CN117298258A - 一种高效递送肿瘤抗原的抗肿瘤疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高效递送肿瘤抗原的抗肿瘤疫苗及其制备方法和应用，所述抗肿瘤疫苗外层是由流感病毒诱导发生免疫原性死亡的肿瘤细胞的细胞膜，内层为包裹了肿瘤抗原的PLGA纳米颗粒，可高效递送肿瘤抗原并达到抗肿瘤作用；所述流感病毒为甲型流感病毒A/WSN/33 H1N1；所述肿瘤细胞为B16‑F10肿瘤细胞，其中所述流感病毒的添加量为MOI=1，疫苗的施用方式为皮下注射。由于流感病毒诱导B16‑F10肿瘤细胞免疫原性死亡时，原本处于肿瘤细胞内质网的钙网蛋白翻转到肿瘤细胞膜表面，且膜上表达了流感病毒刺突蛋白血凝素HA，成功制备了流感病毒诱导的免疫原性死亡的肿瘤细胞膜包裹的含有肿瘤抗原的PLGA纳米颗粒，该策略高效递送肿瘤抗原，提供了一种个性化的肿瘤治疗性疫苗平台。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤免疫治疗技术领域，特别涉及一种高效递送肿瘤抗原的抗肿瘤疫苗及其制备方法和应用。
背景技术
在健康成人中，每秒钟就有数百万发生程序性细胞死亡机制的细胞被有效去除，而不会引发局部或全身炎症。这种通过细胞凋亡发生的稳态细胞死亡通常被认为是一种耐受性（促进对自身的耐受）或无效事件（对免疫系统没有影响）。调节性细胞死亡（RegulatedCell Death，RCD）是一种由基因编码的分子机制控制的细胞死亡形式，长期以来一直被认为是免疫沉默甚至耐受性事件。而在特定情况下，压力诱导的RCD可以驱动炎症反应，最终可能会激活细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T lymphocyte，CTL）驱动的适应性免疫，同时建立长期免疫系统记忆。这种功能独特的应激驱动 RCD 形式现在通常被称为免疫原性细胞死亡（Immunogenic Cell Death，ICD ）。即刺激针对死细胞抗原的免疫反应的细胞死亡方式，特别是当死亡细胞为肿瘤细胞时，能更好地激活对死细胞抗原的免疫反应。这种模式最初是在抗肿瘤化疗的背景下提出的，临床证据表明肿瘤特异性免疫反应可以确定常规细胞毒药物抗肿瘤治疗的疗效。
与ICD相关的细胞应激源包括（但不限于）：专性细胞内病原体，包括多种细菌和病毒物种；治疗性溶瘤病毒；具有溶瘤潜力的各种分子；常规化疗药物等。近年来，由于流感病毒不会整合进宿主基因组，不会导致慢性疾病，有减毒形式等优势成为了溶瘤病毒的优良候选，值得注意的是2000年时Robert G. Webster教授实验室开发了一种八质粒DNA转染系统，用于从cDNA克隆中拯救具有活性的甲型流感病毒，这一转染体系使得流感病毒成为更好的诱导物。流感病毒刺突蛋白血凝素HA可以在流感病毒感染宿主细胞时介导病毒溶酶体逃逸，所以利用流感病毒感染肿瘤细胞时表达在细胞膜表面的HA可以介导溶酶体逃逸。在流感病毒感染肿瘤细胞时诱导肿瘤细胞免疫原性死亡，此时原本处于细胞内质网上的钙网蛋白（Calreticulin，CRT）翻转到肿瘤细胞膜表面。CRT暴露于ICD的肿瘤细胞系表面有助于细胞被树突状细胞吞噬，从而导致肿瘤抗原呈递和肿瘤特异性CTL响应。除此之外肿瘤细胞膜上可能存在丰富的肿瘤抗原，使得流感病毒诱导的免疫原性死亡的肿瘤细胞膜具有极好的疫苗潜力。
