CN117282475A - 从数字微流控芯片中取出液滴的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了从充有填充液的数字微流控芯片中有效取出液滴的方法。具体来说，通过选用熔点高于液滴熔点的填充液，将所述液滴移动到芯片中的指定区域，并将该指定区域的温度降低到所述指定区域的填充液熔点以下、且所述指定区域的液滴熔点以上，使得所述指定区域的填充液变成固态、而液滴仍为液态。这样从数字微流控芯片中将所述液滴取出时，可以将可能混入的填充液的量降低到最小，甚至为零。这可以简化取出液滴后续的储存、处理和使用。

Description

从数字微流控芯片中取出液滴的方法
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种从数字微流控芯片中取出液滴的方法。
背景技术
用于生物医学检测和分析的仪器有很多，在使用这些仪器时，反应所需样本或试剂有很大比例都不参与反应或测量而被浪费。在数字微流控(DMF)体系中，死体积(加入体系但不参与反应和检测的液体体积)可以显著减少，有时甚至可以减少为零，这意味着实验所需的样本或试剂的量就是用于测量的量。这不仅大大降低了样本和试剂的使用成本，因为较小的反应体积可以缩短试剂和样本的混合及反应的时间，检测分析所需的时间也因此可以大大缩短。而且，当前许多生物医学分析系统在使用时需要大量手动处理的步骤，而基于数字微流控的系统(包括DMF芯片和仪器)可以提供高度的集成度和自动化，可大大减少可能的人为错误，从而提高实验的可靠性和数据质量。
在基于液滴控制的数字微流控系统中，液体以离散的格式(液滴)在二维空间中被操控，每个液滴都可以被独立控制，这也是所述技术被称为数字微流控的原因。在数字微流控器件中，液滴的运动路径可以在实验时再做确定，并可以动态更改。与通常的压力驱动(通过真空泵)或离心力驱动(通过旋转离心装置)的管道微流控相比，数字微流控器件仅需要低电压即可控制其中的液滴。数字微流控中的驱动力基于电场效应，例如电润湿或介电泳，这个静电效应和待检测的生物样本之间通常没有相关性，这使得数字微流控系统的设计和具体的检测项目独立，因而具有比较好的通用性。
近年来，数字微流控技术由于具有处理单个液滴的能力，以及容易做到小型化、集成化和自动化等优点，吸引了广泛的关注。数字微流控技术减少了试剂的使用量、简化了实验步骤、缩短了检测时间，具有很大的优越性，在医疗诊断、基因测序、DNA合成、药物开发等领域都有很大的应用价值。
以下是对本发明中可能牵涉到的技术领域做一个简单的介绍。
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,或PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，是生物体外的特殊DNA复制，其最大的特点是能将微量的DNA大幅增加。PCR需要对反应体系进行反复温度循环，这个反应体系包含有特定DNA引物、dNTP(deoxy-ribonucleoside triphosphate，脱氧核糖核苷三磷酸)、热稳定DNA聚合酶(如Taq酶)等，每个温度循环都会使目标DNA分子的数量增加一倍(理论上，但实际上会小一些)，从而导致目标序列数量的指数增长。所述技术将样本中的微量DNA或RNA扩增到可以测量和分析的水平。PCR技术已应用于许多不同领域，包括病毒载量测试、食源性病原体定量、临床诊断、耐药性分析和法医科学。利用PCR技术，医生和研究人员可以通过分析一个单细胞来确定病毒感染的来源。现在可以使用PCR检测到许多传染性生物，例如COVID-19、HIV、乙型肝炎、丙型肝炎、SARS病毒、西尼罗河病毒、结核分枝杆菌等。
基因测序(Gene Sequencing)，也叫DNA测序(DNA Sequencing)，是一种新型基因检测方法，能够从生物样本(例如血液、唾液等)中分析测定部分或全部基因序列。基因测序技术能锁定个人病变基因，提前预防和治疗。当前，基因测序相关产品和技术已由实验室研究演变到临床使用，意义重大。
当前主要的测序技术有：1)1977年Sanger等人发明了具有里程碑意义的末端终止测序法，也常叫做一代测序；2)边合成边测序的二代测序技术；3)不需要经过PCR扩增而实现了对每一条DNA分子的单独测序的第三代测序技术；4)第四代测序技术-不需要对DNA或RNA进行生物或化学处理，通过ssDNA(single strand DNA)或RNA模板分子通过纳米孔而产生的“电信号”变化推测碱基组成进行实时测序。
二代测序技术(Next Generation Sequencing,简称NGS),又称高通量测序技术(High Throughput Sequencing,简称HTS)，以低成本、较高的准确度(大于99％)，一次可对几百、几千个样本的几十万至几百万条DNA分子同时进行快速测序分析，从而迅速得到了广泛的接受，是当前测序的主流技术。二代测序过程中第一步是文库构建(简称建库)。DNA文库(DNA library,也叫基因文库，这里简称文库)严格来讲应称作cDNA文库，是指某生物基因组中所有可表达的基因片段，经mRNA反转录后获得相应的cDNA的集合。NGS测序中所指的文库通常指的是对应于同一个样本的、长短相近的、3’端和5’端有连接头(adaptor)的DNA片段的集合；通常会将多个文库(每个文库有独特的连接头)汇集在一起(pooledtogether)上测序仪测序。所谓文库建库就是对待测序的DNA进行一些处理，将DNA处理成上机测序所需要的格式的过程，这个格式化的过程可能包括样本DNA片段化、末端修复、加A碱基、加连接头、浓度扩增、纯化(例如做磁珠清洗)等。建库是DNA测序过程中非常重要的一个环节，它直接影响到测序质量，建库效果不好，测序质量就不可能好。
针对于当前市场占有率最大的illumina测序平台，DNA类的文库主要分为：DNA小片段文库、DNA大片段文库、外显子(Exon)文库、PCR-Free文库和单细胞文库等。下面是一些建库流程的简介。
典型的DNA小片段建库流程包括：1)片段化-将待测序的DNA分子(利用超声波或酶切反应)打断成一定长度(通常150-500bp)的序列片段；2)末端修复(End repairing,简称ER)-将打碎后的基因组进行末端补平；3)加A(A tailing,简称AT)在补平后的片段3’端加A和5’端进行磷酸化；4)加连接头-对修复后的片段进行接头连接；5)磁珠纯化；6)DNA洗脱；7)对接头连接后DNA片段进行PCR扩增；8)磁珠纯化；9)DNA洗脱；10)文库收集。
DNA大片段文库的构建主要分为以下几个步骤：1)将待测序的基因组打断；2)将打碎的基因组进行末端修复和进行Biotin标记；3)将标记好的基因组环化；4)将环化后的基因组打碎；5)磁珠捕获片段化的基因组；6)对捕获后的基因组进行末端修复加A和加接头；7)对接头连接后的基因组进行PCR扩增；8)文库收集。
