CN117298066A - 一种用于肿瘤示踪及辅助治疗的双靶向吲哚菁绿纳米颗粒及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物制剂领域，具体为一种用于肿瘤示踪及辅助治疗的双靶向吲哚菁绿纳米颗粒及其制备和应用。本申请的双靶向吲哚菁绿纳米颗粒，纳米颗粒为共轭核壳结构，以二茂铁衍生物修饰的透明质酸键合物为外壳，内壳为含有长链烷基修饰的二茂铁，吲哚菁绿存在于该纳米粒内核及共轭包覆层。本发明开发了一种用于肿瘤靶向递送吲哚菁绿的纳米颗粒，其中二茂铁特有的环戊二烯基具备芳香性，有利于电荷的传导及纳米递送系统的稳定，透明质酸及二茂铁作为肿瘤靶向的双靶头，加之吲哚菁绿优良的光动光热效果及二茂铁具备的癌细胞铁死亡效果共同构建生物安全性高、肿瘤靶向性好、兼具肿瘤示踪能力及肿瘤辅助治疗潜力的壳核结构纳米递送系统。

Description

一种用于肿瘤示踪及辅助治疗的双靶向吲哚菁绿纳米颗粒及 其制备和应用
技术领域
本发明涉及药物制剂领域，具体涉及一种用于肿瘤示踪及辅助治疗的双靶向吲哚菁绿纳米颗粒及其制备和应用。
背景技术
肿瘤手术主要依靠术者的眼睛和触觉，只能识别相对狭隘模糊的肿瘤边界，无法较为准确地定位,往往会造成肿瘤的不完全切除，而残余肿瘤组织是术后肿瘤复发和转移的直接原因。另外，较小的肿瘤或转移瘤也是肿瘤手术中的痛点，往往成为预后不良的罪魁祸首。因此肿瘤手术中的准确检测及切除至关重要。使用荧光试剂标记肿瘤在术中成像，以此期望提高患者的预后，这将是未来肿瘤外科的发展方向。
近红外(NIR)光源在生物组织内有较好的穿透性，且受生物体的自发荧光背景影响较小，具备高灵敏度、高分辨率和实时成像能力。吲哚菁绿(ICG)作为FDA批准的为数不多的可用于临床的近红外荧光造影剂，常用于检查肝脏功能和肝有效血流量，也用于其他术中疾病的实时诊断。不仅如此，吲哚菁绿还具备优良的光热及光动效果，可在一定激发波长的光源下实现肿瘤的光热与光动的化学动力学治疗，在肿瘤研究领域具有巨大潜力。但由于吲哚菁绿在液体环境中不稳定，水溶性有限，尤其在生理盐水中难以溶解，配制不方便，且进入血液循环中易被快速清除、不能有效靶向等问题，限制了其在肿瘤诊疗方面的应用。
现今，可负载吲哚菁绿的载体材料层出不穷，但少有具备双靶向的多功能肿瘤递送载体。因此，亟须研发一种具有靶向功能、毒副作用小的功能性递送载体，克服吲哚菁绿本身的不足，以期实现肿瘤的准确示踪与辅助治疗。另外，含铁元素的载体在肿瘤诊疗方面具有广泛研究，但大多集中于无机铁化合物，如铁单质、氧化铁或四氧化三铁等，这些化合物毒性较大，不易代谢。二茂铁作为少有的具备芳香性质的有机铁化合物，有多种生物活性，如与转铁蛋白结合的能力以及同时具有一般化学药品所不具备的低毒性以及氧化还原的可逆性并能在酶的作用下参与代谢作用。现今二茂铁仍未用于制备吲哚菁绿的递送载体以实现肿瘤的诊疗。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明提供一种用于肿瘤示踪及辅助治疗的双靶向多功能吲哚菁绿纳米颗粒及其制备和应用。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种用于肿瘤示踪及辅助治疗的双靶向吲哚菁绿纳米颗粒，纳米颗粒为共轭核壳结构，以二茂铁衍生物修饰的透明质酸键合物为外壳，内壳为含有长链烷基修饰的二茂铁，吲哚菁绿存在于该纳米粒内核及共轭包覆层。
所述纳米颗粒通过反溶剂法将通过二茂铁衍生物修饰的透明质酸和采用长链脂肪胺修饰的二茂铁羧酸进行共轭组装获得，粒径为50-350nm；其中，吲哚菁绿存在于内壳中及共轭包覆层中。
上述所得颗粒，纳米粒内部为长链脂肪胺修饰的二茂铁羧酸为疏水结构，外壳为二茂铁衍生物修饰的透明质酸为两亲性结构，两分子由于二茂铁分子间存在的π-π相互作用及疏水相互作用力，而形成壳核式纳米粒结构。吲哚菁绿本身带负电，亲脂性更强，因此将存在于纳米粒内核中，但由于二茂铁较强的电子离域能力，使吲哚菁绿被吸引至二茂铁与二茂铁分子间的共轭层中，而同时存在的疏水作用力使得吲哚菁绿整齐排列于纳米粒内部，吲哚菁绿相邻分子磺酸基之间的空间位阻和静电斥力引起邻近分子的滑移促使吲哚菁绿单体形成J-聚集体(J-Aggregates)，整体呈现时间依赖性。当纳米粒中的吲哚菁绿形成J-聚集体后，将表现出更强的水溶液稳定性，实现NIR-I的荧光沉默，进入体内后组织散射明显降低，在肿瘤细胞摄取后荧光增强；另一方面，包裹J-聚集体的纳米粒具备更优的光热能力，在体外细胞实验中表现出较好的细胞抑制作用，具备肿瘤辅助治疗的潜力。
一种用于肿瘤示踪及辅助治疗的双靶向吲哚菁绿纳米颗粒的制备方法，通过反溶剂法将通过二茂铁衍生物修饰的透明质酸和采用长链脂肪酸修饰的二茂铁衍生胺共轭组装获得，其中，吲哚菁绿存在于内壳中及共轭包覆层中。
具体：