聚乳酸-乙醇酸共聚物 (PLGA) 是最有效的可生物降解聚合物纳米粒子之一。由于受控和缓释特性、低毒性以及与组织和细胞的生物相容性，它已被美国 FDA 批准用于药物输送系统。PLGA包裹肿瘤抗原后可以缓慢、连续地释放抗原并保持恒定的释放速率，持续的抗原刺激能更好地激发抗肿瘤免疫。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种高效递送肿瘤抗原的抗肿瘤疫苗及其制备方法和应用，一方面利用流感病毒感染后表达在肿瘤细胞膜上的HA进行纳米颗粒的细胞质递送，另一方面利用流感病毒诱导肿瘤细胞ICD后膜上的CRT增强被抗原递呈细胞（Antigen-Presenting Cell，APC）摄取和递呈的效率。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种高效递送肿瘤抗原的抗肿瘤疫苗，所述抗肿瘤疫苗为流感病毒诱导肿瘤细胞膜包裹的PLGA纳米颗粒，该纳米颗粒外层是由流感病毒诱导发生免疫原性死亡的肿瘤细胞的细胞膜，内层为包裹了肿瘤抗原的PLGA纳米颗粒；
所述流感病毒为甲型流感病毒A/WSN/33 H1N1；
所述肿瘤细胞为B16-F10肿瘤细胞。
进一步的，所述肿瘤抗原为M30s肽，其氨基酸序列为DWENVSPELNSTDQP：
即Asp Trp Glu Asn Val Ser Pro Glu Leu Asn Ser Thr Asp Gln Pro。
进一步的，所述流感病毒的添加量为MOI=1。
进一步的，所述高效递送肿瘤抗原的抗肿瘤疫苗的施用方式为皮下注射。
本发明的另一方面：
所述高效递送肿瘤抗原的抗肿瘤疫苗的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，流感病毒诱导肿瘤细胞免疫原性死亡：
向肿瘤细胞中加入配置好的含流感病毒的培养基，诱导肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡，处于“濒死”状态；
步骤2，细胞膜的提取：
取步骤1获得的处于免疫原性细胞死亡状态的肿瘤细胞，通过包括添加蛋白酶抑制剂、液氮冷冻、冻融、超声、离心在内的处理后，提取得到细胞膜；
步骤3，PLGA的制备：
利用二氯甲烷溶解PLGA，将肿瘤抗原加入搅拌均匀的PLGA中，搅拌至水油混合物变成小油滴，经超声处理后得到初乳液，随即向初乳液中PVA溶液，超声处理获得水-油-水乳液，不断搅拌使二氯甲烷充分挥发，之后离心去上清获得的沉淀物，即为包裹了肿瘤抗原的PLGA纳米颗粒；
步骤4，细胞膜包裹的PLGA纳米颗粒的制备：
将步骤2提取得到的细胞膜和步骤3制备的包裹了肿瘤抗原的PLGA纳米颗粒，按照一定比例混合均匀，将混合物转移至脂质体挤出器中，通过滤膜挤压后收获挤出液，即为所述高效递送肿瘤抗原的抗肿瘤疫苗。
进一步的，步骤4中每120 μg所述细胞膜对应10~30 μl 包裹了肿瘤抗原的PLGA纳米颗粒。
本发明的另一方面：
所述高效递送肿瘤抗原的抗肿瘤疫苗在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明相比现有技术的有益效果为：
本发明利用流感病毒感染后表达在肿瘤细胞膜上的HA进行纳米颗粒的细胞质递送，利用流感病毒诱导肿瘤细胞ICD后膜上的CRT增强被抗原递呈细胞（Antigen-Presenting Cell，APC）摄取和递呈的效率。而值得注意的是此时肿瘤细胞膜上存在肿瘤新抗原，如B16-F10细胞膜上存在肿瘤相关抗原TRP2，直接递呈抗原引起特异性抗肿瘤免疫。除此之外使用PLGA纳米颗粒包裹肿瘤抗原，在实验设计时选择了肿瘤相关抗原M30s，该抗原为MHC II分子，M30s单独使用时就具有一定的抗肿瘤效应。B16-F10细胞膜上具有的肿瘤抗原TRP2为MHC I的分子，实验将两种肿瘤抗原一同递呈，增强交叉递呈，并使得CD4+和CD8+ T细胞协同作用，达到良好的抗肿瘤效果。