CN117265069A - 基于半导体测序平台检测brca1/2基因拷贝数变异 - Google Patents

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Abstract

本申请属于生信分析和基因检测技术领域，具体提供一种基于半导体测序平台检测BRCA1/2基因拷贝数变异的方法、生信分析及相应试剂盒。本申请通过优化半导体测序的建库流程，实现多个基因外显子水平拷贝数变异同时检测，与多重连接依赖性探针扩增技术(MLPA)相比较，可准确检测的基因数目更多，检测成本更低，检测周期更短。

Description

基于半导体测序平台检测BRCA1/2基因拷贝数变异
技术领域
本申请属于生信分析和基因检测技术领域，具体涉及一种基于半导体测序平台检测BRCA1/2基因拷贝数变异的方法、生信分析方法及相应试剂盒等。
背景技术
乳腺癌易感基因(breast cancer susceptibility gene,BRCA)是重要的抑癌基因，包括BRCA1(breast cancer gene 1,BRCA1)和BRCA2(breast cancer gene 2,BRCA2)，BRCA1/2通过同源重组修复(homologous recombination repair)途径对DNA双链断裂进行修复，若BRCA基因突变导致BRCA蛋白功能缺陷，会影响基因组的稳定性，并引起多种癌症的发生。约5％～10％的乳腺癌和15％～22％的卵巢癌是由BRCA1/2基因突变导致的。BRCA1/2基因致病性突变，使女性发生乳腺癌风险提高5倍，发生卵巢癌风险提高10～30倍。男性BRCA1基因突变携带者乳腺癌发病风险增加10～50倍，BRCA2基因突变携带这乳腺癌发病风险增加50～100倍。
BRCA1/2基因变异类型主要包括点突变、小片段插入/缺失和拷贝数变异(copynumber variations,CNV)等。目前BRCA1/2基因检测一般采用二代测序(next generationsequencing)技术，Sanger测序使检测BRCA1/2基因点突变和小片段插入/缺失的传统技术，现在一般用于二代测序检测结果的验证。二代测序目前检测平台主要有illumina的MiSeq、HiSeq和NovaSeq6000等，半导体测序和MGI华大制造的MGISEQ2000和DNBSEQT7等。半导体测序平台采用半导体芯片测序技术，无需进行基于光的碱基检测因此不需要昂贵的摄影机和仪器，不涉及DNA放大步骤，简化样本制备流程更加简便。与其他仪器相比测序速度更快、低成本使其称为个人和小型实验室理想的选择。
多重连接依赖性探针扩增(multiplex ligation-dependent probeamplification assay,MLPA)常用于BRCA1/2基因CNV的检测。二代测序中通过测序策略和生物信息学工具方面也可用于CNV的检测但是不准确需要MLPA验证。该技术高效、特异，在一次反应中可以检测45个核苷酸序列拷贝数的改变，已经应用于多个领域、多种疾病的研究。MLPA由于是通过毛细管电泳技术，查看峰图识别，局限性只能检测有限位点，对于多基因检测在通量和成本上受限。
鉴于BRCA1/2基因检测有着重要的临床意义，BRCA1/2基因CNV检测成本高，通量低，本申请将可以区分低至1bp高至10Mbp的被认为检测大片段重排的金标准的MLPA技术，结合快速简便和低成本高通量测序平台半导体测序，获得检测CNV准确、快速、低成本和高通量的方法。
发明内容
为解决上述问题，本申请所采用的技术方案如下：
本申请首先提供一种基于半导体测序平台的检测BRCA1/2基因拷贝数变异的建库探针引物组，包括与目标区域互补的左右杂交探针和通用扩增引物；
所述左右杂交探针序列一端包含通用序列，用于通用扩增引物扩增结合位点，一端包含特异性识别序列；
进一步的，每条探针长度相似，实现了扩增子扩增效率一致；
所述通用扩增引物序列包含部分通用序列；
进一步优选的，所述通用序列为测序平台通用序列。
