CN117295948A - 淋巴细胞清除疗法后的继发性自身免疫的新型预测性生物标记物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了基于来自患有原发性自身免疫性疾病(例如，MS)的患者的生物学样品的总细胞中称作血小板谱系细胞(PLC)的新型细胞类型的分数和/或未成熟血小板分数(IPF)值，评估所述患者在淋巴细胞清除疗法(例如，抗CD52抗体疗法)后发生继发性自身免疫的风险的方法。

Description

淋巴细胞清除疗法后的继发性自身免疫的新型预测性生物标 记物
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年5月13日提交的美国临时专利申请63/188,302的优先权。该优先权申请的公开内容通过引用以其整体并入本文。
背景技术
多发性硬化(MS)是一种影响中枢神经系统的慢性免疫介导的炎性和神经系统变性疾病。其特征为由于炎症、脱髓鞘以及轴突损伤和缺失引起的运动和感觉功能丧失(Friese等人,Nat Rev Neurol.(2014)10(4):225-38；Trapp和Nave,Ann Rev Neurosci.(2008)231:247-69)。MS患者展示众多种严重的临床症状，且身体残疾、疲劳、疼痛和认知损害随着疾病进展而加重。MS在全世界影响超过两百万人，并且女性患病率比男性高至少两至三倍。其对患者生活质量有重大影响，并且使患者的预期寿命平均缩短五至十年。
阿仑单抗，一种人源化抗CD52单克隆抗体，是用于复发形式的MS(RMS)的已批准治疗。尽管已经在临床研究中证实其功效，但是其使用与治疗后数月或数年的不可预测的非MS继发性自身免疫表现相关。大约40％的阿仑单抗治疗的患者表现出自身免疫性甲状腺事件，2％患有血小板缺乏(免疫性血小板减少症；ITP)(Cuker等人,Mult Scler HoundmillsBasingstoke Engl.(2020)26:48-56)，且0.34％患有自身免疫性肾病(Phelps等人,MultScler Houndmills Basingstoke Engl.(2019)25:1273-88)。继发性自身免疫的预测性生物标记物的缺乏使得需要在临床实践中小心监测，且风险管理计划或风险评估和缓解策略(RMP/REMS)就位，以供早期检测出这些自身免疫事件。
因此，对于鉴定用于预测在考虑用淋巴细胞清除疗法如阿仑单抗治疗的患者中发生继发性自身免疫的风险的新型生物标记物，存在未满足的需求。
发明内容
本公开文本提供用于在自身免疫性疾病如MS的治疗中改进风险管理的新的且有用的方法。所述方法减少治疗副作用，如继发性自身免疫，并且帮助医务人员和患者选择用于自身免疫性疾病治疗和治疗后监测的方案。本公开文本的方法是基于如下发现：在MS患者中，即使在淋巴细胞清除疗法(例如，阿仑单抗疗法)之前检测到的血小板谱系细胞(PLC)的低丰度和/或高未成熟血小板分数(IPF)值也与在疗法后增加的发生继发性自身免疫的风险相关。
在一个方面，本公开文本提供一种用于评估患有原发性自身免疫性疾病的患者在淋巴细胞清除疗法后发生继发性自身免疫的风险的方法，所述方法包括：
a)提供来自所述患者的血液样品；以及
b)确定
(i)所述血液样品的总细胞中血小板谱系细胞(PLC)(例如，成熟PLC)的分数，其中与第一参照物相比减小的PLC(例如，成熟PLC)分数指示所述患者在治疗后发生继发性自身免疫的风险增大，和/或
(ii)所述血液样品中的未成熟血小板分数(IPF)，其中与第二参照物相比增加的IPF指示所述患者在治疗后发生继发性自身免疫的风险增大。
在某些实施方案中，所述方法包括确定(i)和(ii)二者。
在另一方面，本公开文本提供一种用于治疗患有原发性自身免疫性疾病的患者的方法，所述方法包括：
a)选择已经被诊断为不具有在淋巴细胞清除疗法后增大的发生继发性自身免疫的风险的患者，其中所述风险已经通过确定以下来诊断：
(i)所述血液样品的总细胞中血小板谱系细胞(PLC)(例如，成熟PLC)的分数，其中与第一参照物相比减小的PLC(例如，成熟PLC)分数指示所述患者在治疗后发生继发性自身免疫的风险增大，和/或
(ii)所述血液样品中的未成熟血小板分数(IPF)，其中与第二参照物相比增加的IPF指示所述患者在治疗后发生继发性自身免疫的风险增大；以及
b)将治疗有效量的所述淋巴细胞清除疗法施用至所述患者。
在某些实施方案中，所述方法包括确定(i)和(ii)二者。
在一些实施方案中，所述原发性自身免疫性疾病是多发性硬化(MS)。在特定实施方案中，所述原发性自身免疫性疾病是复发型MS、复发缓解型MS(RR-MS)或继发进展型MS(SPMS)。
在一些实施方案中，所述淋巴细胞清除疗法是淋巴细胞清除抗体疗法，如抗CD52抗体或其抗原结合部分。在某些实施方案中，所述抗CD52抗体具有阿仑单抗的六个CDR。在某些实施方案中，所述抗CD52抗体具有阿仑单抗的重链可变结构域和轻链可变结构域。在特定实施方案中，所述抗CD52抗体是阿仑单抗。
在本文所述方法的一些实施方案中，所述第一参照物和所述第二参照物是从在淋巴细胞清除治疗后不发生继发性自身免疫的患有所述原发性自身免疫性疾病的患者获得，或者从健康受试者获得。
在一些实施方案中，所述血液样品是红细胞裂解的血液样品。在一些实施方案中，所述血液样品是外周血单核细胞(PBMC)样品(例如，其中所述样品中的中性粒细胞已经被去除)。
在一些实施方案中，与对照受试者的PLC分数相比，所述PLC分数减小>2个标准差。在一些实施方案中，与对照受试者的IPF值相比，所述IPF值增加>2个标准差。
在一些实施方案中，所述PLC的特征为呈CD41+CD61+SPARC+TREML1+。
本公开文本的方法还可以包括确定来自所述患者的生物学样品的总PLC群体中未成熟PLC的分数的步骤，其中与第三参照物相比增加的未成熟PLC分数指示所述患者在治疗后发生继发性自身免疫的风险增大。在一些实施方案中，所述未成熟PLC的特征为呈CD41低CD61低PDGFA高PDCD10高，任选地进一步为呈DAB2高RGS10高RGS18高TSC22D1高。在一些实施方案中，所述第三参照物是从在淋巴细胞清除治疗后不发生继发性自身免疫的患有所述原发性自身免疫性疾病的患者获得，或者从健康受试者获得。
在一些实施方案中，所述继发性自身免疫选自免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、格雷夫斯病、桥本病、古德帕斯彻病(抗肾小球基底膜(GBM)病)、膜性肾小球肾炎(膜性肾病)、红细胞再生障碍、自身免疫性甲状腺疾病、短暂性甲状腺炎、自身免疫性溶血性贫血、1型糖尿病、斑秃/全秃、白癜风、肌痛、结节病、自身免疫性中性粒细胞减少症、自身免疫性肝炎和自身免疫性淋巴细胞减少症。
本发明的其他特征、目的和优势在下文的具体实施方式中是清楚的。然而，应当理解，尽管指示了本发明的实施方案和方面，但具体实施方式是通过仅说明而非限制的方式给出的。根据具体实施方式，本领域技术人员将清楚在本发明范围内的各种变化和修改。
附图说明
图1描绘条形图和散点条形图，所述条形图显示所有主要免疫细胞类型(T细胞、单核细胞、B细胞和NK细胞)以及罕见细胞类型(浆细胞样树突细胞(pDC)和血小板样细胞)的相对丰度，所述散点条形图显示，与发生继发性自身免疫的患者相比，血小板样细胞在不发生继发性自身免疫的患者中显著富集(平均值±S.E.M；Student's t检验**p<0.01)。实心圆形表示从发生继发性自身免疫的患者收集的样品；实心方形表示从不发生继发性自身免疫的患者收集的样品。