该策略设计拟靶向APC细胞质递送肿瘤抗原，这一目标依赖于HA介导的溶酶体逃逸与CRT介导的APC高效吞噬。制备了流感病毒诱导肿瘤细胞膜包裹的PLGA纳米颗粒，并验证了与PLGA、细胞膜包裹的PLGA相比化疗药物诱导的免疫原性死亡的细胞膜包裹的PLGA和流感病毒诱导的免疫原性死亡的细胞膜包裹的PLGA能更好被DC细胞摄取，且后者能进行溶酶体逃逸；并且在B16-F10荷瘤小鼠体内验证了流感病毒诱导的免疫原性死亡的细胞膜包裹的PLGA制备疫苗具有良好的抗肿瘤能力；为模拟细胞免疫原性死亡时所释放的ATP发出“找到我”信号，添加ATP作为佐剂后流感病毒诱导的免疫原性死亡的细胞膜包裹的PLGA制备疫苗展示出更强的抗肿瘤作用。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明：
图1为本发明所述高效递送肿瘤抗原的抗肿瘤疫苗的制备流程及其杀伤肿瘤原理示意图；
图2为测试例1中流感病毒感染后的肿瘤细胞膜具有良好疫苗潜力结果图；
图3为测试例1中细胞膜包裹PLGA纳米颗粒的制备及鉴定结果图；其中，A.提取细胞膜并挤压后形成的类囊泡物电镜图片；B.制备的PLGA的电镜图片；C.细胞膜包裹的PLGA的电镜图片；D. DC2.4细胞内吞PLGA纳米颗粒和细胞膜包裹的PLGA纳米颗粒免疫荧光图像，绿色：PLGA；红色：细胞膜；
图4为测试例1中BMDC细胞内吞PLGA纳米颗粒免疫荧光图像；
图5为测试例1中BMDC细胞内吞B16-F10细胞膜包裹的PLGA纳米颗粒免疫荧光图像；
图6为测试例1中BMDC细胞内吞药物诱导免疫原性死亡的B16-F10细胞膜包裹的PLGA纳米颗粒免疫荧光图像；
图7为测试例1中BMDC细胞内吞流感病毒诱导免疫原性死亡的B16-F10细胞膜包裹的PLGA纳米颗粒免疫荧光图像；
图8为测试例1中流感病毒诱导B16-F10免疫原性死亡的细胞膜包裹PLGA纳米颗粒疫苗体内实验结果图（n=8每组）；
图9~图13为测试例1中流感病毒诱导B16-F10免疫原性死亡的细胞膜包裹PLGA纳米颗粒添加ATP佐剂制备疫苗体内实验结果图（PBS组n=9，其余n=8每组）；其中，图9为荷瘤小鼠肿瘤大小；图10为牺牲小鼠后取出的肿瘤照片；图11为肿瘤重量；图12为小鼠生存率统计图；图13为牺牲小鼠后取出的脾重量统计图；
图14~图16为测试例1中流感病毒诱导B16-F10免疫原性死亡的细胞膜包裹PLGA纳米颗粒添加ATP佐剂制备疫苗能抑制MDSC水平提高，并诱导高水平CD8α+ T细胞；其中，图14为分离小鼠脾淋巴细胞进行CTL流式后，CD3+细胞圈门；图15为CTL流式细胞术代表图；图16为CTL流式细胞术CD8α+IFNγ+细胞比例统计图；
图17、图18为测试例1中流感病毒诱导B16-F10免疫原性死亡的细胞膜包裹PLGA纳米颗粒添加ATP佐剂制备疫苗能控制免疫抑制细胞MDSC水平；其中，图17为分离的脾淋巴细胞MDSC细胞流式代表图；图18为MDSC流式细胞术Gr-1+CD11b+细胞比例统计图。
具体实施方式
本发明实施例中所述流感病毒A/WSN/1933毒株的DNA片段载体质粒PHW2000-PB2，PHW2000-PB1，PHW2000-PA，PHW2000-HA，PHW2000-NP，PHW2000-NA，PHW2000-M，PHW2000-NS由Robert G. Webster教授实验室赠予。
大肠杆菌（E.coli）DH5α菌株购自宝生物工程（大连）有限公司。
MDCK细胞由云南省疾病与控制中心赠予，293T、B16-F10细胞由中国医学科学院医学生物学研究所分子免疫科室保存。