步骤1，当采用二茂铁衍生胺与透明质酸反应时，先将透明质酸采用羧基活化剂活化，与二茂铁衍生胺混合反应，反应产物经纯化并干燥，得到二茂铁衍生胺修饰的透明质酸的键合物；
步骤2，当采用长链脂肪胺修饰二茂铁羧酸时，先将二茂铁羧酸酰氯化再与末端氨基的长链脂肪胺反应并纯化得到含有长链的二茂铁衍生物；或，当采用长链脂肪酸修饰二茂铁衍生胺时，先将长链脂肪酸进行酰氯化，后与二茂铁衍生胺进行反应，即得含有疏水长链的二茂铁衍生物；
步骤3，将步骤1所得二茂铁衍生胺修饰的透明质酸键合物分散在纯化水中，浓度为1～5mg/mL，作为纳米粒亲水相；
步骤4，将步骤2所得含有长链的二茂铁衍生物溶解于有机溶液中，将吲哚菁绿溶解于醇溶液中，将两溶液混合作为疏水相，疏水相中长链的二茂铁衍生物的终浓度为0.5mg～2mg/mL；疏水相中吲哚菁绿的终浓度为1mg～3mg/mL；
步骤5，将疏水相加入亲水相中，经反溶剂法制备吲哚菁绿纳米粒，纯化后即得双靶向吲哚菁绿纳米颗粒，其中，疏水相与亲水相的体积比为0.1～0.5:1。
所述步骤1中羧基活化剂的加入量为透明质酸的0.25N～1N，活化时间为10min～1h，反应时间为16h～36h，反应温度为4℃～35℃，反应体系pH值为6.0～8.0，二茂铁衍生胺与透明质酸反应摩尔比为0.25～1:1；干燥方式为冷冻干燥或离心浓缩干燥。
上述干燥方式为冷冻干燥或离心浓缩干燥，冷冻干燥控制参数为：于温度为-80℃预冻12h，后按照程序进行冷冻干燥12～48h即得；离心浓缩干燥控制参数为：于温度为-80℃～-40℃预冻12h进形成离心浓缩，离心转速为1000r～3000r/min，离心室温度为30～50℃，离心时间为8h～24h，即得。
所述二茂铁衍生胺为二茂铁甲酰乙二胺、二茂铁甲酰丙二胺、二茂铁甲酰丁二胺中的一种或多种；所述透明质酸为分子量为3k-1500k的透明质酸或其钠盐；所述羧基活化剂为二环己基碳二亚胺(DCC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)中的一种或几种。
所述步骤2中酰氯化试剂与酸的反应摩尔比为1～3:1；酰胺化反应时间为24-54h。
所述先将二茂铁羧酸酰氯化再与末端氨基的长链脂肪胺反应并纯化得到含有长链的二茂铁衍生物；所述长链脂肪胺为十二胺(如1-十二胺)、十三胺(如1-十三胺)、十四胺(如1-十四胺)、十五胺(如1-十五胺)、十六胺(如1-十六胺)、十七胺(如1-十七胺)或十八胺(如1-十八胺)；二茂铁羧酸为二茂铁甲酸、二茂铁乙酸或二茂铁丙酸；
或，当采用长链脂肪酸修饰二茂铁衍生胺时，所述长链脂肪酸为十二酸(如月桂酸)、十三酸(如1-十三酸)、十四酸(如肉豆蔻酸)、十五酸(如1-十五酸)、十六酸(如棕榈酸)、十七酸(如珠光脂酸)或十八酸(如硬脂酸)，二茂铁衍生胺为二茂铁甲酰乙二胺、二茂铁甲酰丙二胺、二茂铁甲酰丁二胺中的一种或多种。
上述采用的酰氯化试剂为草酰氯或氯化亚砜。
所述步骤5中，疏水相与亲水相的体积比为0.1～0.5:1，采用透析的方法除去有机试剂及游离在溶液中的药物，即得吲哚菁绿纳米粒溶液，冻干即得哚菁绿纳米粒冻干粉末。
进一步地说，将疏水相缓慢加入亲水相中，经500r～1500r/min搅拌5min～1h得到两相混合液，或利用超声细胞粉碎机200W-400W超声2min-20min得到两相混合液；将所得到的混合液采用旋蒸的方式除去有机试剂得到纳米粒混悬液，采用透析的方法除去游离在溶液中的药物，即得吲哚菁绿纳米粒溶液，也可采用葡聚糖凝胶柱法超速离心法进行游离药物及纳米粒的分离。
一种双靶向吲哚菁绿纳米颗粒的应用，所述双靶向吲哚菁绿纳米颗粒在肿瘤示踪或作为肿瘤辅助治疗药物中的应用。
上述获得纳米颗粒可在实现多靶点靶向肿瘤的同时，联合芬顿化学与光热光动疗法实现肿瘤的准确示踪与辅助治疗，即，利用上述纳米颗粒验证其体外肿瘤细胞杀伤作用、体内对荷瘤小鼠不同体积大小皮下肿瘤及转移瘤的示踪作用、另包括体内对小鼠淋巴系统的靶向作用，本发明的纳米递送系统制备过程简单、绿色环保，经济成本低，具有广阔的应用前景。
本发明所具有的优点：
本发明开发了一种用于肿瘤靶向递送吲哚菁绿的纳米颗粒，该颗粒为共轭核壳结构，通过反溶剂法制备，内核疏水层及药物与外壳包覆层通过异电吸引等长程作用力，共轭作用力、氢键、疏水作用、范德华力等分子间短程作用力形成球形纳米结构，其中二茂铁特有的环戊二烯基具备芳香性，有利于电荷的传导及纳米递送系统的稳定，透明质酸及二茂铁作为肿瘤靶向的双靶头，加之吲哚菁绿优良的光动光热效果及二茂铁具备的癌细胞铁死亡效果共同构建生物安全性高、肿瘤靶向性好、兼具肿瘤示踪能力及肿瘤辅助治疗潜力的壳核结构纳米递送系统；利用本发明纳米颗粒进行肿瘤示踪及辅助治疗具体是：