外显子文库的构建流程主要分为以下几个步骤：1)将质量合格的基因组DNA超声打碎成200-300bp左右的片段；2)将打碎的基因组DNA片段进行末端修复(ER)，3’端加A和5’端进行磷酸化(AT)；3)对修复后的片段进行接头连接；4)对接头连接后DNA片段进行线性扩增(LM-PCR)制备成杂交文库；5)将构建好的文库进行探针杂交捕获；6)将捕获后的文库进行PCR扩增富集；7)文库收集。
从上面的简单描述可以看出现有技术的测序文库构建的步骤比较繁琐，成本也较高。发明人经大量实验发现，在数字微流控上进行建库，可以将整个流程自动化，而且试剂用量大大降低，从而可以降低成本。在数字微流控芯片上进行建库或其他反应(例如DNA合成等)，为了防止样本挥发和交叉污染，通常会在芯片里添加和反应液体不相溶的填充液，例如硅油、氟硅油、矿物油等。在收集文库时，可能会有一定量的填充液会和文库一起被收集，这在一定程度上会影响接下来的浓度测量、上机测序等。利用离心等方法可以将文库和填充液分离，但这些步骤会增加整个测序的成本，而且也容易引起交叉污染。所以，经过冗长建库流程所得到的文库的精准收集，具有很重要的意义。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种从数字微流控芯片中取出液滴的方法，以解决现有的测序文库构建的步骤比较繁琐，成本也较高等问题。本发明在数字微流控芯片中充入熔点高于指定液滴熔点的填充液，将所述液滴移动到芯片中指定的区域，并将所述指定区域的温度降低到该指定区域填充液熔点以下但在该指定区域液滴熔点以上，使得该指定区域的填充液变成固态、而液滴仍为液态。这样从数字微流控芯片将所述液滴取出时，可以将可能混入的填充液的量降低到最小，甚至为零。
本发明的方法基于通常包括具有底板和上盖板的数字微流控芯片进行，底板包括设置有多个用于液滴控制电极的衬底(衬底不导电)，以及覆盖至少部分电极的至少部分有疏水特性的介质层；上盖板包括基本平行于底板的表面，所述表面设置有至少一个电极，以及覆盖至少部分电极的至少部分有疏水特性的介质层；用于样本及试剂的装卸载的出入口(加样、取样孔)，以及可选择的用于试剂存储及反应的液槽。在另一方面，底板上的一些电极构成多个路径，用于实验所需要的NGS建库反应、PCR扩增等。在另一方面，数字微流控芯片可选择的包括器件外壳，为粘合在一起的底板和上盖板提供一定的保护，并为仪器的控制信号提供接口。
本发明采用对数字微流控芯片进行液滴操作、温度控制、磁力控制等的仪器，通过软件控制，仪器可以将完整的实验流程，例如NGS建库反应、PCR扩增、DNA合成等，在数字微流控芯片上实现，当中可以不需要人工干预。
附图说明
图1A至图1B显示为于数字微流控芯片中液滴操作及温度控制的示意图。
图2A至图2D显示为通过温度控制而有效的将液滴从数字微流控芯片中取出的示意图。
图3A至图3B显示为数字微流控芯片的例示性结构示意图。
图4A至图4D显示为数字微流控仪器的例示性结构示意图。
图5A至图5E显示为数字微流控器件通过仪器控温，有效取出液滴的示意图。
图6显示为数字微流控系统(包括芯片和仪器)完成自动化NGS建库的例示性示意图。
图7是杨-拉普拉斯方程的辅助说明示意图。
具体实施方式
为了本公开的目的，单词“包括”及其变种，例如“包含”和“例如”，应当被理解为“包括但不限于”。
在本专利的整个说明中，“一个实施例”、“一个示例”或“一个方面”等是指所述实施例或方面包括一些特定的特征、结构和特性，可以包括在一个实施例中，但不一定会包括在所有的实施例。此外，本专利中公开的特征、结构和特性可以以任何合适的组合方式，应用在一个或多个实施例中。
在本专利的整个说明中，术语“介电泳(Dielectrophoresis)”指的是中性粒子在非均匀电场作用下受力的一种效应。当一个悬浮于液体介质中的粒子在非均匀电场的作用下，它可能会因受力向电场较强的区域移动(正介电泳)，也可能会向电场较弱的区域移动(负介电泳)。与电泳(Electrophoresis)不同，受介电泳力作用的粒子可以是不带电的中性粒子，而且介电泳力对电场极性不敏感。直流电和交流电都可以用来产生介电泳效应。所有粒子在非均匀电场的作用下都会有一定的介电泳效应，介电泳力的强度跟粒子的大小和形状、粒子及介质的电学性质、电场的梯度分布、以及电场的频率都有关。由于操作方便，电场的频率经常被用于对液体中不同粒子进行控制的调节参数，具体描述见专利“Dielectrophoresis based apparatuses and methods for the manipulation ofparticles in liquids(基于介电泳来操控液体中的粒子的器件及方法)”(国际专利号WO2014/036915 A1)。
为了本公开的目的，术语“电润湿(electrowetting)”用来指液体与固体表面接触角随所加电场而变化的效应。应当指出，当所加电压或电场为交流时，“电润湿”效应和“介电泳”效应同时存在，当电压或电场的频率增大时，“介电泳”效应的相对比重通常会相应的增强。本发明中不对“电润湿”效应和“介电泳”效应进行严格区分，所指的都是利用电场来对液滴进行操作的机制。
为了本公开的目的，术语“微流控(microfluidics)”是指能对至少一个横截面尺寸为几微米至约几毫米的液体具有操纵能力的装置、系统或方法。而作为微流控的一个细分领域，“数字微流控(digital microfluidics)”指的是利用某种控制机制，例如电润湿或介电泳效应，可以对一个或多个独立的液滴进行操控的装置、系统及方法。
为了本公开的目的，术语“数字微流控芯片”、“数字微流控装置”、“数字微流控器件”、“DMF芯片”、“DMF装置”以及“DMF器件”可以互换使用，包括具有第一基底表面的第一基底(底板)和具有第二基底表面的第二基底(上盖板)，所述第二基底与第一基底间隔一定距离，以限定一个间隙(第一和第二基板表面之间的空间)，其中所述距离足以容纳置于间隙中的液滴。多个液滴控制电极设置在底板上，并且至少一些电极被一层电介质覆盖，并且电介质层的至少一部分是疏水的。出于接地的目的，在上盖板表面上至少设置一个电极，所述电极的至少一部分被一层电介质覆盖，并且所述电介质层的至少一部分是疏水的。需要指出的是本发明中数字微流控器件可以通过用电信号对独立的液滴进行操作(例如产生、移动、合并、拆分等)，尽管电润湿(electrowetting)和介电泳(dielectrophoresis)是常见的两种液滴控制机制，本发明并不限制使用其他控制机制的可能性，例如电泳(electrophoresis),电渗(electro-osmosis),光电润湿(opto-electrowetting)，或其组合等等。