实验所用的雌性C57BL/6小鼠（6-8周；16-18g）由中国医学科学院医学生物学研究所（IMBCAMS）小动物实验中心提供，并在无特定病原体（SPF）条件下饲养（许可证编号：SYXK滇 2019-0003）。所有动物实验均经中国医学科学院医学生物学研究所实验动物使用和管理委员会批准。
本发明一方面利用流感病毒感染后表达在肿瘤细胞膜上的HA进行纳米颗粒的细胞质递送，另一方面利用流感病毒诱导肿瘤细胞ICD后膜上的CRT增强被抗原递呈细胞（Antigen-Presenting Cell，APC）摄取和递呈的效率。而值得注意的是此时肿瘤细胞膜上存在肿瘤抗原，如B16-F10细胞膜上存在肿瘤相关抗原TRP2，直接递呈抗原引起特异性抗肿瘤免疫。除此之外使用PLGA纳米颗粒包裹肿瘤抗原，在实验设计时选择了肿瘤相关抗原M30s，该肿瘤抗原为MHC II分子，有文献报道M30s单独使用时就具有一定的抗肿瘤效应。B16-F10细胞膜上具有的肿瘤祥光抗原TRP2为MHC I的分子，实验将两种肿瘤抗原一同递呈，以期增强交叉递呈，并使得CD4+和CD8+ T细胞协同作用，达到良好的抗肿瘤效果。该策略设计拟靶向APC细胞质递送肿瘤抗原，这一目标依赖于HA介导的溶酶体逃逸与CRT介导的APC高效吞噬。
实施例1——流感病毒的拯救
本实施例将由Robert G. Webster教授实验室赠予的PHW2000-PB2, PHW2000-PB1, PHW2000-PA, PHW2000-HA, PHW2000-NP, PHW2000-NA, PHW2000-M, PHW2000-NS质粒进行转化、提取，对提取得到的质粒进行测序，并将测序结果与NCBI比对，确定获得的质粒为甲型流感病毒（A/WSN/33 H1N1）。
而后使用流感病毒反向遗传操作体系，用八质粒共转染293T细胞拯救流感病毒并使用鸡胚扩增病毒，收取鸡胚尿囊液4500rpm，4℃离心30min后取上清；将上清使用0.45μm滤器过滤后，20000rpm，4℃离心2h，去上清沉淀使用适量无菌PBS悬起，并使用MDCK细胞检测病毒PFU待用（上述操作均在生物安全柜中进行）。
实施例2——流感病毒诱导肿瘤细胞膜包裹的PLGA纳米颗粒
通过实验发现，流感病毒感染肿瘤细胞后，细胞膜上表达流感病毒刺突蛋白血凝素HA，HA可以介导次级内体膜融合发生溶酶体逃逸。流感病毒感染肿瘤细胞后，原本处于细胞内质网上的钙网蛋白CRT翻转到细胞膜表面，发出“来吃我”信号，促使DC细胞内吞。与此同时肿瘤细胞膜表面存在丰富的肿瘤抗原，因此流感病毒诱导的免疫原性死亡的细胞膜拥有良好的疫苗潜力。
如图1所示，本实施例提供了一种流感病毒诱导肿瘤细胞膜包裹的PLGA纳米颗粒，其制备方法为：
步骤1，流感病毒诱导肿瘤细胞免疫原性死亡：
向肿瘤细胞中加入配置好的含流感病毒的培养基，诱导肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡，处于“濒死”状态。
步骤2，细胞膜的提取
（1）倒出培养瓶内的培养基，并用无菌PBS清洗一次；
（2）加入适量PBS，使用细胞刮子将贴壁的细胞刮落，并使用移液器吹打混匀；
（3）将细胞悬液转移至冻存管内，并加入1%的PMSF蛋白酶抑制剂，随后将细胞直接放入液氮中冷冻；
（4）将细胞冻融两次后，进行超声，超声条件为超10 s，间隔10 s，总时间为10min，温度为4 ℃，超声强度为15 %，超声时需将样品放置于冰上进行；
（5）5000g，4 ℃，离心20 min，取出上清；
将上清再次离心，20000g，4 ℃，离心40 min，弃上清，使用适量PBS悬起沉淀，并使用BCA法测定蛋白质浓度。
步骤3，PLGA的制备
（1）提前一日溶解PVA（Poly 聚乙烯醇），将其配制为2%的PVA溶液，质量体积比（2g + 100 ml水），过夜搅拌；（需提前将烧杯清洗干净并烘干）
