CN117269125A - 一种基于智能扫描的快速荧光寿命成像方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于智能扫描的快速荧光寿命成像方法，包括对长寿命荧光探针进行激发和常规速度扫描成像，最终得到清晰的荧光图像；对长寿命荧光探针进行坐标定位，得到所有长寿命荧光探针的二维坐标位置；对长寿命荧光探针的位置进行非常快速激光扫描成像，得到所有长寿命荧光探针的拖尾图像；对各长寿命荧光探针的拖尾图像所记录的强度曲线进行拟合，得到不同位置的长寿命荧光探针的荧光寿命。本发明有效解决了当前技术获取长寿命荧光探针荧光寿命速度慢的问题，可直接实现上长寿命荧光探针荧光寿命显微成像。

Description

一种基于智能扫描的快速荧光寿命成像方法

技术领域

本发明涉及光学显微成像技术领域，具体涉及一种基于智能扫描的快速荧光寿命成像方法。

背景技术

荧光寿命成像是区别于荧光强度成像的一种光学成像方式，常用于生物分析显微成像，有对样本环境灵敏度高的优点。荧光寿命成像很好地弥补了基于强度成像的不足，对生物医学检测有着重要的意义。荧光寿命显微镜通过荧光探针的特异性标记，可以实现对生物体内物理环境(如温度、PH值等)的检测以及对某类特定物质的探测，并在此基础上进行对生物大分子之间相互作用的研究，大大加深了人类对微观生命科学的认识。

传统荧光寿命显微镜普遍利用有机染料，基于单光子计数法(TCSPC)技术实现荧光寿命成像。但是，TCSPC技术依赖荧光光子数的积累，从而导致在寿命显微成像过程中时间分辨率很低，同时样品需要长时间被激光照射，面临严重的光漂白和光毒性问题，进而导致荧光寿命不准或成像质量不佳的问题。

近年来，稀土掺杂的上转换纳米颗粒在生物医学成像中得到了广泛应用。相较于有机染料等荧光分子，上转换纳米颗粒具有窄辐射带、高信噪比、低光毒性、无光漂白的优势特征。另外，上转换纳米颗粒通过近红外光激发，一般情况下，生物蛋白质不会吸收这段频率的光，从而不会有自发荧光，这极大地减弱了荧光成像时的背景信号。这些特点均有利于上转换纳米颗粒用于荧光寿命成像。但是，上转换纳米颗粒的荧光寿命通常在百微秒甚至毫秒量级，属于长寿命荧光探针，通常导致基于TCSPC技术测试荧光寿命时，时间分辨率极差，通常很难获得长寿命荧光探针的荧光寿命成像图。

因此，为实现快速长寿命荧光探针荧光寿命成像，本发明提出了一种基于智能扫描的快速荧光寿命成像方法：先通过常规扫描定位样品中所有长寿命荧光探针，再通过快速扫描得出拖尾图像，拟合得出荧光寿命，最后得到长寿命荧光探针任意分布的样品中所有荧光探针的荧光寿命。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种基于智能扫描的快速荧光寿命成像方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

需要指出的是，本发明所指的长寿命荧光探针可以是具有微秒级荧光寿命的探针，而该类探针都可为长寿命荧光探针。

一种基于智能扫描的快速荧光寿命成像方法，包括长寿命荧光探针，所述成像方法包括以下步骤：

S1对所述长寿命荧光探针进行激发和常规扫描，得到清晰的荧光图像；

S2根据所述清晰荧光图像，对长寿命荧光探针进行坐标定位，得到所有长寿命荧光探针的二维坐标位置；

S3根据长寿命荧光探针二维坐标位置，依次对长寿命荧光探针的位置进行快速扫描，得到所有长寿命荧光探针的拖尾图像；

S4对各长寿命荧光探针的拖尾图像所记录的强度曲线进行拟合，得到不同位置的长寿命荧光探针的荧光寿命，并赋值所计算的对应寿命参数，最终实现高清晰荧光寿命显微成像。

需要指出的是，本技术方案中的常规扫描指的是，激光在单个像素处驻留时间t>荧光寿命τ，反之，当即t<τ，即为本发明所称的快速扫描。

需要说明的是，所述步骤S2中，所述清晰荧光图像各点的亮度通过一个N×N的像素矩阵记录，每个像素点的位置可以用一个二维坐标表示，其中a是像素点的列坐标，b是像素点的行坐标，a和b均为正整数且小于或等于N；基于二维高斯函数中心定位算法，对各个中心亮点进行二维高斯函数拟合，根据二维高斯函数中心最大值对应的二维坐标，定位各个荧光亮点的中心位置，并记录所有荧光点中心的二维坐标。