进一步，所述右杂交探针的5’端含磷酸化修饰，用于可与左探针发生连接；所述通用扩增引物5’端含磷酸化修饰，用于扩增后产物可与半导体测序接头发生连接。
进一步，所述探针序列如SEQ ID NO.63-216所示。
进一步，所述通用序列如SEQ ID NO.217-218所示，所述通用扩增引物序列如SEQID NO.219-220所示。
进一步，所述建库探针引物组进一步包含质控探针，所述质控探针包含性别质控探针和内参质控探针，
进一步，优选的，所述质控探针序列如SEQ ID NO.1-62所示。
本申请还提供一种BRCA1/2基因拷贝数变异的检测产品，包含上述任一所述的建库探针引物组；优选的，所述检测产品为检测试剂盒。
本申请还提供上述任一所述的建库探针引物组的如下任一应用：
1)在半导体测序平台文库构建中的应用；
2)在基因拷贝数变异检测中的应用；
3)在BRCA1/2基因拷贝数变异检测中的应用；
4)在制备BRCA1/2基因拷贝数变异的检测试剂盒中的应用。
本申请还提供一种半导体测序平台文库构建用的探针引物组制备方法，所述方法包括如下步骤：
制备左/右杂交探针和通用扩增引物，所述杂交探针序列一端包含通用序列，一端包含特异性识别序列；所述通用扩增引物序列包含部分通用序列；
进一步的，每条探针长度相似，实现了扩增子扩增效率一致；
进一步的所述通用序列为测序平台通用序列；
进一步优选的，所述右探针5’含磷酸化修饰，用于可与左探针发生连接；所述通用扩增引物5’端含磷酸化修饰，用于扩增后产物可与半导体测序接头发生连接；
进一步的，还包括制备质控探针，所述质控探针包括性别检测探针和内参探针；性别探针作用质控样本性别，内参探针一方面归一化探针，另一方面质控实验操作过程中出现的错误。
本申请还提供一种基于半导体测序平台的检测BRCA1/2基因拷贝数变异的文库构建方法，包括如下步骤：
步骤1)制备建库探针引物组步骤；
步骤2)DNA提取步骤；
步骤3)文库构建步骤：
所述步骤1)包括如下步骤：制备左/右杂交探针和通用扩增引物，所述杂交探针序列一端包含通用序列，一端包含特异性识别序列；所述通用扩增引物序列包含部分通用序列；
进一步的，每条探针长度相似，实现了扩增子扩增效率一致；
进一步的所述通用序列为测序平台通用序列；
进一步优选的，所述右探针5’含磷酸化修饰，用于可与左探针发生连接；所述通用扩增引物5’端含磷酸化修饰，用于扩增后产物可与半导体测序接头发生连接；
进一步的，还包括制备质控探针，所述质控探针包括性别检测探针和内参探针；性别探针作用质控样本性别，内参探针一方面归一化探针，另一方面质控实验操作过程中出现的错误。
进一步优选的，所述建库探针引物组是上述任一所述的特定序列的建库探针引物组；
进一步的，所述步骤3)文库构建包括：a模板变性；b变性模板与左右探针杂交；c探针连接；d连接产物扩增；e半导体测序平台接头连接和纯化；f qPCR定量。
本申请还提供一种基于半导体测序平台的检测BRCA1/2基因拷贝数变异的测序方法，包括上述步骤，并进一步包括：
步骤4)半导体测序步骤。
本申请还提供一种生信分析方法，所述方法包括如下步骤：
1)对测序原始序列去除通用接头序列；
2)对去除通用接头的测序序列重比对到人参考基因组；
3)对原始测序结果以及重比对结果分别进行质控；
4)对质控后重比对结果进行统计与拷贝数计算：
所述计算为：计算各样本在每个目标区域有效覆盖reads数；待检测样本内参基因区域覆盖的reads数分别与每个样本的目标区域进行比较，对每个样本各目标区域进行归一化处理；
a、当存在阴性样本时，所有阴性样本每个目标区域的归一化值取均值作为各区域的阴性参考值，待测阳性样本对应的每个目标区域归一化值与阴性参考值相比，计算拷贝数比值；
b、当不存在阴性样本时，将待测阳性样本的测序数据与通用阴性样本基线进行比较，从通用阴性样本基线中筛选出最适作为当前待测阳性样本的阴性对照样本；将筛选出的所有阴性样本每个目标区域的归一化值取均值作为各区域的阴性参考值，待测阳性样本对应的每个目标区域归一化值与阴性参考值相比，计算拷贝数比值。
5)根据比值计算实际拷贝数：