（2）取180 mg PLGA，用6 ml DCM（二氯甲烷）溶解，磁力搅拌10 min至完全溶解；（搅拌时须用保鲜膜封口，用皮筋扎紧），完成后放置于冰上；
（3）向搅拌均匀的PLGA中加入肿瘤抗原M30s肽，烧杯中边搅拌边加样，1 ml肽（1mg/ml）对应6 ml PLGA，搅拌至水油混合物变成小油滴，置于冰上（使用的烧杯应使用酒精浸泡清洗）；
肿瘤抗原M30s肽的氨基酸序列为DWENVSPELNSTDQP；
（4）将搅拌完成的PLGA和肽混合物倒入50 ml离心管，冰浴10 min后超声10 min，超声10 s，间隔10 s，4 ℃，30%功率，随后得到初乳液；
（5）超声完成后立即加入24 ml 2 % PVA，超声10 min，超10 s，间隔10 s，4 ℃，30%功率，随后得到水-油-水乳液；
（6）将乳液转至250 ml烧杯中，室温磁力搅拌8 h，充分挥发DCM（保鲜膜封口，针头打孔）；
（7）20000 rpm，4 ℃，20 min离心，去除上清后使用PBS重悬沉淀，并以其洗涤2~3次；
（8）3 ml PBS重悬沉淀，即为制备好的PLGA纳米颗粒，可放入-80℃冻存。
步骤4，细胞膜包裹的PLGA纳米颗粒的制备
（1）测定细胞膜浓度后，120 μg蛋白量对应20 μl PLGA纳米颗粒，混匀上述步骤2提取的细胞膜和步骤3制备的PLGA纳米颗粒，并调整体积为100 μl，得到细胞膜与PLGA混悬液；
（2）将细胞膜与PLGA混悬液转移至脂质体挤出器（AvantiPolar Lipids公司）中，依次使用1 μm、0.4 μm、0.2 μm的滤膜，每个孔径挤压10个循环后收获挤出液，即为细胞膜包裹的PLGA纳米颗粒。
测试例1
为展现流感病毒感染细胞后细胞膜的疫苗潜力，利用流感病毒感染后24 h的B16-F10进行免疫荧光染色并置于共聚焦显微镜下观察（图2），实验结果显示流感病毒感染B16-F10肿瘤细胞后，细胞膜上不仅有刺突蛋白HA，还有钙网蛋白（Calreticulin，CRT）和肿瘤相关抗原TRP2的表达。膜上存在的这些蛋白使得细胞膜具有溶酶体逃逸、促使免疫细胞内吞及呈递肿瘤抗原的潜力。
本测试例对实施例2制备得到的细胞膜包裹PLGA纳米颗粒进行鉴定：
提取细胞膜，使用脂质体挤出器依次经过1μm、400nm、200nm滤膜的挤压后，使用电子显微镜观察发现细胞膜呈现出囊泡样（图3中A）。PLGA经制备后电镜下观察（图3中B），其大小约为300nm左右，呈球形颗粒状，成功制备了PLGA纳米颗粒。将PLGA纳米颗粒与细胞膜提取物混合，使用脂质体挤出器挤压后，呈现出膜包裹状的纳米颗粒（图3中C）。为进一步确定膜与PLGA纳米颗粒是否包裹在一起，将细胞膜使用DID染液染成红色，PLGA纳米颗粒包裹DIO染液，使其发出绿色荧光。将挤压完成的细胞膜和纳米颗粒与DC2.4细胞孵育后，在共聚焦显微镜下观察，发现绿色和红色荧光完全重合，从侧面验证了细胞膜已包裹PLGA纳米颗粒（图3中D）。
流感病毒感染的B16-F10肿瘤细胞膜包裹PLGA纳米颗粒介导溶酶体逃逸：
实验使用小鼠骨髓分离的小鼠骨髓来源树突状细胞（Bone Marrow DendriticCell，BMDC），将包裹了DIO（呈绿色）染液的PLGA纳米颗粒与其孵育，在不同时间段收获细胞样品，并对BMDC的初级内体（黄色）和次级内体（红色）进行免疫荧光染色，分析内吞PLGA颗粒的效率（图4）。随着时间孵育时间的增长被内吞的PLGA颗粒增多，次级内体也增多。
使用B16-F10细胞膜包裹的PLGA纳米颗粒与BMDC孵育，观测其被内吞的效率（图5），发现被细胞膜包裹后，与PLGA纳米颗粒相比在较短时间内颗粒更容易被内吞。