出于本公开的目的，术语“液滴(droplet)”指的是和其他部分由空气或其他气体、其他(通常指相互不融合的)液体和固体表面(例如DMF器件的内表面)等分离开来的一定量的液体(一种或几种的混合)。“液滴”的体积范围很大,一般从几皮升(picoliter，皮升)到几百微升(microliter，微升)。“液滴”可以有任意的形状，包括球形、半球形、扁状的圆形、不规则形等。
出于本公开的目的，术语“储液槽(Reservoir)”或“液槽”用于指示DMF器件上的可以被用来存储、保持和供应液体的部分，可以是全封闭或部分封闭的。储液槽可以与流体路径相关联，所述流体路径允许液体被引入DMF器件间隙进行液滴操作，或从DMF器件间进入储液槽进行液体存储或临时保存。
出于本公开的目的，术语“反应(reaction)”指的是样本和试剂之间的物理反应和化学反应。物理反应是指物质的状态或存在的形式发生了改变，而物质本身的性质没有变化；例如，冻干试剂溶解在溶剂(例如去离子水)、在清洗液中将磁珠上吸附的杂物从磁珠上脱离的磁珠清洗、将两个互溶的液体(或者一个固体、一个液体)均匀混合、将填充液冷却从液态变成固态等都是物理反应。化学反应指的是分子中原子重新排列组合生成新的分子的过程，其本质是旧化学键断裂和新化学键的形成过程；例如PCR反应、DNA的酶切反应、DNA片段和DNA末端修复、加A、加连接头等，都属于化学反应。
出于本公开的目的，术语“反应流程(reaction procedure)”指的是将一种或多种物质按照指定的顺序、和条件(例如混合程度、温度、磁场强度、电场强度、时间、质量比例等)进行反应和/或测量的过程。
出于本公开的目的，术语“反应物质”指的是加在芯片上的所有参与实验的物质，包括样本和试剂。样本和试剂通常以液体的方式被加入芯片，但也可以以固体的方式加入，例如冻干试剂。另外，反应物质可以在加入后即刻使用，也可以预先封装在芯片里，在之后的时间使用；例如芯片在生产加工时可以预先封装指定的试剂(可以是液体试剂、也可以是冻干试剂)，芯片被运输到用户实验所需要的地方，用户将样本加入有预封装试剂的芯片，开始相应的实验。
出于本公开的目的，术语“冻干试剂”和“冻干型试剂”可以互换使用，指的是使用冻干方法制备的试剂，通常用于含有不耐高温的活性物质的试剂。生物试剂保存是医疗诊断的重要环节。从试剂保存的角度，很多核酸即时检测(Point-of-Care Testing,或POCT)的试剂卡盒需要在室温下保存，这就要求检测试剂必须经过脱水处理，以固体形态存在。使用时，用缓冲液复溶进行后续反应。例如，液体试剂滴到液氮中，在极短的时间内固化成小球状，然后将固态小球放入预冷好的冻干机，设计好冻干曲线，完成冷冻干燥。冻干球形式能够最大程度地保持酶的活性，且冻干小球有疏松网状结构，复溶迅速。冻干的固态小球，经过封装后，可以常温储存及运输，极大降低了运输成本及保鲜保存时间。冻干珠技术的这些突出优点，不仅适合核酸试剂POCT工艺生产流程，而且适合其他要求保鲜，保证活性物质，常温储存运输的生物制品等产品的生产工艺。在过去几年里，这项新技术快速得到了应用。
为了本公开的目的，术语“表面活性剂(Surfactant)”是指能使目标液体表面张力下降的物质，具有固定的亲水亲油基团，在液体的表面能定向排列。表面活性剂的分子结构具有两性，一端为亲水基团，另一端为疏水基团；亲水基团常为极性基团，如羧酸、磺酸、硫酸、氨基、或胺基，以及盐，羟基、酰胺基、醚键等也可作为极性亲水基团；而疏水基团常为非极性烃链，如8个碳原子以上烃链。表面活性剂分为离子型表面活性剂(包括阳离子(cationic)表面活性剂与阴离子(anionic)表面活性剂)、非离子型(non-ionic)表面活性剂、两性表面活性剂(zwitterionic)、复配表面活性剂(combination surfactant)等。
表面活性剂要呈现特有的界面活性，必须使疏水基和亲水基之间有一定的平衡。亲水亲油平衡值(Hydrophile-Lipophile Balance)，简称HLB值，表示表面活性剂的亲水疏水性能。
非离子表面活性剂是分子中含有在水溶液中不离解的醚基为主要亲水基的表面活性剂，在溶液中不以离子状态存在，其表面活性由中性分子体现出来，因而稳定性好，不易受强电解质的影响，也不易受酸、碱的影响，与其他类型表面活性剂容易混合使用，在各种溶剂中均有良好的溶解性，在固体表面上不发生强烈吸附，所以本发明所使用的表面活性剂通常为非离子表面活性剂，非离子表面活性剂的HLB值范围为0至20，完全由疏水碳氢基团组成的石蜡分子的HLB值为0，完全由亲水性的氧乙烯基组成的聚乙二醇(Polyethylene glycol，简称PEG)的HLB值为20，既有碳氢链又有氧乙烯链的表面活性剂的HLB值则介于两者之间。HLB值越高亲水性越强，越低亲油性越强；亲油性或亲水性较大的表面活性剂易溶于油或水中，因此在溶液界面的正吸附量较少,故降低表面张力的作用较弱。HLB值可作为选用表面活性剂的参考依据。
为了本公开的目的，术语“油(Oil)”和“蜡(wax)”不做具体区分，指的是在实验所需的温度下(通常小于100摄氏度)是液体的中性、非极性化学物质。
为了本公开的目的，术语“填充液(Filler liquid)”和“填充油(Filler oil)”可以互换使用，指的是可以全部充满或部分充满DMF器件间隙的、与液滴基本不溶、对液滴控制没有明显影响、和芯片材料及涂层兼容、对芯片中液滴反应流程无明显影响的物质；可以是一种，也可以是多种，比如数字微流控芯片上仅充有第一填充液，或同时包含第一填充液和第二填充液，第二填充液包围第一填充液，或与第一填充液交界。填充液可以填充DMF器件的整个间隙或部分间隙；也可以将样本或试剂和填充液置放在DMF器件上特定的储液槽中，使得从所述储液槽中利用电润湿(或介电泳)分配出的液滴包裹有一层薄薄的填充液。
填充液(包括第一填充液和第二填充液)在实验要求的条件(主要是温度)下为液态。填充液熔点高于数字微流控芯片中指定液滴的熔点。例如第一填充液和第二填充液的熔点大约为-10至60摄氏度，比如大约为0至40摄氏度，更具体地，为5至25摄氏度。第一填充液和第二填充液可包含较低粘度油，例如包含一种或多种硅油(Silicone oil)，更具体地，例如包含一种或多种氟硅油(Fluorosilicone oil)；也可以是包含一种或多种矿物油(Mineral oil)，例如包含一种或多种石蜡油(Paraffin oil)；也可以是包含一种或多种烃类化合物(Hydrocarbon)，例如包含一种或多种芳香烃(Aromatic hydrocarbon)，和/或包含一种或多种烷烃(Alkane)。在液滴操作时(温度通常小于100摄氏度)的运动粘度(Kinematic viscosity)通常小于1000cSt(centiStokes)，或小于100cSt，或小于50cSt，或小于20cSt，或小于10cSt,或小于5cSt。