进一步的，所述1)中测序原始序列是基于前述测序方法获得测序序列；
进一步的，所述5)根据比值计算实际拷贝数具体参见下表比值与拷贝数关系：
拷贝数 CN0 CN1 CN2 CN3 CN4
比值范围 [0,0.4) [0.4,0.65] (0.65,1.3) [1.3,1.65) [1.65,2]
进一步的，所述通用阴性样本基线是通过如下方法建立：
1)将若干数量的阴性样本进行测序，累计原始数据；
2)对原始数据的各项分项指标进行训练，构建阴性样本基线；所述指标包括：均一性、平均深度、GC含量和Q20碱基数。
与现有技术相比，本申请至少具有如下优势：
1)本申请通过优化半导体测序的建库流程和训练数据分析软件模型等，实现多个基因外显子水平拷贝数变异同时检测，与多重连接依赖性探针扩增技术(MLPA)相比较，可准确检测的基因数目更多。在优化方面，比如探针序列设计方面，本申请根据杂交探针设计原则，反复优化探针序列，从而提高杂交效率与杂交特异性；在通用引物设计方面，左右探针一端均携带通用序列，每条探针长度相似，实现了扩增子扩增效率一致，通过半导体测序，统计每个区域序列reads数量进行数据分析，相比于MLPA使用毛细管电泳分离和填充序列长短区分不同探针，操作简单结果不受由于毛细管电泳基线漂移和泵输液不稳定等导致数据处理相对复杂的缺点。
2)可扩展性，半导体测序通量更高，可以补充感兴趣的基因位点，同时内参基因设计和投放多，可根据检测基因选择合适内参进行分析，数据更准确。传统MLPA检测通量有限，目标区域和内参个数合计不超过45个。
3)本申请优化了生信分析方法，包括分析过程中引入通用阴性样本基线建立阴性参考值，简化了实验分析流程。
4)有效性，本申请解决了目前BRCA1/2基因CNV检测通量低、检测不准确、实验周期长检测成本高的不足的问题。
附图说明
为了更清楚地说明本申请具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1、目标区域BRCA1 exon18优化前(左)与优化后(右)完整探针、有效reads覆盖情况。
图2、半导体测序平台检测BRCA1/2基因拷贝数变异和数据分析流程图；
图3、样本B01575的CNV检测结果，其中，图3A为本专利方法的结果，图3B为MLPA结果；
图4、样本B01563的CNV检测结果，其中，图4A为本专利方法的结果，图4B为MLPA结果；
图5、样本B01562的CNV检测结果，其中，图5A为本专利方法的结果，图5B为MLPA结果；
图6、样本B01497的CNV检测结果，其中，图6A为本专利方法的结果，图6B为MLPA结果；
图7、样本BRCA2标准品的CNV检测结果；
图8、CNV检测DNA起始量最低限检测结果。
具体实施方式
下面将结合附图对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
以下术语或定义仅仅是为了帮助理解本申请而提供。这些定义不应被理解为具有小于本领域技术人员所理解的范围。
除非在下文中另有定义，本申请具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本申请。
如本申请中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。
在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。
本申请中的术语“大约”、“大体”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10％，优选±5％。
此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在适当的环境下可互换，并且本申请描述的实施方案能以不同于本申请描述或举例说明的其它顺序实施。
如下为本申请具体的实施方式。
实施例1、建库探针引物组的方法学探索
本申请探索全新的探针引物组的设计思路，用于后续半导体测序平台文库的构建，具体的：
