CN117286236A - 检测基因突变的核酸产品及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于检测基因突变的核酸产品及其应用，所述核酸产品包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.80所示的引物中的至少一对。使用上述核酸产品进行多重PCR，能够在胚胎植入前同时检测SLC25A13上游的多个SNP位点，通过判断胚胎的基因型，确定胚胎是否为瓜氨酸血症2型致病基因的携带者。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种检测基因突变的核酸产品及应用。
背景技术
SLC25A13基因突变可导致瓜氨酸血症2型(Citrullinemia,adult-onset typeII，MIM:603471)和新生儿瓜氨酸血症2型(Citrullinemia,type II,neonatal-onset,MIM:605814)。
瓜氨酸血症2型为常染色体隐性遗传病，患者的年龄通常介于20～50岁，临床表现为周期性高氨血症，伴有神经精神症状，包括夜间精神错乱、攻击性、易怒、多动、妄想、迷失方向、烦燥、嗜睡、丧失记忆、震颤、抽搐发作和昏迷等；酒精摄入、糖摄入、药物或手术等因素都可能引起发病。新生儿瓜氨酸血症2型通常表现为胆汁流量抑制、肝纤维化、出生体重低、生长迟滞、低蛋白血症和多种肝功能障碍等。
对携带者进行产期诊断或胚胎植入前遗传学检测(Preimplantation genetictesting，PGT)是预防瓜氨酸血症2型出生缺陷的有效手段。PGT是指当胚胎在体外发育至卵裂期或囊胚期时，活检若干细胞进行遗传学检测，最终选择无患病风险的胚胎植入母体子宫，从而达到生育健康后代的目的。PGT可有效避免因妊娠遗传病胎儿而终止妊娠所带来的身心伤害，越来越成为有生育遗传病高风险胎儿夫妇的首选。
根据欧洲人类生殖与胚胎协会(ESHRE)“对于以扩增为基础的PGT-M实践指南”(2020年版)，建议单基因遗传病的植入前遗传学诊断，采用突变检测联合单体型分析的策略，以保证胚胎检测结果的准确度。
多重巢式PCR法需要预先为SLC25A13女性携带者筛选出杂合的短串联重复序列(STR)，然后在淋巴细胞水平建立包含突变位点和杂合STR位点的多重PCR体系，并在细胞水平评估各个位点法扩增效率及等位基因脱扣率，合格后才能应用于胚胎检测。由于STR数量有限，且人群中杂合频率不同，所以多重巢式PCR法设计较为个性化，通用性较低、从而导致检测周期长。
相较于STR位点，单核苷酸多态位点(SNP)数量多分布广，在人群中的发生频率超过1％，其总数达300万个，平均1个/3Kb，在高通量测序平台易实现自动化分析。Karyomapping技术即通过SNP连锁分析间接排除基因缺陷，其芯片上有30万个SNP探针用于全基因组的连锁分析，是一种综合的通用的单基因病PGD技术。但是Karyomapping不能检测基因突变，所以必须要有先证者样本或合适的家系成员样本。如果没有足够的家系样本，则需要额外增加突变检测。
发明内容
基于此，有必要提供一种通用性强、成本低的检测基因突变的核酸产品及应用。具体技术方案如下：
根据本发明的第一方面，提供了一种用于检测基因突变的核酸产品，所述核酸产品包括如下引物对中的一对或多对：SEQ ID NO.1～2、SEQ ID NO.3～4、SEQ ID NO.5～6、SEQ ID NO.7～8、SEQ ID NO.9～10、SEQ ID NO.11～12、SEQ ID NO.13～14、SEQ ID NO.15～16、SEQ ID NO.17～18、SEQ ID NO.19～20、SEQ ID NO.21～22、SEQ ID NO.23～24、SEQID NO.25～26、SEQ ID NO.27～28、SEQ ID NO.29～30、SEQ ID NO.31～32、SEQ ID NO.33～34、SEQ ID NO.35～36、SEQ ID NO.37～38、SEQ ID NO.39～40、SEQ ID NO.41～42、SEQID NO.43～44、SEQ ID NO.45～46、SEQ ID NO.47～48、SEQ ID NO.49～50、SEQ ID NO.51～52、SEQ ID NO.53～54、SEQ ID NO.55～56、SEQ ID NO.57～58、SEQ ID NO.59～60、SEQID NO.61～62、SEQ ID NO.63～64、SEQ ID NO.65～66、SEQ ID NO.67～68、SEQ ID NO.69～70、SEQ ID NO.71～72、SEQ ID NO.73～74、SEQ ID NO.75～76、SEQ ID NO.77～78、SEQID NO.79～80。
在其中一个实施例中，所述核酸产品包括SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.80所示的40对引物对。
根据本发明的第二方面，提供了上述的核酸产品在制备检测瓜氨酸血症2型的试剂盒中的应用。
根据本发明的第三方面，提供了一种用于检测瓜氨酸血症2型的试剂盒，所述试剂盒包括上述的核酸产品。
