
13.根据权利要求9至12中任一权利要求所述的对不同亚型细胞进行鉴定的方法，还包括如下步骤：
根据组学分析的结果对权利要求1至7中任一权利要求所述的分选不同亚型细胞的方法进行验证。
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