需要说明的是，所述步骤S3中，还包括以下步骤进行处理：

S3.1对长寿命荧光探针的位置进行分类，其中，远近的判定标准为扫描后，各点拖尾图像是否会重叠：

第一类为其邻近行没有其它长寿命荧光探针、且同一行也没有其它长寿命荧光探针或有其它长寿命荧光探针但彼此间相距足够远的位置；

第二类为其邻近行有其它长寿命荧光探针、或同一行有其它相距较近的长寿命荧光探针的位置，如在同一行中有两个邻近的长寿命荧光探针，其位置分别为(a₁,b)和(a₂,b)，其中a₂-5>a₁；

S3.2对两类位置的长寿命荧光探针进行不同方式的扫描：

对第一类位置，根据常规扫描所得荧光图点颗粒(a,b)坐标位置，扫描振镜将激光移动至有荧光点的第b行，从第a-5列进行扫描，每个像素上停留相同的时间t，向列坐标a增大的方向移动，直到a等于N，停止扫描与荧光信号接收。对不同荧光点颗粒执行类似处理，得到所有长寿命荧光探针的拖尾图；

对第二类位置，振镜将激光先移动至同一行中最右荧光点位置处，即(a₂,b)；激光从第a₂-5列开始扫描，同时光电探测器开始接收荧光信号。激光焦点在每个像素点上停留相同时间t，向列坐标a增大的方向移动。当激光移动至第a₂+5列，激光被关闭，但振镜一直在扫描，光电探测器继续接收荧光信号，直到a等于N，停止扫描与荧光信号接收，获得(a₂,b)位置处荧光点的具有拖尾信息的荧光图像；

继续针对(a₁,b)位置处的荧光点进行类似扫描，即从第a₁-5列开始扫描，同时光电探测器开始接收荧光信号；激光焦点在每个像素点上停留相同时间t，向列坐标a增大的方向移动；当激光移动至第a₁+5列，激光被关闭，但振镜一直在扫描，光电探测器继续接收荧光信号，直到a等于N，停止扫描与荧光信号接收，获得(a₁,b)位置处荧光点的具有拖尾信息的荧光图像；其他位置的荧光进行相似的扫描方式，直至获得所有长寿命荧光探针的荧光拖尾图像。

需要说明的是，所述步骤S4中，还包括以下步骤进行处理：

若读取点(a,b)的拖尾图像；记快速扫描停留的列位置为y，光电探测器在不同列位置记录的数值拟合为随y变化的函数h(y)，拟合函数的形式为：

其中需要拟合的参数为A，B，τ_r，τ_d，v为扫描速度，且τ_d即点(a,b)处上转纳米颗粒的荧光寿命。

对所有长寿命荧光探针位置(a,b)进行类似处理，直到获得所有长寿命荧光探针的荧光寿命τ_d，并赋值所计算的对应寿命参数，最终实现高清晰荧光寿命显微成像。

本发明的有益效果在于：

1、与传统TCSPC寿命测试技术相比，本发明可以根据荧光拖尾信息快速获得长寿命荧光探针的荧光寿命，极大地提高了时间分辨率。相比传统TCSPC寿命测试技术，本发明所提出的寿命测试技术将时间分辨率提高了10-100倍。

2、基于传统TCSPC技术的长寿命荧光探针的荧光寿命测试，通常仅可获得一维荧光寿命曲线，无法获得荧光寿命图像。本发明可实现快速二维长荧光寿命成像，增加了长寿命荧光探针应用的新维度。

附图说明

图1为本发明的流程图；

图2为本发明的常规扫描和快速扫描的简单示意图；

图3为本发明的拖尾荧光图和测出的荧光扫描对照图。

图4为本发明的拖尾荧光图和荧光寿命图的数据图

具体实施方式

以下将结合附图对本发明作进一步的描述，需要说明的是，以下实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。