一方面，该纳米粒可由尾静脉注射，通过血液到达全身各部位，在EPR效应的作用下，积累于肿瘤血管中，并由肿瘤细胞表面的CD44受体与转铁蛋白介导进入肿瘤细胞，在非肿瘤部位依赖于聚集淬灭效应(ACQ)荧光部分淬灭，而在肿瘤部位实现特异性激活，从而有效示踪肿瘤，同时证明其对直径约2mm的肿瘤也有较好的示踪效果；第二方面，在体外细胞实验中，本发明中吲哚菁绿纳米粒对正常细胞及肿瘤细胞有较好的毒性选择性，联合光热治疗，对肿瘤细胞的抑制率提高至80％以上；第三方面，足皮下注射本发明吲哚菁绿纳米粒，可实现淋巴管及淋巴结的荧光富集，或可实现术中的淋巴网络成像。此外，本发明的纳米递送系统制备过程简单、绿色环保，经济成本低，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例提供的二茂铁衍生胺修饰的透明质酸键合物的核磁共振氢谱(H1-NMR)谱图；
图2为本发明实施例提的制备双靶向吲哚菁绿纳米颗粒和空白纳米粒的结构示意图；
图3为本发明实施例提供的的制备双靶向吲哚菁绿纳米颗粒的粒径分布图
图4为本发明实施例提供的的制备双靶向吲哚菁绿纳米颗粒的电位分布图；
图5为本发明实施例提供的的制备双靶向吲哚菁绿纳米颗粒的TEM(透射电镜图)及OM(光学显微镜图)；
图6为本发明实施例所制备的吲哚菁绿纳米粒在生理盐水中的溶解性质考察结果图；
图7为本发明实施例制备的双靶向吲哚菁绿纳米颗粒的的包封率及载药量的结果及结果示意图：
图8为本发明实施例制备的双靶向吲哚菁绿纳米颗粒的荧光吸收光谱图；
图9为本发明实施例制备的双靶向吲哚菁绿纳米颗粒的紫外-可见光吸收光谱图；
图10为本发明实施例制备的双靶向吲哚菁绿纳米颗粒与游离吲哚菁绿在相同pH条件下的累计释放率的结果图；
图11为本发明实施例制备的双靶向吲哚菁绿纳米颗粒在不同pH条件下的累计释放率的结果图；
图12为本发明实施例制备的空白纳米颗粒的细胞毒试验结果；
图13为本发明实施例制备的吲哚菁绿纳米颗粒联合光热的细胞毒试验结果；
图14为本发明实施例制备的空白纳米粒及双靶向吲哚菁绿纳米颗粒给药后细胞的光学显微镜图；
图15为本发明实施例制备的双靶向吲哚菁绿纳米颗粒在4T1荷瘤小鼠体内的肿瘤示踪试验结果图；
图16为本发明实施例制备的双靶向吲哚菁绿纳米颗粒及游离吲哚菁绿在B16荷瘤小鼠体内的肿瘤示踪试验结果对比图；
图17为本发明实施例制备的双靶向吲哚菁绿纳米颗粒在正常小鼠体内的淋巴结示踪结果图。
具体实施方式
在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明将二茂铁基化合物与透明质酸(hyaluronic acid，HA)联合的吲哚菁绿纳米颗粒作为肿瘤示踪及辅助治疗递送系统，该纳米载体可在实现多靶点靶向肿瘤的同时，联合芬顿化学与光热光动疗法实现肿瘤的准确示踪与辅助治疗，具有广阔的应用前景。
进一步的说，本发明壳核结构的纳米颗粒的内核采用二茂铁羧酸或其衍生胺连接烷基长链作为疏水端，外壳采用二茂铁衍生胺修饰的透明质酸键合物包覆，内核疏水层及药物与外壳包覆层通过异电吸引等长程作用力，共轭作用力、氢键、疏水作用、范德华力等分子间短程作用力形成球形纳米结构。其中，二茂铁特有的环戊二烯基具备芳香性，有利于电荷的传导及纳米递送系统的稳定，同时二茂铁中的铁离子(本身为Fe2+，在酸性或弱酸性条件下易被氧化为Fe3+，又可轻易被谷胱甘肽还原为Fe2+)提供的正电荷可与带负电荷的吲哚菁绿发生长程异电作用、两个可以自由旋转的环戊二烯环可与吲哚菁绿的芳香性双臂产生π-π堆积作用。同时，二茂铁作为非结合铁与血清转铁蛋白(Tf)两个高亲和位点结合进行转运，以此增强了吲哚菁绿纳米粒的细胞内吞作用。另外，二茂铁具备的癌细胞铁死亡作用，可实现细胞内氧气的循环利用，具有进一步增强光动光热治疗效果的潜力。另外，在肿瘤环境中二茂铁中更多的Fe2+可被氧化为Fe3+，亲水性变强，二茂铁垂直分子和水平分子的Cp环之间的T型相互作用减弱，纳米粒逐步逐步释放包载的吲哚菁绿，实现肿瘤部位的特异性释放。
实施例1
用于肿瘤示踪及辅助治疗的双靶向吲哚菁绿纳米颗粒的制备，按照以下步骤制备：
步骤1：二茂铁衍生物与透明质酸的键合：
将379mg(约1mmol)分子量为150W的透明质酸((C14H21NO11)n,M.W:379.32)加入至60mL的甲醇和pH7.4缓冲液的混合溶液中(V甲醇:VpH7.4缓冲液＝1:3，pH7.4缓冲液为磷酸盐缓冲溶液)，搅拌8h使其溶解，溶解后向溶液中加入206mg(约1mmol)二环己基碳二亚胺(DCC,M.W:206)、115mg(约1mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS,M.W:115.09)，搅拌活化30min，将108mg(约0.4mmol)的二茂铁甲酰乙二胺(M.W:270.05)加入上述搅拌活化后的混合溶液中，边加边调pH值至7.4，反应34h，反应温度为25℃。将反应后的溶液放入5WDa的透析袋中，采用V纯化水:V甲醇＝1:1透析1d，采用纯化水透析2d，冻干后即得二茂铁衍生胺修饰的键合物(HA-HF)(参见图1)。