在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括PCR反应试剂。
在其中一个实施例中，所述PCR反应试剂包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、镁离子和dNTPs中的一种或多种。
在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括DNA提取试剂和MDA反应试剂中的一种或多种。
根据本发明的第四方面，提供了一种非诊断目的的检测基因突变的方法，包括以下步骤：
以待测样本的DNA为模板，使用上述的核酸产品或上述的试剂盒进行PCR扩增，根据所得扩增结果获取所述待测样本的SLC25A13基因上下游的SNP位点的序列信息；
对所述序列信息进行分析处理，从而确定所述待测样本是否存在基因突变。
在其中一个实施例中，所述分析处理的步骤包括：将所述待测样本的SLC25A13基因上下游SNP位点的序列信息与亲代双方的DNA序列进行比对，分析所述待测样本的单体型。
在其中一个实施例中，所述分析处理的步骤还包括：将所述待测样本的SLC25A13基因上下游SNP位点的序列信息与hg19参考基因组进行比对，分析SNP覆盖倍数和基因型。
与传统技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明针对SLC25A13基因上下游的多个SNP位点设计了引物对，通过对上述SNP位点进行检测和分析，结合家系信息构建突变等位基因的单体型，从而判断胚胎基因型，明确植入前胚胎是否存在瓜氨酸血症2型出生缺陷的风险，为患有瓜氨酸血症2型的生育夫妇提供临床指导。本发明的核酸产品能够同时对多个SNP位点同时进行检测，适用于携带不同基因突变的各类人群，具有通用性强、成本低、准确性高等优点。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。
本发明中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。
本文中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。
本文中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本发明的技术方案、解决本发明的技术问题、实现本发明预期的技术效果为准。
本文中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。
本发明中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本发明保护范围的限制。
本发明中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，涉及到数值区间(也即数值范围)，如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点(即最小值及最大值)，以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1-10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本发明中，“SNP”指单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism)，指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。
本发明中，“单体型”指位于一条染色体特定区域的一组相互关联、并倾向于以整体遗传给后代的单核苷酸多态的组合，又称单倍体型或单元型。
本发明中，“引物对”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。
以hg19为参照基因组，申请人从SLC25A13基因的上下游序列中筛选得到如下40个SNP位点：
chr7:92706012、chr7:92716410、chr7:92745289、chr7:92745432、chr7:92800393、chr7:92843156、chr7:92864650、chr7:92872719、chr7:92946456、chr7:92992989、chr7:93016431、chr7:93022869、chr7:93063398、chr7:93155308、chr7:93191202、chr7:93191207、chr7:93197732、chr7:93200058、chr7:93206264、chr7:9325063、chr7:93252839、chr7:93281088、chr7:93298115、chr7:93301114、chr7:93319544、chr7:93358703、chr7:93391800、chr7:93452850、chr7:93484426、chr7:93484445、chr7:93516077、chr7:93529615、chr7:93539490、chr7:93539527、chr7:9356536、chr7:93567789、chr7:93568748、chr7:93607010、chr7:93621393、chr7:93633010。