本发明为一种基于智能扫描的快速荧光寿命成像方法，包括长寿命荧光探针，所述成像方法包括以下步骤：

S1对所述长寿命荧光探针进行激发和常规扫描，得到清晰的荧光图像；

S2根据所述清晰荧光图像，对长寿命荧光探针进行坐标定位，得到所有长寿命荧光探针的二维坐标位置；

S3根据长寿命荧光探针二维坐标位置，依次对长寿命荧光探针的位置进行快速扫描，得到所有长寿命荧光探针的拖尾图像；

S4对各长寿命荧光探针的拖尾图像所记录的强度曲线进行拟合，得到不同位置的长寿命荧光探针的荧光寿命，并赋值所计算的对应寿命参数，最终实现高清晰荧光寿命显微成像。

需要指出的是，本技术方案中的常规扫描指的是，激光在单个像素处驻留时间t>荧光寿命τ，反之，当即t<τ，即为本发明所称的快速扫描。

进一步的，本发明的所述步骤S2中，所述清晰荧光图像各点的亮度通过一个N×N的像素矩阵记录，每个像素点的位置可以用一个二维坐标表示，其中a是像素点的列坐标，b是像素点的行坐标，a和b均为正整数且小于或等于N；基于二维高斯函数中心定位算法，对各个中心亮点进行二维高斯函数拟合，根据二维高斯函数中心最大值对应的二维坐标，定位各个荧光亮点的中心位置，并记录所有荧光点中心的二维坐标。

进一步的，本发明的所述步骤S3中，还包括以下步骤进行处理：

S3.1对长寿命荧光探针的位置进行分类，其中，远近的判定标准为扫描后，各点拖尾图像是否会重叠：

第一类为其邻近行没有其它长寿命荧光探针、且同一行也没有其它长寿命荧光探针或有其它长寿命荧光探针但彼此间相距足够远的位置；

第二类为其邻近行有其它长寿命荧光探针、或同一行有其它相距较近的长寿命荧光探针的位置，如在同一行中有两个邻近的长寿命荧光探针，其位置分别为(a₁,b)和(a₂,b)，其中a₂-5>a₁；

S3.2对两类位置的长寿命荧光探针进行不同方式的扫描：

对第一类位置，根据常规扫描所得荧光图点颗粒(a,b)坐标位置，扫描振镜将激光移动至有荧光点的第b行，从第a-5列进行扫描，每个像素上停留相同的时间t，向列坐标a增大的方向移动，直到a等于N，停止扫描与荧光信号接收。对不同荧光点颗粒执行类似处理，得到所有长寿命荧光探针的拖尾图；

对第二类位置，振镜将激光先移动至同一行中最右荧光点位置处，即(a₂,b)；激光从第a₂-5列开始扫描，同时光电探测器开始接收荧光信号。激光焦点在每个像素点上停留相同时间t，向列坐标a增大的方向移动。当激光移动至第a₂+5列，激光被关闭，但振镜一直在扫描，光电探测器继续接收荧光信号，直到a等于N，停止扫描与荧光信号接收，获得(a₂,b)位置处荧光点的具有拖尾信息的荧光图像；

继续针对(a₁,b)位置处的荧光点进行类似扫描，即从第a₁-5列开始扫描，同时光电探测器开始接收荧光信号；激光焦点在每个像素点上停留相同时间t，向列坐标a增大的方向移动；当激光移动至第a₁+5列，激光被关闭，但振镜一直在扫描，光电探测器继续接收荧光信号，直到a等于N，停止扫描与荧光信号接收，获得(a₁,b)位置处荧光点的具有拖尾信息的荧光图像；其他位置的荧光进行相似的扫描方式，直至获得所有长寿命荧光探针的荧光拖尾图像。