通过使用核磁共振仪器测定产物的氢-核磁共振谱(1H-NMR)，称取约6mg步骤1所制备的样品，用氘代水溶解，加到核磁管中，进行检测，使用MestReNova软件对二茂铁甲酰乙二胺-1-下、透明质酸-2-中、二茂铁甲酰乙二胺修饰的透明质酸-3-上，三张图谱进行分析，参见图1中对二茂铁甲酰乙二胺、透明质酸、键合物进行了核磁表征，如图谱所示，在键合物图谱中，可以看到二茂铁甲酰乙二胺未取代茂环上的氢(δ＝4.19ppm,5H)，以及透明质酸的甲基(δ＝1.89ppm,3H)，根据相对积分面积计算，确定Fc的接枝率为17％。
所述二茂铁甲酰乙二胺的制备过程具体如下：二茂铁甲酸与乙二胺反应制备二茂铁衍生胺：将1.0g二茂铁甲酸置于烘箱中60℃，8h，后混悬于60ml二氯甲烷与甲醇的混悬溶液中，其中二氯甲烷与甲醇的体积比为10:1，加入0.2mol/L的草酰氯的二氯甲烷溶液10ml，在4℃搅拌3h，使其酰氯化，将所得溶液加入乙二胺(3ml)的二氯甲烷溶液(30ml)中反应24h，后采用10％氢氧化钠的水溶液进行萃取，取有机层，旋干后采用V甲醇:V二氯甲烷＝1:1进行柱层析分离，经1H-NMR图谱确定为洗脱出的第一个物质，干燥即为二茂铁甲酰乙二胺。
步骤2：制备含有长链烷基链的二茂铁衍生物：
将920mg(约4mmol)二茂铁甲酸(M.W:230.04)分散在50mL二氯甲烷中，滴入0.5mLDMF，而后再加入1mL草酰氯(约12mmol)，待溶液澄清后，继续反应5h，旋蒸复溶，将1.08g(约4mmol)十八胺(M.W:269.51)加入60mL二氯甲烷中，将复溶后的含酰氯溶液加入含有十八胺的二氯甲烷溶液，反应50h，加入等体积10％氢氧化钾水溶液，将反应后溶液进行萃取，取下层有机层柱层析分离，固定相为300目硅胶，以V乙酸乙酯:V石油醚:V二氯甲烷＝1:1:2为洗脱液，进行洗脱，共洗脱出三个物质，记为1、2、3，以洗脱液为展开液，将洗脱出的物质进行薄层鉴别分析，确定1、2的Rf值分别与反应物二茂铁甲酸与反应中间体二茂铁甲酰氯相同，即1、2分别为二茂铁甲酸与反应中间体二茂铁甲酰氯，3为新物质，即洗脱出的第三个物质为目标产物，干燥即得二茂铁甲酰十八胺。
步骤3：制备纳米粒亲水相
将步骤1所得到的15mg二茂铁衍生胺修饰的键合物溶解于3mL纯化水中，浓度为5mg/mL，作为亲水相。
步骤4：制备纳米粒疏水相
将步骤2所得到含有烷基长链的二茂铁衍生物溶解于丙酮中，将吲哚菁绿溶解于乙醇中，将两者分别溶解后，充分混合共同作为疏水相。疏水相中含有烷基长链的二茂铁衍生物得最终浓度为1.5mg/mL，吲哚菁绿的最终浓度为2mg/mL。
步骤5：制备双靶向吲哚菁绿纳米颗粒
将0.75mL疏水相加入3mL亲水相中，疏水相与亲水相的体积比为0.25:1，将疏水相加入亲水相中；1500r/min搅拌15min得到混合溶液；将所得到的混合液采用旋蒸的方式除去有机试剂，将所得水溶液放入8K～14K透析袋中，透析除去游离未包载的药物，即得双靶向吲哚菁绿纳米颗粒溶液(NP@HF-ICG)。
实施例2空白纳米粒制备
用于负载药物的空白纳米载体的制备，按照以下步骤制备：
步骤1与步骤2与实施例1相同
步骤3：制备纳米粒亲水相
将步骤1所得到的12mgHA-HF溶解于3mL纯化水中，浓度为4mg/mL，作为亲水相。
步骤4：制备纳米粒疏水相
将步骤2所得到含有烷基长链的二茂铁衍生物溶解于丙酮中，浓度为2mg/mL，作为疏水相。
步骤5：制备空白纳米粒
将0.6mL疏水相加入3mL亲水相中，疏水相与亲水相的体积比为0.2:1，将疏水相加入亲水相中；1500r/min搅拌15min得到混合溶液；将所得到的混合液采用旋蒸的方式除去有机试剂，将所得水溶液放入8K-～14K透析袋中，透析除去水溶性杂质，即得空白纳米粒(NP@HF)。
实施例3
用于肿瘤示踪及辅助治疗的双靶向吲哚菁绿纳米粒的制备，按照以下步骤制备：
步骤1：二茂铁衍生物与透明质酸的键合：
将379mg(约1mmol)分子量为150W的透明质酸((C14H21NO11)n,M.W:379.32)反应时加入60mL的甲醇和pH6.5缓冲液的混合溶液中(V甲醇:VpH6.5缓冲液＝1:3，pH6.5缓冲液为磷酸缓冲盐)，搅拌8h使其溶解，加入206mg(约1mmol)二环己基碳二亚胺(DCC,M.W:206)、115mg(约1mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS,M.W:115.09)，搅拌活化30min，将135mg(约0.5mmol)的二茂铁甲酰乙二胺(M.W:270.05)加入上述搅拌活化后的混合溶液中，边加边调pH值至6.5，反应36h，反应温度为25℃。将反应后的溶液放入5WDa的透析袋中，采用V纯化水:V甲醇＝1:1透析1d，采用纯化水透析2d，冻干后即得二茂铁衍生胺修饰的键合物。
步骤2：制备含有长链烷基链的二茂铁衍生物：同实施例1步骤2。
步骤3：制备纳米粒亲水相