第一填充液和第二填充液可包含少量与之相溶的一种或多种表面活性剂，表面活性剂包含非离子型的表面活性剂，例如Triton X-15(Octylphenol ethoxylate，HLB值为4.9)，Span 20(Sorbitan monostearte，化学式为C18H34O6，HLB值为8.6)，Span 40(Sorbitan monopalmitate，化学式为C22H42O6，HLB值为6.7)，Span 60(Sorbitanmonostearte，化学式为C24H46O6，HLB值为4.7)，Span 65(Sorbitan tristearate，化学式为C60H114O8，HLB值为2.1)，Span 80(Sorbitan monoleate，化学式为C24H44O6，HLB值为4.3)，Span 83(Sorbitan sesquioleate，化学式为C66H126O16，HLB值为3.7)，Span 85(Sorbitan trioleate，化学式为C60H108O8，HLB值为1.8)以及氟化表面活性剂(Fluorinated surfactant)。
本发明中，表面活性剂与第一填充液的质量比通常不大于10％、比如小于等于1％、或小于等于0.1％，表面活性剂的HLB值通常小于15，比如小于10、或小于5。
需要指出的是，第一填充液里是否加表面活性剂并不限制反应液滴里添加与所述液滴相溶的表面活性剂。例如，适量的Tween 20(polyoxyethylene-20-sorbitanmonolaurate)(HLB＝16.7),Tween 40(polyoxyethylene-40-sorbitan monolaurate)(HLB＝15.6)，Tween 60(polyoxyethylene-60-sorbitan monolaurate)(HLB＝14.9)，Tween 65(polyoxyethylene-65-sorbitan monolaurate)(HLB＝10.5)，Tween 80(polyoxyethylene-80-sorbitan monolaurate)(HLB＝15.0)，Tween 85(polyoxyethylene-85-sorbitan monolaurate)(HLB＝11.0),或Triton X-100(octylphenol ethoxylate)(HLB＝13.5)等，常被加在反应液滴里，用来在没有外加磁场时降低液滴中磁珠的聚集，减少液滴里的蛋白分子在芯片表面上的吸附等。
在很多应用中，例如免疫分析、核酸分析、NGS建库等，反应液滴中会包括磁珠，而磁珠清洗是反应流程中常见的一个步骤，乙醇(ethanol)是磁珠清洗里常用的组分，因此在相关的应用中，需要选择在常温下和乙醇相互不溶或互溶性比较弱的第一填充液。
为了本公开的目的，术语“染料(Dye)”和“染色剂”可以互换使用，指的是加在填充液里的、对实验条件和结果没有明显影响的、可以用来帮助更好地观察实验现象及效果的物质；它可以是荧光染料(Fluorescent dye)(吸收某一波长的光波后能发射出另一波长大于吸收光的光波的物质)，也可以是非荧光染料。本发明中所使用的染料和填充油体系(包括其中可能混有的表面活性剂)互溶，但和反应液滴基本不溶，即使得第一填充液和/或第二填充液中含有一种或多种表面活性剂。作为非限制的示例，将一种或多种染料(染色剂)和填充油均匀混合，使混合后的填充液有比较适合观察、但不同于芯片中液体的颜色(如黄色、红色、绿色等)，然后注入数字微流控芯片中，在从芯片中取出液滴时，就很容易观察到取样器里是否有填充液的成分。染料与第一填充液的质量比通常小于20％，比如小于10％，或小于5％，或小于1％。
需要指出的是，填充液里是否加染料并不限制反应液滴里加与所述液滴相溶的染料。当然，为了便于观察实验，液滴中可能加的染料的颜色和填充液里是可能加的染料的颜色应所述尽量避免相同或相似。
需要指出的是，除了可能的表面活性剂或染料以外，填充液里也可以按需求加入其他成分。
出于本公开的目的，术语两种物质“基本不溶”通常表示混合后两种物质更多的以混合前的物理状态(液体或固体)连续存在。例如少量的油混在水中时，油在混合后体系中主要在水的表面、或在水中以液滴的方式存在；从定量的角度来说，基本不溶说明其中混合后某物质以连续状态(微米尺度或更大)存在的质量(或体积)的总和，占混合前所述物种质量(或体积)不小于70％，或不小于80％，或不小于90％，或不小于95％，或不小于98％，或不小于99％。
除非另有说明，本公开中，术语“相溶”和“互溶”可以互换使用，指的是一种物质和另一种物质可以均匀混合(homogeneous mixing)，原物质在混合物中不再以混合前的状态连续存在，也就是说两种物质在任意一个微观区域(例如微米或更小)都同时存在。除非专门指出，本公开中的互溶的两种(或更多)的物质之间不发生化学反应。
除非另有说明，本公开中，一个物质的熔点指的是在一个标准大气压(atmosphere，简称atm)下所述物质的熔点。
除非另有说明，本公开中，术语“小于”通常表示“等于或小于”，“大于”通常表示“等于或大于”。
为了本公开的目的，术语“液滴驱动”、“液滴控制”、以及“液滴操作”可以互换使用，可以包括液滴产生(从液槽或连续液体)、移动、合并及混合、分割(对称或不对称)、成形(形成指定的形状)、悬浮及分散颗粒(在液体或液滴内)等。
除非另有说明，本公开中，术语“芯片”是“数字微流控芯片”的简称。
本发明提出了用于处理或测量样本溶液中的目标分析物的仪器、装置和方法。如本领域技术人员将理解的，样本溶液可以包括但不限于体液(包括但不限于血液，血清，唾液，尿液等)，纯化的样本(例如纯化的DNA，RNA，蛋白质，细胞等)，环境样本(包括但不限于水，空气，农业样本等)、和生物战剂样本等。体液可以来自任何生物在一些实施方案中，实体溶液可以是来自哺乳动物的体液，例如来自人的体液。
出于本公开的目的，术语“没有明显影响”或“无明显影响”可以互换使用，指的是新引入的因素(如材料、工艺、配方、温度等)对实验结果的影响在允许的误差范围内。
出于本公开的目的，术语“分析物(analyte)”和“待分析物”可以互换使用，指的是分析或测试中的待测物质或化学成分。“分析物”可以是有机或无机物质。它可以指生物分子(如蛋白质、脂质、细胞因子、激素、碳水化合物等)，病毒(如疱疹病毒、逆转录病毒、腺病毒、慢病毒)，完整细胞(包括原核和真核细胞)、环境污染物(包括毒素、杀虫剂等)、药物分子(如抗生素、治效药物和药物滥用、及毒品)，细胞核，孢子等等。
出于本公开的目的，术语“试剂(reagent)”，指的是用于与样本反应、稀释样本、悬浮样本、乳化样本、包封样本、与样本相互作用等的添加到样本中的任何物质。
为了本公开的目的，术语“磁铁(magnet)”和“磁体”可以互换使用，用于指具有一定形状的、有磁性的物体，包括钐钴磁铁、钕铁硼磁铁、铁氧体磁铁、铝镍钴磁铁、及铁铬钴磁铁。形状包括圆柱形、圆环形、圆片形、圆锥形、金字塔形和其他不规则形状。磁铁包括永久磁铁和非永久磁铁，永久磁铁自身一直有磁性，而非永久性磁铁，例如电磁铁，只有在一定条件下(例如有电流通过)才会出现磁性。