进一步的，本发明的所述步骤S4中，还包括以下步骤进行处理：

若读取点(a,b)的拖尾图像；记快速扫描停留的列位置为y，光电探测器在不同列位置记录的数值拟合为随y变化的函数h(y)，拟合函数的形式为：

其中需要拟合的参数为A，B，τ_r，τ_d，v为扫描速度，且τ_d即点(a,b)处长寿命荧光探针的荧光寿命。

对所有长寿命荧光探针位置(a,b)进行类似处理，直到获得所有长寿命荧光探针的荧光寿命τ_d，并赋值所计算的对应寿命参数，最终实现高清晰荧光寿命显微成像。

实施例

需要指出的是，如前所述，具有微秒级荧光寿命的探针都可为长寿命荧光探针，为了而进一步清晰陈述本发明的技术方案，以下提供采用稀土上转换纳米颗粒作为长寿命荧光探针的实施例，但本实施例不应当理解为对所选长寿命荧光探针的限制。

步骤S1：将NaYF₄,20％Yb2％Er的稀土掺杂上转换纳米颗粒，其为长寿命荧光探针，将其稀释并旋涂在载玻片上，获取颗粒任意分布的样品。激光器发出一束波长为980nm的连续型近红外激光，该激光经过滤光片、准直扩束镜和针孔滤波器等滤波处理与准直扩束后，获得聚焦的高斯型光斑。调整光路，使聚焦光斑落于样本上扫描起点。计算机通过控制旋转装置使扫描振镜旋转，移动聚焦光斑进行逐行扫描，每个像素点停留200μs，由光电倍增管接收每段停留时间内的荧光信号。当完成所有像素的扫描，计算机处理后获得一幅二维激光常规扫描荧光图像；

步骤S2：通过步骤S1所得清晰荧光图像是由512×512个像素点构成，根据清晰荧光图像，通过计算机处理对上转换纳米颗粒进行坐标定位并分类。每个像素点的位置可以用一个二维坐标(a,b)来表示，其中a是像素点的列坐标，b是像素点的行坐标，a和b均为正整数且小于或等于512。基于二维高斯函数中心定位算法，对各个中心亮点进行二维高斯函数拟合，根据二维高斯函数中心最大值对应的二维坐标，定位各个荧光亮点的中心位置，并记录所有荧光点中心的二维坐标，如图2所示，两个上转换纳米颗粒经常规扫描成像后，所获荧光图中荧光点的中心二维坐标分别为(151,256)和(161，256)；

步骤S3：智能扫描模块读取并先存储每个荧光点中心位置坐标，振镜将激光先移动至同一行中列数最大的荧光点位置处，如图2中显示位置坐标为(161,256)的荧光点处。然后，振镜控制激光从第156(161-5)列开始扫描，同时光电探测器开始接收荧光信号。激光焦点在每个像素上停留时间为2μs，向列坐标增大的方向移动。当激光移动至第166(161+5)列，激光被关闭，但振镜一直处于移动状态，光电探测器继续接收荧光信号，直到扫描到第512列，停止扫描与荧光信号接收，获得坐标为(161,256)位置处荧光点的具有拖尾信息的荧光图像。

然后振镜将激光移动至同一行中列数小的荧光点位置处，如图2中(151,256)的荧光点处，进行类似扫描。振镜控制激光从第146(151-5)列开始扫描，同时光电探测器开始接收荧光信号。激光焦点在每个像素上停留时间为2μs，向列坐标增大的方向移动。当激光移动至第156(151+5)列，激光被关闭，但振镜一直处于移动状态，光电探测器继续接收荧光信号，直到扫描到第512列，停止扫描与荧光信号接收，获得(151，256)位置处荧光点的具有拖尾信息的荧光图像。其他位置的荧光进行相似的扫描方式，直至获得所有上转换纳米颗粒的荧光拖尾图像；

步骤S4：读取所得各个荧光拖尾图像，通过读取拖尾图的强度分布曲线以及像素扫描时间，计算分析获得寿命值，如图3所示。依次对所有上转换纳米颗粒的拖尾图像标进行类似处理，直到获得所有上转换纳米颗粒的荧光寿命τ_d，并赋值所计算的对应寿命参数，实现高清晰荧光寿命显微成像,为进一步说明，图4显示了具体数据图。

对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，给出各种相应的改变和变形，而所有的这些改变和变形，都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种基于智能扫描的快速荧光寿命成像方法，包括长寿命荧光探针，其特征在于，所述成像方法包括以下步骤：