1)根据目标区域设计杂交探针，目标位置探针包括左探针和右探针，左右探针由测序平台通用识别序列和与目标序列特异性识别序列组成。其中所有右探针5’端需磷酸化修饰，目的便于右探针5’端与左探针3’端连接。
2)质控探针，包括性别检测探针和内参探针。性别探针作用质控样本性别，内参探针一方面归一化探针，另一方面质控实验操作过程中出现的错误。
3)通用序列和扩增引物，扩增引物5’端需要磷酸化修饰，目的与测序接头进行连接，通用序列的作用1)不同靶标使用同一对引物扩增，可以消除不同片段之间长度差异和序列偏差等因素影响，提高准确率；2)通用序列为不同平台选择提供支撑点。
实施例2、建库探针引物组序列及分析的优化
关于本申请探针序列的优化，实践时考虑额因素是多方面的，比如1)SNP位点对于杂交效率的影响，本方法使用的左右探针连接的连接酶对于左探针的3’端错配最为敏感，左右探针断点位置设计探针时需要避开人群频率较高的SNP位点区域，通过基因组聚合数据库(Genome Aggregation Database，gnomAD)中搜索设计基因的SNP频率和分布，同时在连接点附近也不能有人均频率较高的SNP位点存在，否则会使得连接效果不理想，捕获效率低；2)杂交特异性，本方法检测基因位点众多，即使优化在大量探针杂交过程中也会出现与模板的错配，会产生非特异从而使杂交效率降低，因此将设计序列与基因组比对，有非特异性的位点Tm值要低，目标区域Tm值要＞70℃，提高杂交特异性；3)探针组互相影响，为避免探针内部的互补性或二级结构，导致自身杂交而降低探针特异性，将探针组中所有序列进行比较，有探针组内部互相结合的序列去除重新设计，减少探针组本身的结合从而提高杂交效率。
篇幅原因，这里列举了一部分目标区域的探针优化前后数据：
基于实施例1的引物设计策略，在目标区域内含子或外显子位置设计探针，示例性，部分初步设计的探针序列如表1所示，部分初步设计序列目标区域有效reads个数少无法进行数据分析(表1后半部分)。
考虑到在相同的测序数据量下，部分原始探针由于目标区域左右断点连接处为人群频率较高SNP位点、部分原始探针由于左侧探针或右侧探针与模板或探针内部非特异杂交、部分原始探针在两个连续的目标区域内有重叠等情况，使目标区域左右探针杂交后杂交捕获效率低，探针不完整，导致左右探针连接失败，从而导致完整探针扩增效率低，目标区域覆盖度低，统计有效reads个数少，无法进行数据分析。基于上述情况的考量进行对部分初步设计探针进行靶向区域调整和序列优化等改进，具有优化序列如表2所示，而且由表2后半部分可知，经过原始探针进行调整优化最终使得有效reads少的区域个数可以达到＞100条，捕获效率≥99％。图1为目标区域BRCA1 exon18优化前(左)与优化后(右)完整探针、有效reads覆盖情况。
表1、优化前的探针序列以及有效reads和捕获效率情况
表2、探针组优化后的探针序列以及有效reads和捕获效率情况
内参探针数据的分析优化：
虽然已经在建库探针引物组序列上进行了优化，但是在实验过程中由于环境的变化、样本的变化，不同探针产生的数据仍然会有差异，尤其是作为内参基因的探针数据，如果不能挑选出良好的数据作为后续分析的基础，最终分析结果将产生较大偏差。
内参探针数据的分析优化方案，主要考虑两种策略：
1.选取内参探针数据中具有代表意义的探针数据作为后续分析的基础。在这种情况下，内参探针数据的中位数最为符合。首先，这种策略能够消除掉离群探针数据的影响提高接下来数据分析的准确性，另一方面能够保证计算效率。
2.分别将内参探针数据作为后续分析的基础，通过分析结果的统计，选取最优的分析结果。在这种情况下，最优的分析结果应考虑两个因素：分析结果与一致结果的一致性、阴性位点分析结果的平稳性。本策略做出了更多的分析计算，保证分析结果更趋于真实情况。
基于两种优化策略，选取3个阴性样本和2个已知变异结果的样本，验证不同优化策略的效果。
样本编号 策略 分析结果 总体偏移量
1 1 一致 9.68
1 2 一致 7.25
2 1 一致 8.06
2 2 一致 5.82