为了本公开的目的，术语“聚焦磁铁(focusing magnet)”用于指具有特定形状的磁铁(永久磁铁或电磁铁)，使得一侧的磁场强于相反侧的磁场。示例包括但不限于圆锥形磁铁或金字塔形磁铁。圆锥形磁铁(或金字塔形磁铁)尖端的磁场强于其基体的磁场。
在本发明中，术语“颗粒(particle)”被用来指微米或纳米量级的实体，这些实体可以是天然的，也可以是人工制作的，例如细胞、亚细胞成分、脂质体(liposome)、病毒、纳米球、和微米球，或更小的如生物大分子、蛋白质、DNA及RNA等实体，它也可指与悬浮介质不相融合的液珠，它还可指液体中的小气泡等。“颗粒”的(线性)大小可以从几纳米到几百微米。
本发明中，术语“珠(bead)”可以是任何与溶液反应的珠子或粒子。珠子可以是任意不同的形状，如球形、鸡蛋形、立方形、圆盘形或者不规则形。珠子可以在液滴的里面、DMF器件的内表面上、DMF器件的填充液里、液槽里等。珠子可以由各种各样的材料制成，如树脂、聚合物、玻璃、纳米材料等，并且可以有任意的尺寸如微珠和纳米珠。珠子可以有磁响应性，在这种情况下，至少其一种或部分成分由磁响应材料构成，同时剩下的材料可能含聚合材料、涂层或链接有检测试剂的基团等。关于珠子的实例包括量子点、聚乙烯微珠、二氧化硅微珠、荧光微球或纳米球、磁微珠、磁纳米珠，流式细胞微珠等。
为了本公开的目的，术语“磁珠(magnetic bead)”指的是包含磁响应材料珠子。磁响应材料的示例包括铁磁材料、顺磁性材料、超磁性材料、以及亚铁磁性材料等。顺磁性材料的示例包括诸如镍、铁和钴的金属，以及诸如Fe3O4,Cr2O3,NiO,Mn2O3等金属氧化物。磁响应材料可以基本上构成磁珠的全部、磁珠的一部分、或磁珠的某一种成分。磁珠的其余部分可以包括允许附着目标颗粒的聚合物材料和涂层部分。磁珠可用于各种测定中，其中磁珠通常被用来结合混合物中的一种或多种目标物质，例如分析物或污染物。测定通常需要有效的磁珠清洗过程，减少未与磁珠表面结合的混合物中的一种或多种目标物质的含量，避免对测定结果进行干扰。
基于数字微流控的验证实验表明涂有人抗血清白蛋白抗体(antihuman serumalbumin antibodies)的磁珠，可用于分离人血清白蛋白(human serum albumin)。利用磁珠从全血样本中提取DNA的验证实验也在数字微流控平台上实现。在数字微流控平台上实现DNA提取和传统的方法类似，通常需要包含一步实现细胞裂解的预处理。
出于本公开的目的，“磁珠操作”或“磁珠控制”可以互换使用，用来指以下操作或其组合之一组成：
1.聚集(focus)–在DMF器件上的液滴内、液槽内、液滴(液槽)和液滴(液槽)之间的区域等将磁珠聚集。聚集后磁珠的尺寸小于10毫米，或小于5毫米，或小于2毫米。应所述指出的是，聚集磁珠通常具有清晰的边界，但也可能相当模糊。被聚集的磁珠占所有特定磁珠的比例超过30％，或超过50％，或超过70％，或超过80％，或超过90％。
2.固定(immobilize)–磁珠在DMF器件上基本上被限制在液滴、储液槽和填充液中的某个指定位置，在此期间可以执行如液滴控制等操作。例如，在一个实施方案中，固定的磁珠基本上被限制在液滴中的位置，以允许执行液滴分离的操作，从而产生一个基本上没有磁珠的液滴和拥有大部分磁珠的另一个液滴(剩余液体)。
3.移动(transport)–在DMF器件上将磁珠从一个位置移动到另一个位置，包括但不限于将磁珠从一个液滴或液槽移动到另一液滴或液槽。
4.打散(disperse)-通过去除(或其他控制)磁场，让聚集的磁珠在液滴或液槽中分散开，这可以和液滴操作同时进行。
出于本公开的目的，“扩增(amplification)”指的是可以增加待测分析物的数量或浓度的过程。非限制的例子包括聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction或PCR)及其变种(如定量竞争PCR、免疫PCR、逆转录PCR等)，链置换扩增(Strand DisplacementAmplification或SDA)，基于核酸序列的扩增(Nucleic Acid Sequence Basedamplification或NASBA)，环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification或LAMP)，解链酶扩增(Helicase-dependent amplification或HAD)等。
出于本公开的目的，术语“层(Layer)”和“膜(Film)”可以互换使用，用来指主体的结构，所述结构通常但不必须是平面或基本上平面的，而且通常沉积、形成、涂覆或其他方式放置在另一结构上。
出于本公开的目的，术语“介质层(dielectric layer)”、“介电层”、和“介质膜”可以互换使用，用来指由介电材料在芯片上制作成的薄膜。介电材料是一种可被电极化的绝缘材料，用于制作介电层材料包括但不限于：铁氟龙(Teflon)、Cytop、聚氯代对二甲苯(Parylene C)、氮化硅、氧化硅等。制作方法包括旋涂(Spin coating)、浸涂(Dipcoating)、喷涂(Spray coating)、溅射(Sputtering)、PECVD(Plasma Enhanced ChemicalVapor Deposition,等离子体增强化学的气相沉积法)等。
出于本公开的目的，术语“接地(Ground)”(如用于“接地电极”或“接地电压”)指的是相应电极的电压是零或足够接近于零，从而所述电极(在施加接地电压时)对应的DMF芯片上的区域没有明显的电润湿效应。所有其他电压值，尽管幅度通常小于300伏，应当足够高，以使得能够充分观察到电润湿效应。
应当指出，当布置覆盖的电介质层时，同一层中相邻电极之间的空间通常填充有介电材料。这些空间可以空着，或填充有诸如空气、氮气、氦气和氩气等气体。同一层中的所有电极和不同层处的电极优选的是电绝缘的。
如本文所用，术语“接触角”表示在液体-蒸汽界面接触到固体表面时形成的角度。在三相-液相、固相和气相(可以是环境大气和液体平衡浓度的混合物蒸汽)达到热力学平衡时，液-气界面的形状由Young-Laplace方程(杨氏方程)确定，
γSG-γSL-γLG coSθc＝0
其中,γSG表示固气界面能，γSL表示固液界面能，γLG表示液气界面能(即表面张力),θ表示平衡态时的接触角。参考图7所示，其显示了Young-Laplace方程(杨-拉普拉斯方程)中的量。应当指出，如果气相被另一种不混溶的液相代替，则该方程式也适用。
在纯液体内部，每个分子在每个方向上都被相邻的液体分子均等地拉动，导致净力为零。然而，液体表面的分子不是在所有方向上不具有相邻分子提供平衡的净力，它们被相邻的分子向内拉，从而产生内部压力，其结果就是液体表面积收缩以保持其最低的表面自由能。这种使表面收缩的分子间力即液-气界面能γLG称为表面张力，它决定了液滴的形状。其他外力，如重力，也会使液滴变形。因此，接触角由表面张力和外力(通常为重力)共同决定。接触角也是某种固液系统在特定环境下的一个特征参数。