使用药物诱导免疫原性死亡的B16-F10细胞膜包裹的PLGA纳米颗粒与BMDC孵育，观测其被内吞的效率（图6），发现被药物诱导的免疫原性死亡的细胞膜包裹后，与PLGA纳米颗粒相比内吞的效率大大提高，次级内体量也增多，表明大量颗粒被内吞后即将被加工递呈至溶酶体中。
使用流感病毒诱导免疫原性死亡的B16-F10细胞膜包裹的PLGA纳米颗粒与BMDC孵育，观测其被内吞的效率（图7），发现被流感病毒诱导免疫原性死亡的细胞膜包裹后内吞效率与药物诱导免疫原性死亡的B16-F10细胞膜包裹的PLGA纳米颗粒的内吞效率相似。但值得注意的是，在孵育6 h后绿色荧光量随孵育时长增长而增多，但是红色荧光却减少，分析结果可能是由于流感病毒诱导免疫原性死亡的细胞膜上带有HA，在内吞后纳米颗粒由初级内体转运到次级内体，此时内体中PH值下降，HA在酸性环境下水解为HA1和HA2，然后HA2进行膜融合，纳米颗粒从次级内体中逃逸，所以红色荧光减少。
流感病毒诱导B16-F10免疫原性死亡的细胞膜包裹PLGA纳米颗粒疫苗体内实验：
在疫苗设计时引入了B16-F10肿瘤相关抗原M30s，该抗原为MHC II分子，在此前的文献查阅中发现该抗原单独使用时就具有一定的抗肿瘤效应。而此前的实验验证了B16-F10细胞膜上具有MHC I的肿瘤相关抗原TRP2，实验将两种肿瘤抗原一同递呈，以期增强交叉递呈，并使得CD4+和CD8+ T细胞协同作用，达到良好的抗肿瘤效果。除此之外流感病毒感染细胞后，表达在膜上的HA在被APC内吞时，协助纳米颗粒从溶酶体逃逸，从而更好地递呈肿瘤抗原。
实验使用B16-F10小鼠荷瘤模型，旨在考察流感病毒诱导的免疫原性死亡肿瘤细胞膜包裹的纳米颗粒是否引发强大的抗肿瘤效应。实验采用B16-F10荷瘤小鼠，在肿瘤长至2~3 mm时开始免疫小鼠，在肿瘤接种后第6、10、16天给小鼠接种疫苗。在此期间每隔一天测量一次肿瘤大小，测量结果如图8所示，本次实验显示出流感病毒诱导的免疫原性死亡的细胞膜包裹内含M30s的PLGA纳米颗粒疫苗显示出了较好的抗肿瘤效应。然而由于本次实验中使用的肿瘤模型建瘤技术未完全把握，肿瘤生长过快，失去了干预的时机，其余组均未表现出有统计学差异的抗肿瘤效应。
为了更好地模拟肿瘤细胞免疫原性死亡时所释放的信号，增加ATP作为佐剂，使用水凝胶介质缓释ATP和流感病毒诱导的免疫原性死亡的肿瘤细胞膜包裹的含有M30s的PLGA纳米颗粒。实验使用B16-F10小鼠荷瘤模型，旨在考察增加ATP佐剂后，是否增强流感病毒诱导的免疫原性死亡肿瘤细胞膜包裹的纳米颗粒抗肿瘤效应。实验采用B16-F10荷瘤小鼠，在肿瘤长至2~3 mm时开始免疫小鼠，在肿瘤接种后第14、24天在小鼠左侧腹皮下接种疫苗。在此期间每隔一天测量一次肿瘤大小，测量结果如图9所示，在肿瘤接种后34天牺牲小鼠取出肿瘤拍照并称量（图10、图11），实验结果显示流感病毒诱导的免疫原性死亡的细胞膜包裹内含M30s的PLGA纳米颗粒疫苗显示出了抑制肿瘤生长的效应，在添加ATP作为佐剂后更好抑制肿瘤生长。记录的小鼠生存率（图12）显示疫苗未影响小鼠正常生存，小鼠脾重量（图13）显示IAV induced ICD MEM+PLGA/M30s+水凝胶/ATP组脾重量显著小于PBS组，荷瘤小鼠脾过度增大说明脾脏已转入负免疫调节，IAV induced ICD MEM+PLGA/M30s+水凝胶/ATP疫苗很好的抑制其发展。
分离小鼠脾淋巴细胞，对小鼠脾淋巴细胞中的CTL进行染色，并进行流式细胞术分析实验结果显示（图14、图15、图16），IAV induced ICD MEM+PLGA/M30s组和IAV inducedICD MEM+PLGA/M30s+水凝胶/ATP组都诱导了较高水平的CTL。