图2是散点条形图，其显示在发生继发性自身免疫的患者(sAI)和未发生继发性自身免疫的患者(非sAI)中，在阿仑单抗治疗之前和之后，基于sc-RNAseq数据，单独患者的PLC丰度。由大方形表示的非sAI患者显示PLC数量在T24(第一疗程后24个月)有所减少，并且在随访的4年与7年之间发生sAI。
图3是散点条形图，其显示，在T0(治疗前)和T24(第一阿仑单抗疗程后24个月)两个时间点，血小板谱系细胞(PLC)在不发生继发性自身免疫的患者中富集(平均值±S.E.M；双因素ANOVA，AI状态的整体效应**p<0.01)。实心圆形表示从发生继发性自身免疫的患者收集的样品；实心方形表示从不发生继发性自身免疫的患者收集的样品。
图4描绘散点图和所附的SPRING图，其显示SPARC、TREML1、GP9、ITGB3、ITGA2B和GP1B的基因表达水平(平均值±S.E.M；双因素ANOVA和Sidak's多重比较检验*p<0.05，**p<0.001和***p<0.001)。实心圆形表示从发生继发性自身免疫的患者收集的样品；实心方形表示从不发生继发性自身免疫的患者收集的样品。
图5是条形图，其显示通过流式细胞术测量的全血、新鲜PBMC和冷冻PBMC中血小板的百分比(平均值±S.E.M)。
图6是条形图，其显示通过流式细胞术测量的全血、新鲜PBMC和冷冻PBMC中PLC的百分比(平均值±S.E.M)。
图7是条形图，其对RBC裂解的血液、新鲜PBMC和冷冻PBMC中如下细胞中PLC的百分比进行定量：1)TREML1hi SPARC+或2)TREML1lo SPARC+。
图8描绘条形图，其显示sAI组和非sAI组内属于子集1(未成熟/静息转录组状态)或子集2(成熟/激活的转录组状态)的细胞的百分比。
图9A和图9B是热图，其显示对来自阿仑单抗治疗之前的MS患者的161个基线样品的RNAseq数据的无监督聚类分析。图9A描绘六种成熟PLC基因(GP1BA、PPBP、ITGA2B、ITGB3、SPARC和TREML1)和五种未成熟PLC基因(PDCD10、RGS10、DAB2、TSC22D1和RGS18)在发生继发性自身免疫的患者(“AI富集的”，左侧)和未发生继发性自身免疫的患者(“非AI富集的”，右侧)中的相对表达水平。图9B显示与图9A相同的热图，并在热图底部进一步提供关于患者性状如甲状腺活性、种族和性别的信息。
图10A和图10B是显示图9A和图9B中所示的特定基因在不同取样时间(0个月、12个月和24个月)的表达水平的图，其中成熟PLC基因示于图10A中且未成熟PLC基因示于图10B中。显示发生继发性自身免疫的患者(“AI”；顶部)和未发生继发性自身免疫的患者(“非AI”；底部)的数据。
图11是热图，其显示对来自MS患者基线样品的RNAseq数据的无监督聚类分析，其中一些患者用IFNβ-1a治疗。提供图9A和图9B中所示相同的成熟和未成熟PLC基因的数据。“AI”：发生继发性自身免疫的患者。“非AI”：未发生继发性自身免疫的患者。
图12A是在发生继发性自身免疫的患者(sAI；实心圆形)和不发生继发性自身免疫的患者(非sAI；实心方形)中，T0(基线)的未成熟血小板分数(IPF)临床值的箱线图；正常范围示于红色括号中(误差棒跨越第10-第90百分位数范围)。
图12B是显示在发生继发性自身免疫的患者(sAI；实心圆形)和不发生继发性自身免疫的患者(非sAI；实心方形)中，IPF临床值随时间(0-24个月)的变化的图(平均值±S.E.M.；双因素ANOVA，整体sAI状态差异***p＝0.0001)。
图13是来自发生继发性自身免疫的患者(sAI；实心圆形)和不发生继发性自身免疫的患者(非sAI；实心方形)在T0(基线)的单细胞数据的IPF临床值与PLC百分比的相关性的图。左图：对当前队列内患者的真sAI和真非sAI鉴定的事后分析，基于仅IPF值或一起的IPF值和PLC百分比值。右图：在给定队列的患者中在治疗之前鉴定AI状态方面，对临床IPF值和单细胞PLC数据的组合使用的表格描绘。
具体实施方式
本公开文本是基于如下发现：在淋巴细胞清除疗法后在患有原发性自身免疫性疾病(例如，MS)的患者中继发性自身免疫的发生与相比于对照受试者血小板谱系细胞(PLC)的低丰度和/或高未成熟血小板分数(IPF)值相关，即使在淋巴细胞清除之前。所述对照受试者可以是例如健康受试者或在淋巴细胞清除疗法后不发生继发性自身免疫的患有原发性自身免疫性疾病的患者。因此，减小的PLC分数和/或增加的IPF是用于评估在淋巴细胞清除后发生继发性自身免疫的风险的预测性生物标记物。
基于上述发现，本公开文本提供用于改进在考虑淋巴细胞清除疗法如使用抗CD52抗体(例如，阿仑单抗)的疗法时患有原发性自身免疫性疾病(例如，MS)的患者的风险管理的方法。例如，通过允许医务人员确定MS患者在所述疗法后是否具有增加的发生继发性自身免疫的风险，所述医务人员可以决定所述患者是否应进行所述疗法(例如，如果所述患者不具有增加的风险)，或者所述患者是否不应进行所述疗法或者在所述疗法后加强对继发性自身免疫的监测(例如，如果所述患者具有增大的风险)。
例如，本公开文本提供用于评估患有原发性自身免疫性疾病(例如，MS)的患者发生继发性自身免疫的风险的方法，所述患者具有在淋巴细胞清除疗法后增加的发生继发性自身免疫性疾病的风险。在一些实施方案中，将被评估为不具有增加的风险的患者用淋巴细胞清除疗法治疗。在一些实施方案中，将被评估为具有增加的风险的患者不用淋巴细胞清除疗法治疗。在一些实施方案中，将被评估为具有增加的风险的患者用淋巴细胞清除疗法治疗，然后接受与被鉴定为不具有增加的风险的患者相比加强的监测。
本公开文本还提供用于治疗患有原发性自身免疫性疾病的患者(例如，MS患者)的方法，所述患者不具有在淋巴细胞清除疗法后增加的发生继发性自身免疫性疾病的风险。
本公开文本还提供用于治疗患有原发性自身免疫性疾病的患者(例如，MS患者)的方法，所述患者具有在淋巴细胞清除疗法后增加的发生继发性自身免疫性疾病的风险，其中在所述疗法后加强对发生继发性自身免疫的监测(与针对不具有增加的风险的患者的监测相比)。这样的加强监测可以遵循医务人员在淋巴细胞清除疗法确定的适当的监测方案。用于具有风险的患者的适当监测方案可以包括但不限于在淋巴细胞清除疗法后以例如一周、两周、一个月、两个月、三个月、六个月或一年的间隔对继发性自身免疫更频繁的监测。所述监测可以持续延长时间段，例如，超过一年、两年、三年、四年、五年或更久，因为一些患者可能直到淋巴细胞清除疗法后一年后很久才表现出继发性自身免疫。加强监测也可能使得需要例如由专家针对继发性自身免疫的任何体征进行更彻底的医学检查(例如，更多血液测试)。此外，如果患者具有降低的PLC水平和/或升高的IPF值(任选地具有升高的未成熟PLC水平)，可能需要将淋巴细胞清除药物分配给患者用于治疗MS的药师或临床人员关于在药物使用后增加的发生继发性自身免疫的风险为患者提供建议。还可能需要药师或临床人员在将药物分配给患者之前从所述患者获得知情同意。
I.风险评估的方法
自身免疫性疾病(例如，MS)患者在淋巴细胞清除后发生继发性自身免疫的风险可以通过确定以下来评估：
i)来自所述患者的生物学(例如，血液)样品的总细胞中血小板谱系细胞(PLC)(例如，成熟PLC)的分数，其中与对照受试者相比减小的PLC分数(例如，成熟PLC)指示风险增大；和/或
ii)所述生物学样品中的未成熟血小板分数(IPF)，其中与对照受试者相比增加的IPF指示风险增大。
在一些实施方案中，所述风险通过确定以下来评估：i)(和任选地ii))以及iii)所述生物学样品的总PLC群体中未成熟PLC的分数，其中与对照受试者相比增加的未成熟PLC分数指示风险增大。在一些实施方案中，所述风险通过确定iii)、或ii)和iii)来评估。