疏水性表面具有排斥液体的特性，而亲水性表面具有吸引液体的特性。为了本公开的目的，“疏水表面”具有大于90°的接触角，而“亲水表面”具有小于90°的接触角。
出于本公开的目的，可以理解，当任何形式(如液滴或连续体，可能是在运动或静止的)的液体被描述为在电极、阵列、矩阵和表面“上”、“处”或“之上”时，所述液体可能与电极、阵列、矩阵和表面直接接触，或可能与插入液体和电极、阵列、矩阵、及表面之间的一个或多个层或膜相接触。
出于本公开的目的，可以理解，当诸如层、区域和基底的给定组件被称为置于或形成在另一组件“上”、“中”和“处”时，所述给定组件可以直接位于所述另一组件上，或备选地，也可以存在中间组件(例如一个或更多个缓冲层、夹层和电极)。还可以理解，术语“置于...上”和“形成在...上”可以互换使用，用来描述给定组件如何相对于另一组件进行定位或安置。因此，术语“置于...上”和“形成在...上”并不意在对材料传输、沉积和制造的特定方法引入任何限制。
出于本公开的目的，术语“印刷线路板(Printed Circuit Board，或PCB)”或“印制线路板”可以互换使用，指的是没有焊接元器件的电路板，主要由以下部分组成。
1、线路与图面(Pattern)：线路所用的材料通常是铜，线路可以为电子元器件之间提供导通的途径，另外通常设计大铜面作为接地及电源层。线路与图面是同时做出的。
2、介电层(Dielectric layer)：用来保持线路及各层之间的绝缘性，也叫基材。
3、孔(Through hole，或Via)：导通孔可使两层以上的线路彼此导通，较大的导通孔则做为零件插件用，另外有非导通孔通常用来作为表面贴装定位。
4、防焊油墨(Solder Mask)：并非全部的铜面都要吃锡上零件，因此非吃锡的区域，会印一层隔绝铜面吃锡的物质(通常为环氧树脂)，避免非吃锡的线路间短路。根据不同的工艺，分为绿油、红油、蓝油。
5、丝印(Silk screen)：此为非必要之构成，主要的功能是在电路板上标注各零件的名称、位置框，方便组装后维修及辨识用。
出于本公开的目的，术语“检测(Testing)”、“探测(Detection)”和“测量(Measurement)”可以互换使用，用来获取物理量(例如，位置、带电量、温度、浓度、pH值、亮度、荧光等)的过程。在通常情况下，至少有一个传感器(或探测器)会被用来获取物理量，并将其转换成人或仪器可以识别的信号或信息。待测物和传感器之间可以有其他元器件，比如光学测量中使用的透镜、反光镜、滤光片等，和电学测量中的电阻、电容、三极管等。而且，为了使得测量成为可能或容易些，测量中常会用到其他的辅助装置或器件。例如，诸如激光或激光二极管等光源被用来将粒子从电子基态激发到电子激发态，激发态粒子回到基态时有时会发射的荧光，而测量这里的荧光强度就可以用来测量液体样本中某种粒子的浓度。光学方面的传感器有CCD、光电二极管、光电倍增管等，在电学方面有运算放大器、模数转换器、热电偶、热敏电阻等。
以下是对本发明中的处理生物样本的实施方案，即从数字微流控芯片中取出液滴的方法的具体描述，为了方便于说明，相应的附图(图1A至图6)会在需要的时候提到。应所述说明的是，这些例子的目的是为了帮助说明，而不是为了限制发明的意愿和精神。
本文中作为辅助的附图和具体描述一起，进一步展示和诠释本专利公开的原理，并使相关领域的技术人员能够制造和使用相应的仪器、DMF器件、以及描述的方法。
出于本公开的目的，这里的一些和所有功能模块(例如温度控制模块，液滴控制模块等)都可以自动控制。在微处理器或计算机上运行的程序(软件或固件，software orfirmware)通常被用来实现自动控制。
图1A至图1B展示了一个DMF器件(总体上标为100，即数字微流控芯片)对液滴操作及温度控制的俯视示意图，包括DMF器件上的液滴驱动电极(通常制作在底板上)112，4组液滴驱动电极131至134，它们可以被用来对多个液滴201进行并行操作。图1B中还示意了4个独立于DMF器件的温度控制模块301至304，它们可以用来将DMF器件100的不同区域控制到不同的温度。
图2A至图2D展出了本发明中DMF器件100(即数字微流控芯片)的一部分的侧视图，作为实现从DMF器件中有效取出液体的优选实施例。底板110包含沉积在衬底111上的液滴驱动电极112和介电层113。上盖板150包含了沉积在衬底151上的接地电极152和介电层153；制作在上盖板上的两个液槽154和155，其中液槽154和外界封闭，而液槽155是一个开放(或开口)液槽，液体，例如第一填充液可通过液槽155液槽加入或取出DMF器件100。
通过对液滴驱动电极102按指定顺序的控制，液滴201可以被从图2A中的位置移动到图2B中液槽155的位置。对DMF器件100在液槽155的指定区域进行温度控制，使填充液250在该指定区域变成固体，但液滴201仍为液体，见图2C；此时，由于液滴被固态的填充油包围，其形状可能会变成不规则形状。
图2D显示了用取样器211刺破液槽155处固态的填充油、从DMF器件的底部将液滴201取出的示意图，原来液滴在芯片上的所在指定区域202此时是空的(空气或其他环境气体)。这里描述的是固态填充油比重小于液滴的比重的情形，需要指出的是本发明并不排除固态填充油比重大于液滴的比重的情况，此时，液滴会在固态填充油的上面，取出液滴时需要保证取样器的底部尽量不插入固态的填充油，从而保证液滴取出时不带有填充油。这里的取样器指的是通过控制其中气体压强(使其和液体接触的顶端产生负压)从而将液体吸入其中的装置，非限制的例子包括：1)移液器(也叫移液枪，pipette)-根据原理可分为气体活塞式移液器(Air-displacement pipette)和外置活塞式移液器(Positive-displacement pipette)；2)滴管(包括一次性滴管)；3)洗耳球(也称作吸耳球)-一种橡胶为材质的、可用于吸量管定量抽取液体的工具；4)注射器–一组利用针头抽取或注入气体或液体的装置；5)真空泵(需要连接可以插入芯片的小管等)。
应所述指出的是，这里示出的DMF器件结构出于说明液滴取出的目的，绝不代表所有的可能性。在一些实施例中，DMF器件可以以各种不同的方式实现。例如，1)控制电极可以具有不同的形状，例如长方形、正方形、梯形、五边形、六边形、和不规则形状，并且可以按直线或其他形状排列组合；2)控制电极可以在不同的层(通常是相互电绝缘的)，如专利“Electrowetting Based Digital Microfluidics(基于电润湿的数字微流控)”(国际专利号(WO 2008/147568)中所述的；3)介电层也可以具有两层或更多层，所用材料的包括聚对二甲苯C(Parylene C)，氮化硅，二氧化硅，钽氧化物等；其中一层可以是疏水材料，例如铁氟龙(Teflon)、Cytop及FluoroPel等。