将步骤1所得到的15mgHA-HF溶解于4mL纯化水中，浓度为3.75mg/mL，作为亲水相。
步骤4：制备纳米粒疏水相
将步骤2所得到含有烷基长链的二茂铁衍生物溶解于丙酮中，将吲哚菁绿溶解于乙醇中，将两者分别溶解后，充分混合共同作为疏水相。疏水相中含有烷基长链的二茂铁衍生物得最终浓度为1mg/mL，吲哚菁绿得最终浓度为2mg/mL。
步骤5：制备双靶向吲哚菁绿纳米颗粒
将0.6mL疏水相加入3mL亲水相中，疏水相与亲水相的体积比为0.2:1，将疏水相加入亲水相中；采用细胞破碎机，超声粉碎120W，5min得到混合溶液；将所得到的混合液采用旋蒸的方式除去有机试剂，将所得水溶液放入8K～14K透析袋中，透析除去游离未包载的药物，即得双靶向吲哚菁绿纳米颗粒溶液。
实施例4
用于肿瘤示踪及辅助治疗的双靶向吲哚菁绿纳米颗粒的制备，按照以下步骤制备：
步骤1：二茂铁衍生物与透明质酸的键合：
将379mg(约1mmol)分子量为5W的透明质酸((C14H21NO11)n,M.W:379.32)反应时加入60mL的甲醇和pH6.5缓冲液的混合溶液中(V甲醇:VpH6.5缓冲液＝1:3，其中，pH6.5缓冲液为磷酸缓冲盐)，搅拌4h使其溶解，加入276mg(约1mmol)4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM,M.W:276.72)，搅拌活化1h，将135mg(约0.5mmol)的二茂铁甲酰乙二胺(M.W:270.05)加入上述的搅拌活化后混合溶液中，边加边调pH值至6.5，反应36h，反应温度为25℃。将反应后的溶液放入5WDa的透析袋中，采用V纯化水:V甲醇＝1:1透析1d，采用纯化水透析2d，冻干后即得二茂铁衍生胺修饰的键合物。
步骤2：制备含有长链烷基链的二茂铁衍生物：
将920mg(约4mmol)二茂铁甲酸(M.W:230.04)分散在50mL二氯甲烷中，滴入0.5mLDMF，而后再加入1mL草酰氯(约12mmol)，待溶液澄清后，继续反应5h，旋蒸复溶，将740mg(约4mmol)十二胺(M.W:185.35)加入60mL二氯甲烷中，将复溶后的含酰氯溶液加入含有十八胺的二氯甲烷溶液，反应50h，加入等体积10％氢氧化钾水溶液，将反应后溶液进行萃取，取下层有机层柱层析分离，固定相为300目硅胶，以V甲醇:V二氯甲烷＝1:9为洗脱液，进行洗脱，共洗脱出三个物质，记为1、2、3，以洗脱液为展开液，将洗脱出的物质进行薄层鉴别分析，确定1、2的Rf值分别与反应物二茂铁甲酸与反应中间体二茂铁甲酰氯相同，即1、2分别为二茂铁甲酸与反应中间体二茂铁甲酰氯，而3为新物质，即洗脱出的第三个物质为目标产物，干燥即得二茂铁甲酰十二胺。
干燥即得含有烷基长链的二茂铁衍生物。
步骤3：制备纳米粒亲水相
将步骤1所得到的12mg二茂铁衍生胺修饰的键合物溶解于4mL纯化水中，浓度为3mg/mL，作为亲水相。
步骤4：制备纳米粒疏水相
将步骤2所得到含有烷基长链的二茂铁衍生物溶解于丙酮中，将吲哚菁绿溶解于乙醇中，将两者分别溶解后，充分混合共同作为疏水相。疏水相中含有烷基长链的二茂铁衍生物得最终浓度为1mg/mL，吲哚菁绿得最终浓度为2mg/mL。
步骤5：制备双靶向吲哚菁绿纳米颗粒
将0.5mL疏水相加入3mL亲水相中，疏水相与亲水相的体积比为6:1，将疏水相加入亲水相中；采用细胞破碎机，超声粉碎120W，10min得到混合溶液；将所得到的混合液采用旋蒸的方式除去有机试剂，将所得水溶液放入8K～14K透析袋中，透析除去游离未包载的药物，即得双靶向吲哚菁绿纳米颗粒溶液。所得溶液放入棕色西林瓶中，并加入5％海藻糖作为冻干保护剂，在-80℃预冻12h，放入冷冻干燥机中，冻干48h，无程序升温，得到吲哚菁绿纳米粒冻干粉末。
实施例5
用于肿瘤示踪及辅助治疗的双靶向吲哚菁绿纳米颗粒的制备，按照以下步骤制备：
步骤1：二茂铁衍生物与透明质酸的键合：
将379mg(约1mmol)分子量为30W的透明质酸((C14H21NO11)n,M.W:379.32)反应时加入60mL的甲醇和pH6.5缓冲液的混合溶液中(V甲醇:VpH6.5缓冲液＝1:3，pH6.5缓冲液为磷酸缓冲盐)，搅拌5h使其充分溶解，加入276mg(约1mmol)4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM,M.W:276.72)，搅拌活化1h，将150mg(约0.5mmol)的二茂铁甲酰丁二胺(M.W:298.05)加入上述的搅拌活化后混合溶液中，边加边调pH值至6.5，反应36h，反应温度为25℃。将反应后的溶液放入5WDa的透析袋中，采用V纯化水:V甲醇＝1:1透析1d，采用纯化水透析2d，冻干后即得二茂铁衍生胺修饰的键合物。
步骤2：制备含有长链烷基链的二茂铁衍生物：