在一些实施方案中，所述风险通过确定以下来评估：i)、ii)、iii)或其任何组合，以及iv)测试所述生物学样品中针对成熟或激活的血小板的抗体的存在，其中与对照受试者相比增加的抗(成熟/激活的)血小板抗体指示风险增大。在一些实施方案中，所述风险通过确定iv)来评估。
在某些实施方案中，从患者获得的生物学样品是体液样品，如血液(例如，全血、新鲜分离的外周血单个核细胞(PBMC)或冷冻PBMC)、血清、血浆、尿液、唾液、淋巴液或脑脊液。在特定实施方案中，生物学样品是红细胞(RNA)裂解的血液。
在某些实施方案中，发生治疗后继发性自身免疫的患者的相对PLC丰度、IPF值和/或未成熟PLC分数是关于对照受试者，例如，健康受试者。在此背景中，健康受试者是没有任何已知的炎性病症的个体，包括没有自身免疫性疾病(例如，没有自身免疫性疾病的任何可检测症状)的个体。在一些实施方案中，健康受试者不是淋巴细胞减少的。在一些实施方案中，对照受试者是在淋巴细胞清除后不发生继发性自身免疫的自身免疫性疾病患者。
获得关于来自自身免疫性疾病(例如，MS)患者的生物学样品中的相对PLC丰度、IPF值和/或未成熟PLC分数的信息在选择用于所述患者的治疗和治疗后监测方案中是有用的。当在淋巴细胞清除疗法之前获得所述信息时，可以告知患者在疗法后发生继发性自身免疫的相对风险，并且可以相应地作出治疗决策。如果患者被分类为“具有风险”，还可以告知所述患者对加强的治疗后监测(例如，由专家进行的更频繁且更彻底的检查)的需要。因此，此信息改进自身免疫性疾病的治疗中的风险管理(由医师、药师和患者进行)。在淋巴细胞清除治疗期间或之后获得所述信息在监测继发性自身免疫发展和确定治疗方面也可能是有帮助的。
A.血小板谱系细胞
血小板谱系细胞(PLC)是新型的罕见血小板样细胞类型，其与血小板非常相似，但是与血小板的不同之处在于其更大的尺寸、颗粒性和转录物含量。除了表达经典的血小板标记物如CD41和CD61以外，PLC还以高水平表达并非与血小板普遍相关的另外的表面标记物，包括SPARC(富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白)和TREML1(髓细胞触发受体样蛋白1)。
如下文实施例中所详述，发现PLC包括两个不同子集，它们有几种标记物的表达不同。第一子集(子集1)的特征为血小板标记物的较低表达，以及血小板来源的生长因子亚基A(PDGFA)、抑制性标记物(例如，程序性细胞死亡因子10(PDCD10))和核蛋白(例如，DAB2、RGS10、RGS18和TSC22D1)的较高表达。第二子集(子集2)的肌动蛋白基因ACTB和ACTG1和PPBP(一种血小板来源的生长因子，其为中性粒细胞的强效化学引诱物和激活剂)的表达相对较高。第二子集还富含SPARC和TREML1基因表达。子集1涵盖发生治疗后继发性自身免疫的患者中的大多数PLC。诸位发明人已经进一步发现，所述两个子集之间的成熟度和激活状态存在差异，其中子集1代表未成熟或静息状态PLC(在表现出治疗后继发性自身免疫的患者中富集)，而子集2代表成熟或激活的PLC。
因此，PLC可以基于特定细胞表面标记物的表达来鉴定。在一些实施方案中，PLC可以基于CD41、CD61、SPARC和/或TREML1的并行表达来鉴定(例如，CD41+CD61+SPARC+TREML1+)。在某些实施方案中，成熟或激活的PLC可以基于以下的任何组合的并行表达来鉴定：MYL9、CLU、PPBP、SPARC、TREML1、ACTB、NCOA4、TMSB4X、AP001189.4、F13A1、PARVB、ALOX12、RBPMS2、PVALB、PF4V1、ARPC1B、SH3BGRL3、PKM、TAGLN2、TGFB1I1、HLA.E、FERMT3、LTBP1、GSN、CD9、C6orf25、ITGA2B、SERF2和C19orf33。在特定实施方案中，成熟或激活的PLC是基于以下的并行表达来鉴定：GP1BA、ITGA2B、ITGB3、ACTB、ACTG1、PPBP、SPARC和/或TREML1，如所述标记物中任两个、三个、四个、五个、六个、七个或所有八个的组合(例如，ACTB高ACTG1高PPBP高SPARC高TREML1高)。在某些实施方案中，未成熟或静息PLC可以基于以下的任何组合的并行表达来鉴定：RGS18、ACRBP、PTCRA、TSC22D1、HIST1H3H、HIST1H2AC、MYL4、HIST1H2BJ、TMEM40、SLC40A1、SMIM5、TAL1、PEGFA、FAM110A、THEM5、ARHGAP6、NFE2、MMD、NEXN、SCGB1C1、DNM3、GP6、GFI1B、LIMS1、GSTO1、DAB2、ERV3.1、ELOVL7和LCN2。在特定实施方案中，未成熟或静息PLC可以基于以下的并行表达来鉴定：PDGFA、PDCD10、DAB2、RGS10、RGS18和/或TSC22D1，如所述标记物中任两个、三个、四个、五个或所有六个的组合(例如，DAB2高RGS10高RGS18高TSC22D1高)。例如，未成熟PLC可以被表征为呈CD41低CD61低PDGFA高PDCD10高。
在本公开文本的方法中，相对PLC丰度(总细胞中PLC(例如，成熟PLC)的分数)可以通过本领域技术人员熟知的多种技术来测量。在一些实施方案中，生物学样品是从受试者获得的，并且样品中的相对PLC丰度通过适合于检测含有RNA的细胞的任何方法或测定来测量。在某些实施方案中，相对PLC丰度通过使用流式细胞术分析(例如，高维流式细胞术分析)如荧光激活细胞分选法(FACS)测定或通过来测量。在某些其他实施方案中，相对PLC丰度是使用单细胞RNA测序(scRNA-seq)来测量。在特定实施方案中，scRNA-seq是基于液滴的平行scRNA-seq。
在一些实施方案中，具有在淋巴细胞清除疗法(例如，抗CD52抗体疗法，如阿仑单抗)后增加的发生继发性自身免疫的风险的自身免疫性疾病(例如，MS)患者具有与对照受试者相比减小的生物学样品(例如，血液)的总细胞中的PLC分数，其中与对照受试者的PLC分数相比，所述PLC分数减小>1.5、>2、>3、>4或>5(例如，>2)个标准差。
在一些实施方案中，具有在淋巴细胞清除疗法(例如，抗CD52抗体疗法，如阿仑单抗)后增加的发生继发性自身免疫的风险的自身免疫性疾病(例如，MS)患者具有与对照受试者相比增加的生物学样品(例如，血液)的总PLC中的未成熟PLC分数，其中与对照受试者的PLC分数相比，所述未成熟PLC分数增加>1.5、>2、>3、>4或>5(例如，>2)个标准差。
可以应用某些统计学分析以确定测试样品中的相对PLC丰度或未成熟PLC分数是否与参考水平(例如，来自对照受试者)显著不同。此类统计学分析是本领域技术人员熟知的，并且可以包括但不限于参数性(例如，双尾Student's t检验)或非参数性(例如，Wilcoxon-Mann-Whitney U检验)检验。
B.未成熟血小板分数(IPF)
在淋巴细胞清除治疗后发生继发性自身免疫的自身免疫性疾病患者可能在血小板成熟度的临床量度方面与不发生治疗后继发性自身免疫的患者不同。具体而言，诸位发明人已经发现，与不发生甲状腺自身免疫的那些患者相比，在阿仑单抗治疗后发生甲状腺自身免疫的患者具有显著更高的治疗前未成熟血小板分数(IPF)值。
IPF反映仍保留RNA的循环血小板的分数。其是测量外周血中的年轻网织血小板的参数。在观察到快速血小板破坏的病症中，IPF通常较高。