基于上述筛选得到的SNP位点，本发明的一些实施方式提供了一种用于检测基因突变的核酸产品。
在其中一些实施方式中，上述SNP位点对应的核酸产品的核苷酸序列如表1所示。
表1 SNP位点及引物信息
在其中一些具体示例中，本发明的核酸产品中包括上述40对引物对中的一对或多对。可理解地，核酸产品中可以包括上述任意1对、2对、3对、4对、5对、6对、7对、8对、9对、10对、11对、12对、13对、14对、15对、16对、17对、18对、19对、20对、21对、22对、23对、24对、25对、26对、27对、28对、29对、30对、31对、32对、33对、34对、35对、36对、37对、38对、39对或者全部40对引物对。
采用上述核酸产品，能够快速、准确地检测SLC25A13基因上下游的SNP位点，明确胎胚基因型；从而辅助确认植入前的胚胎是否为瓜氨酸血症2型致病基因的携带者。
在一些具体示例中，上述引物对具有相近的退火温度，且PCR产物的片段大小都在120bp～280bp范围内。
本发明的另一些实施方式提供了一种上述核酸产品在制备检测瓜氨酸血症2型的试剂盒中的应用。
具体地，本发明提供了一种包括上述任一实施方式的核酸产品的试剂盒。
在其中一些具体示例中，试剂盒中还包括PCR反应试剂。
在一些示例中，PCR反应试剂包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、镁离子和dNTPs中的一种或多种。
在其中一些具体示例中，试剂盒中还包括DNA提取试剂。
在其中一些具体示例中，试剂盒中还包括MDA(Multipledisplacementamplification，多重置换扩增)反应试剂。
可以理解的是，在其他一些具体示例中，上述试剂盒可以不包括PCR反应试剂、DNA提取试剂和MDA反应试剂中的任意一些试剂，不包括的试剂可以合理从外部获得。
本发明的试剂盒通过检测SLC25A13基因上下游的多个SNP位点，从而获取单体型的SNP覆盖倍数和基因型，能够明确植入前胚胎否存在瓜氨酸血症2型的出生缺陷风险。
本发明的另一些实施方式还提供了一种基于非诊断目的的检测基因突变的方法，其特征在于，包括步骤S10和步骤S20。
步骤S10：以待测样本的DNA为模板，使用上述的核酸产品或上述的试剂盒进行PCR扩增，根据所得扩增结果获取待测样本的SLC25A13基因上下游的SNP位点的序列信息。
步骤S20：对步骤S10获取的序列信息进行分析处理，从而确定待测样本是否存在基因突变。
在其中一些具体示例中，步骤S20中，采用高通量测序法对序列信息进行分析处理。可以理解的是，序列分析的方法不限于此，也可以采用现有的其他方法。
具体地，步骤S20中，包括如下步骤：将待测样本的SLC25A13上下游SNP位点的序列信息与亲代双方的DNA序列进行比对，分析胚胎的单体型。
进一步地，步骤S20中，还包括如下步骤：将待测样本的SLC25A13基因及其上下游SNP位点的序列信息与hg19参考基因组进行比对，分析SNP覆盖倍数和基因型。可选地，基因组参考序列可来自公共数据库，如人类基因组序列还可以是NCBI或者UCSC数据库中的人类基因组参考序列hg38。
在一些具体示例中，待测样本的DNA选自外周血基因组DNA、精液DNA、口腔粘膜细胞DNA、细胞全基因组扩增产物或MDA扩增产物。
可以理解的是，该方法的检测对象可以是未经体内发育的受精14天以内的胚胎，也可以来自已经死亡的胚胎等；其检测结果也不涉及其亲代双方的疾病诊断结果，因此不属于疾病的诊断和治疗方法。
上述检测基因突变的方法，至少具有通用性强、准确性高、快速高效等优点；通过检测SLC25A13基因的上下游足够多的SNP位点信息，在胚胎植入前明确基因突变情况，从而分析胚胎的基因型；为瓜氨酸血症2型的胚胎植入前遗传学检测提供参考。
下面将结合具体实施例和对比例对本发明作进一步说明，但不应将其理解为对本发明保护范围的限制。
实施例1：
(1)引物合成
针对筛选到的40个SNP位点，通过在线平台https://www.ampliseq.com/分别设计特异性引物，引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.80所示(表1)；交由生物公司合成上述引物对，备用。上述40对引物对的退火温度相近，且PCR产物的片段大小在120bp～280bp范围内。
(2)植入前诊断
临床收集到一例胆汁酸偏高、表现为瓜氨酸血症2型的患儿，其双亲表型正常。双亲申请对本人和患儿的SLC25A13基因进行检测，单体型结果为：双亲均为杂合，患儿为复合杂合。
多重PCR扩增：将步骤(1)中合成的40对引物混合到一个PCR反应管中，对样本进行40重PCR反应，扩增待测样本的SLC25A13基因上下游的SNP位点。
建库和测序：按照Illumina标准建库流程对活检细胞全基因组扩增产物进行建库，用Miseq进行测序。当待测的DNA分子来自多个受试样品时，每个样品可以被加上不同的标签序列(barcode)用以区分，从而实现对多个样品同时进行测序。
比对与统计：利用trimmomatic软件对Illumina测序仪产生的原始数据去除接头序列，用BWA软件比对到人类hg19参考基因组，分析单体型SNP覆盖倍数和基因型；结果如表2所示(M0、M1、F0、F1代表单体型，M0为女方致病单体型，M1为女方正常单体型，F0为男方致病单体型，F1为男方正常单体型)。