将1g(约4mmol)十八酸(M.W:284.48)分散在50mL二氯甲烷中，滴入0.5mLDMF，而后再加入0.5mL氯化亚砜(约6.9mmol)，进行酰氯化反应5h，多次旋蒸除尽氯化亚砜，用30mL二氯甲烷复溶，将1.2g(约4mmol)二茂铁甲酰丁二胺(M.W:298.05)加入60mL二氯甲烷中，将复溶后的酰氯溶液加入含有二茂铁甲酰丁二胺的二氯甲烷溶液，反应30h，加入等体积10％氢氧化钾水溶液，将反应后溶液进行萃取，取下层有机层柱层析分离，固定相为300目硅胶，以V乙酸乙酯:V二氯甲烷＝1:3为洗脱液，进行洗脱，共洗脱出2个物质，记为1、2，以洗脱液为展开液，将洗脱出的物质进行薄层鉴别分析，其中1的Rf值与二茂铁甲酰丁二胺相同，即1为反应物二茂铁甲酰丁二胺，洗脱出的第2个物质即为目标产物，干燥即得含有烷基长链的二茂铁衍生物。
步骤3：制备纳米粒亲水相
将步骤1所得到
步骤4：制备纳米粒疏水相的12mg二茂铁衍生胺修饰的键合物溶解于3mL纯化水中，浓度为4mg/mL，作为亲水相。
将步骤2所得到含有烷基长链的二茂铁衍生物溶解于丙酮中，将吲哚菁绿溶解于乙醇中，将两者分别溶解后，充分混合共同作为疏水相。疏水相中含有烷基长链的二茂铁衍生物得最终浓度为1mg/mL，吲哚菁绿得最终浓度为2mg/mL。
步骤5：制备双靶向吲哚菁绿纳米颗粒
将0.75mL疏水相加入3mL亲水相中，疏水相与亲水相的体积比为0.25:1，将疏水相加入亲水相中；1000r/min搅拌20min得到混合溶液；将所得到的混合液采用旋蒸的方式除去有机试剂，将所得水溶液放入8K～14K透析袋中，透析除去游离未包载的药物，即得双靶向吲哚菁绿纳米颗粒溶液。
对上述实施例制备所得双靶向吲哚菁绿纳米颗粒进行性质表征：
1)对制得的双靶向吲哚菁绿纳米颗粒的粒径分布图及电位进行测试：
采用Nano ZS90纳米激光电势粒度仪(美国马尔文公司)检测吲哚菁绿纳米粒冻干粉的粒度分布及电位，取少量纳米粒冻干粉溶于水中，进行测定。仪器参数设置如下：分散介质选择水，仪器平衡时间设置为120S，所得颗粒粒径分布均在50-350nm范围内，电位在(-35mV)～(-45mV)范围内，以实施例4所得颗粒为例，双靶向吲哚菁绿纳米颗粒(NP@HF-ICG)平均粒径在166.3nm左右，PDI为0.155，粒径分布较均匀。Zeta电位在-38.7mV左右，胶体稳定性良好(参见图3和4)。同时对该颗粒进一步通过透射电镜观察(左)及光学显微镜(右)观察(参见图5)，从图中可以看出明显的壳核结构，所得的吲哚菁绿纳米粒的粒约为200nm以内，与纳米激光粒度电势分析仪测定的结果相似。
2)溶解度试验
以实施例4中所制备的双靶向吲哚菁绿纳米颗粒在纯水及生理盐水中的溶解度考察为例，所用的空白纳米粒为实施例2制备，实验方法如下：
分别配置(1)ICG、(2)ICG与空白纳米粒、(3)吲哚菁绿纳米粒的生理盐水溶液，其所含吲哚菁绿浓度相等为1mg/mL，拍照记录图像。离心3000r；10min后，记录图像，并比较分析。
结果如图6所示，NP@HF-ICG配方通过提供良好的的双靶向吲哚菁绿纳米颗粒为例对其静电环境保持稳定，溶解性良好，而ICG单独或不封装在NPs中的溶解度较差，沉淀迅速，减弱了同离子效应对其溶解度的影响。
3)载药量与包封率测定
以实施例4中所制备包封率及载药量的测定：
采用葡聚糖凝胶柱离心法进行包封率与载药量的测定，方法如下：
填充G-50凝胶柱，离心使得柱体紧实，将实施例4步骤5中所制备的混合溶液旋蒸除去有机试剂，取200μL该药液、200μL药物游离溶液进行对比洗脱，直至游离药物也洗脱下来，本实施例采用纯化水离心洗脱10次，洗脱次数即为稀释倍数，收集洗脱液，过膜，加入等量乙醇超声30min破乳，测定吸光度为A1。另取实施例4步骤5中所制备的混合溶液旋蒸除去有机试剂，取该药液200μL，采用纯化水稀释10倍，并加入等量乙醇超声30min，测定吸光度为A2，带入吲哚菁绿体外标准曲线中，计算溶液浓度，分别为C1、C2，则包封率为C1/C2。并可将未破乳的纯化后纳米粒即洗脱后溶液收集进行冻干，破乳测定药物的含量，计算载药量药物质量与制剂总重的比值。
结果：测得3次包封率与载药量如图7所示，可见测定方法可行，包封率在65％左右，载药量在6％-7％之间。
4)光谱分析
以实施例4中所制备的双靶向吲哚菁绿纳米颗粒为例进行光谱分析，并与吲哚菁绿等进行对比，实验方法如下：
荧光吸收光谱图：取吲哚菁绿与双靶向吲哚菁绿纳米颗粒适量于纯化水中，稀释至相同浓度，根据载药量换算浓度即可，具体浓度为10μg/mL。进行荧光光谱检测，激发波长为760nm，发射波长扫描范围为760nm-850nm。
结果：如图8所示，双靶向吲哚菁绿纳米颗粒荧光光谱出现13nm的蓝移，荧光发生一定程度的淬灭，考虑载体材料作为极性分子的引入使得吲哚菁绿的荧光光谱出现蓝移，载体材料对吲哚菁绿的包裹以及吲哚菁绿J-聚集体的形成使其大部分荧光发生聚集淬灭(ACQ)。