在本公开文本的方法中，IPF可以通过本领域技术人员熟知的多种技术来测量。IPF通常通过流式细胞术(例如，高维流式细胞术)或血液学分析来确定。例如，可以将未成熟血小板的残留RNA内容物容易地用染料如噻唑橙(TO)染色，并且IPF可以使用流式细胞术来测量。可替代地，IPF可以使用在自动化血液学系统的网织红细胞/光学血小板通道中进行的光学荧光法来定量。在此方法中，使用聚甲炔荧光染料对网织细胞、血小板膜和颗粒的RNA/DNA进行染色。该方法允许同时对网织红细胞、红细胞和荧光血小板进行计数。对IPF进行定量的其他方法可以包括例如寻找生物学(例如，外周血)样品中IPF的特定转录组签名，和/或生物学(例如，全血)样品中富含IPF的细胞群体；或者
因此，在一些实施方案中，本文所述的用于评估自身免疫性疾病(例如，MS)患者在淋巴细胞清除疗法后发生继发性自身免疫的风险的任何方法可以包括确定来自所述患者的生物学样品中的IPF值的步骤。在一些实施方案中，具有在淋巴细胞清除疗法(例如，抗CD52抗体疗法，如阿仑单抗)后增加的发生继发性自身免疫的风险的患者具有增加的生物学样品(例如，血液)中的IPF值，其中与对照受试者的IPF值相比，所述IPF值增加>1.5、>2、>3、>4或>5(例如，>2)个标准差。
在一些实施方案中，与对照受试者相比，增加的风险与增加的IPF值和较低PLC丰度相关。
II.淋巴细胞清除疗法
如本文所用，“淋巴细胞清除疗法”是指一类通过治疗性减少循环淋巴细胞(例如，T细胞和/或B细胞)导致淋巴细胞减少而实现的免疫抑制。当例如使用自体骨髓移植(BMT)或全淋巴辐照治疗多发性硬化时，见到延长的淋巴细胞清除。参见例如，Cox等人,Eur JImmunol.(2005)35:3332-42。例如，淋巴细胞清除可以通过甲状腺球蛋白、环磷酰胺和全身辐照的组合使用来实现。MS患者中的淋巴细胞清除也可以通过多种药物治疗来实现。例如，人源化抗CD52单克隆抗体阿仑单抗(CAMPATH-1H)已经用于淋巴细胞清除疗法中以治疗MS患者。已经显示阿仑单抗诱导的淋巴细胞减少可同时在临床上和放射学上有效减少中枢神经系统炎症(Coles等人,Ann.Neurol.(1999)46:296-304；Coles等人,N.Engl.J.Med.(2008)359:1786-1801)。
因此，在一些实施方案中，本文所述的淋巴细胞清除疗法是靶向CD52表达细胞的药剂。在某些实施方案中，淋巴细胞清除疗法是抗CD52抗体或其抗原结合部分。所述抗体可以是例如单克隆、多克隆、寡克隆或双功能抗体。在特定实施方案中，抗CD52抗体或抗原结合部分与阿仑单抗结合至相同表位。所述抗体或抗原结合部分可以包含阿仑单抗的六个CDR氨基酸序列或重链可变结构域和轻链可变结构域氨基酸序列。在某些实施方案中，抗CD52抗体是阿仑单抗。
如本文所用术语“抗原结合部分”是指抗体中保留与衍生出所述部分的完整抗体特异性结合至相同抗原的能力的一个或多个片段。“抗原结合部分”的例子包括但不限于Fab片段、F(ab’)2片段、Fd片段、Fv片段、dAb片段、分离的互补决定区(CDR)、scFv和双抗体。本文所述的抗体及其抗原结合部分可以通过本领域中熟知的任何方法来制备。
其他药剂也可以用于淋巴细胞靶向疗法中以治疗自身免疫性疾病(例如，MS)患者。这些药剂可以是引起淋巴细胞的细胞死亡或抑制淋巴细胞功能的那些药剂。它们包括但不限于(1)靶向带有CD52的细胞的药剂，如在生物学上与阿仑单抗类似的药剂，即，与阿仑单抗结合至相同或不同表位或者与阿仑单抗竞争结合至CD52的其他抗CD52抗体(例如，嵌合、人源化或人抗体)；(2)靶向淋巴细胞上的细胞表面分子的生物分子，如肽、蛋白质和抗体(例如，嵌合、人源化或人抗体)，如抗CD2抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD20抗体(例如，利妥昔单抗)、抗CD38抗体、抗TCR抗体和抗整合素抗体(例如，那他珠单抗)；(3)特异性或非特异性递送至淋巴细胞的细胞毒素(例如，细胞凋亡诱导剂、环磷酰胺、烷化剂和DNA嵌入剂)；(4)前述抗体的抗原结合部分，(5)IMiD(例如，特立氟胺)，以及(6)BTK抑制剂(例如，托莱布替尼)。
III.患者群体
本公开文本的方法可以在患有自身免疫性疾病(“原发性”自身免疫性疾病，以与继发性自身免疫区分)的患者的背景中使用。原发性自身免疫性疾病可以是例如多发性硬化(MS)、N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)脑炎、硬皮病、重症肌无力、系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)、髓鞘-少突胶质细胞糖蛋白(MOG)谱系障碍(MOGSD)或视神经脊髓炎谱系障碍(NMOSD)。
在一些实施方案中，原发性自身免疫性疾病是MS，例如，复发缓解型MS、原发进展型MS或继发进展型MS。在本公开文本的背景中的MS患者是已经通过例如症状史和神经学检查在诸如以下的测试的帮助下被诊断为患有某种形式的MS的那些：磁共振成像(MRI)、脊髓穿刺、诱发电位测试和对血液样品的实验室分析。
MS，也称为播散性硬化，是一种复杂疾病，其特征为其临床、病理学和放射学表现的显著异质性。其为一种自身免疫病症，其中免疫系统攻击中枢神经系统，从而导致脱髓鞘(Compston和Coles,Lancet(2008)372(9648):1502-17)。MS破坏围绕神经纤维并使神经纤维电绝缘的称为髓鞘的脂肪层。几乎任何神经学症状都可能伴随所述疾病显现，其经常进展至身体和认知残疾(Compston和Coles,2008)。新症状可能出现在离散攻击中(复发形式)，或者随时间缓慢累积(进展形式)(Lublin等人,Neurology(1996)46(4):907-11)。在攻击之间，症状可能完全消失(缓解)，但是经常发生永久性神经学问题，尤其随着疾病进展(Lublin等人,1996)。已经描述了几种亚型或进展模式，并且它们对于预后以及治疗决策是重要的。在1996年，美国国家多发性硬化协会标准化四种亚型定义：复发缓解型、继发进展型、原发进展型和进展复发型(Lublin等人,1996)。
复发缓解型亚型(RRMS)的特征为无法预测的急性攻击，称为加重或复发，之后是数月至数年相对安静的阶段(缓解)，没有疾病活动性的新体征。这描述了大多数患有MS的个体的初始过程。RRMS是所述疾病最具异质性的复杂表型，其特征为不同水平的疾病活动性和严重性，特别是在早期阶段中。炎症占主要地位，但是也存在神经变性。脱髓鞘在持续数天至数月的急性复发期间发生，之后在没有疾病活动性的缓解阶段期间部分或完全恢复。RRMS影响约65-70％的MS群体，且往往进展至继发进展型MS。
继发进展型MS(SPMS)以复发缓解型过程开始，但随后演变成急性攻击之间的进展性神经衰退，没有任何明确的缓解阶段，即使偶然复发、轻度缓解或平台期可能显现。在可获得已批准的疾病改善疗法之前，来自MS的自然历史研究的数据显示，一半RRMS患者将在10年内转变为SPMS，且90％将在25年内转变。SPMS影响所有MS患者中的大约20-25％。
原发进展型亚型(PPMS)的特征为残疾逐渐但稳定的进展，在初始MS症状显现后没有明显缓解(Miller等人,Lancet Neurol.(2007)6(10):903-12)。其特征为残疾从发作开始进展，偶然出现短暂的轻度改善或平台期。小部分PPMS患者可能经历复发。所有患有MS的个体中的大约10％患有PPMS。原发进展型亚型的发作年龄通常晚于其他亚型(Miller等人,2007)。男性和女性同等地受影响。
进展复发型MS(PRMS)的特征为稳定神经衰退，伴随急性攻击，之后可能有或可能没有一定恢复。这在所有上述亚型中是最不常见的。