S1对所述长寿命荧光探针进行激发和常规扫描，得到清晰的荧光图像；

S2根据所述清晰荧光图像，对长寿命荧光探针进行坐标定位，得到所有长寿命荧光探针的二维坐标位置；

S3根据长寿命荧光探针二维坐标位置，依次对长寿命荧光探针的位置进行快速扫描，得到所有长寿命荧光探针的拖尾图像；

S4对各长寿命荧光探针的拖尾图像所记录的强度曲线进行拟合，得到不同位置的长寿命荧光探针的荧光寿命，并赋值所计算的对应寿命参数，最终实现高清晰荧光寿命显微成像。

2.根据权利要求1所述的基于智能扫描的快速荧光寿命成像方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述清晰荧光图像各点的亮度通过一个N×N的像素矩阵记录，每个像素点的位置可以用一个二维坐标表示，其中a是像素点的列坐标，b是像素点的行坐标，a和b均为正整数且小于或等于N；基于二维高斯函数中心定位算法，对各个中心亮点进行二维高斯函数拟合，根据二维高斯函数中心最大值对应的二维坐标，定位各个荧光亮点的中心位置，并记录所有荧光点中心的二维坐标。

3.根据权利要求1所述的基于智能扫描的快速荧光寿命成像方法，其特征在于，所述步骤S3中，还包括以下步骤进行处理：

S3.1对长寿命荧光探针的位置进行分类，其中，远近的判定标准为扫描后，各点拖尾图像是否会重叠：

第一类为其邻近行没有其它长寿命荧光探针、且同一行也没有其它长寿命荧光探针或有其它长寿命荧光探针但彼此间相距足够远的位置；

第二类为其邻近行有其它长寿命荧光探针、或同一行有其它相距较近的长寿命荧光探针的位置，如在同一行中有两个邻近的长寿命荧光探针，其位置分别为(a₁,b)和(a₂,b)，其中a₂-5>a₁；

S3.2对两类位置的长寿命荧光探针进行不同方式的扫描：

对第一类位置，根据常规扫描所得荧光图点颗粒(a,b)坐标位置，扫描振镜将激光移动至有荧光点的第b行，从第a-5列进行扫描，每个像素上停留相同的时间t，向列坐标a增大的方向移动，直到a等于N，停止扫描与荧光信号接收。对不同荧光点颗粒执行类似处理，得到所有长寿命荧光探针的拖尾图；

对第二类位置，振镜将激光先移动至同一行中最右荧光点位置处，即(a₂,b)；激光从第a₂-5列开始扫描，同时光电探测器开始接收荧光信号。激光焦点在每个像素点上停留相同时间t，向列坐标a增大的方向移动。当激光移动至第a₂+5列，激光被关闭，但振镜一直在扫描，光电探测器继续接收荧光信号，直到a等于N，停止扫描与荧光信号接收，获得(a₂,b)位置处荧光点的具有拖尾信息的荧光图像；

继续针对(a₁,b)位置处的荧光点进行类似扫描，即从第a₁-5列开始扫描，同时光电探测器开始接收荧光信号；激光焦点在每个像素点上停留相同时间t，向列坐标a增大的方向移动；当激光移动至第a₁+5列，激光被关闭，但振镜一直在扫描，光电探测器继续接收荧光信号，直到a等于N，停止扫描与荧光信号接收，获得(a₁,b)位置处荧光点的具有拖尾信息的荧光图像；其他位置的荧光进行相似的扫描方式，直至获得所有长寿命荧光探针的荧光拖尾图像。

4.根据权利要求1所述的基于智能扫描的快速荧光寿命成像方法，其特征在于，所述步骤S4中，还包括以下步骤进行处理：

若读取点(a,b)的拖尾图像；记快速扫描停留的列位置为y，光电探测器在不同列位置记录的数值拟合为随y变化的函数h(y)，拟合函数的形式为：

其中需要拟合的参数为A，B，τ_r，τ_d，v为扫描速度，且τ_d即点(a,b)处上转纳米颗粒的荧光寿命。

对所有长寿命荧光探针位置(a,b)进行类似处理，直到获得所有长寿命荧光探针的荧光寿命τ_d，并赋值所计算的对应寿命参数，最终实现高清晰荧光寿命显微成像。