紫外-可见光吸收光谱图：取吲哚菁绿与双靶向吲哚菁绿纳米颗粒适量于纯化水中，稀释至相同浓度，根据载药量换算浓度即可，具体浓度为10μg/mL。分别对载体材料、吲哚菁绿、吲哚菁绿纳米粒进行全波长扫描，扫描范围为190nm-1000nm。
结果：如图9所示，双靶向吲哚菁绿纳米颗粒较吲哚菁绿的最大吸收峰红移110nm左右，即从780nm左右红移至893nm左右，且吸光度有所降低，可见载体材料中的基团与吲哚菁绿发生良好的共轭，且较为稳定，同时在加入乙醇后，纳米粒中高度有序的吲哚菁绿J-聚集体被破坏，最大吸收峰又回到780nm左右。其中可看到破坏后的纳米粒吸收峰较游离吲哚菁绿的水溶液的吸收峰高，可能是由于其在醇溶液中能更好的分散。
5)体外响应性释放
以实施例4中所制备的双靶向吲哚菁绿纳米颗粒的体外响应性释放测试，方法如下：
在不同pH条件下吲哚菁绿释放度考察：
模拟血液等正常体液环境pH设置为7.4，模拟肿瘤外环境pH设置为6.5。采用透析袋桨法进行释放度考察，透析袋为8k-14kDa。溶出仪控温37℃，转速70r，溶出杯250mL，溶出介质100mL。以实施例4制备所得双靶向吲哚菁绿纳米颗粒作为缓释制剂，设置为0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h，在此时间点分别取样5mL，测吸光度，以计算释放度，补加新透析液。
结果：如图10及图11所示，相对于游离药物，纳米粒具有缓释作用；相对于PH7.4缓冲液，纳米粒在PH6.5缓冲液介质中累积释放度更高。
6)体外细胞毒及细胞摄取试验
以实施例2中所制备的空白纳米粒(对照)及实施例4制备的双靶向吲哚菁绿纳米颗粒(实验)进行体外细胞毒及细胞摄取试验检测细胞毒，方法如下：将4T1(小鼠乳腺癌)细胞分别以6×103/孔接种到96孔板进行细胞铺板，于37℃二氧化碳培养箱中孵育24h。进行给药，吸走培养基，加入100μL完全培养基溶解的不同浓度即0.05、0.5、1.5、3、4.5mg/mL的空白纳米粒(NP@HF)、吲哚菁绿纳米粒(NP@HF-ICG)，震荡混匀，并对各组进行5min 2W·cm-2，808nm的激光照射，培养12h，吸走含有材料的培养基，并用PBS洗涤细胞，快速吸出所有PBS，向每个孔中加入100μL含有0.5mg/mL CCK-8的无血清培养基，继续培养1-3h，待CCK-8由粉色变为橙色即可。酶标仪测试波长450nm处的光密度(OD)值，并记录给药后细胞状态。
可通过下面公式计算相对细胞活性值：相对细胞活性(％)＝【OD450nm(实验)/OD450nm(对照)】×100％，相对抑制率＝1-相对细胞活性(％)。
实验结果表明：如图12及图13所示空白纳米粒对肿瘤细胞有一定的细胞毒性，吲哚菁绿纳米粒联合光热对肿瘤细的毒性明显高于吲哚菁绿本身，因为吲哚菁绿纳米粒可更实现高效的肿瘤细胞吞噬，且呈现浓度相关性，可能是由于芬顿反应使得体系中的氧气得到循环，同时载体增强了细胞的内吞，因此吲哚菁绿的光热效果明显提高。整体而言，该纳米粒有望联合光热光动力治疗实现肿瘤的辅助治疗。
如图14所示，在经过空白纳米粒处理后，肿瘤细胞呈现出铁死亡形态，经吲哚菁绿纳米粒处理后，图中箭头所指即为吞噬了吲哚菁绿纳米粒的肿瘤细胞的死亡形态。
7)小鼠体内肿瘤示踪效果及小鼠体内淋巴结示踪效果
以实施例4所制备的双靶向吲哚菁绿纳米颗冻干粉末为例检测其在荷瘤小鼠体内的肿瘤示踪效果及小鼠体内淋巴结示踪效果，将双靶向吲哚菁绿纳米颗冻干粉末溶解在生理盐水中并采用紫外-可见分光光度计进行ICG含量检测，直至配制成ICG浓度为0.3mg/mL的药液，具体试验方法如下：
选择Balb/c小鼠建立4T1细胞皮下荷瘤小鼠模型。取2只4T1荷瘤小鼠，肿瘤体积分别为150、210mm3，两只后脚剃毛，将配制好的NP@HF-ICG溶液(含ICG量为0.3mg/mL)通过尾静脉分别注射入2只荷瘤鼠体内，于注射后1、2、4、8、16、24小时，用成像仪观察肿瘤部位的荧光分布。
结果：如图15所示，两只小鼠肿瘤处均出现荧光蓄积，肿瘤轮廓明显，1号小鼠在24h可见腹部的另一小肿瘤，直径为2mm3，可见该纳米粒可以实现皮下大小肿瘤的有效示踪。
选择C57小鼠建立B16细胞皮下荷瘤小鼠模型。取2只C57荷瘤小鼠，两只后脚剃毛，取0.15mL NP@HF-ICG溶液，0.15mLICG(含ICG量均为0.3mg/mL)通过尾静脉分别注射入2只荷瘤鼠体内，于注射后1、2、4、8、16、24小时，用血管成像仪观察肿瘤部位的荧光分布，24小时后将小鼠颈椎脱臼处死，解剖取出心、肝、脾、肺、肾和肿瘤组织，用成像仪观察各脏器的荧光信号。
结果：如图16所示，纳米粒组小鼠肿瘤处自6h开始出现荧光蓄积，肿瘤轮廓逐渐明显，解剖后可见肿瘤荧光较强，同时可发现肿瘤侧浅腹股沟淋巴结荧光强度高于正常腿侧；游离药物溶液进入体内后迅速分布全身，肿瘤部位几乎无荧光蓄积，未发现淋巴结的荧光蓄积。
小鼠足皮下注射后淋巴引流：