经过对分析结果的分析比较，以策略2作为内参探针数据的分析优化策略。
通过上述优化，最终确定了本申请的建库探针和引物序列为：左右探针序列依次如SEQ ID NO.63-216所示；质控探针序列依次如SEQ ID NO.1-62所示；通用序列如SEQ IDNO.217-218所示，通用扩增引物序列如SEQ ID NO.219-220所示，具体如下表3：
表3、确定的探针和引物序列
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实施例3、本申请方法体系的建立
基于实施例1的设计思路和实施例2的探索优化，本申请最终建立本申请半导体测序平台检测BRCA1/2基因拷贝数变异的流程(见图2)，详细如下：
具体实施过程中，每次测试都需要阴性样本做对照,阴性样本与待测阳性样本提取建库测序流程必须保持一致。同一批次样本对应1-3个阴性对照。
1.DNA提取，血液样本，使用QIAamp DNA Mini Kit提取基因组DNA(或其他满足提取条件的试剂盒或方法)。DNA纯度满足OD260/OD280＝1.8-2.0，DNA溶解在TE bu ffer中。
2.质检合格的基因组DNA，使用low TE稀释取总量100ng，体积3-5ul进行变性。反应条件为95℃5min，25℃pause；
3.向变性模板中加入0.75ul杂交反应液和0.75ul总量1-10fmol/probe/reaction的探针。反应条件为95℃1min，60℃16-20hours；
4.保持反应管在PCR仪上，待杂交结束温度降至54℃，向杂交体系中加入总体积为16ul的连接反应液1，连接反应液2、连接酶和ultrapure water混合液。反应条件为54℃pause，54℃15min，98℃5min，20℃pause；
5.连接反应结束，向体系中加入总体积30ul PCR反应液，PCR酶，通用引物F和R各10-15pmol，ultrapure water混合液。反应条件94℃1min，[98℃10s，60℃15s，68℃20-30s]*35cycles。
6.半导体测序平台接头连接，取扩增反应产物22ul，加入4ul连接反应缓冲液、2ul连接酶和1ul样本标签。反应条件22℃30min，72℃10min，10℃保持。
7.连接反应结束后使用平衡至室温至少30min的XP beads进行纯化，磁珠比例1：1，向反应体系中加入30ul纯化磁珠，混合均匀静置5min，静置后置于磁力架吸附1-2min后移去上清，加入180ul 80％乙醇，静置30s不扰动磁珠弃上清，清洗两次，乙醇洗后保持磁珠在磁力架上，待磁珠干(无裂纹)加入20ul Lo w TE buffer混合后静置5min洗脱DNA。然后置于磁力架1-2min，回收上清即为构建好的文库。
8.文库片段质检Agilent 2100(High Sensitivity DNA Chips)，Qubit4(QubitdsDNA HS Assay Kit)初步浓度测定。
9.qPCR进行准确定量(试剂盒Ion Library TaqMan Quantitation Kit)，梯度稀释试剂盒中的浓度为68pM的标准品为6.8pM、0.68pM和0.068pM，每个文库稀释1000倍，进行单样本定量。配置qPCR试剂Mix。5ul Ion Library TaqManTM qPCR Mix，2X，0.5ulIonLibrary TaqManTM Quantitation Assay，20X共5.5ul。阴性对照、标准品和样本5.5ul，总体系10ul。运行程序50℃2min，95℃2min，[95℃15s，60℃1min]*40cycles。
10.按照qPCR定量结果和数据量要求，混合样本进行半导体测序。
11.数据分析
1)测序结果bam文件通过samtools v1.9软件转化为包含原始测序序列信息的fastq文件；
2)使用cutadapt v3.7软件对测序原始序列去除通用接头序列；
3)使用bwa v0.7.12软件对去除通用接头的测序序列重新比对到人参考基因组(hg19)；