表2
有效SNP位点统计如表3所示，通过标准设定为突变位点两侧各有≥3个有效SNP，100名受检者通过率100％；符合欧洲人类生殖与胚胎协会(ESHRE)“对于以扩增为基础的PGT实践指南”(2020年版)的要求。
表3
患儿及其双亲的胚胎SNP单体型检测结果如表4所示，其中M0为女方致病单体型，M1为女方正常单体型，F0为男方致病单体型，F1为男方正常单体型。(表中“？”代表该位点未被检测到，即位点缺失；加下划线代表该位点发生脱扣)其中，1～40号均为SLC25A13基因上游的SNP位点；1～2、4～8、14～24、26、28、35～37和39～40号为男方有效位点；3、9～11、13、25、27、29～34和38号为女方有效位点。
表4
上述结果表明，基于高通量测序技术，使用本发明的核酸产品能够检测样本中SLC25A13基因上下游的多个SNP位点，通过分析比对，从而明确子代胚胎是否为瓜氨酸血症2型致病基因的携带者。具体地，子代胚胎的SNP单体型来源于女方正常单体型和男方正常单体型，可认为该子代胚胎不是瓜氨酸血症2型致病基因的携带者。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种用于检测基因突变的核酸产品，其特征在于，所述核酸产品包括如下引物对中的一对或多对：SEQ ID NO.1～2、SEQ ID NO.3～4、SEQ ID NO.5～6、SEQ ID NO.7～8、SEQID NO.9～10、SEQ ID NO.11～12、SEQ ID NO.13～14、SEQ ID NO.15～16、SEQ ID NO.17～18、SEQ ID NO.19～20、SEQ ID NO.21～22、SEQ ID NO.23～24、SEQ ID NO.25～26、SEQ IDNO.27～28、SEQ ID NO.29～30、SEQ ID NO.31～32、SEQ ID NO.33～34、SEQ ID NO.35～36、SEQ ID NO.37～38、SEQ ID NO.39～40、SEQ ID NO.41～42、SEQ ID NO.43～44、SEQ IDNO.45～46、SEQ ID NO.47～48、SEQ ID NO.49～50、SEQ ID NO.51～52、SEQ ID NO.53～54、SEQ ID NO.55～56、SEQ ID NO.57～58、SEQ ID NO.59～60、SEQ ID NO.61～62、SEQ IDNO.63～64、SEQ ID NO.65～66、SEQ ID NO.67～68、SEQ ID NO.69～70、SEQ ID NO.71～72、SEQ ID NO.73～74、SEQ ID NO.75～76、SEQ ID NO.77～78、SEQ ID NO.79～80。
2.根据权利要求1所述的用于检测基因突变的核酸产品，其特征在于，所述核酸产品包括SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.80所示的40对引物对。
3.权利要求1或2所述的核酸产品在制备检测瓜氨酸血症2型的试剂盒中的应用。
4.一种用于检测瓜氨酸血症2型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的核酸产品。
5.根据权利要求4所述的用于检测瓜氨酸血症2型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应试剂。
6.根据权利要求5所述的用于检测瓜氨酸血症2型的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应试剂包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、镁离子和dNTPs中的一种或多种。
7.根据权利要求4～6任一项所述的用于检测瓜氨酸血症2型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括DNA提取试剂和MDA反应试剂中的一种或多种。
8.一种非诊断目的的检测基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：
以待测样本的DNA为模板，使用权利要求1或2所述的核酸产品或权利要求4～7任一项所述的试剂盒进行PCR扩增，根据所得扩增结果获取所述待测样本的SLC25A13基因上下游的SNP位点的序列信息；
对所述序列信息进行分析处理，从而确定所述待测样本是否存在基因突变。
9.根据权利要求8所述的检测基因突变的方法，其特征在于，所述分析处理的步骤包括：将所述待测样本的SLC25A13基因上下游SNP位点的序列信息与亲代双方的DNA序列进行比对，分析所述待测样本的单体型。
10.根据权利要求9所述的检测基因突变的方法，其特征在于，所述分析处理的步骤还包括：将所述待测样本的SLC25A13基因上下游SNP位点的序列信息与hg19参考基因组进行比对，分析SNP覆盖倍数和基因型。
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