也已经描述具有非标准行为的病例，有时称为MS的交界形式(Fontaine,RevNeurol.(Paris)(2001)157(8-9Pt 2):929-34)。这些形式包括德维克病、巴洛同心圆性硬化、Schilder弥漫性硬化和Marburg多发性硬化(Capello等人,Neurol Sci.25增刊(2004)4:S361-3；Hainfellner等人,J Neurol Neurosurg Psychiatr.(1992)55(12):1194-6)。
规范短语“复发形式的MS”(RMS)通常涵盖RRMS和具有复发的SPMS二者。所述短语通常是指三种不同的患者亚型：RRMS、具有复发的SPMS以及具有在MRI上在时间和空间上病灶扩散的证据的临床上分离的脱髓鞘事件(参见例如，European Medicines Agency,Committee for Medicinal Products for Human Use's“Guideline on ClinicalInvestigation of Medicinal Products for the Treatment of Multiple Sclerosis”(修订版2,2015))。
IV.继发性自身免疫
当自身免疫在首发(“原发性”)疾病(例如，“原发性”自身免疫性疾病，例如，MS)发作后出现时，所述自身免疫在本文中称为“继发性自身免疫”(sAI)。继发性自身免疫有时在例如淋巴细胞清除疗法后具有或已经具有淋巴细胞减少的MS患者中出现。在一些个体中，继发性自身免疫在淋巴细胞清除疗法(例如，用阿仑单抗治疗)后不久出现。在其他个体中，继发性自身免疫可能直到淋巴细胞清除疗法后数月或数年才出现；在那些个体中的一些中，截至他们发生继发性免疫的时间，可能已经发生实质性淋巴细胞恢复(总淋巴细胞计数)，使得他们可能不再是淋巴细胞减少的。因此，在一些情形中，应针对任何继发性自身免疫的体征谨慎监测已经用淋巴细胞清除疗法例如抗CD52抗体治疗的患者并及时加以治疗。
继发性自身免疫包括但不限于自身免疫性甲状腺疾病(包括格雷夫斯病、甲状腺功能亢进症、甲状腺功能减退症、甲状腺肿、桥本病和甲状腺炎(例如，短暂性甲状腺炎))、自身免疫性血细胞减少症(包括特发性血小板减少性紫癜(ITP)、自身免疫性中性粒细胞减少症、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性淋巴细胞减少症和红细胞再生障碍)、1型糖尿病、斑秃(例如，全秃)、白癜风、肌痛、结节病、自身免疫性肝炎和肾病(包括肾小球肾炎(例如，膜性肾小球肾炎)和抗肾小球基底膜(GBM)病(古德帕斯彻综合症))。用于诊断和监测这些继发性自身免疫性疾病的技术都是本领域技术人员熟知的，包括症状评估和医学检查，如血液分析。本发明考虑使用任何已知方法。例如，可以确定患者体液(例如，血液)中的自身抗体水平作为检测继发性自身免疫的体征的手段。具体而言，可以测量抗核抗体、抗平滑肌抗体和抗线粒体抗体。如果检测到抗核抗体，则可以进行另外的测定以测量抗双链DNA抗体、抗核糖核蛋白抗体和抗La抗体。可以测量抗甲状腺过氧化物酶(TPO)和抗促甲状腺激素(TSH)受体抗体以检测自身免疫性甲状腺疾病；如果检测到抗TPO或抗TSH受体抗体，则可以通过测量游离T3、游离T4和TSH水平来测量甲状腺功能是否受影响。可以测量抗血小板抗体以检测自身免疫性血小板减少症；并且血液血小板水平的测量结果可以用于确定抗血小板抗体的存在是否正在引起血小板数量的减少。
V.用于治疗和测试自身免疫性疾病患者的试剂盒
本发明提供用于治疗原发性自身免疫性疾病如多发性硬化的试剂盒。本发明的试剂盒可以含有例如淋巴细胞清除药物(例如，阿仑单抗)，以及用于告知患者或医务人员药物禁忌证(例如，在用药物治疗后发生继发性自身免疫性疾病的风险增加的可能)的书面说明书。所述增加的风险可能与以下相关或由以下指示：如与对照受试者相比，在来自患者的生物学(例如，血液)样品中，(i)总细胞中的减小的血小板谱系细胞(PLC)分数，(ii)增加的IPF值，和/或(iii)总PLC群体中增加的未成熟PLC分数，呈任何组合，以及任选地(iv)增加的针对成熟或激活的血小板的抗体。
在其他实施方案中，本发明提供用于检测来自自身免疫性疾病患者的生物学(例如，血液)样品的总血细胞中的PLC分数、IPF值和/或总PLC中的未成熟PLC分数，和/或用于鉴定具有在淋巴细胞清除后增加的发生继发性自身免疫性疾病的风险的患者的试剂盒。此类试剂盒可以包含用于检测以下的试剂：PLC标记物，如CD41、CD61、SPARC和/或TREML1(和/或本文所述的任何其他PLC/成熟PLC标记物)；未成熟PLC标记物，如PDGFA、PDCD10、DAB2、RGS10、RGS18和/或TSC22D1(和/或本文所述的任何其他未成熟PLC标记物)；和/或IPF值；以及任选地指导使用者从患者获取生物学样品(例如，血液样品)的说明书。此类试剂盒将已经由适当监管机构验证或批准用于在患者如MS患者中作出医学诊断。
除非在本文中另外定义，否则关于本公开文本使用的科学和技术术语应具有由本领域普通技术人员通常所理解的含义。下文描述了示例性方法和材料，但在本公开文本的实践或测试中也可以使用与本文所述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料。在矛盾的情况下，将以包括定义在内的本说明书为准。通常，结合本文所述的免疫学、医学、医学和药物化学以及细胞生物学使用的命名法及其技术是本领域中熟知且常用的那些。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。在本说明书和实施方案通篇中，将理解词语“具有(have)”和“包含(comprise)”或者变体如“具有(has)”、“具有(having)”、“包含(comprises)”或“包含(comprising)”暗示包括所述的整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。如本文所用，如应用于一个或多个目的值的术语“大约”或“约”是指与所述的参考值类似的值。在某些实施方案中，除非另有说明或另外根据上下文是明显的，所述术语是指落入所陈述的参考值的任一方向(大于或小于)的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少内的值的范围。
将本文提及的所有出版物和其他参考文献均通过引用以其整体并入。尽管本文引用了许多文件，但此引用并不意味着承认这些文件中的任一个构成本领域公知常识的一部分。
为了可以更好地理解本发明，列出了以下实施例。这些实施例仅用于说明目的，并不被解释为以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1：阿仑单抗治疗的患者中免疫细胞类型组成的确定
方法：
临床试验和样品收集
从CAMM323研究(CARE-MS I，Clinicaltrials.gov标识符NCT00530348)获得冷藏PBMC样品。在此项研究中，将被诊断患有复发缓解型多发性硬化(RR-MS)且先前尚未用MS疾病改善疗法治疗的患者用阿仑单抗(12mg/天，IV)治疗，在基线(T0)持续连续5天，且在12个月后(T12)持续连续3天，或用皮下干扰素β-1a(44μg，每周三次)治疗。在T0、T12(第一疗程后12个月)和T24时间点(在第二疗程后12个月)，将全血(6-8mL)收集在含有柠檬酸钠的CPTTM管中。此项研究分析总计32名患者的来自T0和T24时间点的样品，其中11名在阿仑单抗治疗后发生继发性自身免疫(sAI，定义为发生甲状腺事件)，18名未发生继发性自身免疫(非sAI)，且3名患者具有如通过自身抗体的存在所定义的实验室异常(LA)(Jones等人,JClin Invest.(2009)119:2052-61)。在判定中，甲状腺事件被定义为具有实验室发现(例如，异常TSH)或临床不良事件(AE)。如果被诊断，则将临床AE分类为格雷夫斯病(即，甲状腺功能亢进症)、桥本病(即，甲状腺功能减退症)、短暂性甲状腺炎、格雷夫斯病转变为甲状腺功能减退症、桥本病转变为甲状腺功能亢进症或不确定的。没有人口协变量如年龄、性别或BMI显示与sAI相关(数据未显示)。自身免疫发展的时间线描述于先前研究(Berger等人,CNSDrugs(2017)31:33-50；Havrdova等人,Neurology(2017)89:1107-16)中。