4)使用bamdst v1.0.9软件对原始测序结果以及重比对的结果分别进行质控计算对重新比对的bam文件进行结果统计与拷贝数计算：计算各样本在每个目标区域有效覆盖的reads数；待检测样本内参基因区域(区分常染色体与X、Y染色体)分别覆盖的reads数作为每个样本的实际参考值，对每个样本各目标区域进行归一化处理；
a、当存在阴性样本时，所有阴性样本每个目标区域的归一化值取均值作为各区域的阴性参考值，待测阳性样本对应的每个目标区域归一化值与阴性参考值相比，计算拷贝数比值；
b、当不存在阴性样本时，将当前待测阳性样本的测序数据与通用阴性样本基线进行比较分析，从通用阴性样本基线中筛选出最适作为当前待测阳性样本的阴性对照样本；将筛选出的所有阴性样本每个目标区域的归一化值取均值作为各区域的阴性参考值，待测阳性样本对应的每个目标区域归一化值与阴性参考值相比，计算拷贝数比值。
通用阴性样本基线建立具体参见实施例4。
5)根据比值计算实际拷贝数，比值阈值见下表4：
表4、相对比值与拷贝数关系对应表
拷贝数 CN0 CN1 CN2 CN3 CN4
比值范围 [0,0.4) [0.4,0.65] (0.65,1.3) [1.3,1.65) [1.65,2]
实施例4、通用阴性样本基线的建立与使用
选择BRCA1/2阳性样本、100个用做建立通用阴性样本基线的阴性样本、3个与BRCA1阳性样本同分析批次的阴性样本进行检测，评估通用阴性样本基线与同分析批次的阴性样本在分析结果准确性上的差异。
100个用做建立通用阴性样本基线的阴性样本单独进行测序，测序完成后对各数据的各项分项指标(包括但不限于均一性、平均深度、GC含量、Q20碱基数等)进行训练，构建阴性样本基线。
BRCA1/2阳性样本与3个阴性样本在同一批次中进行实验和测序，按照实施例3中“11.数据分析”的步骤进行分析。
将BRCA1/2阳性样本与阴性样本基线比较，选取最阴性样本基线中最适合样本作为接下来分析使用的阴性对照样本，按照实施例3中“11.数据分析”的步骤进行分析。
两分析方法得到分析结果对比如下：
分析方案 分析结果 总体偏移量
BRCA1阳性样本+通用阴性样本基线 一致 8.86
BRCA1阳性样本+3同批次阴性样本 一致 6.57
证明使用通用阴性样本基线作为阴性对照依然能够保持数据分析结果的分析质量。
实施例5、BRCA1拷贝数变异检测
选择临床已知4个BRCA1阳性样本和4个阴性样本进行检测，评估实验结果与实际结果准确性。测试样本详情信息见表5。具体实施步骤，参考实施案例3半导体测序平台检测BRCA1/2基因拷贝数变异的流程。
表5、测试样本详情信息
实验结果：
1)数据质控见表6，所有样本目标区域长度8043bp，每一条探针均有覆盖，覆盖率＞99.9％，捕获效率＞98％，均一性＞99％，所有样本质控均合格。
表6、数据质控
序号 样本编号 目标区域长度 捕获效率 均一性 覆盖度(>＝100x)
1 1501 8043 0.9903 0.9922 0.9996
2 1502 8043 0.9896 0.9966 0.9996
3 1503 8043 0.9912 0.9995 0.9995
4 1504 8043 0.9891 0.9939 0.9996
5 B01575 8043 0.9884 0.9922 0.9996
6 B01563 8043 0.9894 0.994 0.9996
7 B01562 8043 0.9903 0.9895 0.9996
8 B01497 8043 0.9937 0.994 0.9996
2)数据分析，将原始数据进行比对、去除接头和低质量，对重比对的bam文件进行结果统计与拷贝数计算，计算各样本在每个目标区域有效覆盖的reads数，根据内参基因均一化处理每个样本，然后通过对照样本计算最终拷贝数情况。
3)结果展示,4个阳性样本(B01575、B01563、B01562、B01497)CNV情况与真实情况一致(图3-6)，并且样本均使用MLPA验证，本方法与MLPA方法高度一致，证明本方法在检测BRCA1基因拷贝数缺失的准确性高。