衬底可以是任何非导电材料或涂覆有非导电层的导电材料，只要它具有足够的机械强度,使其形状保持在所需的系统操作和存储条件内即可，它可以是透明的、半透明的和不透明的，例如玻璃、石英、塑料(例如聚碳酸酯(Polycarbonate，简称PC)、环烯烃共聚物(Cyclic olefin copolymer，简称COC)、亚克力(Acrylic)等)、陶瓷、PCB、硅片等。电极可以由任何导电材料制成，例如金属、合金和导电聚合物，它可以由一种材料或不同材料的混合物制成，它可以是透明的、半透明的和不透明的。DMF器件上的透明电极可以由透明导电材料，例如铟锡氧化物(ITO)，掺杂铝的氧化锌(AZO)，透明导电聚合物(聚乙炔，聚苯胺等)，或透明纳米材料等制成。
电压控制模块用于向液滴控制电极提供电压控制信号。它通常具有多个输出，最大数量为1000000，或100000，或10000，或1000。电压输出可以是单极性(只有正电压或只有负电压)或双极性(正电压和负电压都有)的；双极性电压输出时，可能是正负对称、也可能是正负不对称的；电压幅度小于1000伏，或小于500伏，或小于300伏，或小于100伏，或小于60伏，或小于30伏。电压频率小于10MHz(兆赫兹)，或小于1MHz，或小于100KHz(千赫兹)，或小于20KHz，或小于5KHz，或小于1KHz的交流信号，或直流信号。电压的波形可以是方波，正弦波，锯齿形，脉宽调制信号等。电压控制模块通常由电路板上的微处理器或计算机通过SPI(Serial Peripheral Interface)，I2C(Inter-Integrated Circuit)，USB(UniversalSerial Bus)，并行端口(parallel port)，以太网(Ethernet)，Wi-Fi或蓝牙(Bluetooth)等，对输出信号的顺序、持续时间、幅度、及频率进行编程。弹簧探针(Spring loadedelectrical contact pin，也叫Pogo pin)或接口板(connector pad)可用来将多个高压控制信号传递到DMF器件上的电极。
图3A和3B是基于本发明的数字微流控芯片实物设计的立体图和俯视图。这里只能看到上盖板部分。上盖板的材料是PC，利用注塑工艺制作。其中数字微流控芯片上的加样、取样孔156的孔径约3毫米。利用这个数字微流控芯片，可以同时对4个样本进行杂交捕获建库。
图4A至图4D展示了本发明所使用的控制仪器的一个优选实施方案。图4A展示了本发明使用仪器温度控制模块的一个实施方式。温度控制模块311至316可以独立控温，使用时可以将数字微流控芯片中相应的区域控制到-10摄氏度(负10摄氏度)至100摄氏度范围中的任意一个温度。图4B是所述装置的顶-前-侧视图，4C是俯视图，图4D是后视图。其中，弹簧探针350可以用来实现仪器和数字微流控芯片100的液滴控制的接口，向数字微流控芯片上的液滴控制电极提供电压信号；磁铁控制模块360可以对上面的磁铁的位置进行上下左右控制，磁铁控制模块可以用来对数字微流控芯片中的磁珠进行控制(例如聚集、固定、移动等)，从而实现芯片上的核酸分子的捕获、富集、清洗、洗脱等；磁铁控制模块上的磁铁可能是聚集磁铁。触摸屏401用来提供用户可操作的图形界面，供用户输入命令并显示帮助、实验状态、及测量结果等；可滑动的托盘402用于加载及卸载数字微流控芯片，当推入时，弹簧探针400与数字微流控芯片的底部基板接触；图4D中，通风口404是用于对外排放仪器工作时产生热量(内部通常装有具有风扇)；USB端口405为在计算机上运行的应用软件提供与仪器进行通讯(如发送命令或接收数据)的方式；还设置有交流电源端口406。
图5A至图5E展示了通过温控将液滴从数字微流控芯片中有效取出的示例。图5A至图5D展示了一个放置在控制仪器中的数字微流控芯片100，仪器中的温控模块311至316和数字微流控芯片100底部接触，用于对数字微流控芯片不同的区域进行温度控制。图5A展示了芯片中已经注入了填充油，但取样孔156中没有液滴时的状态；图5B展示了芯片中已经注入了填充油，而且取样孔156中有液滴时的状态；图5C展示了温度模块313的温度降低到接近于0摄氏度使指定区域180的填充油变成了固体，但取样孔156中的液滴仍为液体时的状态；图5D展示了取样孔156中的液滴被取样器穿过固态的填充油取出后的状态；图5E展示了取样器从芯片中的取样孔156之一中取出的液体201，取样器中液滴201的上面501和下面502都是空气，说明取样器中只有取出的液体成分，没有混入填充油。
图6的步骤S601至S616展示了本发明用于在数字微流控芯片做NGS自动化建库，以及完成建库后取出文库的示例。
在步骤S601中，将一个数字微流控芯片放入仪器，并将指定体积的填充油(通过注油孔)加入所述数字微流控芯片；
在步骤S602中，将建库所需的试剂，包括片段化试剂(可选)、ER和AT试剂、连接头试剂、二种磁珠试剂、PCR试剂、以及样本，按指定体积通过相应的加样孔加入所述数字微流控芯片；
在步骤S603中，将所述数字微流控芯片上的样本液滴和片段化试剂液滴从相应的加样孔移动到芯片上的指定位置合并混合，并将合并后的液滴移动到芯片上指定区域，所述指定区域有所述填充油(即第一填充液)，将所述指定区域控制到指定温度并保持指定长时间，以完成样本DNA的片段化(通常通过酶切的方法)；
在步骤S604中，将片段化后的样本液滴和所述数字微流控芯片上的ER、AT试剂液滴移动到芯片上的指定位置合并混合，并将合并后的液滴移动到芯片上指定区域，将所述指定区域控制到指定温度并保持指定长时间，以完成ER、AT反应；
在步骤S605中，将完成ER、AT反应后的液滴和所述数字微流控芯片上的连接头试剂液滴移动到芯片上的指定位置合并混合，并将合并后的液滴移动到芯片上指定区域，将所述区域控制到指定温度并保持指定长时间，以完成接头连接反应；
在步骤S606中，将完成接头连接反应后的液滴和芯片上的磁珠液滴移动到芯片上的指定位置合并混合，等待指定的时间后，利用仪器上的磁铁将所述混合后液滴里的磁珠在所述数字微流控芯片中聚集、并按指定路线转移到所述数字微流控芯片上第一清洗液槽，再将磁珠在所述清洗液槽范围内按照指定轨迹和速度移动，以实现磁珠的清洗；
在步骤S607中，利用仪器的磁铁将步骤S606中清洗后的磁珠在芯片上按指定路线转移到芯片上第二清洗液槽，再将磁珠在所述清洗液槽范围内按照指定轨迹和速度移动，以实现磁珠的再次清洗；
在步骤S608中，利用仪器的磁铁将步骤S607中清洗后的磁珠在芯片上按指定路线转移到芯片上的第一洗脱槽，停止仪器对芯片的磁力控制(例如将磁铁移开、远离芯片)，此时磁珠在洗脱液里从聚集状态分散在洗脱液中，从而实现磁珠上吸附DNA的洗脱；
在步骤S609中，利用仪器的磁力控制将第一洗脱槽中的磁珠重新聚集，并按指定路径将其移动到芯片上的指定位置丢弃；