PBMC处理和储存
在血液收集后，将CPTTM管在临床地点离心，使得将红细胞(RBC)捕获于凝胶屏障内。在运输前将PBMC的血浆层和白膜层(white buffy coat)混合在一起。将CPTTM管在室温下运输至实验室并在收集的60小时内进行处理。在II类生物学安全工作橱中进行PBMC收集。将细胞温和地倒置到血浆中5-10次，然后打开CPTTM管并将凝胶上方的全部悬浮液转移至无菌15mL锥形管中。记录溶液体积。在将样品以300g离心10-15分钟后，在不扰动细胞沉淀物的情况下取出血浆并弃去。通过温和吸液使沉淀物重悬，并且添加Dulbecco's PBS(1X)以使体积补足10-13mL。然后将样品以300g离心10-15分钟。在不扰动沉淀物的情况下抽吸上清液，并且添加Dulbecco's PBS(1X)以使体积达到10mL。温和地倒置并混合样品。使用Gen-S血液学分析仪来确定白细胞计数以及淋巴细胞％和单核细胞％计数。通过用碘化丙啶染色和在FACSCaliburTM上处理来确定细胞活力。随后，将样品以300g离心10-15分钟，并抽吸上清液。通过吸液温和地使沉淀物重悬。添加2mL冷冻溶液CS10(StemcellTechnologies，目录号07930)并使用1mL移液器混合。将1mL细胞溶液等分至2个冷冻小瓶中并在-80℃储存最少24小时且最多72小时，之后在液氮中长期储存。
PBMC解冻和预处理用于单细胞工作流
如先前在Hanamsagar等人,Sci Rep.(2020)10:2219中所述，将冷藏的PBMC在37℃水浴中解冻(一次2个小瓶)1-2分钟，直至小晶体残留。将冷冻小瓶从水浴取出，并使用宽孔径移液器吸头将细胞溶液转移至无菌的2mL 管中。将冷冻小瓶用1mL的0.04％BSA/PBS洗涤，并将溶液转移至/>管中。将样品在室温(RT)下以150g离心5min。谨慎地去除上清液，并且使用宽孔径移液器吸头用1mL的0.04％BSA/PBS洗涤样品。使用上文相同条件将样品再洗涤两次，总计洗涤3次。在最终洗涤后，将细胞重悬于1mL的0.04％BSA/PBS中并且使用血细胞计数器(C-ChipTM，SKC，目录号DHCF015)以锥虫蓝(0.4％，GIBCOTM目录号15250061)作为染色剂进行计数。如果发现活力低于75％，则使用死细胞去除试剂盒(Miltenyi Biotec，目录号130-090-101)使样品经历“净化(clean-up)”步骤。将细胞再次洗涤并重悬于500μL的0.04％ BSA/PBS中并进行计数。将体积调整至1×106个细胞/mL 0.04％ BSA/PBS。使细胞运行经过10X Genomics Chromium装置以供包封。
单细胞转录组学
在将细胞体积调整到1×106个细胞/mL后，使用用于10X Genomics 5'基因表达文库制备的方案。每个样品靶向8000个细胞。使用2100Bioanalyzer仪器(Agilent)用高灵敏度DNA试剂盒(Agilent，目录号5067-4626)确定唯一索引文库的质量，并且使用KapaTM文库定量试剂盒(Kapa Biosystems，目录号KK4824-07960140001)在QuantStudioTM7Flex实时PCR系统上进行定量。将所述文库稀释于10mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中并以等摩尔浓度(2nM)合并用于测序。
在NOVAseqTM6000系统(Illumina)上使用NOVAseqTM6000S2试剂盒(300个循环，Illumina目录号20028314)进行测序。测序深度和循环数量是根据10X Genomics推荐：读段1＝26个循环，i7索引＝8个循环，读段2＝98个循环，并且将目标设定为每个细胞35,000个读段的测序深度。
单细胞管线、预处理和QC
如先前所述进行单细胞分析(Hanamsagar等人,Sci Rep.(2020)10:2219)。简单来说，在BCL转化后，经由CellRangerTMv2.1.1版处理FASTq用于分用、比对、过滤、条形码计数、UMI计数和基因x条形码矩阵的生成。随后，运行内部构建的预处理管线用于环境RNA的背景去除和过滤出空条形码以及应激和线粒体基因。然后将所得hdf5文件输入称为SPRING的内部单细胞可视化工具中(Weinreb、WoloCk和Klein,Bioinforma Oxf Engl.(2018)34:1246-8)。SPRING还允许压缩/减小大型单细胞数据集的尺寸用于快速可视化。然后使用内部开发的工具自动注释细胞类型和细胞亚型，以及鉴定新型细胞类型。在仔细审查后，从分析排除质量差的样品。简单来说，评价每个样品的CellRangerTM网页概要。如果发现“悬崖图(cliffgraph)”通过了QC，则评价测序深度。对于测序深度低的样品，将文库再次合并以解释低读段样品并再次测序。合并来自所有测序运行的数据并经由CellRangerTM再次运行。再次评价网页概要并且标记具有低细胞计数和不良“悬崖图”的样品。将所有样品经由内部管线进行处理用于去污染和过滤(如上所述)，并且在SPRING门户上进行可视化。标记在SPRING布局上聚类较差或具有少于100个细胞的样品。因此，从分析剔除未通过CellRangerTMQC和SPRING聚类的样品。鉴定出七个此类样品并将其剔除。将所得的新数据集标为Lemtrada_SC(样品净化)。因为这些样品属于不同患者的不同时间点，创建另一个数据集，其从Lemtrada_SC数据集中的患者剔除成对样品。这个新的数据集被称为Lemtrada_PC(患者净化)。
结果：
在阿仑单抗治疗之前和之后细胞类型的相对丰度的变化
如先前所观察到的(Baker等人,JAMA Neurol.(2017)74:961)，在治疗后时间点(在第二疗程后12个月；T24)检测到B细胞的增加和T细胞的减少(数据未显示)。
此外，这些细胞类型在每个样品中的单独比例(如使用单细胞RNA测序(scRNA-seq)所确定)与临床上记录的淋巴细胞计数高度相关。这表明，scRNA-seq相对丰度测量结果(如使用所开发管线所测量)提供关于细胞计数的可靠观点。另外，就细胞类型而言，其提供比常规使用的标准荧光激活细胞分选法(FACS)更深层次的解析。在任一组的总单核细胞和NK细胞数量方面未观察到差异(数据未显示)。来自单细胞数据的NK细胞丰度也与临床值(数据未显示)高度相关，从而进一步提高使用scRNA-seq数据作为临床值的替代品的可能性。
在阿仑单抗治疗之前和之后sAI与非sAI患者的B细胞和T细胞差异
与先前发现(Baker等人,2017；Evan等人,Expert Opin Biol Ther.(2018)18:323-34)一致，发现在治疗后幼稚B细胞的数量显著增加，而CD4和CD8 T细胞数量有所减少(数据未显示)。在sAI与非sAI患者中，在B细胞和T细胞亚型方面未观察到差异(数据未显示)。
未知细胞类型的分类