取正常km小鼠，足皮下注射15微升经实施例4制备所得双靶向吲哚菁绿纳米颗粒配置获得ICG含量是0.3mg/mL得药液，在5min、10min、1h、24h采用血管成像仪记录淋巴引流状况。
ICG含量是0.3mg/mL得药液为将实施例4所得双靶向吲哚菁绿纳米颗冻干粉末溶解在生理盐水中并采用紫外-可见分光光度计进行ICG含量检测，直至配制成ICG浓度为0.3mg/mL的药液
结果：如图17所示，吲哚菁绿纳米粒在腘窝淋巴结的荧光从5min-1h越来越强，后又逐渐消失，24h后到达另一腘窝淋巴结，可见经足皮下给药后，该纳米粒可透过淋巴管壁进入淋巴组织，实现淋巴结的荧光示踪，同时由图15-16结果可知，该吲哚菁绿纳米粒经尾静脉注射后也有一定的淋巴靶向作用。

Claims (10)

1.一种用于肿瘤示踪及辅助治疗的双靶向吲哚菁绿纳米颗粒，其特征在于：纳米颗粒为共轭核壳结构，以二茂铁衍生物修饰的透明质酸键合物为外壳，内壳为含有长链烷基修饰的二茂铁，吲哚菁绿存在于该纳米粒内核及共轭包覆层。
2.按权利要求1所述的用于肿瘤示踪及辅助治疗的双靶向吲哚菁绿纳米颗粒，其特征在于：所述纳米颗粒通过反溶剂法将二茂铁衍生物修饰的透明质酸和采用长链脂肪胺修饰的二茂铁羧酸进行共轭组装获得，其中，吲哚菁绿存在于内壳中及共轭包覆层中。
3.一种权利要求1所述的用于肿瘤示踪及辅助治疗的双靶向吲哚菁绿纳米颗粒的制备方法，其特征在于：通过反溶剂法将二茂铁衍生物修饰的透明质酸和采用长链脂肪酸修饰的二茂铁衍生胺共轭组装获得，其中，吲哚菁绿存在于内壳中及共轭包覆层中。
4.按权利要求3所述的用于肿瘤示踪及辅助治疗的双靶向吲哚菁绿纳米颗粒的制备方法，其特征在于：
步骤1，当采用二茂铁衍生胺与透明质酸反应时，先将透明质酸采用羧基活化剂活化，与二茂铁衍生胺混合反应，反应产物经纯化并干燥，得到二茂铁衍生胺修饰的透明质酸的键合物；
步骤2，当采用长链脂肪胺修饰二茂铁羧酸时，先将二茂铁羧酸酰氯化再与末端氨基的长链脂肪胺反应并纯化得到含有长链的二茂铁衍生物；或，当采用长链脂肪酸修饰二茂铁衍生胺时，先将长链脂肪酸进行酰氯化，后与二茂铁衍生胺进行反应，即得含有疏水长链的二茂铁衍生物；
步骤3，将步骤1所得二茂铁衍生胺修饰的透明质酸键合物分散在纯化水中，浓度为1～5mg/mL，作为纳米粒亲水相；
步骤4，将步骤2所得含有长链的二茂铁衍生物溶解于有机溶液中，将吲哚菁绿溶解于醇溶液中，将两溶液混合作为疏水相，疏水相中长链的二茂铁衍生物的终浓度为0.5mg～2mg/mL；疏水相中吲哚菁绿的终浓度为1mg～3mg/mL；
步骤5，将疏水相加入亲水相中，经反溶剂法制备吲哚菁绿纳米粒，纯化后即得双靶向吲哚菁绿纳米颗粒，其中，疏水相与亲水相的体积比为0.1～0.5:1。
5.根据权利要求4所述的用于肿瘤示踪与辅助治疗的纳米递送系统的制备方法，其特征在于：所述步骤1中羧基活化剂的加入量为透明质酸的0.25N～1N，活化时间为10min～1h，反应时间为16h～36h，反应温度为4℃～35℃，反应体系pH值为6.0～8.0，二茂铁衍生胺与透明质酸反应摩尔比为0.25～1:1；干燥方式为冷冻干燥或离心浓缩干燥。
6.根据权利要求5所述的用于肿瘤示踪与辅助治疗的纳米递送系统的制备方法，其特征在于：所述二茂铁衍生胺为二茂铁甲酰乙二胺、二茂铁甲酰丙二胺、二茂铁甲酰丁二胺中的一种或多种；所述透明质酸为分子量为3k-1500k的透明质酸或其钠盐；所述羧基活化剂为二环己基碳二亚胺(DCC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)中的一种或几种。
7.根据权利要求5所述的用于肿瘤示踪与辅助治疗的纳米递送系统的制备方法，其特征在于：所述步骤2中酰氯化试剂与酸的反应摩尔比为1～3:1；酰胺化反应时间为24-54h。
8.根据权利要求7所述的用于肿瘤示踪与辅助治疗的纳米递送系统的制备方法，其特征在于：所述先将二茂铁羧酸酰氯化再与末端氨基的长链脂肪胺反应并纯化得到含有长链的二茂铁衍生物；所述长链脂肪胺为十二胺、十三胺、十四胺、十五胺、十六胺、十七胺或十八胺；二茂铁羧酸为二茂铁甲酸、二茂铁乙酸或二茂铁丙酸；
或，当采用长链脂肪酸修饰二茂铁衍生胺时，所述长链脂肪酸为十二酸(月桂酸)、十三酸、十四酸、十五酸、十六酸、十七酸或十八酸；二茂铁衍生胺为二茂铁甲酰乙二胺、二茂铁甲酰丙二胺、二茂铁甲酰丁二胺中的一种或多种；
上述采用的酰氯化试剂为草酰氯或氯化亚砜。
9.根据权利要求5所述的用于肿瘤示踪与辅助治疗的纳米递送系统的制备方法，其特征在于：所述步骤5中，疏水相与亲水相的体积比为0.1～0.5:1，采用透析的方法除去有机试剂及游离在溶液中的药物，即得吲哚菁绿纳米粒溶液，冻干即得哚菁绿纳米粒冻干粉末。
10.一种权利要求1所述的双靶向吲哚菁绿纳米颗粒的应用，其特征在于：所述双靶向吲哚菁绿纳米颗粒在肿瘤示踪或作为肿瘤辅助治疗药物中的应用。
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