对小鼠脾淋巴细胞中的MDSC进行染色，并进行流式细胞术分析实验结果显示（图17、图18），IAV induced ICD MEM+PLGA/M30s+水凝胶/ATP组免疫抑制性细胞MDSC显著减少。
综上所述的疫苗策略使用流感病毒诱导B16-F10肿瘤细胞免疫原性死亡，此时细胞膜上表达HA和CRT，提取细胞膜包裹含有肿瘤抗原M30s的PLGA纳米颗粒。为模拟免疫原性细胞死亡的状态，辅以ATP为佐剂，使用水凝胶缓释ATP和流感病毒诱导的ICD肿瘤细胞膜包裹的含有M30s的PLGA纳米颗粒。ATP组分发出“找到我”信号促使DC细胞向疫苗部位迁移；CRT促使DC细胞内吞纳米颗粒；HA促使纳米颗粒从溶酶体逃逸至DC胞质呈递肿瘤抗原M30s及细胞膜上存在的丰富肿瘤抗原，如TRP2等。疫苗设计将多种组分有机结合起来，组成一个高效递送肿瘤抗原的体系，达到了良好的肿瘤抑制作用。
最后应说明的是，以上仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳布置方案对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (7)
1.一种高效递送肿瘤抗原的抗肿瘤疫苗，其特征在于，所述抗肿瘤疫苗为流感病毒诱导肿瘤细胞膜包裹的PLGA纳米颗粒，该纳米颗粒外层是由流感病毒诱导发生免疫原性死亡的肿瘤细胞的细胞膜，内层为包裹了肿瘤抗原的PLGA纳米颗粒；
所述流感病毒为甲型流感病毒A/WSN/33 H1N1；
所述肿瘤细胞为B16-F10肿瘤细胞。
2.根据权利要求1所述的高效递送肿瘤抗原的抗肿瘤疫苗，其特征在于，所述肿瘤抗原为M30s肽，其氨基酸序列为DWENVSPELNSTDQP。
3.根据权利要求1或2所述的高效递送肿瘤抗原的抗肿瘤疫苗，其特征在于，所述流感病毒的添加量为MOI=1。
4.根据权利要求1或2所述的高效递送肿瘤抗原的抗肿瘤疫苗，其特征在于，所述高效递送肿瘤抗原的抗肿瘤疫苗的施用方式为皮下注射。
5.一种如权利要求1-4所述高效递送肿瘤抗原的抗肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1，流感病毒诱导肿瘤细胞免疫原性死亡：
向肿瘤细胞中加入配置好的含流感病毒的培养基，诱导肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡，处于“濒死”状态；
步骤2，细胞膜的提取：
取步骤1获得的处于免疫原性细胞死亡状态的肿瘤细胞，通过包括添加蛋白酶抑制剂、液氮冷冻、冻融、超声、离心在内的处理后，提取得到细胞膜；
步骤3，PLGA的制备：
利用二氯甲烷溶解PLGA，将肿瘤抗原加入搅拌均匀的PLGA中，搅拌至水油混合物变成小油滴，经超声处理后得到初乳液，随即向初乳液中PVA溶液，超声处理获得水-油-水乳液，不断搅拌使二氯甲烷充分挥发，之后离心去上清获得的沉淀物，即为包裹了肿瘤抗原的PLGA纳米颗粒；
步骤4，细胞膜包裹的PLGA纳米颗粒的制备：
将步骤2提取得到的细胞膜和步骤3制备的包裹了肿瘤抗原的PLGA纳米颗粒，按照一定比例混合均匀，将混合物转移至脂质体挤出器中，通过滤膜挤压后收获挤出液，即为所述高效递送肿瘤抗原的抗肿瘤疫苗。
6.根据权利要求5所述高效递送肿瘤抗原的抗肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，步骤4中每120 μg所述细胞膜对应10~30 μl 包裹了肿瘤抗原的PLGA纳米颗粒。
7.一种如权利要求1-4所述高效递送肿瘤抗原的抗肿瘤疫苗在制备抗肿瘤药物中的应用。
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