由于在具有或不具有甲状腺事件的那些之间，在已知细胞类型或亚型的相对丰度方面未观察到差异，分析通过自动化算法分类为未知的细胞类型的丰度。令人惊讶地，这揭示与不具有甲状腺事件的那些相比，在具有甲状腺事件的那些中罕见血小板样细胞类型(PLC)显著更低(图1，sAI 0.07％；非sAI 0.52％)。这种效应并非由任何特定的患者驱动(图2)。PLC百分比低(<0.1％)，但是sAI与非sAI之间的差异非常显著并且在治疗前和治疗后两个时间点都保持着(图3)。基于标记物表达(图4)，PLC与血小板非常相似，但是以高水平表达并非与血小板普遍相关的两种另外的表面标记物：SPARC和TREML。血小板是PBMC制剂中的常见污染物(McFarland等人,Cytom Part J Int Soc Anal Cytol.(2006)69:86-94)，但是它们很小并且预期不含RNA。因此，假设这种细胞类型构成具有适合于sc-RNAseq捕获的特殊物理特征(例如，较大尺寸和转录物含量)的血小板谱系细胞(PLC)。
实施例2：使用FACS对血小板谱系细胞(PLC)的鉴定
为了确认PLC的身份，使用来自两个健康供体的样品进行FACS实验以估计在所有样品分离和处理步骤期间PLC的相对丰度。
方法：
流式细胞术：
细胞的预处理
在马萨诸塞州弗雷明汉使用Sanofi的内部供体研究程序从两名健康受试者获得全血样品。将每个供体的75-100mL血液收集至含有柠檬酸钠的CPTTM管(BD Biosciences，目录号362761)中。在第一实验中，如上所述从血液分离PBMC。此后，将PBMC用1×PBS洗涤两次，并使用碘化丙啶/吖啶橙染色剂(Nexcelom，目录号CS2-0106-5ML)在CellacaTMMX(Nexcelom，MX-SYS1型)上进行计数。将一半新鲜收集的PBMC储存于CryostorTMCS10(Stemcell technologies，目录号07930)中并在-80℃下冷冻24小时，之后将其储存于液氮中。一周后，将细胞解冻，计数并处理用于流式细胞术。处理剩余一半新鲜PBMC用于抗体染色和流动分析。在第二组实验中，召回健康供体，并且如上所述收集血液。根据制造商的说明书使用ACK裂解缓冲液(GibcoTM，A10492-01，批号2048611)进行RBC裂解。简单来说，每个供体使用两个50mL FalconTM锥形管。在初始离心以去除血浆后，将大约10-12mL全血倒入每个50mL管中。将ACK缓冲液添加至45mL，并且在VWR变速摇床上孵育10分钟。在第三次10分钟孵育后，细胞沉淀物几乎为白色，表明红细胞已经被裂解并通过洗涤去除。此后，处理细胞用于染色和流式细胞术。
补偿、染色和流动分析：
在BD InfluxTM(Becton Dickinson Influx Configurable，646500型，s/nX64650000137)上运行样品之前，根据Influx方案进行自动补偿。简单来说，将两滴补偿珠(见下文)与一次测试的染色剂混合，在冰上在暗中孵育20分钟，然后使其重悬于5mLFalcon管中的350μL染色缓冲液中。
将所有细胞在4℃下以300g离心5分钟。使沉淀物重悬于3mL BD染色缓冲液中，并将其转移至5mL Falcon聚丙烯管中。将细胞再次离心，然后将沉淀物重悬于100μL染色组中并在冰上在暗中孵育30min。所述染色组由以下组成：CD61-BV510(5μL/测试)、CD41A-APC(20μL/测试)、TREML/TLT-1-FITC(5μL/测试)和SPARC-(350)(5μL/测试)。在孵育后，添加3mL染色缓冲液并离心。去除上清液并将沉淀物重悬于2mL染色缓冲液中，并根据制造商的说明书在BD Influx上进行分析。BD InfluxTM信息：将振幅设定为4.91，液滴频率为44.70，液流焦点为15，液滴位置为200，最大液滴为101，液滴延迟为28.43，并且管的液流偏转为-84、-33、33、86。
设门策略：
根据关于FSC和SSC的对数标度对活细胞设门，不包括死细胞。在活细胞中，使用关于FSC和SSC的对数标度对“小细胞”设门，因为其尺寸小(2-3μm)。在FSC和SSC门外使用触发脉冲宽度对单态细胞(singlet)设门。CD41A+和CD61+被认为是血小板的标记物，并且在单态细胞门外对其设门。根据CD41A+CD61+门，将PLC鉴定为对SPARC和TREML1呈双阳性。
统计学分析
使用FlowJoTM(版本10)分析流动数据。使用GraphPad Prism(版本8)生成图并进行统计学分析。显著性水平表示为：***p<0.001，**p<0.01，以及*p<0.05。
通过排除也表现出此实验室异常的单一sAI患者(10553163)，针对抗PLGY抗体的存在测试PLC丰度结果的稳健性。排除该患者后，显著性水平为p<0.015。
结果：
PLC鉴定
观察到CD41+CD61+细胞在全血中的比例为35％，在新鲜PBMC(去除中性粒细胞后)中增加至55％，并且在冷冻PBMC中降低至30％(图5)。然而，PLC(定义为CD41+CD61+SPARC+TREML1+)仅占全血的0.55％和新鲜和冷冻PBMC的0.1-0.2％(图6和图7)。为了更好地理解PLC在尺寸和颗粒性方面的物理特征，通过SSC/FSC设门分析它们，显示它们与SPARC-TREML1-(双阴性)血小板相比时显现为更大且更具颗粒性(数据未显示)。
在阿仑单抗治疗之前sAI与非sAI患者之间的PLC差异
阐明此新型细胞类型的身份后，进行PLC转录组的聚类以确定在阿仑单抗治疗之前在具有甲状腺事件的患者之间是否存在PLC的任何定性差异。发现存在不同的PLC子集，其几种标记物的表达及其相对比例有所不同(数据未显示)。子集1(“未成熟/静息PLC”)涵盖sAI患者(由五名患者代表)中的大多数PLC。其特征为血小板标记物的较低表达，以及PDGFA、抑制性标记物(PDCD10)和核蛋白(DAB2、RGS10、RGS18和TSC22D1)的较高表达。第二子集(子集2，“成熟/激活的”PLC)的肌动蛋白基因ACTB和ACTG1、生长因子(中性粒细胞的强效化学引诱物和激活剂)PPBP相对较高。该子集还富含SPARC和TREML1基因表达。这些结果表明两个子集之间成熟度和激活状态的差异，其中描绘PLC的未成熟/静息状态的子集富集于具有甲状腺事件的那些患者中(图8)。
实际上，对来自161个基线患者样品的scRNA-seq数据的无监督聚类分析揭示，未发生继发性自身免疫的患者具有可以作为成熟PLC的标记物的六种基因(GP1BA、PPBP、ITGA2B、ITGB3、SPARC和TREML1)的较高相对表达水平(图9A)。该发现与患者性状如甲状腺活性、种族和性别无关(图9B)。在阿仑单抗治疗后0、12和24个月评估六种成熟PLC基因(图10A)和五种未成熟PLC基因(PDCD10、RGS10、DAB2、TSC22D1和RGS18)(图10B)的表达水平。成熟PLC基因的表达水平在发生继发性自身免疫的患者中显著下降。未成熟PLC基因的表达水平在发生继发性自身免疫的患者中大致相同或略有下降。
对来自从用IFNβ-1a治疗的MS患者获得的样品的scRNA-seq数据的类似的无监督聚类分析揭示相同成熟和未成熟PLC基因的不同聚类模式，表明这些尤其是在阿仑单抗治疗后发生继发性自身免疫的风险的标记物(图11)。
这些研究表明在阿仑单抗治疗后具有或不具有甲状腺事件的患者中血小板成熟度的临床量度的差异。为了测试这个假设，对所述队列可获得的未成熟血小板分数(IPF)数据进行分析，并且发现，与不具有甲状腺事件的那些患者相比，具有甲状腺事件的患者在T0时具有显著增加的IPF(图12A)。此外，具有甲状腺事件的患者在贯穿两年阶段中进行的每月测量中IPF的轨迹更高(图12B)。在T0时的高IPF并非sAI所特有。然而，低相对PLC和高IPF一起显现为比单独的高IPF更具特异性的指标(图13)。