实施例6、BRCA2拷贝数变异检测
选择BRCA2阳性标准品和3个阴性样本进行检测，评估实验结果与实际结果准确性。测试样本详情信息见表7。具体实施步骤，参考实施案例3,半导体测序平台检测BRCA1/2基因拷贝数变异的流程。
表7、测试样本详情信息
序号 样本编号 性别 阴阳性 变异信息
1 BRCA2标准品 女 阳 BRCA2-21～27号外显子杂合缺失
2 1501 女 阴 无
3 1502 男 阴 无
4 1503 女 阴 无
实验结果：
1)数据质控见表8，所有样本目标区域长度8043bp，每一条探针均有覆盖，覆盖率＞99.9％，捕获效率＞98％，均一性＞99％，所有样本质控均合格。
表8数据质控
序号 样本编号 目标区域长度 捕获效率 均一性 覆盖度(>＝100x)
1 BRCA2标准品 8043 0.9913 0.9810 0.9996
2 1501 8043 0.9896 0.9827 0.9996
3 1502 8043 0.9922 0.9827 0.9995
4 1503 8043 0.9894 0.9827 0.9996
2)数据分析，将原始数据进行比对、去除接头和低质量，对重比对的bam文件进行结果统计与拷贝数计算，计算各样本在每个目标区域有效覆盖的reads数，根据内参基因均一化处理每个样本，然后通过对照样本计算最终拷贝数情况。
3)结果展示如图7所示，4个阳性样本CNV情况与真实情况一致，证明本方法在检测BRCA2基因拷贝数缺失的准确性高。
实施例7、拷贝数变异检测最低检测限
选择BRCA1阳性样本和3个阴性样本进行检测，评估实验检测限范围。测试样本详情信息见表9。具体实施步骤，将阳性样本稀释20ng、30ng、50ng和100ng进行测试，参考实施案例1,半导体测序平台检测BRCA1/2基因拷贝数变异的流程。
表9、测试样本详情信息
序号 样本编号 性别 阴阳性 变异信息
1 B01562 女 阳 BRCA2-21～27号外显子杂合缺失
2 1501 女 阴 无
3 1502 男 阴 无
4 1503 女 阴 无
实验结果
1)数据质控见表10，所有样本目标区域长度8043bp，每一条探针均有覆盖，覆盖率＞99.9％，捕获效率＞98％，均一性＞99％，所有样本质控均合格。
表10、数据质控
2)数据分析，将原始数据进行比对、去除接头和低质量，对重比对的bam文件进行结果统计与拷贝数计算，计算各样本在每个目标区域有效覆盖的reads数，根据内参基因均一化处理每个样本，然后通过对照样本计算最终拷贝数情况。
3)结果见图8所示,20ng、30ng、50ng和100ng阳性样本CNV情况与真实情况一致，但是随着总量的降低拷贝数散点图有波动，不影响结果判读，最低可做20ng DNA投入。证明本方法在检测基因拷贝数缺失的最低检测限为20ng，而现有技术中NGS捕获杂交中推荐都是500ng。
前述对本申请的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本申请限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本申请的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本申请的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本申请的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (10)

1.一种生信分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)对测序原始序列去除通用接头序列；
2)对去除通用接头的测序序列重比对到人参考基因组；
3)对原始测序结果以及重比对结果分别进行质控；
4)对质控后重比对结果进行统计与拷贝数计算：
5)根据比值计算实际拷贝数。