在步骤S610中，将第一洗脱槽中的指定量的洗脱液液滴和芯片上的PCR试剂液滴移动到芯片上的指定位置合并混合，并将混合后的液滴在芯片上指定的温度区域来回移动，以实现PCR浓度扩增；
在步骤S611中，将步骤S610中PCR扩增后的液滴和芯片上第二个磁珠液滴移动到芯片上的指定位置合并混合，等待指定的时间后，利用仪器上的磁铁将所述混合后液滴里的磁珠在芯片聚集、并按指定路线转移到芯片上第三清洗液槽，再将磁珠在所述清洗液槽范围内按照指定轨迹和速度移动，以实现磁珠的清洗；
在步骤S612中，利用仪器的磁力控制将步骤S611中清洗后的磁珠在芯片上按指定路线转移到芯片上第四清洗液槽，再将磁珠在所述清洗液槽范围内按照指定轨迹和速度移动，以实现磁珠的再次清洗；
在步骤S613中，利用仪器的磁力控制将步骤S612中清洗后的磁珠在芯片上按指定路线转移到芯片上的第二洗脱槽，停止仪器对芯片的磁力控制(例如将磁铁移开、远离芯片)，此时磁珠在洗脱液里从聚集状态分散在洗脱液中，从而实现磁珠上吸附DNA的洗脱；
在步骤S614中，利用仪器的磁力控制将第二洗脱槽中的磁珠重新聚集，并按指定路径将其移动到芯片上的指定位置丢弃；
在步骤S615中，利用仪器的温控模块对芯片的第二洗脱槽区域进行温度控制，将温控降低到填充油熔点以下、但在液滴熔点以上，并保持指定时间，使得所述区域填充油变成固态；
在步骤S616中，利用取样器在芯片的第二洗脱槽处穿过(刺破)固态的填充油将芯片中该指定区域的液滴取出，从而得到可以用来上机测序的文库。
应当指出，上述示例和上述优点是出于说明的目的，绝不是穷举的。
尽管已经示出和描述了本发明的优选实施例，但是应当理解，可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下进行各种改变。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (24)

1.一种从数字微流控芯片中取出液滴的方法，其特征在于，包括步骤:
a)将第一填充液加入所述数字微流控芯片；
b)将一种或多种反应物质加入所述数字微流控芯片；
c)在所述数字微流控芯片上执行指定的反应流程；
d)将所述数字微流控芯片中的指定液滴移动到所述数字微流控芯片上的指定区域，所述指定区域有所述第一填充液；
e)将所述指定区域的温度控制到低于所述指定区域的第一填充液的熔点，但高于所述指定区域的液滴的熔点，并保持指定的时间，以使所述指定区域的第一填充液变为固体状态，而所述指定区域的液滴仍为液体状态；
f)利用取样工具从所述指定区域将液滴取出。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，第一填充液熔点为-10至60摄氏度。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，第一填充液熔点为0至40摄氏度。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，第一填充液熔点为5至25摄氏度。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，第一填充液含有一种或多种硅油。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述硅油含有一种或多种氟硅油。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，第一填充液含有一种或多种矿物油。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述矿物油含有一种或多种石蜡油。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，第一填充液含有一种或多种烃类化合物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述烃类化合物含有一种或多种烷烃，和/或含有一种或多种芳香烃。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，第一填充液在常温下和乙醇不溶。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，第一填充液包含一种或多种表面活性剂。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，表面活性剂和第一填充液的质量比不大于10％。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，表面活性剂和第一填充液的质量比不大于1％。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，表面活性剂和第一填充液的质量比不大于0.1％。
16.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，表面活性剂包含非离子型表面活性剂。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，非离子型表面活性剂的HLB值小于15。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，非离子型表面活性剂的HLB值小于10。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，非离子型表面活性剂的HLB值小于5。
20.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，第一填充液包含一种或多种染色剂。
21.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，液滴控制通过电润湿或介电泳实现。
22.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述数字微流控芯片上充有第二填充液，第二填充液包围第一填充液，或与第一填充液交界。
23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，第二填充液包含一种或多种表面活性剂。
24.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，第二填充液包含一种或多种染色剂。
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CN117488412A (zh) * 2023-12-28 2024-02-02 北京贝瑞和康生物技术有限公司 基于数字微流控技术的靶向捕获测序文库全流程构建方法

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