为了研究PLC不足如何与sAI的亚临床表现相关，从队列中未表现出临床sAI事件但具有可检测的自身抗体的三名另外的患者生成数据：两名具有抗PLGLY抗体，另一名具有抗TPO抗体。在所有三个样品中，PLC都不存在(数据未显示)。
接下来，检查T0时的PLC数量是否可以指示超出4年时间范围(horizon)的AI结局。获得相同患者的7年随访数据。发现7年数据与4年数据在很大程度上一致，例外是单一患者在4年随访后的某个时间发生AI。观察到，与T0相比该患者在T24时具有显著更低的PLC(图2)。

Claims (25)

1.一种用于评估患有原发性自身免疫性疾病的患者在淋巴细胞清除疗法后发生继发性自身免疫的风险的方法，所述方法包括：
a)提供来自所述患者的血液样品；以及
b)确定
(i)所述血液样品的总细胞中血小板谱系细胞(PLC)的分数，其中与第一参照物相比减小的PLC分数指示所述患者在治疗后发生继发性自身免疫的风险增大，和/或
(ii)所述血液样品中的未成熟血小板分数(IPF)，其中与第二参照物相比增加的IPF指示所述患者在治疗后发生继发性自身免疫的风险增大。
2.一种用于治疗患有原发性自身免疫性疾病的患者的方法，所述方法包括：
a)选择已经被诊断为不具有在淋巴细胞清除疗法后增大的发生继发性自身免疫的风险的患者，其中所述风险已经通过确定以下来诊断：
(i)来自所述患者的血液样品的总细胞中血小板谱系细胞(PLC)的分数，其中与第一参照物相比减小的PLC分数指示所述患者在治疗后发生继发性自身免疫的风险增大，和/或
(ii)所述血液样品中的未成熟血小板分数(IPF)，其中与第二参照物相比增加的IPF指示所述患者在治疗后发生继发性自身免疫的风险增大；以及
b)将治疗有效量的所述淋巴细胞清除疗法施用至所述患者。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述确定步骤包括确定(i)和(ii)二者。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述原发性自身免疫性疾病是多发性硬化(MS)。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞清除疗法是淋巴细胞清除抗体疗法。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述抗体是抗CD52抗体或其抗原结合部分。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述抗CD52抗体具有阿仑单抗的六个CDR。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述抗CD52抗体具有阿仑单抗的重链可变结构域和轻链可变结构域。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述抗CD52抗体是阿仑单抗。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述第一参照物和所述第二参照物是从在淋巴细胞清除治疗后不发生继发性自身免疫的患有所述原发性自身免疫性疾病的患者获得，或者从健康受试者获得。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述血液样品是红细胞裂解的血液样品。
12.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述血液样品是外周血单核细胞(PBMC)样品，任选地其中所述样品中的中性粒细胞已经被去除。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中与对照受试者的PLC分数相比，所述PLC分数减小>2个标准差。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中与对照受试者的IPF值相比，所述IPF值增加>2个标准差。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述PLC的特征为呈CD41+CD61+SPARC+TREML1+。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括确定来自所述患者的生物学样品的总PLC群体中未成熟PLC的分数的步骤，其中与第三参照物相比增加的未成熟PLC分数指示所述患者在治疗后发生继发性自身免疫的风险增大。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述未成熟PLC的特征为呈CD41低CD61低PDGFA高PDCD10高，任选地进一步为呈DAB2高RGS10高RGS18高TSC22D1高。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述第三参照物是从在淋巴细胞清除治疗后不发生继发性自身免疫的患有所述原发性自身免疫性疾病的患者获得，或者从健康受试者获得。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述继发性自身免疫选自免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、格雷夫斯病、桥本病、古德帕斯彻病、膜性肾小球肾炎、红细胞再生障碍、自身免疫性甲状腺疾病、短暂性甲状腺炎、自身免疫性溶血性贫血、1型糖尿病、斑秃/全秃、白癜风、肌痛、结节病、自身免疫性中性粒细胞减少症、自身免疫性肝炎和自身免疫性淋巴细胞减少症。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述原发性自身免疫性疾病是复发型MS。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述原发性自身免疫性疾病是复发缓解型多发性硬化(RR-MS)。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述原发性自身免疫性疾病是继发进展型MS(SPMS)。
23.一种用于治疗患者的原发性自身免疫性疾病的淋巴细胞清除疗法，其中所述患者已经被选择为不具有在所述淋巴细胞清除疗法后增大的发生继发性自身免疫的风险，其中所述风险已经通过确定以下来诊断：
(i)来自所述患者的血液样品的总细胞中血小板谱系细胞(PLC)的分数，其中与第一参照物相比减小的PLC分数指示所述患者在治疗后发生继发性自身免疫的风险增大，和/或
(ii)所述血液样品中的未成熟血小板分数(IPF)，其中与第二参照物相比增加的IPF指示所述患者在治疗后发生继发性自身免疫的风险增大。
24.淋巴细胞清除疗法在制造用于治疗患者的原发性自身免疫性疾病的药物中的用途，其中所述患者已经被选择为不具有在所述淋巴细胞清除疗法后增大的发生继发性自身免疫的风险，其中所述风险已经通过确定以下来诊断：
(i)来自所述患者的血液样品的总细胞中血小板谱系细胞(PLC)的分数，其中与第一参照物相比减小的PLC分数指示所述患者在治疗后发生继发性自身免疫的风险增大，和/或
(ii)所述血液样品中的未成熟血小板分数(IPF)，其中与第二参照物相比增加的IPF指示所述患者在治疗后发生继发性自身免疫的风险增大。
25.根据权利要求23所述的用于所述用途或根据权利要求24所述的用于所述用途的淋巴细胞清除疗法，其中所述治疗和/或所述选择符合根据权利要求1-22中任一项所述的方法。
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