2.根据权利要求1所述的生信分析方法，其特征在于，所述4)中的计算为：计算各样本在每个目标区域有效覆盖reads数；待检测样本内参基因区域覆盖的reads数分别与每个样本的目标区域进行比较，对每个样本各目标区域进行归一化处理；
a、当存在阴性样本时，所有阴性样本每个目标区域的归一化值取均值作为各区域的阴性参考值，待测阳性样本对应的每个目标区域归一化值与阴性参考值相比，计算拷贝数比值；
b、当不存在阴性样本时，将待测阳性样本的测序数据与通用阴性样本基线进行比较，从通用阴性样本基线中筛选出最适作为当前待测阳性样本的阴性对照样本；将筛选出的所有阴性样本每个目标区域的归一化值取均值作为各区域的阴性参考值，待测阳性样本对应的每个目标区域归一化值与阴性参考值相比，计算拷贝数比值；
优选的，所述通用阴性样本基线是通过如下方法建立：
1)将若干数量的阴性样本进行测序，累计原始数据；
2)对原始数据的各项分项指标进行训练，构建阴性样本基线；所述指标包括：均一性、平均深度、GC含量和Q20碱基数。
3.根据权利要求1所述的生信分析方法，其特征在于，所述5)根据比值计算实际拷贝数具体参见下表比值与拷贝数关系：
拷贝数 CN0 CN1 CN2 CN3 CN4 比值范围 [0,0.4) [0.4,0.65] (0.65,1.3) [1.3,1.65) [1.65,2]
优选的，所述1)中的对测序原始序列是利用权利要求10所述测序方法制备获得。
4.一种基于半导体测序平台的检测BRCA1/2基因拷贝数变异的建库探针引物组，包括与目标区域互补的左右杂交探针和通用扩增引物，其特征在于，
所述左右杂交探针序列一端包含通用序列，一端包含特异性识别序列；
所述通用扩增引物序列包含部分通用序列；
优选的，所述通用序列为测序平台通用序列；所述杂交探针长度相似。
5.根据权利要求4所述的建库探针引物组，其特征在于，所述右杂交探针的5’端含磷酸化修饰；所述通用扩增引物的5’端含磷酸化修饰。
6.根据权利要求4-5任一所述的建库探针引物组，其特征在于，所述探针序列如SEQ IDNO.63-216所示；
优选的，所述通用序列如SEQ ID NO.217-218所示，所述通用扩增引物序列如SEQ IDNO.219-220所示。
更优选的，所述建库探针引物组进一步包含质控探针，所述质控探针包含性别质控探针和内参质控探针；进一步优选的，所述质控探针序列如SEQ ID NO.1-62所示。
7.一种BRCA1/2基因拷贝数变异的检测产品，其特征在于，包含权利要求4-6任一所述的建库探针引物组；优选的，所述检测产品为检测试剂盒。
8.权利要求4-6任一所述的建库探针引物组的如下任一应用：
1)在半导体测序平台文库构建中的应用；
2)在基因拷贝数变异检测中的应用；
3)在BRCA1/2基因拷贝数变异检测中的应用；
4)在制备BRCA1/2基因拷贝数变异的检测试剂盒中的应用。
9.一种基于半导体测序平台的检测BRCA1/2基因拷贝数变异的文库构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1)制备建库探针引物组步骤；
步骤2)DNA提取步骤；
步骤3)文库构建步骤：
所述步骤1)包括：制备左/右探针和通用扩增引物，所述探针序列一端包含通用序列，一端包含特异性识别序列；所述通用扩增引物序列包含部分通用序列；
优选的，所述通用序列为测序平台通用序列；所述探针的长度相似；
更优选的，所述右杂交探针的5’端含磷酸化修饰；所述通用扩增引物的5’端含磷酸化修饰；
进一步优选的，所述建库探针引物组是权利要求4-6任一所述的建库探针引物组；
更进一步优选的，所述步骤3)文库构建包括：
a、模板变性；
b、变性模板与左右探针杂交；
c、探针连接；d、连接产物扩增；
e、半导体测序平台接头连接和纯化；
f、qPCR定量。
10.一种基于半导体测序平台的检测BRCA1/2基因拷贝数变异的测序方法，其特征在于，
包括权利要求9所述步骤，并进一步包括：
步骤4)半导体测序步骤。
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